PT772624E - Interleucina-15 - Google Patents

Description

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"lnterleucina-15"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se de um modo geral a um factor polipeptídico das células T derivado do epitélio ("ETF") de mamíferos aqui referido como lnterleucina-1 5 ("IL-15"). Refere-se mais especificamente a uma sequência de ADNc isolada que codifica um polipéptido que possui actividade biológica de IL-15, a sequências isoladas do polipéptido IL-15 e de derivados, a processos para produção de polipéptidos IL-15 utilizando tecnologia de ADN recombinante, a um método para indução da proliferação e da diferenciação de células T e a composições contendo IL-15 que proporcionam imunidade anti-tumores e anti-doenças infecciosas.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As células T, também conhecidas como linfócitos T, são uma classe de células imunitárias efectoras. Em tecidos periféricos, as células T podem ser divididas em dois amplos grupos com base na expressão mutualmente exclusiva das moléculas de superfície celular CD4 e CD8. As células T CD8+ típicas tornam-se células T citotóxicas após activação e destroem células alvo portadoras de antigénios através de contacto celular directo. As células T CD4+ activadas proporcionam geralmente sinais positivos, por exemplo função "ajudante" para células B (que permite que as células B se diferenciem em células que formam anticorpos) e portanto, são designadas células T ajudantes.

Foram anteriormente identificados seis factores de crescimento das células T. Os seis são: Interleucina (IL)-2, -4, -7, -9, -12 e o co-factor IL-10. A estrutura de leitura aberta de IL-2 codifica para um polipéptido de 153 aminoácidos de 15 kDa. A IL-2 é produzida por determinadas células T e por linfócitos granulares grandes. A IL-2 foi originalmente identificada como factor que sustenta o crescimento a longo prazo de células T humanas. Para além do crescimento das células T, os seus efeitos incluem a activação de células assassinas naturais (NK) e de células assassinas activadas por linfóquinas (LAK) bem como de células T citotóxicas ("CTL"), macrófagos e promoção do crescimento de células B.

A IL-4 é uma proteína de 15-20 kDa produzida pelas células T activadas, pelas células do estroma da medula óssea e pelos mastócitos. A estrutura de leitura aberta de IL-4 codifica para a IL-4 de murídeo de 140 aminoácidos e para a IL-4 humano de 153 aminoácidos. Originalmente, a IL-4 foi definida como factor que activava o crescimento e a diferenciação das células B. Os seus efeitos incluem também a activação de macrófagos e a indução das moléculas do MHC de classe II, o crescimento de algumas linhas de células T e de mastócitos, a proliferação e a criação de CTL a partir de células T do sangue periférico humano, o aumento da produção de imunoglobulina pelas células B e é um co-factor no crescimento das células hematopoiéticas a partir de hemocitoblastos. A IL-4 tem um papel importante na regulação superior das actividades das células NK e LAK induzidas por IL-2. A IL-4 humana não é activa em células de murídeo. A IL-7 é um polipéptido de 177 aminoácidos de 20-25 kDa produzido por células do estroma da medula óssea e do timo. Embora tenha sido originalmente descrita como um factor de crescimento de pré-células B, a IL-7 sustenta o crescimento de pró-células B bem como de pré-células B. A IL-7 induz também a proliferação e a criação de CTL a partir de células T do sangue periférico humano, a expressão do receptor de IL-2, a produção de IL-2 e a proliferação de células CD4" e CD8 + . A IL-7 tem também efeito sinérgico com a IL-2 e aumenta a proliferação de células T do timo e induz a proliferação de timócitos CD4' e CD8\ A IL-9 é um polipéptido de 144 aminoácidos de 30-40 kDa produzido por linfócitos T activados. A IL-9 foi inicialmente identificada como factor de crescimento das células T. A IL-9 estimula o crescimento eritróide e aumenta a proliferação induzida por IL-3 dos mastócitos derivados da medula óssea. Modula também a produção de IgE e de IgG pelas células B na presença de IL-4. A IL-9 de murídeo é activa em células humanas, enquanto a IL-9 humana não actua em células de murídeo. A IL-10 humana é um polipéptido de 178 aminoácidos de 16-20 kDa produzido por.macrófagos e pelas células T ajudantes TH2 mas não pelas TH1. Tal como IL-2, IL-4 e IL-7, a IL-10 possui várias actividades biológicas diferentes. A IL-10 foi identificada com base na sua capacidade para inibir a produção de citóquinas pelas células T activadas. Ambas as IL-10, humana e de

murídeo, são co-factores estimulantes do crescimento de timócitos e de células T em combinação com IL-7 ou com IL-2 mais IL-4. A IL-10 estimula a viabilidade e o crescimento dos mastócitos em combinação com IL-4 ou com IL-3 mais IL-4. A IL-10 também induz a secreção de IgG e a expressão de moléculas do MHC de classe II em células B e aumenta a sua viabilidade em cultura. A IL-12 é constitutiva ou induzida por éster de forbol e ionóforo de cálcio em linhas celulares linfoblastóides e é produzida por macrófagos estimulados por LPS. A IL-12 tem um peso molecular de 70 kDa e uma estrutura heterodimérica invulgar, sendo formada por duas glicoproteínas ligadas por ligações dissulfureto. A maior das duas subunidades glicoproteicas é um polipéptido de 328 aminoácidos de 40 kDa. A menor subunidade glicoproteica é um polipéptido de 253 aminoácidos de 35 kDa. Ambas as subunidades glicoproteicas são necessárias para a sua bioactividade. A IL-12 induz a proliferação de células T activadas de ambos os subconjuntos 004" e CD8 + independentemente de IL-12. A IL-12 activa também a citotoxicidade mediada por células NK e tem efeito sinérgico com a IL-12 para gerar células LAK. Ao contrário de IL-2 e de IL-7, mas de forma semelhante a IL-4, a IL-12 causa pouca ou nenhuma proliferação das células mononucleares do sangue periférico em repouso.

Giri et a/., J. Ce//. BioL, Suplemento 18D, página 400, Resumo N° V561 de "Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology, 26 de Fevereiro - 17 de Abril de 1994, relataram a caracterização bioquímica de uma nova citóquina, designada IL-15. O resumo não descreveu qualquer informação sobre a sequência relacionada com esta citóquina.

SUMÁRIO PO INVENTO

Foi isolado e purificado um novo factor de crescimento de células T, daqui em diante referido por "lnterleucina-15" ("IL-15"). Foi isolada uma sequência de ADNc que codifica um polipéptido IL-15 de símio que possui uma região a 5' não codificadora de 483 pb que antecede uma estrutura de leitura aberta de 489 pb e uma região a 3' não codificadora de 303 pb. Uma sequência de ADNc que codifica um polipéptido IL-15 humano possui uma região a 5' não codificadora de 316 pb que antecede uma estrutura de leitura aberta de 489 pb e uma região a 3' não codificadora de 397 pb. As sequências nucleotídicas e as

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EP 0 772 624/PT sequências de aminoácidos deduzidas das estruturas de leitura abertas de símio e humana são divulgadas em SEQ ID Nos 1 e 4. Ambas as estruturas de leitura abertas, de símio e humana, codificam um polipéptido percursor (SEQ ID Nos 2 e 5). Cada um dos polipéptidos percursores compreende uma sequência de comando de 48 aminoácidos e uma sequência que codifica polipéptidos IL-15 de símio ou humanos. Os polipéptidos IL-15 activos de símio e humano são divulgados em SEQ ID Nos 3 e 6, respectivamente. O presente invento compreende ainda outros polipéptidos IL-15 codificados por sequências nucleotídicas que hibridam, sob condições de rigor de moderadas a elevadas, a sondas definidas pelos nucleótidos de 145 a 489 das SEQ ID Nos 1 ou 4 ou às suas cadeias de ADN ou ARN complementares e que codificam na expressão para polipéptidos que estimulam os linfócitos T a proliferarem e a diferenciarem-se. O invento compreende ainda sequências nucleotídicas que, devido à degenerescência do código genético, codificam polipéptidos IL-15 codificados pelas sequências nucleotídicas acima descritas e pelas sequências que lhes são complementares.

Mais ainda, o invento proporciona moléculas de ADN recombinante compreendendo as sequências nucleotídicas anteriores, por exemplo, vectores de expressão ou plasmídeos e células hospedeiras transformadas, que são úteis na produção de polipéptidos IL-15 e processos para a produção de polipéptidos IL-15 recombinantes utilizando tais moléculas.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida da espécie activa de IL-1 5 de símio. A Figura 2 mostra a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida da espécie activa humana de IL-15. A Figura 3 mostra um esquema de purificação e de sequenciação proteica útil no isolamento de polipéptidos IL-15. A Figura 4 mostra a homologia entre as sequências nucleotídicas que codificam a espécie de IL-15 humana e de símio. A sequência humana é mostrada acima da sequência de símio.

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A Figura 5 mostra a homologia entre as sequências de aminoácidos da espécie de IL-15 humana e de símio. A sequência humana é mostrada acima da sequência de símio. Em ambas as espécies, a sequência de comando (aminoácidos de 1 a 48) é clivada do polipéptido percursor para formar o polipéptido maduro (aminoácidos de 49 a 162). A Figura 6 mostra a actividade biológica de IL-15 recombinante, IL-12 e IL-4, in vitro utilizando células CTLL-2. A resposta proliferativa in vitro das células CTLL-2 foi medida em concentrações crescentes de citóquina recombinante (expressa em ng/ml). Os dados estão expressos em cpm de timidina-3H incorporada ( X 10'3). A Figura 7 mostra a indução da actividade lítica de CTL por de rlL-15 e IL-2. Os linfócitos T citolíticos (CTL) específicos de antigénios foram criados in vitro. Células mononucleares do sangue humano periférico (PBL) de um dador foram estimuladas com PBL irradiados de um dador alogénico em culturas contendo várias concentrações de IL-2 ou de rlL-15 humana. As culturas foram ensaiadas quanto à actividade citolítica contra os alvos marcados com 51Cr derivados do dador estimulante original. As unidades líticas foram calculadas como o inverso da fracção necessária da cultura de resposta para gerar 50% da libertação máxima específica de 51Cr. A Figura 8 mostra a indução da actividade lítica das células LAK por rlL-15 e IL-2. As células assassinas activadas por linfóquinas (LAK) foram criadas in vitro. PBL humanos foram estimulados com PBL autólogos irradiados e a actividade citolítica foi medida contra a linha celular linfoblastóide de Daudi. As unidades líticas foram calculadas como o inverso da fracção necessária da cultura de resposta para gerar 30% da libertação máxima específica de 51 Cr. A Figura 9 mostra a indução da actividade lítica das células NK por rlL-15 e IL-2. As células assassinas naturais (NK) foram isoladas de PBL humanos totais através de afinidade para anticorpos para microesferas paramagnéticas utilizando anticorpos monoclonais contra CD16. As células NK purificadas foram cultivadas durante 3 dias e a actividade citolítica foi medida contra a linha celular de eritroleucemia K562.

