CZ200075A3 - Chimérový rozpustný protein receptor/ligand interleukinu-6, jeho analogy a použití - Google Patents

Chimérový rozpustný protein receptor/ligand interleukinu-6, jeho analogy a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ200075A3
CZ200075A3 CZ200075A CZ200075A CZ200075A3 CZ 200075 A3 CZ200075 A3 CZ 200075A3 CZ 200075 A CZ200075 A CZ 200075A CZ 200075 A CZ200075 A CZ 200075A CZ 200075 A3 CZ200075 A3 CZ 200075A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sil
cells
protein
chimeric protein
chimeric
Prior art date
Application number
CZ200075A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ302488B6 (cs
Inventor
Michel Revel
Judith Chebath
Tsvee Lapidot
Orit Kollet
Original Assignee
Yeda Research And Development Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26323470&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ200075(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from IL12128497A external-priority patent/IL121284A0/xx
Application filed by Yeda Research And Development Company Limited filed Critical Yeda Research And Development Company Limited
Publication of CZ200075A3 publication Critical patent/CZ200075A3/cs
Publication of CZ302488B6 publication Critical patent/CZ302488B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Chimérový rozpustný protein receptor/ligand interleukinu-6, jeho analogy a použití
Oblast techniky
Vynález obecně popisuje biologické aktivity interleukinu 6 (IL-6), které závisí na agonistickém působení rozpustného receptoru IL-6 (sIl-6R). Vynález popisuje nové chimérové proteiny SIL-6R/IL-6 konstruované z fúze podstatně přirozeně se vyskytující formy SIL-6R a IL-6 a jejich biologicky aktivních analogů, které jsou zvláště použitelné v případě léčby zhoubného bujení prostřednictvím inhibice růstu karcinogenních buněk, transplantace kostní dřeně, léčby poruch jater a jiných stavů, které souvisí s IL-6.
Dosavadní stav techniky
Interleukin 6 (IL-6) je dobře známý cytokin, jehož biologické aktivity zprostředkovává membránový receptorový systém, který obsahuje dva různé proteiny. Jeden se nazývá IL6 Receptor (IL-6R nebo gp80) a druhý je gp 130 (Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signál transduction through gpl30 that is shraed among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells, 12: 262-277, 1994).
Rozpustné formy IL-6R (sIL-6R) odpovídající extracelulární oblasti gp80 jsou přirozené produkty lidského těla a vyskytují se jako glykoproteiny v krvi a v moči (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligandaffinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337, 1990; Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M.
Enhancement of interleukin-6 cytostatic effact on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11, 1992).
Výjimečnou vlastností molekul sIL-6R je, že působí jako silné • · agonisty IL-6 u mnoha typů buněk. Uvedené buňky zahrnují lidské buňky (Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signál transducer gpl30. Cell, 58: 573-581, 1989; Novick D, Shulman
LM, Chen L and Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effact on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11, 1992). To způsobuje skutečnost, že dokonce bez intracytoplazmatické oblasti gp80, je sIL-6R stále schopna spustit dimerizaci gpl30, jako odezvu na IL-6, který naopak zprostředkovává podstatný transdukční signál specifický pro IL-6 a biologické účinky (Murakami H, Hibi M, Nakagawa N, Nagakawa T, Yasukawa K, Yamashi K, Taga T and Kishimoto T. IL-6 induced homodimerization of gpl30 and asociated activation of a tyrosine kinase. Science, 260: 18081810, 1993). Komplex aktivního receptoru IL-6 ve skutečnosti vykazuje hexamérovou strukturu, kterou tvoří dva řetězce gpl30, dva IL-6R a dva ligandy IL-6 (Ward L. D, Howlett G. J, Discolo G, Yasakawa K, Hammacher A, Moritz R. L and Simpson R. J. High affinity interleukin-6 receptor is a hexameric complex consisting of two molecules each of interleukin-6, interleukin-6 receptor and gpl30. J. Biol. Chem., 269: 2328623289, 1994; Paonessa G, Graziana R, DeSerio A, Savino R, Caipponi L, Lahmm A, Salvati A. L, Toniatti C and Ciliberto G. Two distinct and independent sites on IL-6 trigger gpl30 dimer formation and signalling. EMBO J. , 14: 1942-1951, 1995) . SIL6R má dva typy interakce s gpl30, přičemž obě uvedené interakce jsou podstatné při biologické aktivitě specifické pro IL-6 (Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chenath J. Epitop peptides from interleukin-6 receptor which inhíbit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135143, 1995) .
Léčba sIL-6R vede k zesílení biologické aktivity IL-6 u mnoha typů buněk. Příkladem jsou nádorové buňky, jejichž růst IL-β inhibuje silněji v případě, že se přidá sIL-6R. Příkladem uvedených nádorových buněk jsou myší myeloleukémické buňky Ml (Taga T, Hibi M, Hirata Y, Yamasaki K, Yasukawa K, Matsuda T, Hirano T and Kishimoto T. Interleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signál transducer gpl30. Cell, 58: 573-581, 1989), lidské buňky T47D karcinomu prsu (Novick D, Shulman LM, Chen L and Revel M. Enhancement of interleukin-6 cytostatic effact on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4:6-11, 1992) nebo lidské buňky karcinomu plic (buňky „Non-small) (Ganapathi Μ. K, Weizr A. K, Borsellino S, Bukowski R. M, Ganapathi S, Rice T, Casey G and Kawamura K. Resistance to Interleukin-6 in human Non-small cell lung carcinoma cell lineš: Role of receptor components. Cell Growth and Differentiation, 7: 923-929,
1996). IL-6 vykazuje aktivity proti tvorbě mestáz in vivo (Katz A, Shulman L. M, Porgador A, Revel M, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of B16 malanoma metastases by longterm low-dose Interleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98109, 1993), sIL-6R může také zesílit určité protinádorové účinky IL-6 in vivo (Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, Nowak J, Pawlowski T, Baumann H, Heinrich P and Rose-John S. Interleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann. New Yourk Acad. Sci., 762: 361-374,
1995). Další aktivita IL-6, k jejímuž zesílení dojde přidáním sIL-6R, stimuluje hematopoietické kmenové buňky, aby produkovaly vícerodové kolonie (Sui X, Tsuji K, Tanaka R, Tajima S, Muraoka K, Ebihara Y, Ikebuchi K, Yasukawa K, Taga T, Kishimoto T and Nakahata T. Gpl30 and c-kit signalings synergize for ex vivo expansion of human promitive hemopoietic progenitor cells. Proč. Nati.Acad. Sci. USA 92: 2859-2863,
1995). Také se pozorovalo, že sIL-6R a kombinace IL-6
podporuje přežití primárních kultur mozkových oligodendrocytů (Oh J-W. Expression of recombinant soluble· human interleukin-6 receptors and analysis of their functions. Ph.D Thesis Weizmann Institute of Science (Revel M, supervisor), 1997), zatímco samotný IL-6 je v takových kulturách pouze velmi málo aktivní (Kahn M. A and De Vellis J. Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-β family of cytokines. Glia, 12: 87-98, 1994). Toto zjištění ukazuje, že IL-6, jsetliže se kombinuje s sIL-6R, může napodobovat aktivitu jiných neurotrofnich cytokinů, jako je ciliární neurotropický faktor (CNTF) nebo faktor inhibující leukémii (LIF), který také působí prostřednictvím gpl30, jako se také děje v případě IL-11 a onkostatinu M (Hirano T, Matsuda T and Nakajima K. Signál transduction through gpl30 that is shraed among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells, 12: 262-277, 1994).
Při pokusu vytvořit molekulu, která může kombinovat shora uvedené funkce IL-6 a sIL-6R, se popisuje produkce fúzního proteinu mezi zkráceným segmentem sekvence lidského IL-6R a IL-6 spojených s linkerem, který je bohatý na glycin, v rekombinanntich buňkách kvasinek (Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, Brakenhoff J. P. G, Kallen K-J, Wollmer A, Grotzinger J and Rose-John S. A bioactive designér cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nátuře Biotechnology 15: 142-145, 1997). Tento fúzní protein zahrnuje v podstatě pouze N-oblast receptoru cytokinů IL-6R a C-oblast t
receptoru cytokinů a tak mu chybí v podstatě celá oblast podobná imunoglobulinu (Ig) interlekinu IL-6R a pre-membránová oblast receptoru (oblast mezi C-oblastí a trans-membránovou doménou). To reprezentuje zkrácenou formu sIL-6R. Tento zkrácený sIL-6R je ve fúzním proteinu spojen prostřednictvím shora v textu uvedeného linkeru v podstatě s celou přirozenou formou IL-6. Vedle chybějících částí přirozeného sIL-6R, tento fúzní protein produkovaný v kvasinkách nemá glykosylační patern, který by měl, kdyby se produkoval v savčích buňkách, zvláště například v lidských buňkách. Ve skutečnosti tento fúzní protein produkovaný v kvasinkách má molekulovou hmotnost pouze přibližně 57 000 na rozdíl od fúzního produktu, který obsahuje v podstatě celý přirozený sIL-6R a aminokyselinové zbytky IL-6 a je v savčích (například v lidských) buňkách zcela glykosylován. Jeho očekávaná molekulová hmotnost je přibližně 85 000 (popisuje se dále v textu v příkladu 2).
Běžná zkušenost při vývoji rekombinantních proteinů, které se mohou použít při léčbě lidských pacientů ukázala, že je důležité, aby rekombinentí proteiny zůstaly co nejvíce podobné jejich přirozeným formám, které se nacházejí v lidském těle. Důvodem je zabránit vývoji protilátek a jiným vedlejším účinkům, které je možné pozorovat při použití nepřirozených rekombinantních produktů. Z tohoto důvodu je výhodné při produkci glykosylovaných proteinů, jako je interferon-β nebo faktor stimulující kolonie granulocytů (Chernajovsky Y, Mory Y, Chen L, Merks Z, Novick D, Rubinstein and Revel M. Efficient constitutive production of hman fibroblast interferon by hamster cells transformed with the IFN-βΙ gene fused to an SV40 early promotor. DNA, 3: 297-308, 1984), které jsou svou chemickou formou co nejvíce podobné přirozenému lidskému produktu, použít rekombinantní savčí buněčné systémy. Bakterie nebo mikroorganizmy, jako jsou například kvasinky, kde nedochází ke správné glykosylaci, také způsobují nesprávné svinutí proteinových řetězců, což vede k imunogenní reakci. To zvláště důležité s ohledem na IL-6, jehož molekula se silně upravuje postranslačně N- a O-glykosylací, stejně jako fosforylací (Revel M. Host defence against infections and of the multifunctional ΙΕ-6/ΙΡΝ-β2 inflamentations: Role cytokine. Experientia
45: 549-557, 1989) s ohledem na přirozený sIL-6R z lidské krve a moče, kterým je glykoprotein, jehož aminokyseliny N-konce a C-konce jsou konstantní a jsou známé (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner O, Revel M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337, 1990; a patent č. US 5,216,128 a odpovídájící.EP 413908 Bl).
Proto se zdá, že shora uvedený fúzní produkt mezi částí sIL-6R a IL-6 má řadu nevýhod zvláště s ohledem na jeho použití při léčbě lidí. To je způsobeno skutečností, že mu chybí část sIL-6R a že při jeho produkci v kvasinkách, může dojít k nesprávné glykosylaci proteinu.
Proto fúzní molekula obsahující sIL-6R, který se nachází v lidských tělních tekutinách, a IL-6, který produkují lidské nebo jiné savčí buňky, není popsána.
Cílem vynálezu je proto vytvořit takovou fúzní molekulu, která obsahuje přirozený sIL-6R a přirozený IL-6 (v libovolném pořadí) a která vzniká v savčích buňkách.
Dále vynález popisuje použití fúzního proteinu (chiméry SIL-6R/IL-6) k inhibici růstu silně metastázujících buněk melanomu při velmi nízké koncentraci. Tyto buňky jsou rezistentní vůči IL-6 a samotnému sIL-6R.
Dále vynález popisuje použití takového fúzního proteinu (chiméra sIL-6R/IL-6) k in vivo štěpům lidských hematopoietických kmenových buněk při způsobech transplantace kostní dřeně.
Dále vynález popisuje použití takového fúzního proteinu při dalších poruchách spojených s IL-6, jako je například poškození jater nebo neurologické poruchy.
Dále vynález popisuje farmaceutické kompozice, které obsahují shora uvedený přirozený fúzní protein sIL-6Rpřirozený IL-6 (chiméra SIL-6R/IL-6) při léčbě zhoubného bujení, při transplantaci kostní dřeně a při jiných poruchách spojených s IL-6. Jsou to například poruchy jater a neurologické poruchy.
Podstata vynálezu
V souladu s vynálezem se připravilo velké množství fúzních proteinů (chiméry), kdy každý protein obsahuje v podstatě všechny přirozeně se vyskytující sIL-6R z lidských tělních tekutin a v podstatě všechny přirozené formy přirozeně se vyskytujících lidských IL-6. Tyto fragmenty jsou spojeny krátkými linkerovými peptidy, které mohou tvořit pouze 3 a nebo více aminokyselinových zbytků (například 13 aminokyselinových zbytků) (popisuje se v příkladech 1 a 2) . Mělo by se však poznamenat, že v těchto fúzních proteinech se mohou linkerové peptidy opomenout a část sIL-6R se může přímo spojit s částí IL-6. Protože linkery reprezentující nepřirozené aminokyselinové sekvence mohou být imunogenní epitopy vyvolávající u pacientů protilátky, upřednostňuje se použít přímo fúzovanou chiméru SIL-6R/IL-6, která má požadovanou biologickou aktivitu a minimalizuje se nebezpečí vytvoření potencionálně nebezpečných protilátek v případě aplikace uvedené chiméry.
Za účelem redukce potencionální imunogenicity chimérového proteinového produktu je také důležitá konzervace celé sekvence sIL-6R zahrnující oblast podobné Ig, jak se nachází v prirozene glykosylace stejně jako správná modifikace zavedené.
se vyskytující molekule, a jiné post-translační lidskými nebo savčím buňkami v případě, že uvedená chiméra se v takových buňkách tvoří.
Ve spojovacím místě mezi částí SIL-6R a IL-6 chimérového proteinu je však možné použít velmi krátký linker o délce přibližně 3 aminokyselin. Tak krátký linker nebude působit jako imunogenní epitop. Je také možné pro spojení obou částí použít delší linkery, až o délce 30 aminokyselin, ale v tomto případě je nutné zaručit bezpečnost a biologickou účinnost, aby ze zjistilo, že chimérové molekuly nejsou imunogenní.