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DESCRICAO DETALHADA DO INVENTO "lnterleucina-15" ou "IL-15" referem-se a polipéptidos de mamíferos que são estruturalmente semelhantes aos polipéptidos aqui divulgados e que estimulam os linfócitos T a proliferarem e a diferenciarem-se. A IL-15 é distinguível de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-10 e IL-12 na estrutura e na origem celular (Tabela 1). Em primatas, o polipéptido IL-15 é inicialmente produzido por células epiteliais como um polipéptido percursor de IL-15 de 162 aminoácidos. Este percursor contém uma sequência de comando de 48 aminoácidos que é removida do polipéptido percursor para formar o polipéptido maduro. O polipéptido IL-15 maduro é capaz de sinalizar a proliferação e/ou a diferenciação de células T percursoras ou maduras. A proteína, portanto, pode ser utilizada para promover culturas a longo prazo de linfócitos T e de linhas de células T in vitro. "slL-15" refere-se a uma espécie de IL-15 de símio. "hlL-15" refere-se a uma espécie de IL-15 humana. "rlL-15" refere-se a IL-15 recombinante. Tanto a slL-15 como a rlL-15 purificadas estimularão a proliferação de células CTLL-2 (Gillis e Smith, Nature 268: 154 (1977); ATCC TIB 214). Nos ensaios de proliferação de CTLL-2, os sobrenadantes de células transfectadas com percursor expresso recombinantemente e fusões em enquadramento de formas maduras de slL-15 induziram a proliferação de células CTLL-2. Para outros ensaios, foram isolados do sangue periférico humano as células T do sangue periférico ("PBT") e os leucócitos mononucleares do sangue periférico ("PBL"). Verificámos que a rlL-15 estimulou a proliferação de PBT e de PBL previamente cultivados com fito-hemaglutinina ("PHA"). A rlL-15 estimulou também a proliferação de células CD4+ e CD8+ activadas por PHA. A rlL-15 estimulou a proliferação de células T humanas em repouso e de clones de células T de murídeo em repouso na presença de anticorpos anti-CD3 (receptor de células T). As experiências com PBT activadas por PHA demonstram que a rlL-15 exerce os seus efeitos estimuladores do crescimento independentemente de IL-2, na medida em que os anticorpos para IL-2 ou para o receptor de IL-2 não inibem a IL-15.

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Os termos IL-15, slL-15 e hlL-15 incluem análogos ou subunidades dos polipéptidos nativos de mamífero que são codificados pelos ácidos nucleicos que se ligam às sequências de ácidos nucleicos das Figuras 1 e 2 (nucleótidos de 145 a 489, inclusive, em SEQ ID Nos 1 e 4) sob condições de rigor especificado e que induzem a proliferação e a diferenciação de linfócitos T e que estimulam a proliferação de linhas de células T e de PBT isolados. "Tecnologia de ADN recombinante" ou "recombinante", tal como aqui se utiliza, refere-se a técnicas e processos para a produção de polipéptidos específicos a partir de células microbianas (p. ex., bacterianas, fúngicas ou de leveduras) ou de mamíferos ou organismos (p. ex., transgénicos) que foram transformados ou transfectados com sequências de ADN sintéticas ou clonadas para permitir a biossíntese de péptidos heterólogos. Os padrões de glicosilação nativos apenas serão alcançados com sistemas de expressão em células de mamíferos. As leveduras proporcionam um padrão de glicosilação diferente. A expressão em células procarióticas (p. ex., E. co/i) produzirá de um modo geral polipéptidos sem glicosilação. * "Biologicamente activo" significa que um polipéptido IL-15 específico é capaz de estimular a proliferação e/ou a diferenciação de linfócitos T. No caso de slL-15 e de hlL-15, esta actividade biológica corresponde também à estimulação da proliferação de linhas de células T ou de PBT de murídeo ou de primatas, por exemplo, humanos.

Uma "sequência nucleotídica" refere-se a um polinucleótido na forma de um fragmento separado ou como componente de uma construção de ADN maior, que é derivado de ADN isolado pelo menos uma vez na forma substancialmente pura (i.e., isento de materiais endógenos contarhinantes) e numa quantidade ou concentração que permite identificação, manipulação e recuperação das sequências nucleotídicas suas componentes através de métodos bioquímicos padrão (tais como os delineados em Sambrook et a/., Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) tal como um vector de clonagem. Tais sequências são de preferência proporcionadas na forma de uma estrutura de leitura aberta não interrompida por sequências internas não traduzidas, ou intrões, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. As sequências de ADN não traduzidas podem estar presentes a 5' ou a 3' de uma estrutura de

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leitura aberta, onde as mesmas não interferem com a manipulação ou a expressão das regiões de codificação. "Vector de expressão recombinante" refere-se a um plasmídeo compreendendo uma unidade de transcrição que compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos que possuem um papel regulador na expressão génica, por exemplo, promotores ou potenciadores, de (2) uma sequência estrutural ou de codificação que é transcrita em ARNm e traduzida num polipéptido que possui actividade biológica de IL-15 e de (3) sequências de iniciação e de terminação da transcrição e da tradução apropriadas. Os vários elementos reguladores que podem ser utilizados são discutidos abaixo (ver Técnicas de ADN Recombinante). Os elementos estruturais destinados a utilização em sistemas de expressão em leveduras incluem de preferência uma sequência de comando que permite a secreção extracelular do polipéptido traduzido por uma células de levedura hospedeira. Alternativamente, num sistema de expressão bacteriano, o polipéptido recombinante pode incluir um resíduo de metionina no terminal-N. 0 resíduo de metionina do terminal-N pode ser subsequentemente clivado do polipéptido recombinante expresso para proporcionar um produto adequado para posterior purificação. "Sistema de expressão microbiano recombinante" refere-se a uma monocultura substancialmente homogénea de microorganismos hospedeiros adequados, por exemplo, bactérias, tais como E. co/i, ou leveduras, tais como S. cerevisiae, que integraram estavelmente uma unidade de transcrição recombinante no ADN cromossómico ou que transportam a unidade transcrição recombinante como componente de um plasmídeo residente. Geralmente, as células hospedeiras que constituem um sistema de expressão microbiano recombinante são a progénie de uma única célula ancestral transformada. Os sistemas de expressão microbianos recombinantes expressarão polipéptidos heterólogos após indução dos elementos reguladores ligados a uma sequência nucleotídica estrutural a ser expressa.

As células hospedeiras transformadas são células que foram transformadas ou transfectadas com um vector de expressão recombinante. A IL-15 de mamífero expressa encontrar-se-á dentro da célula hospedeira e/ou será excretada para o sobrenadante da cultura, dependendo da natureza da célula hospedeira e da construção do gene inserida na célula hospedeira.

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Condições de hibridação de rigor moderado, tal como aqui definido e tal como conhecidas pelos peritos na arte, referem-se às condições descritas em, por exemplo, Sambrook et al., supra, Vol. 2, págs. 8.46-8.49 e 9.47-9.55. As condições de rigor moderado, tal como definidas por Sambrook et a!., incluem, por exemplo, hibridação de um dia para o outro e lavagens pós-hibridação a 55°C, SSC 5x e SDS 5%. As condições rigorosas ou de alto rigor incluem temperaturas altas de hibridação e lavagens pós-hibridação, ou menores concentrações salinas.

Polipéptidos IL-15

Purificámos uma espécie de IL-15 de símio (slL-15) e sequenciámos o péptido do terminal-N da slL-15 madura. Utilizando a sequência de aminoácidos do terminal-N e PCR, isolámos um ADNc que codifica a slL-15 e determinámos a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida da slL-15 madura (Figura 1) e a sequência nucleotídica e a sequência de aminoácidos deduzida de um percursor do polipéptido slL-15 (SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2). A sequência do polipéptido IL-15 percursor na espécie de símio compreende uma proteína activa madura (SEQ ID No 3) precedida por uma sequência de comando de 48 aminoácidos. A sequência de comando são os aminoácidos 1-48 de SEQ ID No 2. A IL-15 dos primatas estimula a proliferação de linhas de células T de murídeo (p. ex., CTLL-2) e estimula a proliferação e a diferenciação das células PBT humanas. 0 presente invento compreende também outras IL-15 de mamíferos, incluindo a IL-15 humana, que possui actividade biológica de IL-15 e é codificada pelas sequências nucleotídicas que hibridam, sob condições de rigor de moderado a alto, com sondas definidas em SEQ ID No 5. Um plasmídeo contendo um clone recombinante do ADNc da IL-1 5 humana foi depositado com a American Type Culture Collection, 12302 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA ("ATCC") de acordo com o Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Objectivos do Procedimento de Pantenteamento em 19 de Fevereiro de 1993 com o número de acesso ATCC 69245. 0 depósito foi nomeado "141-hETF" e compreendia uma estirpe de £. coti contendo o plasmídeo hETF/pDC406 que continha uma região a 5' não codificadora de 316 pb precedendo uma estrutura de leitura aberta de 489 pb e uma região a 3' não codificadora de 397 pb flanqueada pelos adaptadores Sal I mostrados em SEQ ID Nos 7 e 8. Todas as

restrições na disponibilidade ao público do material depositado serão irrevogavelmente retiradas após a concepção de uma patente. A estrutura dos aminoácidos dos polipéptidos IL-15 aqui divulgados pode ser modificada através da formação de conjugados covalentes ou agregativos com outras porções químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes ou através da criação de sequências de aminoácidos mutantes. Os derivados covalentes de IL-15 de mamíferos são preparados através da ligação de determinados grupos funcionais às cadeias laterais de aminoácidos de IL-15 de mamífero ou ao terminal-N ou ao terminal-C de um polipéptido IL-15 de mamífero. Outros derivados da IL-15 de mamífero dentro do âmbito deste invento incluem conjugados covalentes ou agregativos de IL-15 de mamífero ou de fragmentos deste com outras proteínas ou polipéptidos, tal como através de síntese em cultura recombinante tal como fusões do terminal-N ou do terminal-C. Por exemplo, o polipéptido conjugado pode ser uma sequência de sinal (ou de comando) polipeptídica na região do terminal-N de um polipéptido IL-15 de mamífero para transporte do seu local de síntese para um local dentro ou fora da membrana ou da parede celulares (p. ex., o comando do factor-α de leveduras). Ainda, utilizando técnicas convencionais, os polipéptidos IL-15 podem ser expressos como fusões de polipéptidos compreendendo sequências polipeptídicas adicionais, tais como de Fc ou sequências de outras imunoglobulinas, sequências de ligação, ou outras sequências que facilitem a purificação e a identificação de polipéptidos IL-15. Mais ainda, as fusões de polipéptidos IL-15 podem compreender fusões com outras citóquinas para proporcionar novas entidades polifuncionais. Em outras citóquinas inclui-se, por exemplo, qualquer uma das interleucinas de 1 a 13, o factor de necrose tumoral (TNF), o factor estimulante de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), o factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), o factor de crescimento dos mastócitos (MGF) e outras citóquinas que afectam o crescimento, a diferenciação ou a função de células imunitárias. O presente invento inclui ainda polipéptidos IL-15 que possuem glicosilação alterada. Os polipéptidos IL-15 expressos em sistemas de expressão de leveduras ou de mamíferos (p. ex., células COS-7 (ATCC CRL 1651)) podem ser semelhantes ou significativamente diferentes no peso molecular e no padrão de glicosilação em relação ao polipéptido IL-1 5 nativo. Isto depende da escolha

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 12 do sistema de expressão. A expressão de polipéptidos IL-15 em sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli, proporciona moléculas não glicosiladas.

Podem ser sintetizados mutantes funcionais análogos de IL-15 humana ou de outros mamíferos, por exemplo, com locais de N-glicosilação inactivados através da síntese e da ligação de oligonucleótidos e ou através de técnicas de mutagénese específica para um local. Os derivados do polipéptido IL-15 podem ser expressos na forma de hidrato de carbono homogéneo e reduzido utilizando sistemas de expressão de leveduras. Os locais de N-glicosilação em polipéptidos eucarióticos são caracterizados através de um tripleto de aminoácídos Asn-Φ-Ω onde Φ é um aminoácido qualquer excepto Pro e Ω é Ser ou Thr. Um mutante derivado de IL-15, tal como aqui se refere, é um polipéptido substancialmente homólogo a uma sequência de um IL-15 de mamífero nativo mas que possui uma sequência de aminoácídos diferente do polipéptido IL-15 de mamífero nativo devido a uma deleção, inserção ou substituição.

Os análogos bio-equivalentes de polipéptidos IL-15 de muteínas de IL-15 podem ser construídos através de várias substituições de resíduos de aminoácidos ou de sequências, ou através de deleção de resíduos ou de sequências terminais ou internos não necessários para a actividade biológica. Por exemplo, os resíduos Cys podem ser delecionados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas após a renaturação. Outras abordagens à mutagénese envolvem a modificação de resíduos de aminoácidos dibásicos para aumentar a expressão em sistemas de leveduras nos quais está presente a actividade da protease KEX2. Geralmente, as substituições são feitas conservativamente através da substituição de um aminoácido com características físico-químicas semelhantes às do resíduo nativo.

Os oligonucleótidos anti-sentido ou com sentido compreendem sequências de ácidos nucleicos de cadeia simples (tanto ARN como ADN) capazes de se ligarem a ARNm de IL-15 com sentido ou a sequências de ADNc de IL-15 anti-sentido. Um oligonucleótido anti-sentido ou com sentido, de acordo com o presente invento, compreende um fragmento das sequências nucleotídicas das Figuras 1 ou 2 ou um complemento de ADN ou de ARN das sequências nucleotídicas das figuras 1 e 2. Um tal fragmento compreende pelo

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ menos cerca de 14 nucleótidos e é capaz de se ligar ao ADN de IL-15. A capacidade para criar um oligonucleótido anti-sentido ou com sentido, com base numa sequência de ADNc para IL-15 é descrita em, por exemplo, Stein e Cohen, Câncer Res. 48: 2659 (1988) e van der Krol et aL, BioTechniques 6: 958 (1988). O isolamento e a caracterização de IL-15 a partir de fontes celulares não recombinantes requerem uma linha celular de mamífero que produz IL-15 e uma linha de células respondedoras que prolifere em resposta à estimulação da IL-15. Um ensaio biológico para IL-15 de mamíferos pode empregar uma linha de células T dependente de factores de crescimento como detector dos factores que induzem a proliferação das células linfóides. As células T isoladas de amostras de sangue recolhidas de humanos ou de outros mamíferos também podem ser utilizadas para ensaiar polipéptidos IL-1 5 de mamíferos.

Uma linha celular dependente de IL-15 pode ser derivada de células CTLL-2 de murídeo. Esta linha celular responde a IL-2 humano, de murídeo e recombinante, purificados, e a IL-4 de murídeo, mas não a IL-1, IL-3, ou IL-4 humana ou a qualquer outros factores de crescimento conhecidos.

Podem-se utilizar as sequências de ADNc de IL-15 de símio ou humano aqui divulgadas para obter ADNc codificando outros homólogos de mamíferos da IL-15 de símio ou humano através de técnicas de hibridação cruzada entre espécies. Sucintamente, é criada uma sonda oligonucleotídica a partir da sequência nucleotídica da região de codificação proteica do ADNc de slL-15 tal como descrita na Figura 1 ou em SEQ ID No 1 ou do ADNc de hlL-15 tal como descrita na Figura 2 ou em SEQ ID No 4. Esta sonda pode ser feita através de técnicas padrão, tais como as descritas em Sambrook et a!., supra. A sonda de símio ou humana é utilizada para pesquisar uma biblioteca de ADNc ou uma biblioteca de ADN genómico de mamíferos sob condições de rigor moderado. As bibliotecas de ADNc de mamíferos podem ser feitas a partir de ARNm isolados de, por exemplo, linfócitos do sangue periférico de murídeo. Alternativamente, podem ser pesquisadas outras bibliotecas de ADNc ou de ARNm isolados de vários tecidos ou de linhas celulares através de hibridação de Nothern para determinar uma fonte adequada de ADN de IL-15 ou de ARNm de mamíferos.

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Purificação de IL-15 de CV-1/EBNA

Purificámos IL-15 para proporcionar uma preparação de polipéptido isolado a partir de uma solução proteica não homogénea, tal como, meio condicionado colhido de células que expressam IL-15. A actividade de IL-15 em amostras brutas de meio condicionado nem sempre é detectável utilizando as técnicas de bioensaio de IL-15 presentemente disponíveis. Pelo menos um passo de purificação é tipicamente necessário antes da actividade biológica de IL-15 se tornar detectável utilizando as técnicas de bioensaio aqui descritas.

Uma solução proteica não homogénea, p. ex., meio condicionado, é preparada através da linha CV-1/EBNA (C.J. McMahan et a/., EMBO J., 10(10): 2821-2832 (1991); ATCC CRL 10478) de células do rim do Macaco Verde Africano em crescimento num meio de cultura de tecidos. De preferência, o meio é Meio Essencial Modificado por Dulbecco com alto teor de glucose ("DMEM", Gibco). Mais preferivelmente utiliza-se um meio de crescimento e um meio de produção. 0 meio de crescimento empregue no isolamento de slL-15 tal como aqui descrito foi DMEM com alto teor de glucose (4500 mg/l) suplementado com 7,5% de soro fetal bovino, 50 u/ml de penicilina, 50 u/ml de estreptomicina, L-glutamina de 3 a 4,0 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e tampão de ácido N-[2- hidroxietil]piperazino-N'-[2-etanossulfónico] ("HEPES") 10 mM. Foi desenvolvido um meio de produção de DMEM isento de soro sem vermelho de fenol suplementado com 50 u/ml de penicilina, 50 u/ml de estreptomicina, L-glutamina de 3 a 4,0 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e tampão HEPES 10 mM, para a produção e purificação de IL-15. As células CV-1/EBNA eram dependentes de adesão e podiam crescer em placas, balões, garrafas redondas ou microtransportadores.

Mais especificamente, a IL-15 foi produzida cultivando células CV-1/EBNA em microtransportadores num biorreactor controlado. As reservas de células foram mantidas em garrafas redondas. Para iniciar um ciclo de produção, as células foram tratadas com tripsina e inoculadas num balão de agitação contendo o meio de crescimento acima descrito e microtransportadores Cytodex®4 3 a 5 g/l (Pharmacia). A densidade da cultura inicial variou de 1,5 a 3,5x105 células/mi. Para assegurar a eficiente adesão das células aos microtransportadores, as células foram mantidas em balões de agitação durante 2 a 24 horas. As culturas em balões de agitação foram incubadas a 37°C e

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EP 0 772 624/PT 15 agitadas a de 25 a 40 RPM. Após o período de adesão, a cultura foi transferida para um biorreactor controlado. Os valores estabelecidos de temperatura, pH, oxigénio e agitação no biorreactor foram 37°C, 7,0, 20% de saturação (relativamente ao ar) e 75-85 RPM, respectivamente. Para a observação de rotina do crescimento e da saúde das células, foram observadas amostras através de microscopia de campo claro. A quantificação do crescimento celular foi alcançada através da contagem dos núcleos libertados após tratamento com uma solução de ácido cítrico 100 mM e violeta de cristal a 0,1%. A cultura foi suplementada com meio de crescimento adicional quando os níveis de amónia atingiram 5,0 mM. Isto foi repetido até os microtransportadores estarem confluentes. O meio de cultura foi então mudado para o meio de produção isento de soro acima descrito. Este procedimento foi efectuado permitindo que os microtransportadores assentassem no fundo do reactor, aspirando o meio de crescimento e substituindo-o pelo meio de produção. Isto foi repetido até ter sido atingida uma diluição de aproximadamente 3125 vezes. Pode-se esperar de dois a seis ciclos de produção. Em cada ciclo, permitiu-se que as células produzissem durante de quatro a sete dias e depois eram colhidos 80% do meio de produção. Isto foi repetido até as células estarem completamente soltas dos microtransportadores.