Ve skutečnosti se překvapivě ukázalo, že v souladu s vynálezem takové dlouhé linkery nejsou podstatné pro
aktivitu chimérového proteinu, což ukazuje, že správné svinutí chiméry nevyžaduje delší linker, zvláště když v podstatě všechny přirozeně se vyskytující sekvence částí sIL-6R a IL-6 jsou začleněny do chimérové molekuly (popisuje se například v příkladu 3 a na obrázku č. 5, které porovnávají chiméru sIL6R/IL-6 vykazující velmi krátký linker (3 aminokyseliny) a podobnou chiméru s delším linkerem obsahujícím 30 aminokyselin).
Tyto fúzní proteiny nebo chiméry SIL-6R/IL-6 se účinně produkují v souladu s vynálezem v savčích buněčných expresívních systémech za vzniku glykosylovaných produktů, které mají potencionální aktivitu na nádorové buňky, jenž obvykle nejsou citlivé na IL-β nebo samotný sIL-6R. Tyto proteiny zaručují úspěch při štěpech transplantovaných buněk lidské kostní dřeně (popisuje se dále v textu v příkladech 1 až 4). Ve skutečnosti v takových transplantátech kostní dřeně jsou chiméry SIL-6R/IL-6 podstatné pro přežití a proliferaci transplantovaných nedeterminovaných pluripotencionálních hematopoietických kmenových buněk. Z experimentálních výsledků a dalších analýz vyplývá, že se mohou připravit různé analogy chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 podle vynálezu, které mají v podstatě stejnou biologickou aktivitu chiméry SIL-6R/IL-6. Tyto analogy jsou chiméry SIL-6R/IL-6, ve deletoval, přidal nebo substituoval jeden aminokyselinových zbytků. Existuje omezení takových analogů, musí obsahovat většinu přirozeně se vyskytující sekvence sIL6R a IL-6. Například adice aminokyselin k sekvencím přirozeně IL-6 jsou přednostně omezeny na Přednostně tyto adice probíhají v místě spojení mezi sIL-6R a IL-6, to je v místě linkeru. Podobně delece sekvencí sIL-6R a IL-6 se přednostně omezují na 20 až 30 aminokyselin. Substituce aminokyselinových zbytků v sekvencích sIL-6R a IL-6 jinými aminokyselinovými zbytky jsou přednostně omezeny na 20 až 30 aminokyselin. Všechny tyto kterých se nebo více se vyskytujících sIL-6R a přibližně 20 aminokyselin.
• · dříve v textu zmiňované delece, adice a substituce jsou přijatelné v souladu s vynálezem, když takto získané analogy exprimované v savčích buňkách si uchovávají v podstatě stejnou biologickou aktivitu jako chiméra SIL-6R/IL-6 obsahující v podstatě přirozeně se vyskytující sekvence a mají v podstatě stejný glykosylační patern chiméry složený z podstatě přirozeně se vyskytujících sekvencí.
Vynález popisuje chimérový glykosylovaný protein rozpustného receptoru interleukinu-β (sIL-6R)-interleukin-5 (IL-6) (sIL-6R/IL-6) a jeho biologicky aktivní analogy.
Uvedený protein a jeho analogy obsahují fúzní proteinový produkt mezi v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou sIL-6R a v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou IL6. Uvedený sIL-6R/IL-6 a jeho analogy se glykosylují stejným způsobem jako probíhá glykosylace přirozeně se vyskytujícího SIL-6R a IL-6.
Provedení shora v textu uvedeného chimérového proteinu podle vynálezu zahrnuje:
(i) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, kde uvedený sIL-6R se fúzuje s IL-6 prostřednictvím molekuly peptidového linkeru.
(ii) Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (i), kde uvedený linker je velmi krátký a není imunogenní a je tvořen 3 až 4 aminokyselinovými zbytky.
(iii) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (ii), kde uvedený linker je tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met).
(iv) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jako v odstavci (i), kde uvedený linker je peptid tvořený 13 aminokyselinovými zbytky se sekvencí E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (ví) (vii) (viíi) (ix) (X) (xi) (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-PheMet) (SEQ ID NO: 1).
Chimérový protein sIL-6R/IL-6, který se označil sIL-6R5Val/IL-6 a vykazuje tripeptidový linker se sekvencí E-F-M mezi C-terminální Val-356 sIL-6R a N-terminální Pro-29 IL-6. Uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3. Chimérový protein sIL-6R/IL-6, který se označil sIL-6R6Val/L/IL-6 a vykazuje peptidový linker v délce 13 aminokyselin se sekvencí E-F-G-A-G-L-VL-G-G-Q-F-M mezi C-terminální Val-356 sIL-6R a Nterminální Pro-29 IL-6. Uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3, kde tripeptid sekvence E-F-M mezi pozicemi 357-359 zobrazený na obrázku č. 3 je nahrazen peptidovou sekvencí uvedených 13 aminokyselin.
Chimérový protein SIL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v savčích buňkách ve zcela zpracované formě.
Chimérový protein SIL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v lidských buňkách.
Chimérový protein sIL-6R/IL-6, kde uvedený protein se produkuje v buňkách CHO.
Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny inhibovat růst vysoce maligních rakovinových buněk.
Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny inhibovat růst buněk vysoce maligního melanomu.
(xii) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny umožnit ín vivo štěpy lidských hematopoietických buněk při transplantaci kostní dřeně.
(xiii) Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se uvádí shora v textu, kde uvedený chimérový protein a analogy se charakterizují tím, že jsou schopny chránit játra proti působení hepatoxíckých činidel.
Vynález dále popisuje sekvenci DNA kódující chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, jak se popisuje shora v textu.
Vynález dále popisuje vektor DNA obsahující sekvenci DNA kódující chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu. Uvedený vektor je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v savčích buňkách.
Provedení vektoru DNA podle vynálezu zahrnuje:
(i) Vektor DNA, který je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v lidských buňkách.
(ii) Vektor DNA, který se exprimuje v savčích nebo lidských buňkách, přičemž exprimovaný chimérový protein má sekvenci, která umožňuje plné zpracování chimérového proteinu savčí nebo lidskou buňkou a vylučování zcela upraveného proteinu z buněk do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují.
(iii) Vektor DNA, jak se popisuje shora v textu označený jako plazmid pcDNAsIL-6R/IL-6 obsahující vektor pcDNA3, jenž zahrnuje DNA sekvenci kódující chimérový protein SIL-6R/IL-6, který řídí cytomegalovirový promotor (CMV).
····· ·· · ·· ·· (iv) Vektor DNA, jak se popisuje shora v textu označený jako plazmid SIL-6R/L/IL-6 obsahující vektor pcDNA3, který zahrnuje sekvenci DNA kódující chimérový protein SIL-6R/IL-6, jenž je řízen cytomegalovirovým promotorem (CMV) a kde uvedená sekvence DNA kódující uvedený chimérový protein SIL-6R/IL-6 se začlenila do linkerové sekvence kódující linkerový peptid v restrikčním místě EcoRI umístěném mezi sekvencí kódující část sIL-6R a sekvencí kódující část IL-6 proteinu.
Podobně vynález popisuje transformované savčí buňky obsahující vektor DNA, jak se popisuje shora v textu, který je schopen exprímovat sekvenci chimérového proteinu SIL-6R/IL-6, kterou nese uvedený vektor, a úpravy exprimovaného proteinu a jeho vylučování do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují.
V provedení těchto transformovaných buněk podle vynálezu se popisují lidské embryonální buňky ledvin 293 (HEK293) transfekované vektorem pcDNA sIL-6R/IL-6. Uvedené buňky jsou schopny exprimovat chimérový protein SIL-6R/IL-6, zcela upravit uvedený protein a vylučovat ho do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují. Uvedený protein je ve formě glykoproteinu o velikostí 85 000.
V jiném provedení transformovaných buněk podle vynálezu se popisují buňky CHO (buňky vaječníků čínských křečků) transfekované vektorem pcDNA SIL-6R/IL-6. Uvedené buňky jsou schopny exprimovat chimérový protein v cela upravené formě do kultivačního média, kde buňky rostou. Protein se vyskytuje ve formě glykoproteinu o přibližné velikosti 85 000.
Vynález dále popisuje způsob produkce chimérového proteinu nebo jeho biologicky aktivních analogů, jak se popisuje shora v textu, který zahrnuje kultivaci dříve v textu popsaných transformovaných buněk za podmínek vhodných pro expresi, úpravu a vylučování uvedeného proteinu nebo analogů do • 9 · ·
9 kultivačního média, ve kterém uvedené buňky rostou a čištění uvedeného proteinu nebo analogů z uvedeného kultivačního média imunoafinitní chromatografií za použití monoklonálních protilátek specifických pro SIL-6R.
Chimérový protein podle vynálezu má řadu použití, která zahrnuj í:
(i) Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo jeho analogů nebo jejich solí a jejich směsi, jako inhibitoru rakovinových buněk.
(ii) Použití, jak se popisuje v odst. (i) shora v textu, jako inhibitoru buněk silně maligního melanomu.
(iii) Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo jeho analogů nebo jejich solí a jejich směsi, jako aktivní složky umožňující štěp lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně.
(iv) Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo jeho analogů nebo jejich solí a jejich směsi, jako aktivní složky při zesílení krvetvorby při léčbě hepatických a neurologických poruch nebo při jiných aplikacích, kdy se používají IL-6 nebo sIL6R.
Podobně se chimérový protein podle vynálezu může použít při přípravě medikamentů vhodných pro řadu medicínských indikacích. Jmenovitě se chimérový protein sIL-6R/IL-6 nebo jeho ananlogy, jejich sole nebo jejich směsi mohou použít při přípravě medikamentů vhodných pro léčbu zhoubného bujení způsobem inhibice rakovinových buněk nebo při přípravě medikamentu vhodného pro zlepšení transplantace kostní dřeně způsobem umožňujícím štěp lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně nebo při přípravě medikamentu vhodného pro zesílení krvetvorby nebo pro léčbu neurologických poruch nebo pro aplikaci, tam kde se použije IL-6 nebo sIL6R.
Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jako aktivní složku chimérový protein sIL-6R/IL-6 nebo jeho analog, jak se popisuje shora v textu, a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo a ekcipient.
Provedení této farmaceutické kompozice podle vynálezu zahrnuj e:
(i) Farmaceutickou kompozici vhodnou pro léčbu zhoubného bujení u savců.
(ii) Farmaceutickou kompozici vhodnou pro zlepšení transplantace kostní dřeně.
(iii) Farmaceutickou kompozici pro léčbu poruch jater a neurologických poruch nebo po zesílení krvetvorby nebo pro jiné aplikace, při kterých se používá IL6 nebo sIL-6R
Vynález dále popisuje způsob léčby zhoubného bujení u savců nebo zlepšení transplantace kostní dřeně nebo léčby jaterních a neurologických poruch nebo zesílení krvetvorby nebo jiné aplikace, při kterých se používá IL-6 nebo SIL-6R. Tyto aplikace zahrnují aplikaci pacientovi farmaceutické kompozice, jak se popisuje shora v textu, ve vhodné dávkové formě a vhodným způsobem.
Aby se předešlo pochybnostem, vynález popisuje chiméru mezi IL-6 a SIL-6R v libovolném pořadí. To znamená, že pořadí N-terminální a C-terminální části se může obrátit a chimérou je pak protein IL-6-sIL-6R, ačkoli se zde označuje jako protein SIL-6R/IL-6.
Vynález popisuje chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy, které v podstatě mají všechny přirozeně se vyskytující formy sIL-6R a v podstatě všechny přirozeně se vyskytující formy IL-6 fúzované dohromady. Fúze probíhá prostřednictvím linkerového peptidu, jehož délku mohou tvořit pouze 3 aminokyseliny. Chimérový protein a jeho analogy mají podobné množství a patern glykosylace, jako přirozeně se • · ·
• · vyskytující sIL-6R a IL-6. Zjistilo se, že takový chimérový protein SIL-6R/IL-6 produkovaný v souladu s vynálezem v savčích buňkách, zvláště pak v lidských buňkách (popisuje se v příkladech 1 až 4 dále v textu) nebo v buňkách CHO (popisuje se v příkladu 6 dále v textu) se účinně exprimuje v uvedených buňkách, je vysoce glykosylován a vykazuje potencionální aktivitu na nádorové buňky, které nevykazují odezvu na žádný ze samotných IL-6 nebo sIL-6R.
V souladu s vynálezem se pozorovalo (popisuje se v příkladu 3 dále v textu), že dříve zmiňovaný chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle vynálezu způsobuje zablokování růstu vysoce maligních savčích buněk, jako jsou buňky melanomu F10.9 v koncentracích, které jsou nižší, než jsou koncentrace nutné v případě, kdy se používá směs nefúzovaných sIL-6R a IL-6. To je zvláště podstatný výsledek s ohledem na skutečnost, že buňky melanomu F10.9 nepřestávají v normálním případě růst, když se aplikují odděleně pouze IL-6 a sIL-6R. K zablokování jejich růstu dojde pouze, když se vystaví relativně vysokým dávkám kombinace nefúzovaného IL-6 a sIL-6R.
Chimérový protein sIL-6R/IL-6 podle vynálezu je překvapivě silnější inhibitor těchto buněk maligního melanomu, než směs jeho oddělených částí. To znamená směs nefúzovaného sIL-6R a IL-6. Chimérový protein podle vynálezu je zvláště možné použít, jako aktivní složku léčby různých druhů zhoubného buj ení.
Vyšší aktivitu chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 způsobuje vyšší aktivita gpl30 ve srovnání se směsí nefúzovaného IL-6 a sIL-6R (popisuje se v příkladu 7).
Dále se také zjistilo v souladu s vynálezem (popisuje se v příkladu 4 dále v textu), že chimérová molekula SIL-6R/IL-6 podle vynálezu je zvláště použitelná při zlepšení transplantace kostní dřeně. Použití známého protokolu pro provedení štěpu lidských buněk kostní dřeně u těžce imunodefictiních myší (SCID), kde faktor kmenových buněk (SCF) • ·
a Flt3-ligand se používá pro umožnění přežití a pomnožení nejprimitivnějších pluripotenciálních krvetvorných kmenových buněk, umožňuje dlouho přetrvající štěp kostní dřeně. Zjistilo se, že tyto dva faktory SCF a Flt3-ligand nejsou dostatečné, aby vyvolaly štěp lidských buněk do kostní dřeně recipientních myší a že pouze po přidání chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 je štěp úspěšný. Toto zjištění indikuje, že chimérový protein může být podstatný při provedení takových protokolů pro zavádění štěpů. Ve stejných experimentech, když se přidaly odděleně nefúzovaný IL-6 a sIL-6R, se zjistilo, že nejsou dostatečné pro úspěšnou transplantaci kostní dřeně a když se přidaly společně, jsou daleko méně aktivní ve srovnání s chimérovým proteinem SIL-6R/IL-6. To znamená, že chimérový protein sIL-6R/IL-6 v koncentraci 100 ng/ml zaručil úspěšnou transplantaci kostní dřeně, zatímco dvě oddělené nefúzované části sIL-6R a IL-6 v případě, že se přidaly společně v dokonce ve vyšší koncentraci (koncentrace sIL-6R je v rozmezí 125 až 1259 ng/ml, koncentrace IL-6 je v rozmezí 50 až 200 ng/ml) jsou méně aktivní při průběhu uvedené transplantace.