Foram utilizados aproximadamente 64 litros de meio condicionado por CV-1/EBNA para purificar e proporcionar proteína para a sequenciação dos aminoácidos-N de slL-15. Tal como mostrado na Figura 3, o esquema de purificação incluiu ultrafiltração, cromatografia hidrófoba, cromatografia de permuta aniónica, cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RP-HPLC) e electroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). A proteína foi sequenciada através de transferência do gel de SDS para uma membrana de fluoreto de polivinilideno ("PVDF") e da determinação de uma sequência de aminoácidos do terminal-N através de degradação de Edman directamente a partir da membrana de PVDF. A sequenciação dos aminoácidos do terminal-N revelou os 33 primeiros aminoácidos mostrados em SEQ ID No 3. A sequenciação subsequente de um clone de ADNc obtido de uma biblioteca de ADNc de CV-1/EBNA produziu uma sequência de ADN que codifica o polipéptido de SEQ ID No 2. Este clone inclui uma sequência de comando relativamente curta de 48 aminoácidos de SEQ ID No 2 e um polipéptido maduro representado por SEQ ID No 3.

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 16 Técnicas de ADN Recombinante

Os polipéptidos IL-15 humanos, de símio e de outros mamíferos são produzidos de preferência através de técnicas de ADN recombinante. Tais técnicas envolvem a inserção de um ADNc que codifica um polipéptido IL-15 humano ou de outros mamíferos ou um derivado deste num vector de expressão. A produção recombinante de polipéptidos IL-15 de mamíferos ou de derivados destes necessita primeiro do isolamento de um clone de ADN (i.e. ADNc) que codifique em expressão para um polipéptido IL-15 de mamífero ou para um derivado deste. Os clones de ADNc são derivados de células primárias ou de linhas celulares que expressam polipéptidos IL-15 de mamíferos. Primeiro é isolado o ARNm celular total, depois é feita uma biblioteca de ADNc a partir do ARNm através de transcrição inversa. Um clone de ADNc pode ser isolado e identificado utilizando a informação da sequência de ADN aqui proporcionada para conceber uma sonda de hibridação cruzada entre espécies ou um iniciador de PCR tal como acima descrito. 0 ADNc isolado está de preferência na forma de uma estrutura de leitura aberta não interrompida por sequências não traduzidas internas, ou intrões. O ADN genómico que contém as sequências nucleotídicas relevantes que codificam para expressão de polipéptidos IL-15 de mamíferos pode também ser utilizado como fonte de informação genética útil na construção de sequências de codificação. O ADNc isolado pode ser mutado através de técnicas conhecidas na arte para promover derivados de IL-15 ou análogos que exibam actividade biológica de IL-15.

Os vectores de expressão recombinante incluem fragmentos de ADN sintético ou derivados de ADNc que codificam IL-15 ou derivados biologicamente activos destes. O ADN que codifica um IL-15 ou um derivado deste é ligado operativamente a uma sequência nucleotídica estrutural ou reguladora da transcrição ou da tradução adequada, tal como uma sequência derivada de genes de mamíferos, de micróbios, de vírus ou de insectos. Os exemplos de sequências reguladoras incluem, por exemplo, uma sequência genética possuindo um papel regulador na expressão do gene (p. ex.,

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 17 promotores ou potenciadores de transcrição), uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifique locais de ligação do ARNm aos ribossomas adequados e sequências apropriadas que controlem o início e o termo da transcrição e da tradução. As sequências nucleotídicas estão ligadas operativamente quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente com o gene estrutural. Por exemplo, uma sequência de ADN para um péptido de sinal (comando de secreção) pode estar ligado operativamente a uma sequência de ADN de um gene estrutural para uma IL-15 de mamífero ou um derivado desta se o péptido de sinal for expresso como parte de uma sequência de aminoácidos percursora e participar na secreção de um IL-15 de mamífero. Ainda, uma sequência nucleotídica promotora está ligada operativamente a uma sequência de codificação (p. ex., ADN de um gene estrutural) se a sequência nucleotídica promotora controla a transcrição da sequência nucleotídica do gene estrutural. Mais ainda, o local de ligação ao ribossoma pode estar operativamente ligado a uma sequência nucleotídica codificadora de um gene estrutural (p. ex., IL-15 de mamífero) se o local de ligação ao ribossoma estiver posicionado dentro do vector para encorajar a tradução.

As células hospedeiras adequadas para expressão de IL-15 de mamíferos ou de derivados destes incluem procariotas, leveduras ou células eucarióticas superiores sob o controlo de promotores apropriados. Os procariotas incluem organismos gram negativos e gram positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. As células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, BaciHus subtilis, Salmonella typhimurium e várias outras espécies dentro dos géneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus. Tal como descrito com mais detalhe abaixo, os exemplos de células hospedeiras adequadas incluem também leveduras tais como 5. cerevisiae, uma linha celular de mamíferos tal como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de insectos. Os sistemas de tradução sem células também podem ser empregues para produzir IL-15 de mamíferos ou derivados destes utilizando ARN derivados das construções de ADN aqui divulgadas. Os vectores de clonagem e de expressão apropriados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de leveduras e de mamíferos são descritos, por exemplo, em Powels et al., Cloninq Vectors: A Laboratorv Manual. Elsevier, New York, 1985.

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Quando uma IL-15 de mamífero ou um derivado desta é expresso numa célula hospedeira de levedura, a sequência nucleotídica (p. ex., o gene estrutural) que codifica em expressão para uma IL-15 de mamífero ou para um derivado desta pode incluir uma sequência de comando. A sequência de comando pode permitir uma melhor secreção extracelular do polipéptido traduzido pela célula hospedeira de levedura. A IL-15 de mamífero pode ser expressa em células hospedeiras de levedura, de preferência do género Saccharomyces (p.ex., S. cerevisiae). Outros géneros de leveduras, tais como Pichia ou Kluyveromyces, também podem ser empregues. Os vectores de leveduras contêm frequentemente uma sequência origem de replicação de um plasmídeo de levedura de 2 μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região promotora, sequências para poliadenilação e sequências para terminação da transcrição. De preferência, os vectores de leveduras incluem uma sequência origem de replicação e um marcador seleccionável. As sequências promotoras adequadas para vectores de leveduras incluem promotores para metalotioneína, 3-fosfogliceratoquinase (Hitzeman et a/., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et a!., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; e Holland et a!., Biochem. 17: 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfogliceratomutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Outros vectores e promotores adequados para utilização em expressão de leveduras estão ainda descritos em Hitzeman, EP-A-73657.

Os vectores de leveduras podem ser montados, por exemplo, utilizando sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação). Outras sequências de ADN de leveduras que podem ser incluídas numa construção de expressão de leveduras incluem um promotor ADH2 reprimível através de glucose e o líder de secreção do factor-a. 0 promotor ADH2 foi descrito por Russell et ai. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et ai. {Nature 300: 724, 1982). A sequência de comando do factor-α de levedura dirige a secreção de polipéptidos heterólogos. A sequência de comando do factor-α é frequentemente inserida entre a sequência promotora e a sequência do gene estrutural. Ver, p. ex., Kurjan et a!., Cell 30: 933, 1982;

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ e Bitter et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5330, 1984. Uma sequência de comando pode ser modificada próximo da sua extremidade 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto facilitará a fusão da sequência de comando com o gene estrutural.

Os protocolos de transformação de leveduras são conhecidos dos peritos na arte. Um desses protocolos é descrito por Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 1929, 1978. O protocolo de Hinnen et ai. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, em que o meio selectivo consiste em 0,67% de base azotada de levedura, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glucose, 10 mg/ml de adenina e 20 mg/ml de uracilo.

As células hospedeiras de leveduras transformadas com vectores contendo a sequência promotora ADH2 podem ser cultivadas para indução de expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é um meio que consiste em 1% de extracto de levedura, 2% de peptona e 1% de glucose, suplementado com 80 mg/ml de adenina e 80 mg/ml de uracilo. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre quando a glucose se esgota do meio.

Alternativamente, numa célula hospedeira procariótica, tal como E. coii, a IL-15 de mamífero ou um derivado desta pode incluir um resíduo de metionina do terminal-N para facilitar a expressão do polipéptido recombinante numa célula hospedeira procariótica. A Met do Terminal-N pode ser clivada da IL-15 de mamífero recombinante expressa.

Os vectores de expressão recombinantes portadores da sequência nucleotídica do gene estrutural de IL-15 de mamífero recombinante ou de um derivado desta são transfectados ou transformados para um microorganismo ou linha celular de mamífero hospedeiros adequados.

Os vectores de expressão transfectados para células hospedeiras procarióticas compreendem geralmente um ou mais marcadores fenotípicos seleccionáveis. Um marcador fenotípico seleccionável é, por exemplo, um gene que codifica proteínas que conferem resistência a antibióticos ou que fornecem um requisito autotrófico e uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro para assegurar a amplificação dentro do hospedeiro. Outros vectores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem um marcador 20 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ seleccionável de origem bacteriana derivado de plasmídeos comercialmente disponíveis. Este marcador seleccionável pode compreender elementos genéticos do vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017). O pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e à tetraciclina e assim proporciona um meio simples de identificação das células transformadas. As secções "de esqueleto" de pBR322 são combinadas com um promotor apropriado e uma sequência do gene estrutural de IL-15 de mamífero. Outros vectores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) e pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA).

As sequências promotoras são vulgarmente utilizadas para vectores de expressão de células hospedeiras procarióticas. As sequências promotoras usuais incluem o sistema promotor da β-lactamase (penicilinase) e da lactose (Chang et a/., Nature 275: 615, 1978; e Goeddel et aL, Nature 281: 544, 1979), o sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et aL, Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; e EPA 36776) e o promotor tac (Sambrook et aL, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Um sistema de expressão de células hospedeiras procarióticas particularmente útil emprega um promotor PL do fago λ e uma sequência repressora termolábil de cl857ts. Os vectores plasmídicos disponíveis em American Type Culture Collection que incorporam derivados do promotor PL de λ incluem o plasmídeo pHUB2 (residente na estirpe JMB9 de E. coli (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente em E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Também podiam ser empregues sistemas de culturas de células hospedeiras de mamíferos ou de insectos para expressar o polipéptido IL-1 5 de mamífero recombinante ou derivados deste. Os exemplos de linhas celulares de mamíferos adequadas incluem as linhas COS-7 das células de rim de macaco (Gluzman et aL, Ce/I 23: 175, (1981); ATCC CRL 1651), as linhas celulares de células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células CHO, células HeLa (ATCC CRL 2) e BHK (ATCC CRL 10). Os vectores de expressão de mamíferos adequados incluem elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, uma sequência promotora, um potenciador ligado ao gene estrutural, outras sequências a 5' ou a 3' flanqueadoras não transcritas, tais como locais de ligação ao ribossoma, um local de poliadenilação, locais de união ao dador e ao aceitador e sequências de terminação da transcrição.