Shora uvedený chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle vynálezu je přednostně rekombinantní glykosylovaná chiméra SIL-6R/IL-6 produkovaná v lidských buňkách nebo v libovolném jiném savčím buněčném expresívním systému, jako jsou buňky křečků CHO, které jsou schopny glykosylovat proteiny, jak to provádějí lidské buňky a které také provádějí stejné post-translační modifikace. Důležitou charakteristikou je, že takto produkovaný chimérový glykoprotein se zpracovává a upravuje stejným způsobem, jako je tomu u přirozených molekul sIL-6R a IL-6, které se nacházejí v lidském těle, aniž dochází ke zkrácení a k přidání dalších nepřirozených polypeptidových sekvencí. Výjimku tvoří začlenění velmi krátkého tripeptidu nebo delšího linkerového peptidu mezi části sIL-6R a IL-6 chimérového proteinu.
Aby se připravil shora uvedený preferovaný chimérový protein podle vynálezu, zvažují se následující rysy přirozeně se vyskytujících sIL-6R a IL-6:
Je známo, že IL-6R přítomný v lidských buněčných membránách se produkuje pomocí cDNA kódující 468 aminokyselin, která obsahuje signální peptid, oblast podobnou imunoglobulinu, oblast vázající cytokin, trans-membránovou oblast a cytoplazmatickou doménu (Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T and Kishimoto T. Cloning and expression of the human Interleukin-6 (BSF-2/Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1988). Rozpustná forma sIL-6R se našla v tělních tekutinách, které mají, podobně jako zralý IL-6R z membrán, N-konec odpovídající Leu-20 (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner 0, Revel M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokine receptors from normál urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337, 1990) a C-konec odpovídající Val-359 právě před transmembránovou oblastí IL-6R (US patent č. 5,216,128 a EP 413.908 Bl). Za účelem fúze sekvence sIL-6R s IL-6 se zavedlo za polohu Val-356 restrikční místo EcoRI. Sekvence IL-6 začínající v poloze Pro-29 cDNA IL-6 a končící Met-212 (Zilberstein A, Ruggieri R, Korn H. J and Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J. , 5: 2529-2537, 1986; Hirano T, Yasukawa K, Harada H, Taga T, Watanabe Y, Matsuda T, Kashima S, Nakajima K, Koyama K, Iwamatsu K, Tsunasawa S, Sakiyama F, Matsui H, Takahara Y, Taniguchi T and Kishimoto T. Complementary DNA for a novel interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulins. Nátuře, 234: 73-76, 1986) se zavedla tak, aby následovaly za tímto restrikčním místem EcoRI. V tomto restrikčním místě EcoRI se může také nacházet, ale ne nezbytně, linkerový peptid požadované délky, který od sebe odděluje v chimérovém proteinu části SIL-6R/IL-6. Jak se popisuje v příkladech dále v textu, vytvořily se dva odlišné chimérové proteiny, jako příklady možných chimérových proteinů. Jeden má tripeptidový linker a druhý vykazuje linker s 13 aminokyselinovými zbytky v restrikčním místě EcoRI. Oba proteiny jsou v podstatě stejně biologicky aktivní.
Vynález také zahrnuje analogy shora uvedeného chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 podle vynálezu, jehož analogy si ponechávají v podstatě stejnou biologickou aktivitu chimérového proteinu, který má v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6. Takovým analogem může být molekula s delecí 30 aminokyselinových zbytků, adicí nebo substitucí jiných zbytků v částech SIL-6R a/nebo IL-6 chimérového proteinu. Takové úpravy nemění podstatně biologickou aktivitu analogu chimérového proteinu s ohledem na samotný chímérový protein a část sIL-6R takových analogů si v podstatě ponechává přirozeně se vyskytující strukturu (před zpracováním, popisuje se na obrázku č. 3) signálního peptidu, oblasti podobné Ig, N-oblasti cytokinového receptoru, Coblasti cytokinového receptor a receptorové pre-membránové oblasti. Podobně takové analogy chimérového proteinu by si měly v podstatě zachovat přirozeně se vyskytující zralou formu části IL-6. Různé analogy se mohou od sebe a od základní molekuly chimérového proteinu (molekula obsahující v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6) nejvíce lišit v místě linkerového peptidu, který spojuje části sIL-6R a IL-6. Takový linker může obsahovat až 30 aminokyselin a slouží k oddělení částí SIL-6R a IL-6 v chimérovém proteinu. Co se týče takového linkeru, je nutné pečlivě vybrat jeho sekvenci (a také provést biologické testy ve vhodných standardních testech s každým takovým analogem) tak, že nedojde například k nesprávnému svinutí chimérového proteinu, který by nebyl aktivní, nebo nedojde ke vzniku analogu chimérového proteinu, který je imunogenní a vyvolává tak u • ·· ·· » ΦΦ ♦ · Φ ♦ · · · r φ · · φ » * · >
• · ΦΦΦ · » · Φ Φ Φ β * φ • ♦ « ΦΦ Φ · · ·> φ • Φ Φ ·Φ ·· φ «φ «φ pacienta, kterému se aplikuje, protilátky nebo nevznikne analog, který by nebyl dostatečně účinný alespoň jako medikament s dlouhodobým nebo střednědobým účinkem.
Pokud jde o shora uvedené analogy chimérového proteinu podle vynálezu, jsou to analogy, kde jeden nebo vice a až 30 aminokyselinových zbytků základního chimérového proteinu podle vynálezu se nahradí odlišnými aminokyselinovými zbytky nebo se deletují nebo jeden nebo více aminokyselinových zbytků se přidá k původní sekvenci chimérového proteinu podle vynálezu (kterou tvoří v podstatě pouze přirozeně se vyskytující sekvence sIL-6R a IL-6), aniž se podstatně změní aktivita výsledných produktů ve srovnání se základním chímérovým proteinem podle .vynálezu. Tyto analogy se připravují známou syntézou a/nebo metodami místně řízené mutageneze nebo libovolnou jinou vhodnou známou metodou.
Libovolný takový analog má přednostně sekvenci aminokyselin dostatečně podobnou sekvencí základní chiméry SIL-6R/IL-6, aby vykazoval dostatečně podobnou aktivitu. Lze stanovit, zda libovolný daný analog má dostatečně stejnou aktivitu, jako základní chimérový protein podle vynálezu, způsoby rutinních experimentů. V takových experimentech se analog vystaví testům biologické aktivity, které se popisují dále v textu v příkladech 2 až 4.
Analogy chimérového proteinu, které se mohou použit v souladu s vynálezem, nebo nukleové kyseliny, které je kódují, zahrnují konečnou sadu dostatečně odpovídajících sekvencí, jako substituční peptidy nebo polynukleotidy, které může odborník běžně získat, aniž musí provést experimenty, na základě zde prezentovaných informací. Detailní popis chemie proteinu a struktury se uvádí v publikaci Schulz, G. E. et al., Principles od Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978 a Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman and Co., San Francísco, 1983. V publikaci Ausubel et al., paragraf A.l.l-A.1.24 a • · • * • · » · · · • ······· · • · · · · • · · · ·
A Laboratory Manual, 2 nd
Sambrook et al., Molecular Cloning:
Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk v dodatku C a D.
Preferované změny u analogů v souladu s vynálezem jsou ty, které jsou známy jako „konzervativní substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce aminokyselin v chimérovém proteinu, který má v podstatě přirozeně se vyskytující sekvence SIL-6R a IL-6, zahrnují synonymní aminokyseliny ve skupině, která vykazuje dostatečně podobné fyzikálně chemické vlastnosti, přičemž substituce mezi členy skupiny zachová biologickou funkci molekuly (popisuje se v publikaci Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)).
Je zřejmé, že začlenění a delece aminokyselin se může také provést do shora definovaných sekvencí, aniž se změní jejich funkce, zvláště jestliže začlenění nebo delece zahrnuje pouze několik aminokyselin, například méně než 30, upřednostňuje se méně než 10, přičemž se neodstraní nebo nenahradí aminokyseliny, které jsou nepostradatelné pro funkční konformaci, například cysteinové zbytky (popisuje se v publikací Anfinsen, „Principles That Govern The Folding of Protřen Chains, Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973)).
Analogy produkované takovou delecí a/nebo inzercí vyplývají 2 vynálezu.
Přednostně, skupiny synonymních aminokyselin jsou ty uvedené v tabulce I. Více se upřednostňují skupiny synonymních aminokyselin uvedené v tabulce II a nejvíce se upřednostňují skupiny synonymních aminokyselin, které jsou definované v tabulce III.
Tabulka č. 1: Preferované skupiny synonymních aminokyselin
Aminokyselina Synonymní skupina
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, Thr, Pro
• ·
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, Thr, pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn Gin, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
Tabulka č. II: Více preferované skupiny synonymních aminokyselin
Aminokyselina Synonymní skupina
Ser Ser
Arg Arg, Lys, His
Leu Ile, Phe, Met, Leu
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Met, Ile, Val
Gly Gly
• ·
Ile Met, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr Phe, Tyr
Cys Ser, Cys
His Gin, Arg, His
Gin Glu, His, Gin
Asn Asp, Asn
Lys Arg, Lys
Asp Asn, Asp
Glu Gin, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
Tabulka č. III: Nejvíce preferované skupiny synonymních aminokyselin
Aminokyselina Synonymni skupina
Ser Ser
Arg Arg
Leu Ile, Met, Leu
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Met, Leu, Ile
Phe Phe
Tyr Tyr
Cys Ser, Cys
His His
Gin Gin
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
• ·
• · • · · • · · · «
Glu Glu
Met Ile, Leu, Met
Trp Met
Příklady produkce aminokyselinových substitucí v proteinech, které se mohou použít za účelem získání analogů chimérového proteinu podle vynálezu zahrnují libovolné známé kroky metod, jak se popisují v US patentu RE 33, 653, 4,959,314, 4,588,585 a 4,737,462 ' (Mark et al.), 5,116,943 (Koths et al.), 4,965,195 (Namen et al.), 4,879,111 (Chong et al.) a 5,017,691 (Lee et al.) a lyzinem substituované proteiny uvedené v US patentu č. 4,904,584 (Shaw et al.).
V jiném preferovaném provedení vynálezu má libovolný analog chimérového proteinu vhodný pro použití podle vynálezu aminokyselinovou sekvenci v podstatě odpovídající aminokyselinové sekvenci shora v textu uvedeného základního chimérového proteinu podle vynálezu. Termín „v podstatě odpovídájící zahrnuje analogy s minoritními změnami sekvence základního chimérového proteinu, které neovlivňují jeho základní charakteristiky, zvláště jeho schopnost inhibovat prolíferaci rakovinových buněk nebo podporovat transplantace kostní dřeně. Typ změn, které v obecném případě spadají do „v podstatě odpovídající, jsou ty, které vznikly běžnými metodami mutageneze DNA kódující chimérový protein podle vynálezu, což vede k několika málo minoritním modifikacím a k testování požadované aktivity způsobem uvedeným shora v textu.
Analogy podle vynálezu zahrnují ty molekuly kódované nukleovou kyselinou, jako je DNA nebo RNA, která hybridizuje s DNA nebo RNA za přísných podmínek, kóduje chimérový protein v souladu s vynálezem a která obsahuje v podstatě všechny přirozeně se vyskytující sekvence kódující SIL-6R a IL-6. Takovými hybridizačními DNA nebo RNA mohou být například ty kódující stejný protein podle vynálezu, který vykazuje
například sekvencí uvedenou na obrázku č. 3, ale která se liší svou nukleotidovou sekvencí od přirozeně získané nukleotidové sekvence schopností degenerovat genetický kód. To znamená, že odlišná sekvence nukleové kyseliny může stále kódovat stejnou aminokyselinovou sekvenci, což způsobuje tato degenerace. Dále, jak je uvedeno shora v textu, množství změn aminokyselin (delece, adice, substituce) se omezuje až na přibližně 30 aminokyselin tak, že dokonce s maximálním množstvím změn analogy podle vynálezu budou ty, které si v podstatě zachovávají vedoucí sekvenci (před úpravou), oblast podobnou Ig, N- a C-oblasti cytokinového receptoru a receptorovou premembránovou oblast (oblast mezi C-oblastí a transmembránovou oblastí) v části SIL-6R a v podstatě celou část IL-6. Taková nukleová kyselina je primárním kandidátem pro stanovení, zda kóduje polypeptid, který si zachoval funkční aktivitu chimérového proteinu podle vynálezu. Termín „přísné podmínky znamená hybridizační a následné promývací podmínky, které odborník nazývá přísné (popisuje se v publikaci Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Intersence, N.Y., para 6.3 a 6.4 (1987, 1992) a Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk). Příklady přísných podmínek bez omezení zahrnují promývací podmínky při teplotě o 12 až 20 °C nižší než je vypočítaná Tm studovaného hybridu, například 2 x SSC a 0,5 % SDS po dobu 5 minut, 2 x SSC a 0,1 % SDS po dobu 15 minut; 0,1 x SSC a 0,5 % SDS při teplotě 37 °C po dobu 30 až minut a pak 0,1 x SSC a 0,5 % SDS při teplotě 68 °C po dobu až 60 minut. Odborník rozumí, že přísné podmínky také závisí na délce sekvencí DNA, oligonukleotidových sond (jako je 19 až 49 baží) nebo smíchaných oligonukleotidových sond.
Jestliže se používají smíchané sondy, preferuje se použití tetramethylamoniumchloridu (TMAC) místo SSC (popisuje se v publikací Ausubel, supra).