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As sequências de controlo da transcrição e da tradução em vectores de expressão de células hospedeiras de mamíferos podem ser proporcionadas por fontes virais. Por exemplo, as sequências promotoras e as sequências potenciadoras de células de mamíferos vulgarmente utilizadas são derivadas de Polioma, Adenovírus 2, Vírus 40 de símio (SV40) e citomegalovírus humano. As sequências de ADN derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, a origem de SV40, os promotores precoce e tardio, o potenciador, os locais de união e de poliadeniiação, podem ser utilizadas para proporcionar os outros elementos genéticos necessários para a expressão de uma sequência de um gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores precoce e tardio virais são particularmente úteis pois ambos são facilmente obtidos de um genoma virai como fragmento que também pode conter uma origem virai de replicação (Fiers et a/., Nature 273: 1 13, 1978). Também podem ser utilizados fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde que a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende do local Hind\\\ até ao local Bgl\ localizada no local origem de replicação virai de SV40 esteja incluída.

Podem ser construídos os vectores de expressão de mamíferos como exemplos, tal como divulgados por Okayama e Berg (Mo/. Cell Biol. 3: 280, 1983). Vectores de expressão de mamíferos úteis adicionais são descritos no Pedido de Patente dos EUA N° de Série 07/480694 apresentado em 14 de Fevereiro de 1990 e no Pedido dos EUA N° de Série 07/543193 apresentado em 5 de Junho de 1 990.

Purificação de IL-15 de Mamífero Recombinante

Os polipéptidos IL-15 podem ser preparados através da cultura de células hospedeiras transformadas sob as condições de cultura necessárias para expressarem polipéptidos IL-15 de mamíferos ou derivados destes. Os polipéptidos expressos resultantes podem então ser purificados a partir dos meios de cultura ou dos extractos celulares. Um polipéptido IL-15 de mamífero ou um derivado deste pode ser concentrado utilizando um filtro de concentração proteica comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Com ou sem o passo de concentração, os meios de cultura podem ser aplicados numa matriz de purificação tal como meio hidrófobo de cromatografia. O meio preferido é Phenil-Sepharose® CL-4 (Pharmacia). Alternativamente, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato possuindo grupos 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 22

dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou de outros tipos vulgarmente empregues em purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser utilizado meio de filtração em gel. A IL-15 recombinante é estável em tampões aquosos ácidos e uma resina de permuta catiónica também pode ser utilizada.

Finalmente, podem ser empregues um ou mais passos de cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RP-HPLC) empregando meio hidrófobos de RP-HPLC, p. ex., sílica gel possuindo grupos metilo ou outros grupos alifáticos pendentes, para purificar adicionalmente a IL-15. Alguns ou todos os passos de purificação anteriores, em várias combinações, podem também ser empregues para proporcionar uma proteína recombinante substancialmente homogénea. Alternativamente, alguns ou todos os passos utilizados no procedimento de purificação acima descrito para IL-15 de símio podem também ser empregues. A proteína recombinante produzida em culturas bacterianas é normalmente isolada através da destruição inicial das células hospedeiras, centrifugação, extracção dos sedimentos celulares se for um polipéptido insolúvel ou do sobrenadante se for um polipéptido solúvel, seguidos de um ou mais passos de concentração, "salting-out", cromatografia de permuta iónica ou exclusão por tamanhos. Finalmente, pode ser empregue RP-HPLC nos passos finais de purificação. As células microbianas podem ser destruídas através de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação e descongelação, aplicação de ultra-sons, destruição mecânica ou utilização de agentes de lise celular.

As células hospedeiras de leveduras transformadas são empregues de preferência para expressarem IL-15 como polipéptido excretado. Isto simplifica a purificação. O polipéptido recombinante excretado de uma fermentação de células hospedeiras de leveduras pode ser purificado através de métodos análogos aos descritos por Urdal et a!., (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal et al.t descrevem dois passos sequenciais de HPLC de fase inversa para purificação de IL-2 humana recombinante numa coluna de HPLC preparativa.

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Administração de Polipéptido IL-15 de Mamífero e de Composições Derivadas O presente invento proporciona métodos de utilização de composições terapêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de IL-15 num diluente ou transportador adequado. Para o uso terapêutico, a IL-15 purificado ou um derivado deste biologicamente activo é administrado a um doente, de preferência um humano, para tratamento de um modo apropriado à indicação. Assim, por exemplo, as composições de IL-15 administradas para suprimir uma forma de anemia podem ser dadas através de injecção de bolo, infusão contínua, libertação sustentada a partir de implantes ou outra técnica adequada. A administração pode ser através de injecção intravenosa, injecção subcutânea ou infusão parentérica ou intraperitonlal. Tipicamente, um agente terapêutico de IL-15 será administrado na forma de uma composição farmacêutica compreendendo o polipéptido purificado em conjunção com transportadores, excipientes ou diluentes fisiologicamente aceitáveis. Tais transportadores não serão tóxicos para os doentes nas dosagens e nas concentrações empregues. Vulgarmente, a preparação de tais composições vincula a combinação de um polipéptido IL-15 de mamífero ou de um derivado deste com tampões, antioxidantes tais como ácido ascórbico, polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono tais como glucose, sacarose ou dextrano, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa e outros estabilizantes e excipientes. A solução salina tamponada neutra e a solução salina misturada com albumina de soro conspecífico são exemplos de diluentes apropriados.

Os seguintes exemplos têm o objectivo de ilustrar e não de limitar. EXEMPLO 1 PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO PARA slL-15 NATIVA Ultrafiltracão A ultrafiltracão não foi absolutamente necessária para purificar IL-15. O procedimento, no entanto, remove certas proteínas menores contaminantes e reduz o volume, acelerando assim o esquema de purificação. O passo de ultrafiltracão pode ser efectuado utilizando um cartucho em espiral YM10 ou YM30, um cartucho de fibras ocas, ou uma membrana circular em vários tipos de aparelhos de ultrafiltracão. No entanto, foi preferido um sistema de 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 24

ultrafiltração Amicon com um cartucho em espiral YM30. Não foi necessária qualquer muda de tampão antes ou após este passo.

Foi obtida uma solução proteica não homogénea, i.e. meio condicionado, através do crescimento de culturas de células CV-1/EBNA em DMEM isento de soro e isento de vermelho de fenol em biorreactores com microtransportadores de Cytodex® 3 a 5 g/l. Oito biorreactores de 8 litros (total de 64 litros), foram colhidos e centrifugados para remover as células e os microtransportadores, filtrados através de um filtro de membrana de acetato de celulose de 0,22 micra e depois concentrados até um volume final de cerca de 2 litros utilizando um cartucho em espiral de YM30. De preferência, o concentrado de YM30 é filtrado antes de sofrer cromatografia hidrófoba. Este passo minimizará a contaminação através da remoção de bactérias e de outras partículas. Qualquer filtro com um tamanho de poro de 0,1 a 0,45 micra que não se ligue a proteínas pode ser utilizado; no entanto, foi preferido um filtro de membrana de acetato de celulose de 0,22 micra.

Cromatografia Hidrófoba A cromatografia hidrófoba proporcionou um modo rápido de transferência da proteína para um tampão de baixa salinidade que pode ser aplicado em colunas de permuta aniónica. Adicionalmente, proporcionou purificação de três a seis vezes. Mais ainda, não foi necessária nenhuma muda de tampão antes ou depois deste passo. Várias colunas hidrófobas são adequadas. Foi preferida uma coluna de Phenil-Sepharose® CL-40 (Pharmacia). Como uma alternativa ao passo de cromatografia hidrófoba aqui descrito, pode ser utilizado um passo de diafiltração ou de diálise.

Por preferência, foi adicionado sulfato de amónio ao concentrado da ultrafiltração até uma concentração final de cerca de 0,2 Μ. O concentrado da ultrafiltração foi tamponado com HEPES 1M a pH cerca de 8,5 até uma concentração final de cerca de 20 mM. O concentrado foi então bombeado para uma coluna CL-40 de Phenil-Sepharose® e lavado com sulfato de amónio 0,2 M, HEPES 10mM a pH cerca de 8,5 para remover as proteínas não ligadas. As proteínas ligadas foram eluídas com HEPES 10mM a pH cerca de 8,5. O pico das proteínas eluídas (incluindo IL-15) foi aplicado numa coluna de permuta aniónica.

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Cromatoarafia de Permuta Aniónica A purificação por cromatografia de permuta aniónica permitiu purificação adicional sem ser necessário diálise ou mudança de tampão. Este passo envolve de preferência duas passagens do banco de proteínas de Phenil-Sepharose® por colunas contendo um meio de permuta aniónica. Após cada uma das passagens, as proteínas ligadas foram eluídas com NaCI em HEPES. Embora vários meios de permuta aniónica e sistemas de tampões possuindo um pH de cerca de 8 a cerca de 9 fossem adequados, o DEAE Sephacel® {Pharmacia) seguido por Mono Q permitiu passos de permuta aniónica sequenciais sem mudas de tampão ou diálise. O DEAE Sephacel® proporcionou a remoção de algumas proteínas contaminantes antes da aplicação numa cromatografia líquida de rápida resolução ("FPLC", Pharmacia) Mono Q de maior resolução. A concentração de NaCI utilizada dependeu do meio de permuta aniónica seleccionado e do pH do tampão escolhido. Para eluir a proteína do gel de permuta aniónica podiam ter ser utilizados outros sais em substituição do NaCI.

Foi preferido que o NaCI fosse adicionado ao banco de Phenil-Sepharose até uma condutividade final de cerca de 1,2 miliSiemens/Centímetro ("mS/cm") (NaCI a menos de aproximadamente 0,1 M) e bombeado para uma coluna DEAE Sephacel® que foi equilibrada com NaCI a cerca de 0,1 M em HEPES a cerca de 10 mM a pH cerca de 8,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de NaCI de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 M em HEPES a cerca de 10 mM a pH cerca de 8,5. As fracções de proteína activa eluídas (incluindo IL-15) foram reunidas para aplicação numa coluna Mono Q de permuta aniónica. 0 banco activo de DEAE Sephacel® foi diluído com HEPES a cerca de 10 mM até uma condutividade final de menos de 1,6 mS/cm (NaCI a menos de 0,14 Μ). O banco diluído foi então bombeado para uma coluna Mono Q FPLC de cromatografia líquida de rápida resolução que foi equilibrada com NaCI a cerca de 0,14 M em HEPES a cerca de 10 mM a pH cerca de 8,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de NaCI de cerca de 0,14 M a cerca de 0,5 M em HEPES a cerca de 10 mM a pH cerca de 8,5. As fracções activas (incluindo IL-15) foram reunidas para aplicação em cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RP-HPLC).

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RP-HPLC Ο polipéptido IL-15 de mamífero nativo é estável em pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 e a pH aproximadamente 2,5 em ácido trifluoroacético a 0,1% ("TFA") em acetonitrilo ("AcN"). A actividade de IL-15 não foi recuperada quando foram utilizados tampões aquosos ácidos; eliminando assim muitos sistemas de tampões de HPLC e não permitindo que a cromatografia de permuta catiónica fosse incluída no esquema de purificação. As colunas C4 de RP-HPLC (Vydac™ 0,46 χ 25 cm, 5 micra) proporcionaram a maior purificação. Outras colunas de fase inversa (C8 ou C18) não serviram; a proteína eluiu de C4 a uma alta concentração de AcN e não foi de todo recuperada de C8 ou de C18. Os outros sistemas de tampões que experimentámos (i.e., acetato de amónio/metanol pH 7 e acetato de piridina/propanol) não tiveram sucesso. A purificação por RP-HPLC envolveu de preferência duas passagens do banco activo de Mono Q sobre a matriz de Vydac™ C4. Na primeira passagem, o banco activo de Mono Q foi bombeado para uma coluna C4 de HPLC a cerca de 1 ml/min e eluiu com um gradiente de 0,1% de TFA/H20 a 0,1% de TFA/100% de AcN no seguinte gradiente: de 0 a 45% de AcN, 1 % de AcN/minuto de 45 a 60% de AcN, 0,5% de AcN/minuto de 60 a 100% de AcN, 2% de AcN/minuto

As fracções activas do pico (incluindo IL-1 5) eluíram entre cerca dos 48 e cerca dos 51% de AcN. As fracções activas determinadas através de bioensaio foram reunidas, diluídas com 0,1% de TFA/H20 para reduzir a concentração de AcN e aplicadas à mesma coluna C4. O banco activo, diluído que correu em C4 com TFA/AcN foi bombeado novamente para a coluna C4, lavado com 0,1% de TFA/H20 e eluído com um gradiente linear de 0,1% de TFA/H20 (tampão A) a 0,1% de TFA/60% de n-propanol (tampão B) a cerca de 0,5 ml/min. O gradiente foi corrido a cerca de 0,5% de tampão B/min. As fracções foram bioensaiadas para identificar a fracções que continham IL-15. As fracções que continham IL-15 foram reunidas.

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SDS-PAGE A IL-15 purificado pode ser visualizado através de SDS-PAGE corado com prata. As bandas proteicas de IL-15 de mamífero isoladas através de SDS-PAGE podem ser transferidas e analisadas para determinar as suas sequências de aminoácidos do terminal-N. A banda da proteína IL-15 pode ser identificada através de bioensaio.

As fracções proteicas de IL-15 purificada que correram em HPLC de C4 com TFA/n-propanol foram sujeitas a vácuo para secagem rápida, ressuspensas em tampão de amostra de SDS redutor e corridas num gel de poliacrilamida SDS. Por preferência, a IL-15 purificada por HPLC foi corrida em SDS-PAGE (Phastgel® 8-25%, Pharmacia) em duas pistas adjacentes. Antes da fixação e da coloração, fatias de gel de aproximadamente 1 mm foram cortadas de uma pista do Phastgel® e postas directamente em bioensaios. O restante gel foi revelado e as bandas coradas com prata coincidiram com as fatias postas em bioensaios. A actividade da IL-15 correspondeu a 15-17 kDa. Para a determinação da actividade específica, a IL-15 purificado foi ressuspenso em tampão de amostra de SDS redutor, corrido em gel de poliacrilamida SDS a 14% (Novex) e corado com prata. A pureza dos poiipéptidos slL-15 que correspondiam a 15-17 kDa era aproximadamente 222000 vezes maior que a pureza do polipéptido slL-15 nos meios condicionados de CV-1/EBNA no início do esquema de purificação (Tabela 2). Para além da pureza e dos dados da proteína, a Tabela 2 mostra a actividade do polipéptido slL-15 nativo num bioensaio de CTLL-2 (descrito abaixo no Exemplo 2) conduzido após cada um dos passos do processo de purificação. (Segue Tabela 2) 84 774ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ28 LU Q < 9 > ι—CJ < < COLU τ— >Ο w JS '09υ λ-οο (Λοο (0Cο'5Cοοο Ο <Λ09 "D <Λ Ο Η·C α> <λ (0ο '09 ε

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Transferências para PVDF Ο gel de poliacrilamida SDS a 14% foi transferido para uma membrana de PVDF (ProBlot® de Applied Biosystems) utilizando corrente constante, regulada a cerca de 60 V durante cerca de uma hora. As bandas proteicas foram visualizadas através de coloração da membrana PVDF com azul de Coomassie (0,1% em 10% de ácido acético, 50% de metanol). A membrana pode ser descorada utilizando a mesma solução sem azul de Coomassie para realçar as bandas proteicas. A banda da proteína que corresponde à actividade da IL-15 foi cortada e foi efectuada a determinação da sequência proteica do terminal-N directamente a partir da membrana PVDF.

Seauenciacão do Polipéptido slL-15 A preparação de IL-15 resultante do passo anterior de RP-HPLC foi analisada através de SDS-PAGE. Cada um dos géis foi corado com prata para indicar a presença de bandas proteicas. O bioensaio das fatias de gel não coradas que correspondiam às bandas visíveis indicou que a actividade de IL-15 estava associada a proteínas com pesos moleculares na gama de 15-17 kDa. O terminal-N do polipéptido de 15-17 kDa, transferido para uma membrana de PVDF, foi sequenciado através de degradação de Edman num sequenciador de proteínas de Applied Biosystems. Os resultados indicaram a identidade dos 33 primeiros aminoácidos mostrados em SEQ ID No 3. A sequenciação subsequente de um clone de ADNc obtido de uma biblioteca de símio proporcionou uma sequência que codificava o polipéptido de SEQ ID No 2. O polipéptido de SEQ ID No 2 compreende uma sequência de comando relativamente curta de 48 aminoácidos e um polipéptido maduro representado por SEQ ID No 3. EXEMPLO 2

BIOENSAIO

As células CTLL-2 proporcionam um bioensaio rápido e sensível para detecção de polipéptidos IL-15. Outras linhas celulares que também proliferam em resposta a IL-15 com sensibilidade variável são CTLL-2.4 (Valentine et a!., Eur. J. Immunol., 21(4): 913 (1991), 32D (Greenberg, Federation Proceedings 42: 2762 (1983)), BAF-B03 (Hatakeyma et al., Cell, 59: 837 (1989)), M07e (Avanzi et al., Br. J. Haematol. 69: 359 (1988)) e TF1 (Kitamura et a!., J. Cell Physcio/., 140: 323 (1989)).

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Por preferência, foram cultivadas células CTLL-2 em DMEM de alto teor de glucose suplementado com IL-2 a cerca de 30 ng/ml, soro fetal bovino (FBS) a 5%, 2-mercaptoetanol 5χ10'5 M, penicilina a 50 pg/ml, estreptomicina 50 μοΛηΙ e L-glutamina 3-4,0 mM a 37°C, C02 a 10% e humidade a 97%. A CTLL-2 é uma linha celular dependente de factores que necessita de IL-2 para crescer. Consequentemente, para o ensaio, as células CTLL-2 foram lavadas duas vezes com DMEM ce alto teor de glucose suplementado com FBS a 5%, 2-mercaptoetanol 5χ10'5 M, penicilina a 50 pg/ml, estreptomicina a 50 pg/ml e L-glutamina 3-4,0 mM para remover a IL-2. As amostras de IL-15 a serem ensaiadas foram tituladas em DMEM -FBS a 5% em placas de microtítulo de fundo plano de 96 poços. As células CTLL-2 lavadas foram adicionadas (volume final do ensaio de 100 μΙ, 2000 células/poço) e as placas foram incubadas cerca de 24 horas a 37°C e C02 a 10%. As placas foram pulsadas com timidina-3H (25 Ci/mMole) a 0,5 μΟί/ρορο durante cerca de 5 horas, depois foram colhidas (dispositivo de colheita de células de 96 poços Inotech) e contaram-se as CPM (sistema de contagem proporcional de gás Packard Matrix 96). As unidades foram calculadas a partir das CPM onde 1 unidade é igual ao número de microlitros que origina 50% da estimulação máxima. EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DO CLONE DE ADNc DE slL-15 A sequência dos 31 aminoácidos do terminal-N do polipéptido slL-15 purificado (aminoácidos 1-31 em SEQ ID No 3) foi utilizada para conceber iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificação por PCR das sequências de ADN específicas de IL-15. Os primeiros seis aminoácidos do terminal-N (Asn-Trp-Val-Asn-Val-lle) foram utilizados para conceber um iniciador, uma mistura degenerada que codifica para todas as utilizações possíveis do códão dos seis primeiros resíduos de aminoácido: 5'-AAYTGGGTNAAYGTNATH-3' tal como mostrado em SEQ ID No 9 onde Y é T ou C; H é A, T ou C; e N é A, C, G ou T. As sequências de aminoácidos do terminal-N maduro de símio de 26-31 (Tyr-Thr-Glu-Ser-Asp-Val) foram utilizadas para conceber um segundo iniciador, uma mistura degenerada que codifica para um complemento de todas 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 31

as utilizações possíveis do códão dos aminoácidos 26-31 omitindo a posição 3 de Vai: 5'-ACRTCNGAYTCNGTRTA-3' e 5'-ACRTCRCTYTCNGTRTA-3' tal como mostrado em SEQ ID Nos 10 e 11, respectivamente, onde Y e N são tal como acima definido e R é A ou G.