• ·
Termín „sole znamená sole karboxylových skupin a kyselinové adiční sole amino-skupin chimérového proteinu podle vynálezu nebo jejich analogy. Sole karboxylové skupiny se mohou tvořit způsobem, který je dobře znám v oboru, a zahrnují anorganické sole, například sole sodíku, vápníku, amoniaku, železa nebo zinku a podobně a sole s organickými bázemi, které vznikají například s aminy, jako je triethanolamin, arginin nebo lysin, piperidin, prokain a podobně. Kyselé adiční sole zahrnují například sole s minerální kyselinou, jako je například kyselina chlorovodíková nebo sírová a sole s organickými kyselinami, jako je například kyselina octová nebo kyselina šťavelová. Samozřejmě libovolné takové sole musí mít v podstatě stejnou aktivitu vztahující se k chimérovému proteinu podle vynálezu nebo k jeho analogům.
Vynález dále popisuje sekvence DNA kódující shora v textu uvedený chimérový protein podle vynálezu a jeho analogy, stejně jako vektory DNA nesoucí takové sekvence DNA vhodné pro expresi ve vhodných savčích buňkách. Upřednostňují se lidské buňky. Vektor podle vynálezu je plazmid pcDNA SIL-6R/IL-6 obsahující vektor pcDNA (Invitrogen) zahrnující fúzované sekvence SIL-6R/IL-6 řízené cytomegalovirovým promotorem (CMV).
Vynález také popisuje transformované savčí, přednostně lidské, buňky schopné exprimovat shora v textu uvedené proteiny podle vynálezu. Takové transformované buňky zahrnují lidské embryonální ledvinové buňky 293 (HEK 293, ATCC CRL 1573) transfekované pcDNA SIL-6R/IL-6, které vylučují fúzovaný chimérový glykoprotein SIL-6R/IL-6 o molekulové hmotnosti 85 000 .
V dalším provedení vynálezu se popisuje plazmid pcDNA sIL6R/L/IL-6, který se liší od shora v textu popsaného pcDNA sIL6R/IL-6 začleněním krátkých linkerů, které kódují 10 dalších aminokyselin, do restrikčního místa EcoRI. Za účelem • · · · · · · optimalizace vzdálenosti mezi sIL-6R a IL-6 je možné zavést řadu různých sekvenci různé délky.
Vynález také zahrnuje chimérový protein, ve kterém část IL-6 předchází sIL-6R (zobrazeno na obrázku č. 11).
Vynález dále popisuje způsob produkce a čištění chimérového proteinu podle vynálezu nebo jeho analogy, který zahrnuje kultivaci shora uvedených transformovaných buněk za podmínek vhodných pro expresi a vylučování chimérového proteinového produktu do kultivačního média a pak čištění vylučovaného proteinu imunoafinítní chromatografií za použití anti-sIL-6R monoklonálních protilátek 34.4, jak se popisuje v příkladu 2 a 5 dále v textu.
Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující jako aktivní složku chiméru SIL-6R/IL-6 nebo její analogy nebo jejich směsi nebo sole a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo ekcipient. Provedení farmaceutické kompozice podle vynálezu zahrnuje farmaceutickou kompozici pro zesílení působení typu IL-6, pro léčbu zhoubného bujení, pro transplantaci kostní dřeně, pro zesílení krvetvorby, pro léčbu neurologických poruch, pro léčbu poruch jater a pro jiné aplikace IL-6 nebo příbuzných cytokinů.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu se pro aplikaci připravují smícháním chimérového proteinu nebo jeho analogů s fyziologicky přijatelnými nosiči a/nebo stabilizátory a/nebo ekcipienty a připravují se v dávkové formě například lyofilizací ve zkumavkách. Způsob aplikace se děje v libovolných přijatelných módech vhodných pro podobná činidla a bude záviset na stavu, který se léčí. Aplikace probíhá intravenóznš, intramuskulárně, podkožně, lokální injekcí nebo povrchovým nanesením nebo nepřerušovaně infúzí atd.. Množství aktivní látky, která se má aplikovat závisí na způsobu aplikace, léčeném onemocnění a stavu pacienta. Lokální injekce například bude vyžadovat menší množství proteinu vzhledem ke hmotnosti ve srovnání s intravenózní infuzí.
Vynález také popisuje použití chimérového proteinu podle vynálezu nebo jeho analogů nebo směsí pro léčbu zhoubného bujení, pro transplantace kostní dřeně, zesílení krvetvorby, pro léčbu neurologických stavů, pro ochranu tkáně jater u pacientů s nekrózou způsobenou chemikáliemi (například chlorid uhličitý, alkohol, paracetamol) nebo jiné případy (například virové, chirurgické nekrózy) a pro použití při jiných aplikacích IL-6 nebo příbuzných cytokinů. Podobně vynález popisuje chimérový protein nebo jeho analogy nebo směsi pro použití při přípravě medikamentů pro léčbu shora uvedených stavů nebo pro použití ve shora uvedených indikacích.
Vedle shora uvedených metod léčby vynález zahrnuje tako ex vivo postupy a genovou terapii s chimérou a/nebo s DNA ji kóduj icí.
Popis obrázků na výkrese
Na obrázku č. 1 se nachází schéma různých vektorů, činidel a kroků používaných při konstrukci chimérové molekuly DNA kódující chimérový protein, ve kterém po konzervativní struktuře přirozené formy SIL-6R končící zbytkem Val 356 následuje sekvence přirozené, upravené formy IL-6. Detailněji se popisuje v příkladu 1.
Na obrázku č. 2 (A, B) jsou zobrazeny výsledky získané z analýzy, která se uskutečnila za účelem identifikace chiméry sIL-6R5Val/IL-6 p86 elektroforézou na polyakrylovém gelu (A) a na základě profilu bioaktivity (B). Obrázek č. 2A ukazuje gel obarvený podle Comassie, na kterém se analyzovaly imunologicky čištěné frakce vymyté z kolony afinitní chromatografie, na kterou se nanesl vzorek vylučovaného proteinu získaného z buněčných kultur transfekovaných vektorem, který kóduje chimérový protein. Obrázek č. 2B zobrazuje graf biologické aktivity (inhibice růstu buněk melanomu F10.9) každé ze shora • · · · · • · · · • · · * • ·
uvedených frakcí vymytých z kolon afinitní chromatografie. Detailněji se popisuje v příkladech 2 a 3.
Obrázek č. 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvencí (jednopísmenný kód) chiméry sIL-6R8Val/IL-6, kde jsou znázorněny různé oblasti molekuly zahrnující N-terminální signální peptid (linka nad sekvencí), oblast podobnou imunoglobulinu (Ig-like), N-oblast receptoru cytokinu (podtrženo), C-oblast cytokinu (linka nad sekvencí) a receptorovou pre-membránovou oblast (oblast mezi C-oblastí a trans-membránovou oblastí), celou část sIL-6R chiméry, stejně jako upravenou část IL-6 (podtrženo) chiméry, jak se popisuje v příkladu 1 a 2.
Na obrázku č. 4 (A, B) je fotografie melanomových buněk F10.9 v kultuře, aniž se aplikuje chimérový protein (A) a při aplikaci (B) chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 po dobu 4 dní. Na obrázku č. 4B jsou patrné morfologické změny vyvolané v takových buňkách metastáz melanomu (buňky F10.9) aplikací chiméry sIL-6R/IL-6, jak se popisuje v příkladu 3.
Na obrázku č. 5 je graf reprezentující výsledky inhibice růstu buněk melanomu F10.9 chimérovým proteinem sIL-6R/IL-6 při různých koncentracích chiméry, které se pohybují v rozmezí přibližně 0,12 ng/ml až 150 ng/ml, kde se chiméra s linkerem IL-6RIL-6 obsahující pouze 3 aminokyseliny, jak se popisuje v příkladu 3 porovnává s chimérou s linkerem obsahujícím 13 aminokyselin (IL-6RLIL-6).
Obrázek č. 6 je graf výsledků znázorňující absenci účinků inhibice růstu na buňky melanomu F10.9 při aplikaci buď samotného izolovaného IL-6 (čárkovaná horní křivka vyznačená prázdnými čtverci) při koncentrací v rozmezí 0 až 40 ng/ml IL6 nebo samotného sIL-6R (bod konvergence všech křivek na vertikální ose, kde koncentrace IL-6 je nulová). Dále graf znázorňuje pozorované účinky inhibice růstu , kdy IL-6 a sIL6R se přidá dohromady, ale v rozdílných koncentracích každé složky, kde koncentrace IL-6 je v rozmezí 10 ng/ml až 40 ng/ml • ♦ a SIL-6R se přidá ve třech koncentracích 100 ng/ml, 200 ng/ml a 400 ng/mlv případě každé koncentrace IL-6, což zobrazují tři spodní křivky (dvě přerušované značené křivky s prázdnými trojúhelníky a kolečky a křivka znázorněná nepřerušovanou čarou s plnými čtverci), jak se popisuje v příkladu 3.
Obrázek č. 7 znázorňuje autoradiogram Southernova blotu ukazující nutnost přítomnosti chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 při úspěšném štěpu lidských krvetvorných kmenových buněk během transplantace kostní dřeně u myší SCID-NOD (dvě dráhy po pravé ruce reprezentují myši, kterým se aplikoval chimérový protein SIL-6R/IL-6 spolu s dalšími nezbytnými faktory, SCF, FLT-3 a naopak tři dráhy po levé ruce reprezentují myší, kterým se aplikoval pouze SCF a FLT-3 a SCF, FLT-3 stejně jako izolovaný, to znamená ne fúzovaný, IL-6 a sIL-6R), jak se popisuje v příkladu 4.
Obrázek č. 8 znázorňuje Scatchardův graf afinítních charakteristik chiméry sIL-6R/IL-6 ve srovnání se směsí IL-6 a SIL-6R. Hodnoty spojené s chimérou jsou označeny plnými čtverci a hodnoty spojené se směsí jsou označeny kosočtvercem, poměr sklonu je 4:1.
Obrázek č. 9 znázorňuje vyšší aktivitu chiméry SIL-6R/IL-6 v případě buňky melanomu F10.9 ve srovnání s jednou ze směsí SIL-6R + IL-6 nebo s jedním z SIL-6R (bez IL-6).
Obrázek č. 10 znázorňuje ochranu chimérou sIL-6R/IL-6 proti toxickým účinkům na játra. Hodnoty reprezentují průměr čtyř experimentů. Plné čtverce reprezentují myší IL-6-/-, plné kosočtverce reprezentují myši IL-6-/-, kterým se aplikoval IL6 a plné hvězdy reprezentují myši IL-6-/-, kterým se aplikovala chiméra.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Konstrukce expresívního vektoru chiméry sIL6RóVal/IL-6
Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma kroků při konstrukci expresívniho vektoru, který nese sekvenci kódující chimérový protein sIL-6RóVal/IL-6. Schéma zahrnuje všechny různé počáteční a intermediární vektory, různá činidla a reakční kroky. Postup konstrukce je v podstatě použití metod, které jsou dobře známy v oboru a slouží ke konstrukci expresívních vektorů (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York).
Knihovna cDNA z buněk T47D lidského karcinomu prsu se klonovala do bakteríofága lambda (X)gtll a testovala se oligonukleotidovými sondami odvozenými od sekvence IL-6R (popisuje se v publikaci Yamasaki K, Taga T, Hirata Y, Yawata H, Kawanishi Y, Seed B, Taniguchi T, Hirano T and Kishimoto T. Cloning and expression of the human Interleukín-6 (BSF2/Interferon beta-2) receptor. Science, 241: 825-828, 1988). Izoloval se jeden klon cDNA (X)gtll, který nese celou sekvenci kódující lidský IL-6R. Tento inzert se z (Á)gtll vystřihl restrikčním enzymem EcoRI a klonoval se do vícenásobného klónovacího místa (MCS) fágemidu E. coli Blue Script pBS/SK (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, California). Tento plazmid pBS/SK-IL-6R (obrázek č. 1) se štěpil restrikčním enzymem EcoRI, pak se konce fragmentu upravily na tupé konce a znovu se štěpil restrikčním enzymem EcoRV za vzniku 5'fragmentu IL-6R o velikosti 959 párů baží (bp), který končí restrikčním místem EcoRV IL-6R (koordináta 1203) . Tento fragment extrahovaný z agarózového gelu elektroforézy se klonoval do nového vektoru pBS/Sk otevřeného v restrikčním místě EcoRV MCS (pBS/SK-sIL-6R-RV zobrazen na obrázku č. 1).
Jak se popisuje shora v textu, dříve získaná DNA pBS/SKIL-6R se použila pro PCR za účelem amplifikace fragmentu o velikosti 368 bp mezi forvard primerem 1137-1156 a reverzním prímerem 1505-1488. Reverzní primer se syntetizoval s restrikčním místem EcoRI, které bezprostředně následuje po
kodónu pro valin-356 IL-6R (zobrazeno na obrázku č. 1). Dříve se určilo, že valinový zbytek je aminokyselin C-konce přirozené formy rozpustného SIL-6R vylučovaného do lidské moči (Novick D, Englemann H, Wallach D, Leitner 0, Revel M and Rubinstein M. Purification of soluble cytokíne receptors from normál urine by ligand-affinity and immunoaffinity chromatography. J. Chromatogr., 510:331-337, 1990; Oh J-W,
Revel M and Clebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encode by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401409, 1996; US patent č. 5,216,128 a EP patent č. 413908 Bl).
Produkt PCR se štěpil restrikčními enzymy EcoRV a EcoRI a ligoval se do pBS/SK-sIL-6R-RV mezi restrikční místa EcoRV v IL-6R a EcoRI MCS (zobrazeno na obrázku č. 1). Výsledný plazmid pBS-sIL-6R-5Val-RI se pak zkrátil tak, že se odstranily 5'nepřekládané sekvence ligací restrikčního místa HindlII MCS s místem Ncol v místě páru baží 410 IL-6R (konce obou míst se nejdříve upravila na tupé konce). Vznikl pBS-sIL-6R-5Val-RINcol (zobrazeno na obrázku č. 1).
Sekvence IL-6 se získala z plazmídu ρΚΚβ2-7, který se, jak se uvádí dříve (Chen L. , Mory Y, Zilberstein A and Revel M. Growth inhibition opf human breast carcinoma and leukemia/lymphoma cell lineš by rekombinant interferon-beta 2/IL-6. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 8037-8041, 1988) inzercí cDNA IFN~P2/IL-6 štěpené restrikčním (Zilberstein A, Ruggieri R, Korn H. J and Revel
M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growthzkonstruoval enzymem BstNI stimulatory cytokines. EMBO J.