Os ARN poliadenilados das CV-1/EBNA estimuladas durante 24 h, 37 h e 72 h com 12-miristato-13-acetato de forbol 10 ng/ml ("PMA") foram utilizados como moldes separados para a síntese da primeira cadeia de ADNc. Uma porção das reacções da primeira cadeia foi adicionada a misturas de reacção de PCR comercialmente disponíveis contendo os iniciadores oligonucleotídicos. Esta mistura foi sujeita a 31 ciclos de amplificação por PCR em reacções de 100 μΙ e tampão padrão com os iniciadores a uma concentração de 1 μΜ. Os ciclos foram programados como se segue: desnaturação a 94°C durante 0,5 min, passo de hibridação durante 0,5 min e passo de alongamento a 72°C durante 0,75 min. Dois ciclos de hibridação a cada uma das temperaturas 55°C, 53°C e 51°C foram seguidos por 25 ciclos com uma temperatura de hibridação de 49°C.

Após a amplificação, as amostras foram purificadas e sujeitas a electroforese em gel de agarose. Isto produziu uma fragmento de ADN de 92 pares de bases que foi excisado das pistas de gel de duas reacções separadas envolvendo as células CV-1/EBNA. 0 fragmento de ADN de 92 pares de bases foi purificado utilizando uma coluna Elutip-D (Schleicher & Schuell, Keene NH), clonado em pBluescript SK' (Stratagene, La Jolla, CA) e utilizado para sequenciação dideoxi do ADN.

Foi preparada uma sonda de hibridação através de marcação aleatória do iniciador, do fragmento de ADN de 92 pares de bases. A sonda de hibridação foi utilizada para pesquisar uma porção de uma biblioteca de plasmídeo contendo inserções de ADNc preparada a partir de ARN poliadenilado de CV1-/EBNA. Isto resultou no isolamento do clone C85.slL-15 que possui uma estrutura de leitura aberta que compreende a sequência nucleotídica em SEQ ID No 1.

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 32 A sequência nucleotídica da região codificadora do polipéptido de slL-15 é ilustrada em SEQ ID No 1. Esta sequência foi derivada da inserção C85.slL-15 que foi ligada através de SalI no local SalI do vector de expressão pDC406 (C. J. McMahan et a/., EMBOJ., 10(10): 2821-2832 (1991)). Foi preparado ARNm poliadenilado a partir da linha celular CV-1/EBNA e os ADNc foram preparados utilizando técnicas padrão. A linha celular CV-1/EBNA é um produtor de slL-15. As extremidades do ADNc foram adaptadas com adaptadores Sall (Haymerle et a!., Nucleic Acid Res., 14: 8615-24 (1986)): 5'-TCGACTGGAACGAGACGACCTGCT-3' 3'-GACCTTGCTCTGCTGGACGA-5' (SEQ ID Nos 7 e 8, respectivamente) e clonados no vector pDC406. Um banco consistindo em aproximadamente 500 isolados individuais contendo os plasmídeos foi plaqueado e pesquisado através de hibridação a um fragmento sonda de ADN. 0 fragmento sonda de ADN foi preparado utilizando amplificação por PCR das sequências de slL-15 do ADNc da linha celular CV-1/EBNA. EXEMPLO 4

CLONAGEM DE IL-15 HUMANA

Foi preparada uma sonda de slL-15 a partir de um fragmento SalI isolado, purificado e radiomarcado (cerca de 1,37 kb) contendo ADNc de slL-15 através de marcação primária aleatória. A actividade específica da sonda foi aproximadamente de 1x106cpm/ng. Em transferências de Northern, a sonda foi hibridada com ARN humanos de várias fontes, incluindo a linha celular IMTLH. A linha celular IMTLH foi derivada de uma transformação estável de uma cultura de células do estroma da medula óssea humana com pSV3Neo. A sonda foi hibridada com ARN humanos a cerca de 42°C em formamida a cerca de 40% durante 18 horas. A hibridação foi seguida por lavagem em 6x SSC durante cerca de dez minutos a 22°C seguido por lavagem em 2x SSC a 42°C durante 30 minutos. A autorradiografia revelou um sinal positivo na pista de IMTLH.

Sondámos transferências de Southern de bancos de bibliotecas digeridas com Sall da biblioteca de ADNc de IMTLH para identificar um banco contendo um ADNc de IL-15 humana. Utilizando o método de Haymerle et a!., Nucleic

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Acid Res., 14: 8615-24 (1986) utilizado acima para a biblioteca de CV-1/EBNA, a biblioteca de IMTLH foi construída no vector de expressão pDC406. 0 Banco "114", um banco de aproximadamente 1000 clones de ADNc diferentes, foi identificado como positivo. Aproximadamente 4000 colónias de "114" foram então plaqueadas e sondadas através de métodos convencionais de hibridação de colónias para identificar um clone contendo o ADNc de IL-15 humana. Apenas um único clone, N4.hETF, mostrou codificar IL-15 humana. Existe cerca de 96% de identidade da sequência nucleotídica e aproximadamente 96% de identidade da sequência de aminoácidos entre as sequências da estrutura de leitura aberta de IL-1 5 humana e de símio (Figuras 4 e 5). EXEMPLO 5 ESTIMULAÇÃO por rlL-15 DA PROLIFERAÇÃO DE CTLL-2

Foram inseridos ADNc codificando formas maduras de IL-15 (nucleótidos 145 a 489, inclusive, em SEQ ID Nos 1 e 4) a jusante de um sinal de secreção heterólogo de mamífero para criar o plasmídeo de expressão de rlL-15 para slL-15 e hlL-15. O sinal de secreção é um trecho de aminoácidos grandemente hidrófobo (normalmente no terminal-N de um polipéptido) que dirige a secreção e clivagem do polipéptido entre o terminal-C do péptido sinal e o terminal-N da proteína madura secretada (von Heijne, Eur. J. Biochem., 116: 419 (1981)). A sequência de sinal de secreção utilizada foi uma sequência de sinal de IL-7 de murídeo. Os plasmídeos criados foram transfectados para células COS-7. Os sobrenadantes das culturas de célula transfectadas estimularam a proliferação de CTLL-2. Adicionalmente, a região de codificação para a forma percursora de hlL-15 (SEQ ID No 3) foi inserida em pDC406 e transfectada para células CV-1/EBNA. Os sobrenadantes das células transfectadas com pDC406:hlL-15 (i.e. hETF/pDC406), mas não das que foram transfectadas com vector vazio, estimularam a proliferação de CTLL-2. EXEMPLO 6 INDUÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DE CTLL-2 por rlL-15

Foi purificada IL-15 recombinante de símio (rlL-15 de símio) a partir do sobrenadante de leveduras que expressam o ADNc de slL-15 através de uma modificação do método de purificação acima descrito no Exemplo 1 no qual foram omitidos os passos de ultrafiltração e de permuta iónica. A rlL-15 de símio foi comparada, quanto à actividade biológica, com IL-2 e com IL-4 recombinantes purificadas. A pureza de cada uma das três proteínas foi

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ confirmada através da análise dos aminoácidos. Cada uma das três proteínas recombinantes purificadas foi ensaiada quanto à actividade biológica in vitro utilizando células CTLL-2. As culturas de CTLL-2 continham a citóquina indicada com 2000 células/cultura em 100 μΙ de meio de cultura suplementado. As culturas de CTLL-2 foram tratadas com pulsos de 0,5 pCi de timidina [3H]/cultura durante as últimas 4 horas de um período de cultura de 24 horas, colhidas para um filtro de fibra de vidro e a radioactividade foi determinada através de avalanche de gás de ionização. A resposta proliferativa in vitro das células CTLL-2 foi medida em concentrações crescentes de citóquina recombinante (expressa em ng/ml). Os dados estão expressos na Figura 6 em cpm de timidina-3H incorporada (χ 10'3). EXEMPLO 7 INDUÇÃO DA ACTIVIDADE LÍTICA DE CTL, LAK E NK POR rlL-15

Foram gerados in vitro linfócitos T citolíticos (CTL) específicos para antigénios. Foram estimuladas células mononucleares do sangue periférico humano (PBL) de um dador (5x105/cultura) com PBL irradiados (5x105/cultura) de um dador alogénico em culturas contendo várias concentrações de IL-2 ou de rlL-15 humana, ou sem citóquina. As culturas efectuadas tal como descrito por M.B. Widmer et ai., em J. Exp. Med., 1 66: 1447 (1 987), colhidas após 7 dias e ensaiadas quanto à actividade citolítica contra alvos marcados com 51Cr derivados do dador estimulante original. 0 ensaio de lise continha vários números de PBL responsivos cultivados com 1000 alvos marcados em 200 μΙ de meio em poços de fundo em V e os sobrenadantes foram recolhidos após 4 horas de incubação. As unidades líticas foram calculadas como o inverso da fracção necessária da cultura responsiva para criar 50% da libertação máxima específica de 51Cr. Os dados para os CTL tratadas com citóquina estão resumidos na Figura 7.

As células assassinas activadas por linfóquinas (LAK) foram criadas sob condições de cultura idênticas às de CTL acima descritas excepto que os PBL humanos não foram estimulados com PBL irradiados de um dador alogénico. Em vez disso, os PBL autólogos irradiados foram substituídos e a actividade citolítica foi medida contra a linha celular linfoblastóide de Daudi. Para o ensaio de LAK, as unidades líticas foram calculadas como o inverso da fracção necessária da cultura responsiva para criar 30% da libertação máxima específica

35 células LAK tratadas com citóquina estão resumidos 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ de 51Cr. Os dados para as na Figura 8.

As células assassinas naturais (NK) foram isoladas dos PBL humanos totais através de afinidade de anticorpos para microesferas paramagnéticas com MACS (Miltenyi Biotec, Sunnyvale CA) utilizando anticorpos monoclonais contra CD16. As células NK purificadas foram cultivadas durante 3 dias e a actividade citolítica foi medida contra a linha celular de eritroleucemia K562. Para o ensaio de NK, as unidades líticas foram calculadas como o inverso da fracção necessária da cultura responsiva para criar 30% da libertação máxima específica de 51Cr. Os dados para as células NK tratadas com citóquina estão resumidos na Figura 9.