2529-2537, 1986:
do restrikčního místa EcoRI expresívního vektoru pKK223-3 E. coli (Pharmacia, Uppsala, Sweden) za použití syntetického oligonukleotidu s restrikčním místem EcoRI, po němž následuje kodón methioninu a kodón pro prolin-29 IL-6 a končící v restrikčním místě BstNI (EcoRII). Inzert cDNA IL-6 ρΚΚβ2-7 • · končí 7 párů baží po terminačním kodónu v místě NlalV a o 11 bp dále následuje restrikční místo HindlII vektoru pKK223-3 (zobrazeno na obrázku č. 1). DNA ρΚΚβ2-7 se štěpila restrikčním enzymem HindlII. Konce fragmentu se upravily na tupé konce a fragment se znovu štěpil restrikčním enzyme EcoRI a cDNA IL-6 se začlenila do pBS-sIL-6R-5Val-RI-NcoI tak, že fúzovala přirozená sekvence IL-6 (počátek v poloze prolin-29) bezprostředně po valinu-356 částí IL-6R. Sekvence jsou odděleny pouze třemi kodóny (Glu-Phe-Met). Výsledný plazmid pBS/SK-sIL-6R/IL-6 (obrázek č. 1) se pak znovu štěpil v restrikčních místech Sáli a Notl jeho MCS a inzert se klonoval do restrikčního místa EcoRV pcDNA3 (Invitrogen Corporation, San Diego, California). Výsledný plazmid pCDNA3SIL-6R/IL-6 (obrázek č. 1) obsahuje inzert po směru exprese genu silného cytomegalovirového promotoru (CMV) a pak následuje polyadenylační místo, které zaručuje účinnou transkripci chiméry sIL-6R-5Val/IL-6. Konzervace 5'konce SIL-6R v chiméře zaručuje, že při expresi v savčích buňkách je signální peptid funkční a zpracování N-konce chimérového proteinu bude stejné jako u přirozeného SIL-6R.
Jak se uvádí shora v textu výhodnou charakteristikou konstrukce sIL-6R-óVal/IL-6 je, že je v podstatě fúzí přirozené formy sIL-6R přirozené formy IL-6, jak se nacházejí v lidském těle, bez dalších peptidových sekvencí. Konzervace v konstrukci sIL-6R-5Val/IL-6 (zobrazeno na obrázku č. 1) však jednoduše umožňuje zavést linkerové polypeptidové segmenty mezi části SIL-6R a IL-6. Vytvořila se jedna taková konstrukce s linkerovou sekvencí obsahující 13 aminokyselin Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-LeuGly-Gly-Gln-Phe-Met zavedenou mezi Val-356 SIL-6R a Por-29 IL6 (sIL-6R-5Val/L/IL-6).
restrikčního místa
EcoRI
Příklad 2: Exprese chiméry sIL-6R-5Val/IL-6 v lidských buňkách •« · · · · ·
·· · ·· »·
Za použití v podstatě standardních metod kultivace savčích buněk, transfekce buněk a analýzy transfekovaných buněk, kdy se zjišťovala exprese nově zavedené sekvence DNA (postupy se popisují například v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York) se shora v textu uvedená plazmidová konstrukce (popisuje se v Příkladu 1) použila při transfekci lidských buněk a posuzovala se její exprese.
Lidské buňky HEK 293 (ATCC CRL 1573, transformované primární lidské embryonální ledvinové buňky) se transfekovaly konstrukcí pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA (popisuje se v příkladu 1 shora v textu) . Kultura buněk HEK 293 v log fázi se ošetřila trypsinem a buňky se nanesly na plotny Nunc o velikosti 9 cm (2,5 χ 106 buněk/plotnu) . 0 jeden den později proběhla transfekce s 10 pg pCDNA3-sIL-6R/IL-6 DNA postupem precipitace s CaPO4 (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York) a o hodinu později se kultivační médium nahradilo DMEM-10 % FCS a kultivace pokračovala po dalších 16 hodin. Po výměně kultivačního média za DMEM-10% FCS, se shromáždily vylučované proteiny během dvou po sobě jdoucích period o délce 48 hodin. Debris se odstranil centrifugací při 1000 ot./min. po dobu 10 minut a v supernatantu se testovala testem ELISA přítomnost sIL-6R za použití polyklonálních králičích protilátek proti SIL-6R a myších McAB 17.6 (Novick D, Engelmann H, Rvel M. Leitner O and Rubenstein M. Monclonal antibodies to the soluble 11-6 receptor: affinity purifications, ELISA and inhíbítíon of ligand binding. Hybridoma, 10: 137-146, 1991). Zjistila se přítomnost sIL-6R ekvivalentů v koncentraci 1,2 gg/ml, což ukazuje na velmi účinou expresi chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 v transfekovaných lidských buňkách.
Vylučovaný chimérový protein (sIL-6R/IL-6) se čistil imunologickou cestou pomocí monoklonálních protilátek 34.4 • · » *
• · · specifických pro epitop v extracelulární oblasti lidského sIL6R (Novick D, Engelmann H, Rvel M. Leitner 0 and Rubenstein M. Monclonal antibodies to the soluble 11-6 receptor: affinity purifications, ELISA and inhibition of ligand binding. Hybridoma, 10: 137-146, 1991; Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chenath J. Epitop peptides from interleukin-6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135-143, 1995). Buňky hybridomu 34.4 se kultivovaly v peritoneální dutině myši a imunoglobulinová frakce (Ig) se získala z ascitové tekutiny precipitací se síranem amonným. K imobilizaci McAB 34.4 se použil Affigel-10 (Bio-Labs, Richmond, California) (15 mg Ig se spojilo s 1 ml přípravku Affigel-10). Supernatanty obsahující proteiny vylučované z buněk HEK 293 transfekované pCDNA3-sIL-6R/IL-6 se adsorbovaly na kolony s McAB 34.4 (kolona o objemu 0,3 ml slouží pro 15 ml supernatantu) . Po promytí PBS se navázané proteiny vymyly 25 mM kyselinou citrónovou pH 2,5 a bezprostředně potom se neutralizovaly 1 M pufrem Hepes pH
8,5. Přes noc proběhla dialýza (přibližně 8 až 12 hodin) proti PBS.
Analýza imunologicky čištěného proteinu elektroforézou na polyakrylovém gelu v SDS ukázala jediný proteinový pruh obarvený modří podle Coomassie (obrázek č. 2). Molekulová hmotnost proteinu je 85 000, jak se odhadlo z fúze glykosylované formy sIL-6R5Val (v publikaci Oh J-W, Revel M and Clebath J. A soluble interleukin-6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encode by a differentially spliced mRNA. Cytokine, 8: 401-409, 1996; se uvádí molekulová hmotnost je 60 000 ) a glykosylované formy IL-6 (v publikaci Zilberstein A, Ruggieri R, Korn H. J and Revel M. Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2 a distinct species inducible by growthstimulatory cytokines. EMBO J. , 5: 2529-2537, 1986; se uvádí molekulová hmotnost 23 000 až 26 000) . Aminokyselinovou • <· » · · » * sekvenci SIL-6R/IL-6 tvoří 543 aminokyselin. Po zpracování signálních peptidů vznikne protein tvořený 524 aminokyselinami nebo s molekulovou hmotností přibližně 58 000 (obrázek č. 3) . Daleko větší velikost chiméry SIL-6R/IL-6 produkované z rekombinantní DNA v lidských buňkách ukazuje, že glykosylace tvoří výraznou část velikosti molekuly.
Příklad 3: Chiméra SIL-6R/IL-6 brání růstu a vyvolává diferenciaci metastázujících buněk melanomu
Klon F10.9 získaný z buněk B16 melanomu tvoří vysoce metastázující nádory u myší C57Black/6. Zvířata umírají na základě výskytu pulmonárních metastáz ve dvou až třech měsících (Katz A, Shulman L. M, Porgador A, Revel M, Feldman M and Eisenbach L. Abrogation of B16 malanoma metastases by long-term low-dose Interleukin-6 therapy. J. Immunother. 13: 98-109, 1993). Vedle chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 kultura buněk F10.9 produkuje zjištěné morfologické změny a blokuje jejich růst (obrázek č. 4). Buňky F10.9 ošetřené chimérou se prodlužují vystupujícím dendritickým prodloužení a podobají se vřetenovité diferenciaci gliových buněk.
embryonálních melanocytů nebo
Růst buněk se hodnotí čtyři dny po nanesení 3 χ 103 buněk do prohlubně mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi. Buňky se kultivují v kultivačním médiu RPMI 1640 s 10 % FCS o objemu 0,2 ml. Buňky se fixovaly v 12,5 % glutaraldehydu po dobu 30 minut, promyly se vodou a barvily se 0,1 % krystalickou violetí po dobu 30 minut. Po promytí a usušení se barvivo extrahovalo 10 % kyselinou octovou a stanovila se optická hustota při vlnové délce 540 nm. Chiméra inhibovala růst v závislosti na dávce. K úplné inhibici růstu dochází při koncentraci 10 ng/ml chimérového proteinu (p85) (zobrazeno na obrázku č. 5). Oba chimérové proteiny sIL-6R5Val/IL-6 a sIL6R5Val/L/IL-6 (chiméra s delším linkerem mezi sIL-6R a IL-6, popisuje se v příkladu 1) vykazují stejnou aktivitu. Tento • · · β £ ·»··· ·· · · · výsledek také ukazuje, že linkerový peptid mezi částmi sIL-6R a IL-6 v chiméře není pro aktivitu chiméry podstatný. Shora v textu uvedená chiméra sIL-6R8Val/IL-6 má pouze velmi krátký linker tvořený pouze 3 aminokyselinami, zatímco chiméra sIL6R8Val/L/IL-6 má delší linkerový peptid tvořený 13 aminokyselinami, přičemž obě chiméry vykazují v podstatě stejnou aktivitu při inhibici růstu metastázujících buněk. Naopak ani samotný IL-6 ani samotný sIL-6R8Val neinhibují růst těchto melanomových buněk (zobrazeno na obrázku č. 6), což demonstruje jedinečnou aktivitu chimérového proteinu sIL6R/IL-6 (p85). Aby se získal podobný účinek, je nutné použít směs obsahující 200 až 400 ng/ml IL-6 a 125 ng/ml sIL-6R8Val (zobrazeno na obrázku č. 6). Pro maximální inhibici buněk F10.9 je nutné použít 7,5nM IL-6 a 2 nM sIL-6R8Val ve srovnání s pouze 0,12 nM chimérou SIL-6R/IL-6.
Během imunologického čištění na koloně s McAB 34.4 (popisuje se v Příkladu 2) se sledovala inhibiční aktivita růstu chimérového proteinu p85 SIL-6R/IL-6. Patern aktivity odpovídal intenzitě pruhu proteinu p85, který se objevil v různých frakcích na elektroforetickém SDS polyakrylamidovém gelu na obrázku č. 2.
Příklad 4: Chiméra sIL-6R/IL-6 je podstatná při ujmutí štěpů transplantovaných buněk kostní dřeně.
Přijetí krvetvorných kmenových buněk z kostní dřeně se může studovat po transplantaci do těžce imunodeficitních (SCID) myší (Vormoor J, Lapidot T, Pflumio F, Risdon G, Patterson B, Broxmeyer Η. E and Dick J. E. SCID mice as an in vivo model of human cord blood hematopoiesis. Blood cells 20: 316-320, 1994). Myši SCID-NOD se vystavily subletálnímu ozáření a do ocasní žíly se injekcí zavedlo 3 χ 105 buněk CD34+ lidské kostní dřeně. Před injekcí se buňky CD34+ držely po dobu 3 dní v kapalné kultuře při různých kombinacích cytokinů. Po jednom měsících se myší usmrtily a z kostí se shromáždily • · buňky kostní recipientních buněk u
Southernovou dřeně. Ujmutí štěpů lidských myší SCID-NOD se hodnotilo hybridizací s repeticemi lidské DNA.
Zjistilo se, že faktor kmenových buněk (SCF, ckit-ligand) a Flt3-ligand (flt3/flk2 ligand receptoru tyrozinové kinázy) je důležitý pro přežití a proliferaci nejprimitivnějších pluripotenciálních krvetvorných kmenových buněk vhodných pro dlouhodobé štěpy v recipientu kostní dřeně (McKenna H.J, de Vries P, Brasel K, Lyman S. D. and Williams D. E. Effect of flt3 ligand on the ex vivo expansion of human CD34 + hemtopoietic progenitor cells. Blood 86: 3413-3420, 1995). Jak je možné spatřit na obrázku č. 7 tyto dva faktory samostatně nejsou dostačující, aby vyvolaly přijetí štěpu lidských buněk v kostní dřeni recipientních myší SCID-NOD. Aby došlo k dostatečnému přijetí štěpu je nutné přidat chimérový protein SIL-6R/IL-6. Při koncentraci 100 ng/ml chiméra SIL-6R/IL-6 je daleko více aktivní ve srovnání s IL-6 (v koncentraci 50 až 200 ng/ml) a sIL-6R (v koncentraci 125 až 1250 ng/ml) (obrázek č. 7). Nutnost chiméry SIL-6R/IL-6.indikuje, že tento protein je v podstatný pro přežití a proliferaci pluripotencionálních krvetvorných kmenových buněk, které mohou znovu obsadit prostředí kostní dřeně, což indikuje, že tento protein se může použít při klinických protokolech při transplantaci kostní dřeně.
Toto je první demonstrace, že chiméra SIL-6R/IL-6 má následující alespoň dvě nově nalezené aktivity:
(i) Když se přidá dohromady s oběma faktory SCF a
Flt3-ligandem k lidským krvetvorným primitivním progenitálním buňkám, podpoří jejich přežití a proliferaci a 'ii) ie aktivní (a zjevně podstatná) v modelu in vivo lidské kostní dřeně je aktivní (a transplantace v imunodeficitních myších.
• ·
..... ... ...
Příklad 5: Chiméra SIL-6R/IL-6 je aktivní v případě vysoce čistých primitivních krvetvorných kmenových buněk.
Za účelem přípravy 80 % čisté populace buněk CD34 + se lidské chordové krevní jednobuněčné buňky rozdělily na jednobuněčné buňky s nízkou hustotou (NMC) na Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) , pak se použil kit MACS (Miltney Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Tyto buňky pak prošly přes imobilizované monoklonální protilátky proti CD38 nebo se roztřídily pomocí třídění fluorescencí aktivovaných buněk a získala se populace CD34+CD38-, což odpovídá přibližně 0,1 % původních buněk. Tyto čištěné kmenové buňky (20 000 buněk) se umístily do suspenzních kultur do kultivačního média RPMI o objemu 0,5 ml, 10 % fetální telecí sérum (FCS), 1% bovinní sérový albumin obsahující 50 ng/ml faktoru kmenových buněk (SCF) a 100 ng/ml flt3-ligandu (FL) (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Polovina kultury se doplnila chimérou sIL6R/IL-6 o koncentraci 100 ng/ml, další se kultivovaly bez přítomnosti chiméry. Inkubace proběhla při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % C02 po dobu 6 dní. Počet znovu obsazených buněk kostní dřeně se hodnotil tak, že se sub-letálně ozářeným myším NOD-SCID zavedly injekcí (i.v.) všechny buňky z těchto in vitro kultur. Myši se udržovaly v prostředí bez mikrobů. Po šesti týdnech se myši usmrtily a z jejich dlouhých kostí se získala kostní dřeň. Tyto buňky kostní dřeně (BM) se nanesly na semi-pevné plotny s 0,9% methylcelulosou s 30 % FCS, 50 μΜ β-merkaptoethanolem, 50 ng/ml SCF, 5 ng/ml IL-3, 5 ng/ml GMCSF, 6 u/ml erythropoietinu (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Kultury obsahovaly také lidské sérum a kultivace probíhala za podmínek, které brání růstu myších kolonií. Výsledky (tabulka č. IV) indikovaly, že při přidání chiméry sIL-6R/IL-6 do suspenzních kultur dochází k 30'až 50 násobnému zvýšení počtu lidských buněk, které tvoří kolonie (CFU), získaných z myší, u kterých proběhla transplantace, ve srovnání se samotným SCF a FL. To reprezentuje velké zvýšení počtu kmenových buněk, které
znovu obsadily SCID v suspenzních kulturách 6. den ve srovnání s 0. dnem. V nepřítomnosti chiméry SIL-6R/IL-6 SCF a FL neprodukují zvýšené množství kmenových buněk během 6-ti dnů kultivace suspenzní kultury. DNA buněk BM získaná z transplantovaných myší NOD/SCID se analyzovala Southernovým přenosem, jako v příkladu 4. Množství získané lidské DNA bylo 10 krát vyšší než u myší, kterým se aplikovaly buňky kultivované v přítomnosti chiméry.
Progenitory CFU z kostní dřeně myší NOD/SCID, jak se uvádí v tabulce č. IV, byly příčinou zvýšení krvetvorných buněk různých myeloidů (makrofág a granulocyt) stejně jako erythroidů a lymfoidů (např. CD19+, CD56+) pouze, když lidské krevní buňky se před transplantací kultivovaly s chimérou sIL6R/IL-6.
Tabulka IV: Lidské kmenové buňky schopné znovu obsadit kostní dřeň myší NOD/SCID
Přidání během Dny kultivace Počet lidských
kultivace suspenzní kultury krvetvorných kolonií
kultury CD34+CD38+ vytvořených z BM
lidských buněk transplantovaných
z chordové krve myší NOD/SCID
0 4
SCF + FL 6 2 až 3
SCF + FL + SL-6R/IL- 6 6 50 až 100
Další experimenty porovnávaly účinek sIL-6R/IL-6 na populaci CD34+CD38+ chordové krve s účinkem na vysoce čištěné kmenové buňky CD34+CD38-. Expanze vysoce čištěných kmenových buněk in vitro byla daleko silnější v přítomností chiméry sIL6R/IL-6 než u méně čištěných kmenových buněk (tabulka č. V) . To indikuje, že nejprimitivnější kmenové buňky jsou preferovaným cílem účinku chiméry SIL-6R/IL-6 na expanzi buněk.
Tabulka č. V: In vitro expanze krvetvorných kmenových buněk
Nanesená buněčná Počet buněk 6-tý den Počet buněk 6-tý den
populace (20 000 s SC + FL s SC + FL + sIL-
buněk) 6R/IL-6
Experiment 1
CD34+CD38+ 780 000 675 000 (x 0,86)
CD34+CD38- 42 000 153 000 (x 3,6)
Experiment 2
CD34+CD38- 330 00 507 000 (x 1,5)
CD34+CD38+ 3 000 18 000 (x 6,0)
Zachování znovu obsazené kostní dřeně in vitro se měřilo prodloužením kultivace suspenzních kultur vysoce čistých kmenových buněk CD34+CD38- před zavedením injekcí do NOD/SCID myší. Přijetí štěpů se hodnotilo poměrem lidské DNA v kostní dřeni u recipientních myší 6 týdnů po i.v. injekci, kterou se aplikovaly kultivované buňky. Když se během kultivace kultury přidala k SCF a FL chiméra SIL-6R/IL-6, se po dvouch týdnech kultivace pozorovalo vysoké přijetí štěpů ( větší než 1 % lidské DNA) a příjem štěpů byl vyšší než u nekultivovaných buněk. Naopak experimenty s kulturami, které obsahují SCF, FL, GM-CSF, IL-3 ukázaly, že SCID-znova obsazené buňky nezůstávají v kultuře po jednom týdnu kultivace (Bhata, M. et al., J. Exp. Med. 186, 619-624 1997).
Tyto výsledky ukazují, že chiméra SIL-6R/IL-6 umožňuje expanzi a udržení lidských primitivních kmenových buněk schopných obsadit v recipientu kostní dřeň. Kmenové buňky zůstávají aktivní v nediferenciovaném stádiu, zatímco se dělí. Chiméra SIL-6R/IL-6 umožňuje nový způsob kultivace krvetvorných buněk, které tvoří štěpy pro transplantaci. To také umožňuje použití retrovirových vektorů pro začlenění genů
do kmenových buněk, což se využívá v metodách genové terapie. Do dnešní doby toto nebylo možné s lidskými kmenovými buňkami, protože tyto primitivní buňky se nemohly udržovat in vitro v cyklujícím stádiu, jak to vyžaduje integrace retrovirové DNA. Chiméra SIL-6R/IL-6 řeší tento problém.
Příklad 6: Produkce chiméry IL-6R/IL-6 v buňkách CHO
DNA plazmidu SIL-6R/IL-6 pcDNA3 zobrazená na obrázku č. 1 se ko-transf e-kovala do buněk vaječníků čínských křečků (CHO) spolu s DNA plazmidu pDHFR, jak popisuje v publikaci Mory et al., DNA 5, 181-193, 1986). Mezi transformanty rostoucími v 50 nM methotrexátu se izoloval klon L12-[IL-6R/IL-6]. Zjistilo se, že tento klon je stabilní po mnoho pasáží a semikonfluentní kultury vylučují do kultivačního média chiméru IL6R/IL-6 v množství 2,5 μς/ιηΐ.
Za účelem čištění chiméry I1-6R/IL-6 se 3,25 litrů kultivačního média z kultury klonu L12 v 2 % bovinním séru zakoncentrovalo na objem 200 ml. Médium se absorbovalo na koloně o objemu 18 ml obsahující monoklonální protilátky 34.4 proti lidskému sIL-6R spojené s částicemi přípravku Affigel 10 a chiméra se eluovala způsobem, který se popisuje v publikaci Novick et al., Hybridoma, 10, 137-146, 1991). 25 mM eluát kyseliny citrónové se ihned neutralizoval pufrem 1 x Hepes pH
8,6. Proteiny se zakoncentrovaly na membráně Amicon oddělující molekuly o molekulové hmotnosti 10 000 na konečnou koncentrací 1 mg/ml. Při testu SDS-PAGE se objevil jediný pruh odpovídající molekulové hmotnosti 85 000, což koresponduje s chimérou I1-6R/IL-6. Glykosylace se demonstrovala zmenšením velikosti molekuly po ošetření glykosidasy (Boehrínger, Mannheim). Biologická aktivita chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO je stabilní po dobu alespoň 5 měsíců při teplotě 4 °C. Uchovávání probíhá při teplotě -70 °C.
Příklad 7: Afinita chiméry IL-6R/IL-6 vůči gpl30 • ·
U chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO a směsi lidského IL-6 a sIL-6R se porovnávala jejich schopnost vázat se na rozpustnou formu gpl30 (sgp 130), který je druhým řetězcem receptorového systému IL-6 (popisuje se v části dosavadní stav techniky). Mikrotitrační destička s 96 prohlubněmi (Nunc) se potáhla s monoklonálními protilátkami proti lidskému gp!30 a přidalo se 50 ng/ml sgpl30 ((R&D Systems, Minneapolis, MN) . Po promytí fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem se do různých prohlubní přidala chiméra IL-6R/IL-6 v různých koncentracích, které se pohybují v rozmezí 0,1 až 50 ng/ml. Do separátních prohlubní se přidal rhuIl-6 (Ares-Serono, Geneva) v koncentraci 500 ng/ml spolu s lidským sIL-6RóVal v koncentracích v rozmezí 2 až 500 ng/ml. Po celonoční inkubaci při teplotě 4 °C se přidaly králičí polyklonální protilátky proti IL-6R (Oh et al., Cytokine, 8, kozí anti-králičí Ig která se detekovala Obrázek č. 8 ukazuje
401-409, 1996) . Pak se přidaly konjugované s křenovou peroxidasou, barevnou reakcí (Sigma, St. Louis).
Scatchardův graf výsledků. Zjistilo se, že afinita chiméry II6R/IL-6 vůči gpl30 je více jak 4 krát vyšší než afinita dvou částí molekul, které se přidaly odděleně (6,3 χ 10’11 M verzus
2,6 x chiméry a vůči
ΙΟ-10 M) . Tento výsledek vysvětluje vyšší aktivitu ve srovnání s kombinací IL-6 + sIL-6R vůči melanomu krvetvorným buňkám (zobrazeno na obrázku č. 9a popisuje se v Příkladu 4
Příklad 8: Chiméra IL-6R/IL-6 chrání před toxickými účinky na j átra.
Zavedením chloridu uhličitého (CC14) injekcí do myší vzniká silná nekróza jater vedoucí k úmrtí zvířat (popisuje se v publikaci Slater T. F. et al., Philos. Trans. R. Soc. Biol. Sci. 311, 633-645, 1985). Když se myším, které jsou geneticky deficitní na IL-6 (IL-6-/-), aplikuje relativně malá dávka chloridu uhličitého (2 až 3 ml/kg tělesné hmotnosti)
intraperitoneální injekcí, stupeň úmrtnosti během 24 hodin je přibližně 70 % (zobrazeno na obrázku č. 10). Injekce chiméry IL-6R/IL-6 produkované buňkami CHO jednu hodinu před aplikací chloridu uhličitého a opět 4 hodiny po aplikaci ochrání zvířata před smrtí po dobu 24 hodin. Naopak podobně zavedený volný rhuIL-6 nevykazuje žádný účinek (zobrazeno na obrázku č. 10). Chiméra IL-6R/IL-6 je účinná v dávkách 2 až 3 μς na jednu injekci, kde vyjádřeno v molárním poměru je 10 krát nižší než dávka IL-6, které není účinná. Při vyšších dávkách chloridu uhličitého (např. 3,5 ml/kg zobrazeno na obrázku č. 10) chiméra má také ochranný účinek, přičemž úmrtnost je nižší ve srovnání s IL-6 nebo bez aplikace cytokinu. Rozdíl v úmrtnosti mezi myšmi ošetřenými chimérou a neošetřenými myšmi, přičemž obou skupinám se aplikovala stejná dávka chloridu uhličitého, je podstatný a hodnota p je menší než 0,01. Histologické pozorování sekcí jater obarvených hematoxilinem-eosinem potvrdilo, že chlorid uhličitý způsobuje nekrózu tkáně jater a že chiméra IL-6R/IL-6 chrání hepatocyty před uvedeným toxickým účinkem (není zobrazeno).
Aplikace chiméry IL-6R/IL-6 se může použít při ochraně jaterná tkáně u pacientů s nekrotickým onemocněním, které je způsobené chemikáliemi (například alkohol, paracetamol) nebo v jiných případech (například při virové hepatitidě).
Příklad 9: Konstrukce a aktivita chiméry Il-6/sIL-6R5Val
Zkonstruovala se chimérová molekula, ve které část IL-6 je na N-konci, zatímco část sIL-6R je na C-konci. Plazmid pBSsIL-6R5Val se štěpil v restrikčním místě Sau3a (bp 1086) a HindlII, které následuje po terminačním kodónu po Val-359 (popisuje se v Příkladu 1). Syntetizoval se linker obsahující tři restrikční místa Spěl, Smál a BamHI:
Spěl Smál BamHl
5' CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GG
A CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5' (SEQ ID NO: 2)
Toto restrikční místo Sau3a sIL-6R se ligovalo do restrikčního místa BamHl linkeru a vše se klonovalo do vícenásobného klónovacího místa plazmidu Bluescript pBS SK. Sekvence IL-6 se amplifikovala pomocí PCR z DNA ρΚΚβ2-7 za použití primerů (počáteční kodón je podtržen)
Forward Reverzní Spěl 5' GA CTA GTA GCT ATG AAC TCC TTC HaelII 5' AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C TC (SEQ (SEQ ID NO: 3) ID NO: 4)
Produkt PCR štěpený restrikčním enzymem Spěl a HaelII se
zavedl do restrikčního místa Spěl a Smál shora uvedeného
linkeru. Dále se syntetizoval jiný linker BamHl-NcoI
s vnitřním restrikčním místem Smál:
Smál
5' GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[NcoI] [BamHl] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5' (SEQ ID NO: 5)
Tento linker se klonoval mezi restrikční místo předchozího linkeru a Ncol 1464 sekvence IL-6R. Fragment IL-6R od Smál 867 do Ncol 1464 se pak zavedl mezi restrikční místo Smál druhého linkeru a Ncol IL-6R. Výsledná chimérová DNA se sekvenovala a znovu klonovala do pCDNA3 za účelem exprese v lidských buňkách HEK 293. Aminokyselinová sekvence chiméry IL-6-IL-6R 3e je zobrazena na obrázku č. 11 (linker je podtržen). Chiméra 3e se čistila afinitní chromatografií na • · • « * ♦ * · * · « « ··· ······· ♦ · «· ··· · · · • · · ♦ · · · monoklonálních protilátkách proti IL-6 (popisuje se v publikaci Novick et al., Hybridoma 8, 561-567, 1989). Při testu SDS-PAGE se objevil pruh odpovídající molekulové hmotnosti 75 000.
Biologická aktivita chiméry IL-6-IL-6R 3e inhibovat růst buněk melanomu F10.9 je zobrazena na obrázku č. 12. Uvedená chiméra je jasně aktivní ve srovnání s chimérou IL-6R/IL-6 (příprava 1 až 3) ve stejném experimentu, ačkoli je nutné její vyšší koncentrace, aby došlo k 50 % inhibici růstu.
Pomocí PCR mutageneze se připravily dva mutanti IL-6R/IL6, ve kterých aminokyseliny His-280 a Asp-281 části IL-6R chiméry IL-6R/IL-6 (obrázek č. 3) se zaměnily za Ser a Val (mutant 39 nebo HD) nebo kde Asn-230 se dále zaměnil za Asp (mutant NHD) . Jak je možné spatřit na obrázku č. 12, tyto dva mutanty nevykazovaly skoro žádnou aktivitu ve srovnání s chimérami IL-6R/IL-6 a IL-6-IL-6R. Protože v IL-6R tyto aminokyseliny interagují s gpl30, jak se ukázalo molekulárním modelováním (popisuje se v publikaci Halimi H, Eisenstein M, Oh J, Revel M and Chenath J. Epitop peptides from interleukin6 receptor which inhibit the growth of human myeloma cells. Eur. Cytokine Netw., 6: 135-143, 1995), což demonstruje, že chiméra SIL-6R/IL-6 konzervuje toto podstatné místo interakce.
Chiméra IL-6-IL-6R 3e nezahrnuje oblast IL-6R podobnou imunoglobulinu, která je přítomna v IL-6R/IL-6. Avšak pouhé odstranění Ig-oblasti z IL-6R/I1-6 nesníží její biologickou aktivitu vůči buňkám F10.9. Navázání chiméry IL-6-IL-6R 3e na gpl30 tvoří přibližně 30 % navázání další chiméry IL-6R/IL-6 (nenízobrazeno). Toto menší schopnost se vázat je v souladu s nižší aktivitou vůči růstu buněk melanomu.
Tyto výsledky ukazuji, že blokování C-konce IL-6 fúzí prostřednictvím linkeru s SIL-6R, konzervuje v nových chimérách dobrou biologickou aktivitu .
• ·
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin
(B) TYP: aminokyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE : lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: peptid
(xi) Popis sekvence : SEQ ID NO: 1:
Glu Phe 1 Gly Ala Gly Leu Val 5 Leu Gly Gly Gin Phe Met 10
(2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) (B) (C) (D) DÉLKA: 44 párů baží TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
GGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG
Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 25 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
GACTAGTAC-C TATGAACTCC TTCTC • » ·
(2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C
(2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 62 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: cDNA
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
GA.TCC GGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC GCCCTCCTCC CGG<
AC
(2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 14 aminokyselin
(B) TYP: aminokyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: peptid
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Glv Gly Gly Pro Gly 1 5 ío (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
• · · (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 543 aminokyselin
(B) TYP: aminokyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(íi) DRUH MOLEKULY: peptid
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Met 1 Leu Ala Val Gly 5 Cys Ala Leu Leu Ala Ala 10 Leu Leu Ala Ala 15 Pro
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gin Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu 35 Thr Ser Leu Pro Gly 40 Asp Ser Val Thr Leu 45 Thr Cys Pro
Gly Val 50 Glu Pro Glu Asp Asn 55 Ala Thr Val His Trp 60 Val Leu Arg Lys
Pro 65 Ala Ala Gly Ser His 70 Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 80
Leu Leu Leu Arg Ser 85 Val Gin Leu His Asp Ser 9C* Gly Asn Tyr Ser 95 Cys
Tyr Arg Ala Gly 100 Arg Pro Ala Gly Thr 105 Val His Leu Leu Val 110 Asp Val
Pro Pro Glu 115 Glu Pro C-ln Leu Ser 120 Cys Phe Arg Lys Ser 125 Pro Leu Ser
Asn Val 130 Val Cys Glu Trp Gly 135 Pro Arg Ser Thr Pro 140 Ser Leu Thr Thr
Lys 145 Ala Val Leu Leu Val 150 Arg Lys Phe Gun Asn 155 Ser Pro Ala Glu Asp 160
Phe Gin Glu Pro Cys 165 Gin Tyr Ser C-ln Glu Ser ±70 Gin Lys Phe Ser 175 Cys
Gin Leu Ala Val 180 Pro Glu Gly Asp Ser 135 Ser Phe Tyr Ile Val 190 Ser Met
Cys Val Ala 195 Ser Ser Val Gly Ser 200 Lys Phe Ser Lys Thr 205 Gin Thr Phe
Gin Gly 210 Cys Gly Ile Leu Gin 215 Pro Asp Pro Pro Ala 220 Asn Tle Thr Val
Thr 225 Ala Val Ala Arg Asn 230 Pro Arg Trp Leu Ser 235 Val Thr Trp Gin Asp 240
• ·
Pro His Ser Trp Asn 245 Ser Ser Phe Tyr Arg 250 Leu Arg Phe Glu Leu 255 Arg
Tyr Arg Ala Glu 260 Arg Ser Lys Thr Phe 265 Thr Thr Trp Met Val 270 Lys Asp
Leu Gin His 275 His Cys Val Ile His Asp 280 Ala Trp Ser Gly Leu 285 Arg His
Val Val 290 Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu 295 Phe Gly Gin 300 Gly Glu Trp Ser
Glu 305 Trp Ser Pro Glu Ala 310 Met Gly Thr Pro Trp Thr 315 Glu Ser Arg Ser 320
Pro Pro Ala Glu Asn 325 Glu Val Ser Thr Pro 330 Met Gin Ala Leu Thr 335 Thr
Asn Lys Asp Asp 340 Asp Asn Ile Leu Phe 345 Arg Asp Ser Ala Asn 350 Ala Thr
Ser Leu Pro 355 Val Glu . Phe Met Pro Val 360 Pro Pro Gly Glu Asp 365 Ser Lys
Asp Val 370 Ala Ala Pro His A.rg Gin Pro 375 Leu Thr Ser 380 Ser Glu Arg Ile
Asp 385 Lys Gin Ile Arg Tyr 3 90 Ile Leu Asp Gly Ile Ser 395 Ala Leu Arg Lys 400
Glu Thr Cys Asn Lys 405 Ser Asn Met Cys Glu 410 Ser Ser Lys Glu Ala 415 Leu
Ala Glu Asn Asn 420 Leu Asn Leu Pro Lys 425 Met Ala Glu Lys Asp 430 Gly Cys
Phe Gin Ser 435 Gly Phe Asn Glu Glu Thr 440 Cys Leu Val Lys Ile 445 Ile Thr
Gly Leu 450 Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu 455 Glu Tyr Leu 460 Gin Asn Arg pF-
Glu 465 Ser Ser Glu Glu Gin 470 Ala Arg Ala Val Gin Met 475 Ser Thr Lys Val 480
Leu lie Gin Phe Leu 485 Gin Lys Lys Ala Lys 4 90 Asn Leu Asp Ala Ile 495 Thr
Thr Pro Asp Pro 500 Thr Thr Asn Ala Ser 505 Leu Leu Thr Lys Leu 510 Gin Ala
Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser
515 520 525
Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin Met 530 535 540 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 471 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Met A.sn Ser 1 Phe Ser Thr Ser Ala 5 Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala 20 Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 25 30
Gly Glu Asp 35 Ser Lys Asp Val Ala 40 Ala Pro His Arg C-ln Pro Leu Thr 45
Ser Ser Glu 50 Arg Ile Asp Lys Gin 55 Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 60
Ser Ala Leu 65 Arg Lys Glu Thr Cvs 70 Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 75 80
Ser Lvs Glu Ala Leu Ala Glu Asn 85 Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser 100 Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 105 110
Val Lys Ile 115 Ile Thr Gly Leu Leu 120 Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 125
Leu Gin Asn 130 Arg Phe Glu Ser Ser 135 Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin 140
Met Ser Thr 145 Lys Val Leu Ile Gin 150 Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp 165 Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 170 175
Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin 180 Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His 185 190
Leu Tle Leu 195 Arg Ser Phe Lys Glu 200 Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala 205
Leu Arg Gin 210 Met Gly Gly Gly Gly 215 Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly 220
Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser
225 230 235 240
Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser
245 250 255
Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro
260 265 270
Ala Glu Asp Phe Gin Glu· Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys
275 280 285
Phe Ser Cys Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile
290 295 300
Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr
305 310 315 320
Gin Thr Phe Gin Gly Cys Gly Ile Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn
325 330 335
Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr
340 345 350
Trp Gin Asp Pro His Ser Trp .Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe
355 360 365
Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu .Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met
370 375 380
Val Lys Asp Leu Gin His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly
385 390 395 400
Leu Arg His Val Val Gin Leu Arg A.la Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly
405 410 415
Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu
420 425 4 30
Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gin Ala
4 35 440 445
Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe ?.rg Asp Ser Ala
450 455 460
Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val

Claims (13)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chímérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6) receptoru interleukinu-6 (sIL-6R)-interleukin-6(IL-6) a jeho biologicky aktivní analogy obsahující fúzní proteinový produkt mezi v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou IL-6R a v podstatě celou přirozeně se vyskytující formou IL-6, přičemž uvedený SIL-6R/IL-6 a jeho analogy se glykosylují způsobem podobným, jako je glykosylace přirozeně se vyskytujícího SIL-6R a IL-6.
  2. 2. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle nároku 1, kde uvedený sIL-6R se fúzuje s IL6 prostřednictvím molekuly peptidového linkeru.
  3. 3. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle nároku 2, kde uvedený linker je velmi krátký, není imunogenní a tvoří jej přibližně 3 aminokyselinové zbytky.
  4. 4. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle nároku 3, kde uvedený linker je tripeptid se sekvencí E-F-M (Glu-Phe-Met).
  5. 5. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle nároku 2, kde uvedený linker je peptid obsahující 13 aminokyselinových zbytků se sekvencí E-F-GA-G-L-V-L-G-G-Q-F-M (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-GlyGly-Gln-Phe-Met).
  6. 6. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle libovolného z nároků 1 až 4, který se označil sIL-6R5Val/IL-6 a má tripeptidový linker se sekvencí E-F-M mezi C-terminální Val-356 sIL-6R a N-terminální Pro-29 IL-6, kde uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3.
  7. 7. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 podle libovolného z nároků 1, 2 a 5, který se označil sIL-6R5Val/IL-6 a má peptidový linker tvořený 13 aminokyselinami se sekvencí E-F-G-A-G-L53 • · · · · ·· ·· • · · · · # · · ·· ···· · “ · • · · · ······· ~ * • · ·· · · · · ·
    V-L-G-G-Q-F-M mezi C-terminální Val-356 sIL-6R a Nterminální Pro-29 IL-6, kde uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 3, kde tripeptid se sekvencí E-F-M mezi polohami 357 až 359 na obrázku č. 3 je nahrazen uvedenou sekvencí peptídu tvořeného 13 aminokyselinami.
  8. 8. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle nároku 1, který se označil IL-6/sIL-6R, má celou sekvenci IL-6, která předchází sekvenci sIL-6R s peptidovým linkerem tvořeným
    14-ti aminokyselinami se sekvencí G-G-G-G-D-P-G-G-G-G-G-GP-G (SEQ ID NO: 6) mezi C-terminální MET-212 IL-6 a VAL112 sIL-6R, přičemž uvedený chimérový protein má sekvenci uvedenou na obrázku č. 11.
  9. 9. Chimérový protein sIL-6R/IL-6 podle libovolného z nároků 1
    až 8, který se produkuje v savčích buňkách ve zcela zpracované formě. 10. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle nároku 9, který se produkuj e v lidských buňkách. 11. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 podle nároku 9, který se produkuj e v buňkách CHO. 12. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní
    analogy podle libovolného z nároků 1 až 11, které se charakterizují svou schopností inhibovat růst buněk vysoce maligního karcinomu.
  10. 13. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle nároku 12, které se charakterizují svou schopností inhibovat růst buněk vysoce maligního melanomu.
  11. 14. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle libovolného z nároků 1 až 11, které se charakterizují svou schopností vyvolat ín vivo přijetí lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní dřeně.
  12. 15. Chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle libovolného z nároků 1 až 11, které se
    4 ·
  13. 16, charakterizují svou schopností ochránit játra před hepatoxickými činidly.
    Sekvence DNA kódující chimérový protein SIL-6R/IL-6 a jeho biologicky aktivní analogy podle libovolného z nároků 1 až
    11.
    Vektor
    DNA, vyznačující se tím, obsahuje sekvenci DNA kódující chimérový protein sIL6R/IL-6 j eho biologicky aktivní analogy podle libovolného z nároků 1 až 11, který je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v savčích buňkách.
    18 . Vektor DNA podle nároku 17, v y z n a č u j í c i se tím, že je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v lidských buňkách. 19. Vektor DNA podle nároku 17, v y z n a č u j í c i se tím, že je vhodný pro expresi uvedeného chimérového proteinu v buňkách CHO. 20. Vektor DNA podle libovolného z nároků 17 až 19, v y z n a č u j i c i se tím, že se exprimuj e
    v savčích lidských buňkách, pricemz exprimovaný chimérový protein ma sekvenci, která dovoluje úplné zpracování chimérového proteinu savčími nebo lidskými buňkami a vylučování zcela zpracovaného chimérového proteinu z buněk do kultivačního média, ve kterém uvedené buňky rostou.
    Vektor DNA podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že uvedený vektor je plazmid označený pcDNAsIL-6R/IL-6 zahrnující vektor pcDNA3, který obsahuje sekvenci DNA kódující chimérový protein sIL-6/IL-6 řízenou cytomegalovirovým promotorem . (CMV) .
    Vektor DNA podle libovolného z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že uvedený vektor je plazmid označený pcDNAsIL-6R/L/IL-6 zahrnující vektor pcDNA3, který obsahuje sekvenci DNA kódující chimérový protein SIL-6/IL-6 řízenou cytomegalovirovým promotorem (CMV), 'a že v uvedené sekvenci DNA kódující uvedený chimérový protein SIL-6R/IL-6 je v restrikčním místě EcoRI umístěném mezi sekvencí kódující část sIL-6R a sekvencí kódující část IL-6 proteinu začleněna sekvence linkeru kódující peptídový linker.
    Transformované savčí buňky obsahující vektor DNA podle libovolného z nároků 17 až 22 vyznačující se tím, že jsou schopny exprimovat sekvenci chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nesenou uvedeným vektorem a zcela zpracovat exprimovaný protein a vyloučit ho do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují.
    Transformované buňky podle nároku 23, vyznačující se tím, že jde o zde popsané lidské embryonální ledvinové buňky 293 (HEK293) transfekované vektorem pcDNAsIL-6R/IL-6, přičemž uvedené buňky jsou schopny exprimovat chimérový protein SIL-6R/IL6, zcela zpracovat uvedený protein a vylučovat uvedený protein do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují, ve formě glykoproteinu o molekulové hmotnosti 85 000.
    Způsob produkce chimérového proteinu nebo jeho biologicky aktivních analogů podle libovolného z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci transformovaných buněk podle nároku 23 nebo 24 za podmínek vhodných pro expresi, zpracování a vylučování uvedeného proteinu nebo analogů do kultivačního média, ve kterém se uvedené buňky kultivují, a čištění uvedeného proteinu nebo jeho analogů z uvedeného kultivačního média.
    Způsob podle nároku 25, vyznačuj ící se tím, že čištění probíhá imunoafinitní chromatografií za použití monoklonálních protilátek specifických pro SIL-6R.
    9 9 • » · · · »··<··* » · ··· · · fe «««· * · · t · · · 9 · · 9 9
    27. Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo analogů podle libovolného z nároků 1 až 11, solí libovolného z nich a jejich směsí, jako inhibitoru buněk karcinomu.
    28. Použití chimérového proteinu nebo analogů podle nároku 27, jako inhibitoru buněk vysoce maligního melanomu.
    29. Použití chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 nebo analogů podle libovolného z nároků 1 až 11, solí libovolného z nich a jejich směsí, jako aktivní složky pro vyvolání přijetí lidských krvetvorných buněk při transplantací * kostní dřeně.
    30. Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo analogů »
    podle libovolného z nároků 1 až 11, solí libovolného z nich a jejich směsí, jako aktivní složky při ochraně jater proti hepatoxickým činidlům.
    31. Použití chimérového proteinu sIL-6R/IL-6 nebo analogů podle libovolného z nároků 1 až 11, solí libovolného z nich a jejich směsí, jako aktivní složky pro zesílení krvetvroby, při léčení poruch jater a neurologických poruch nebo při jiných aplikacích, při kterých se používají IL-6 a sIL-6R.
    32. Použití chimérového proteinu SIL-6R/IL-6 nebo analogů podle libovolného z nároků 1 až 11, solí libovolného z nich a jejich směsí při přípravě medikamentu pro léčbu savčích karcinomů způsobem inhibice buněk savčích karcinomů nebo při přípravě medikamentu pro posílení transplantace kostní dřeně způsobem umožňujícím přijetí r
    lidských krvetvorných buněk při transplantaci kostní , dřeně nebo pří přípravě medikamentu pro zesílení krvetrvorby nebo při přípravě medikamentu pro léčbu poruch jater nebo neurologických poruch nebo při přípravě medikamentu pro jiné aplikace, při kterých se používají
    IL-6 nebo SIL-6R.
    33. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku chimérový protein
    A A A A A to «κ>« A < A A AA · AA AA
    SIL-6R/IL-6 nebo jeho analog podle libovolného z nároků 1 až 11 a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo
    ekcipient. 34 . Farmaceutická kompozice podle nároku 33, vyznačuj ící se t í m, že je vhodná pro léčbu zhoubného buj ení. 35. Farmaceutická kompozice podle nároku 33, vyznačuj ící se t í m, že je vhodná pro zlepšení transplantace kostní dřeně. 36. Farmaceutická kompozice podle nároku 33, vyznačuj ící se t í m, že j e vhodná pro
    léčbu jaterních a neurologických poruch nebo pro zesílení krvetvorby nebo pro jiné aplikace, při kterých se používají IL-6 nebo sIL-6R.
    37. Způsob léčby zhoubného bujení u savců nebo zlepšení transplantací kostní dřeně nebo léčby jaterních nebo neurologických poruch nebo zesílení krvetvorby nebo jiných aplikací, při kterých se používají IL-6 nebo sIL6R, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci farmaceutické kompozice podle libovolného z nároků 33 až 36 pacientovi ve vhodné dávkové formě a vhodným způsobem aplikace.
CZ20000075A 1997-07-10 1998-07-09 Chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6) CZ302488B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12128497A IL121284A0 (en) 1997-07-10 1997-07-10 Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
IL12281897A IL122818A0 (en) 1997-07-10 1997-12-30 Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200075A3 true CZ200075A3 (cs) 2000-08-16
CZ302488B6 CZ302488B6 (cs) 2011-06-15

Family

ID=26323470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20000075A CZ302488B6 (cs) 1997-07-10 1998-07-09 Chimérový glykosylovaný rozpustný protein (sIL-6R/IL-6)

Country Status (26)

Country Link
US (2) US7198781B1 (cs)
EP (1) EP0991661B1 (cs)
JP (1) JP4402288B2 (cs)
KR (1) KR100505172B1 (cs)
CN (1) CN1185348C (cs)
AR (1) AR013201A1 (cs)
AT (1) ATE342915T1 (cs)
AU (1) AU758161B2 (cs)
BG (1) BG64680B1 (cs)
BR (1) BR9812096B1 (cs)
CA (1) CA2295936C (cs)
CY (1) CY1105895T1 (cs)
CZ (1) CZ302488B6 (cs)
DE (1) DE69836217T2 (cs)
DK (1) DK0991661T3 (cs)
EA (1) EA004793B1 (cs)
EE (1) EE05519B1 (cs)
ES (1) ES2271999T3 (cs)
HU (1) HU225855B1 (cs)
IL (2) IL122818A0 (cs)
NO (1) NO327397B1 (cs)
NZ (1) NZ502139A (cs)
PL (1) PL199212B1 (cs)
PT (1) PT991661E (cs)
SK (1) SK287039B6 (cs)
WO (1) WO1999002552A2 (cs)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
US5919763A (en) * 1998-06-01 1999-07-06 Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. IL-6/SIL-6R complex for promotion of liver functions
US20040170604A1 (en) 1998-07-06 2004-09-02 Tosoh Corporation IL-6 receptor IL-6 direct fusion protein
EP1094081B1 (en) * 1998-07-06 2005-09-21 Tosoh Corporation Fused protein with direct bond of il-6-receptor to il-6
MXPA01009074A (es) * 1999-03-09 2002-03-27 Zymogenetics Inc Nuevo ligando zalfa11 de citocina.
IL130586A0 (en) * 1999-06-21 2000-06-01 Yeda Res & Dev IL6RIL6 chimera for the treatment of demyelinating diseases
WO2001096565A2 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Asterion Limited Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins
AU9184901A (en) * 2000-09-14 2002-03-26 Ares Trading Sa Use of il-6r/il-6 chimera in huntington's disease
DE10106827A1 (de) * 2001-02-14 2002-09-05 Stefan Rose-John Verwendung eines Konjugats aus Interleukin-6(IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression des Stammzellfaktors (SCF) und von Flat-3-Ligand (Flt-3L)
DE10107737A1 (de) * 2001-02-16 2002-09-05 S Rose John Christian Albrecht Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor zur Tumortherapie
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
GB0119015D0 (en) * 2001-08-03 2001-09-26 Univ Cardiff A fusion protein
GB2384001B (en) * 2001-12-14 2004-02-04 Asterion Ltd Chimeric growth hormone-growth hormone receptor proteins
IL147412A0 (en) * 2001-12-31 2002-08-14 Yeda Res & Dev The use of il6r/il6 chimera in nerve cell regeneration
AU2003223089A1 (en) * 2002-04-29 2003-11-17 Hadasit Medical Research Services And Development Company Ltd. Compositions and methods for treating cancer with an oncolytic viral agent
WO2004069173A2 (en) 2003-01-31 2004-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for modulating an inflammatory response
FR2850621B1 (fr) * 2003-02-04 2006-12-08 Journee Paul Connecteur reliant un bras d'essuie-glace a un balai d'essuyage, qui comporte deux languettes pour le verrouillage transversal de bras d'essuie-glace
DE10321317A1 (de) * 2003-05-13 2004-12-23 Christian-Albrechts-Universität Zu Kiel Verfahren zum Nachweis des funktionellen IL-6/ sIL-6-Rezeptor-Komplexes und Test-Kit zur Durchführung dieses Verfahrens
IL157309A0 (en) * 2003-08-07 2004-02-19 Applied Research Systems Method for the purification of a non-immunoglobulin protein
IL159558A0 (en) 2003-12-24 2004-06-01 Applied Research Systems Use of il-6 in liver injury
IL161673A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Applied Research Systems Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
IL161672A0 (en) 2004-04-29 2004-09-27 Yeda Res & Dev Compositions and methods for therapy of chemotherapy-induced neuropathy
SG177946A1 (en) 2005-08-29 2012-02-28 Technion Res & Dev Foundation Media for culturing stem cells
AU2012261726B2 (en) * 2005-08-29 2015-03-12 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for Culturing Stem Cells
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
JP2009543579A (ja) * 2006-07-19 2009-12-10 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 抗炎症反応のための標的としてのＷＳＸ−１／ｐ２８
DK3441459T3 (da) * 2006-08-02 2021-06-07 Technion Res & Dev Foundation Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur
US8052968B2 (en) 2006-10-16 2011-11-08 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
CA2690627C (en) * 2007-06-15 2014-12-02 Genelux Corporation Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
CN101827857A (zh) * 2007-08-03 2010-09-08 埃斯特瑞恩有限公司 粒细胞集落刺激因子
GB0715216D0 (en) * 2007-08-03 2007-09-12 Asterion Ltd Leptin
EP2310508A1 (en) * 2008-07-02 2011-04-20 Emergent Product Development Seattle, LLC Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
WO2010003101A2 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Il6 immunotherapeutics
WO2010081738A1 (en) 2009-01-16 2010-07-22 Agirx Limited Vaccine compositions
ES2932664T3 (es) 2009-11-12 2023-01-23 Technion Res & Dev Foundation Medios de cultivo, cultivos celulares y métodos de cultivo de células madre pluripotentes en estado no diferenciado
EP2516467A2 (en) 2009-12-23 2012-10-31 Emergent Product Development Seattle, LLC Compositions comprising tnf-alpha and il-6 antagonists and methods of use thereof
DK2614141T3 (da) 2010-09-07 2019-09-09 Technion Res & Dev Foundation Hidtil ukendte fremgangsmåder og dyrkningsmedier til dyrkning af pluripotente stamceller
EP2832856A4 (en) 2012-03-29 2016-01-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF
CA2909576C (en) 2013-04-19 2023-07-18 Cytune Pharma Cytokine derived treatment with reduced vascular leak syndrome
US20160194369A1 (en) * 2013-08-12 2016-07-07 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods and compositions for co-expression of polypeptides of inerest and il6
EP2915569A1 (en) 2014-03-03 2015-09-09 Cytune Pharma IL-15/IL-15Ralpha based conjugates purification method
CN104826093A (zh) * 2015-04-16 2015-08-12 刘永庆 用于治疗慢性传染性肝病的Th2免疫反应拮抗剂及卵黄抗体
CN104922659B (zh) * 2015-07-03 2018-04-20 刘永庆 防治肿瘤和/或慢性结核病的Th2免疫反应抑制剂及其应用
US20240269236A1 (en) 2021-06-04 2024-08-15 Sonnet BioTherapeutics, Inc. Methods of treating age-related frailty with interleukin-6
CN116064563B (zh) * 2022-11-04 2025-11-11 广州达安基因股份有限公司 白细胞介素-6截短体的制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5216128A (en) 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL99803A (en) * 1991-10-20 1997-02-18 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising interleukin-6 for the treatment of chronic lymphocytic leukemia and B-cell lymphomas
PL190445B1 (pl) * 1995-05-15 2005-12-30 Akademia Medyczna Im K Marcink Genetyczna szczepionka przeciwrakowa
DE19608813C2 (de) 1996-03-07 1998-07-02 Angewandte Gentechnologie Syst Konjugat zur Beeinflussung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
AR020315A1 (es) * 1997-12-19 2002-05-08 Serono Lab Un complejo de interferon tipo i(ifn) y una subunidad del receptor del interferon humano-(ifnar) que es capaz de unirse al inf tipo i del complejo, una molecula de adn, un vector, una celula huesped incapaz de conducir a la regeneracion de un animal o una planta transformada con un vector, una compo

Also Published As

Publication number Publication date
DE69836217D1 (de) 2006-11-30
SK287039B6 (sk) 2009-10-07
JP4402288B2 (ja) 2010-01-20
BR9812096A (pt) 2000-07-18
EE200000012A (et) 2000-08-15
PL199212B1 (pl) 2008-08-29
DE69836217T2 (de) 2007-08-23
KR100505172B1 (ko) 2005-08-03
IL122818A0 (en) 1998-08-16
EP0991661B1 (en) 2006-10-18
DK0991661T3 (da) 2007-02-05
EA004793B1 (ru) 2004-08-26
IL133972A (en) 2015-07-30
NO327397B1 (no) 2009-06-22
JP2001509371A (ja) 2001-07-24
AU758161B2 (en) 2003-03-20
HUP0002426A2 (hu) 2000-11-28
HK1031895A1 (en) 2001-06-29
NO20000086D0 (no) 2000-01-07
NO20000086L (no) 2000-03-08
HUP0002426A3 (en) 2003-01-28
ES2271999T3 (es) 2007-04-16
HU225855B1 (en) 2007-11-28
WO1999002552A3 (en) 1999-04-01
PL338002A1 (en) 2000-09-25
WO1999002552A2 (en) 1999-01-21
AU8127198A (en) 1999-02-08
US20070172455A1 (en) 2007-07-26
EE05519B1 (et) 2012-02-15
SK62000A3 (en) 2000-07-11
CY1105895T1 (el) 2011-02-02
ATE342915T1 (de) 2006-11-15
AR013201A1 (es) 2000-12-13
CA2295936C (en) 2009-05-26
PT991661E (pt) 2007-01-31
EP0991661A2 (en) 2000-04-12
CN1269835A (zh) 2000-10-11
BG104070A (en) 2000-11-30
CN1185348C (zh) 2005-01-19
NZ502139A (en) 2002-03-28
EA200000109A1 (ru) 2000-08-28
US7374912B2 (en) 2008-05-20
BG64680B1 (bg) 2005-11-30
KR20010021522A (ko) 2001-03-15
CZ302488B6 (cs) 2011-06-15
US7198781B1 (en) 2007-04-03
BR9812096B1 (pt) 2011-09-06
CA2295936A1 (en) 1999-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU758161B2 (en) Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof
ES2229264T3 (es) Receptor il-17.
FI116943B (fi) Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori
JP2002514887A (ja) トロンボポイエチンポリペプチドの分泌方法
PT772624E (pt) Interleucina-15
JPH06505631A (ja) 巨核球刺激因子
EP1148065B1 (en) Fusion proteins comprising two soluble gp130 molecules
IE912135A1 (en) Mast cell growth factor
AU680909B2 (en) Interleukin-15
AU620537B2 (en) Human interleukin-4 muteins
MXPA00000364A (en) Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein, analogs thereof and uses thereof
EP0920511A1 (en) Expression vectors, cells, and methods for preparing thrombopoietin polypeptides
JP3689111B2 (ja) インターロイキン１５
Yasukawa et al. Fusion protein of interleukin-6 and interleukin-6 receptor without a polypeptide linker

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20160709