Devido à semelhança de actividade entre IL-2 e IL-15 nos Exemplos 6 e 7 daqui, um vulgar perito na arte esperará que IL-15 estimule a actividade de células CTL, LAK e NK e que expanda a população de células T que pode destruir células tumorais e células infectadas por vírus. Tal como acima descrito na secção sobre Administração de polipéptido IL-15, pode ser administrada uma quantidade eficaz de IL-15 num diluente ou transportador adequado a doentes com carcinomas, melanomas, sarcomas, leucemia ou linfomas, ou a doentes infectados com Herpesviridae, incluindo citomegalovírus, Polyomaviridae, Retroviridae, incluindo HIV, vírus influenza, Hepadnaviridae, hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite delta ou hepatite D.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: Grabstein, Kenneth

Anderson, Dirk Eisenman, June Fung, Victor Rauch, Charles (ii) TITULO DO INVENTO: lnterleucína-15 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Immunex Corporation (B) RUA: 51 University Street (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 98101 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Launer, Charlene (B) NÚMERO DE REGISTO: 33035 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/REGISTO: 281 1 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 206-587-0430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 489 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS 84 774ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 37

(Β) LOCALIZAÇAO: 1..489 (χϊ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC % Λ · V*. CAG TGC TAC 48 Met Arg lie Ser Lvs Pro His Leu Arg Ser lie Ser He Gin Cys Tyr -I 10 15 CTG TGT 7TA CTT CTA AAG AGT í~ ; -> TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT 56 Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser His Phe Leu 'fU» Glu Ala Glv lie His 20 25 30 G7C mmrn m « W ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTC AAA ACA r»·* >» CAA GCC 144 Vai ?he Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys 'Τ'ν — Glu Ala 35 40 45 AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA AT · GAA GAT CTT Λ-. · 152 Asn Ή -|_--|—1. Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 -- 5 0 CAA «ζΛ ATG CAT GAT GCT ACT TTA m ACA GAA AGT GAT GTT CAC 240 Gin Ser Meu His Ile Asp Λ. C ""1 U, _ « i i Λ. Leu Tyr Thr * G-í. u Ser Asn Vai His 65 70 7 5 30 o n o AGT TGC AAG GTA ACA ATG AAG TGC TTT - -O GAG mmr· * «.vj 288 Pro Ser Cys Lys Vai — A« à Meu Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 50 w S GTT ^ mm TCA CAT GAG *» - W GGA GAT ACA GAT ^ ww Λ. · CAT GAT ACA GTA GAA 325 Vai Ile Ser His Glu Ser Gly ASp Thr Asp XL0 His Asp Th~ Vai Glu 100 105 110 AAT CTT ATC ATC CTA GCA AAC AAC ATC TTG mmm » W* mr+m • w- AAT GGG AAT ATA 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn lie Leu Ser Ser Asn Gly Asn Ile 115 120 125 ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG ^sAA CTA GAG GAA AAA > > m * mm Λ A . 422 Thr Glu Ser Glv Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu GLu Glu Lys Asn Ile 130 125 140 AAA GAA TTT mmr* • sj CAG AGT mmm GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC % m*·* A* w AAC 480 Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Meu Phe Ile Asn 145 150 155 160 AC? mr+m Λ, TGA 489 Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 162 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Mec Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gin Cvs Tv- 1 5 10 is “

Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Glv -n- H,· _ 20 25 3Õ

38 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ

Vai ?he Ile 35 Leu Gly Cys ?he Ser 40 Ala Glv Leu Pro Lys 45 Thr Glu Ala Asn Trp 50 Val Asn Val Ile Ser 55 Asp Leu Lys Lys Ile 60 Glu Asp Leu Ile Gin 65 Ser Met His Ile Asp 7 0 Ala Th - Leu Tvr Thr 75 Glu Ser Asp Val His 30 Pro Ser Cys Lys Val S5 Thr Ala Met Lys Cys 90 Phe Leu ^eu Glu Leu 95 Gin Vai Ser His ICO Glu Ser Gly Asp * Λ ς • V «1 Asp Ile Hís Asp Thr 110 Val Glu Asn Leu Xle Ile Leu Ala Asn Asn 120 X L e Leu Ser Ser Asn 125 Gly Asn Ile Th.— Glu 130 Ser Gly Cys Lys Glu 135 Cys Glu Glu Leu Glu 140 Glu Lys Asn Ile Lys 145 Glu Phe Leu Gin Ser 150 Phe Val HL 3 lie Val 155 Gin Met Phe lie Asn 160

Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARÁCTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Asn 1 Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys 10 Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gin Ser Met His 20 Ile Asp Ala Thr Leu 25 Tyr Thr Glu Ser Asp 30* Val His Pro Ser Cys 35 Lys Val Thr Ala Met 40 Lys Cys Phe Leu Leu 45 Glu Leu Gin Val Ile 50 Ser His Glu Ser Gly 55 Asp Thr Asp Ile His 60 Asp Thr Val Glu Asn 65 Leu Ile Ile Leu Ala 70 Asn Asn Ile Leu Ser 75 Ser Asn Gly Asn Ile 80 Thr Glu Ser Gly Cys 85 Lys Glu Cys Glu Glu 90 Leu Glu Glu Lys Asn 95 Ile Lys Glu Phe Leu 100 Gin Ser Phe Val His 105 Ile Val Gin Met Phe 110 Ile Asn

Thr Ser

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARÁCTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 489 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍST1CA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..489 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ATG AGA TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT λΤΤ Tr* — • W w ATC CAG T AC 43 Met Arç lie Ser Lvs ?ro His Leu Arç Ser Ile Ser Ile GLr. Cys Tv s 5 10 15 ??G TTA CTT CTA AAC AGT r·" *** WA - TTT CTA GAA GCT GGC ATT CAT 96 Leu Cys Leu Leu Asn Sèr HLs Phe Leu Glu Ala Gly Ile His 20 25 5*0 GTC « A w TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTT CCT ΛΛΛ ACA GAA GCC 144 Vai ?he lie Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lvs f>W - Glu Ala 35 40 45 AAC ?GG GTG AA? GTA Λ.Λ AGT •oAT TTG ^ ^ ΛΛΛ aÀÀ ATT oAA GAT CTT ATT 192 Asn Tro Vai Asn Vai Ile Ser AS? Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu lie 50 55 60 CAA A W* ATG CAT % «nm Λ* A GAT GCT ACT TTA ACG GAA AGT GAT GTT CAC 240 Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr •PV A, Λα * Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 80 WWW AGT TGC AAA GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTA CAA 288- Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ai a Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95 GT? ATT TCA CTT GAG TCC GGA GAT GCA AGT ATT CAT GAT ACA GTA GAA 336 Vai Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Vai Glu 100 105 110 ΑΑΓ CTG ATC ATC CTA GCA AAC AAC AGT TTG TCT AAT GGG AAT GTA- 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Vai 115 120 125 ACA GAA TC? GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTG GAG GAA AAA AAT ATT 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC 48.0 Lys Glu Phe Leu Gin .Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe Ile Asn 145 .150 155 160 ACT TC? TGA 489

Thr Ser

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARÁCTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 162 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Met Arg lie Ser Lys •u M O His Leu Arg Ser 11a Ser 31 e Gin Cys Tyr - 10 - Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser H' e Phe Leu Thr .-1U Ala Gly lie Hi s 20 25 30 Vai ?he lie Leu Gly Cys ?he Ser Ai e Gly Leu Pro lys Thr Glu Au a 35 40 Λ C Asn Tr? Vai Asn Vai lie Ser Asc Leu Lys Lys’ lie Glu Asp leu Ile 50 50 Gin Ser Met His lie Asp A— 2 Th’· Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai His 65 7 0 75 80 ?ro Ser Cys Lys Vai ··*>! Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu leu Gin 35 *90 95 Vai Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser lie β Asp Vai Glu 100 105 110 Asn Leu lie lie Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn vai 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn lie 120 135 140 Lys Glu ?he Leu Gin Ser ?he Vai His lie Vai Gin Mer Phe Ile Asn 145 150 155 160

Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 41 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Asn Trp Vai Asn Vai 5 lie Ser Asp Leu Lvs 10 Lvs lie Glu Asp Leu À r lie Gin Ser Met His 20 T * o Asp Ai a m U v Leu 25 Tv r Thr Glu Ser Aso 30* vai His ?ro Ser Cys Lvs vai Thr Aj_a Mor 40 Lys Cys ?he Leu Leu 45 Giu Leu Gin Vai lie 50 Ser leu Giu Ser Giy Asp Ala Ser lie His 50 Asp Thr Vai Glu Asn 35 Leu lie lie Leu Ai a 70 A.sn Asn Ser Leu Ser 7 5 Ser Asn Giy Asn Vai 30 Thr Glu Ser Giv Cys 0 c. •J w Lys Glu Cys Glu SO Leu G1 u Giu Lys Asn lie lys Glu ?he Leu 100 Gin Ser ?he Vai His 105 2 i A vai Gin Mor P he 110 lie -Asn

Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: TCGACTGGAA CGAGACGACC TGCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 42

(iv) ANTI-SENTIDO: ΝΑΟ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: 20

AGCAGGTCGT CTCGTTCCAG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: AAYTGGGTNA AYGTNATH 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: ACRTCNGAYT CNGTRTA 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) SEM SENTIDO: SIM (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 1:

ACRTCRCTYT

CNGTRTA 17 43 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 2:

Asn m Vai Asn Vai iie Ser Asp leu Ly s Ly s 10 lie Glu Asp Leu lie •i ΐ Gin Ser Meu His 20 lie Asp Ala Thr Leu Tvr Thr Giu Ser Asp 30* vai His ?ro Ser Cvs 35 Lvs Vai Thr Ala Meu Lys. 40 Cys ?he Ι.βϋ Leu Glu 45 Leu Gin Vai 50 Ser Xaa Glu Ser Giy Asp Xaa Xaa lie His 50 Asp Thr Vai Giu Asn 55 Leu lie lie Leu Ala 70 Asn Asn Xaa Leu Ser Ser Asn Giy Asn Xaa 30 mV — Giu Ser Giy Cys Lvs 85 Giu Cys Glu Glu Leu 50 Glu Giu Lys Asn lie 55 Lys Glu ?he Leu 100 Gin Ser ?he Vai His 105 lie Vai Gin Meu ?he 110 lie Asn

Thr Ser

Lisboa, 12. DFI 2600

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Claims (16)

1. 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 1. Sequência de ADN isolada que codifica um polipéptido que exibe actividade biológica de interleucina-15 (IL-15) de mamífero que é capaz de estimular a proliferação e/ou a diferenciação de linfócitos T, em que a sequência de ADN é seleccionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ADN que codifica um polipéptido IL-15 de mamífero compreendendo a sequência: Λ5Π m Vai Asa vai 5 Ile Ser Asp Leu Lys 10 Lvj Ile- Glu Asp Leu Ile Ser Met His 20 lie Asp Ai â Thr Leu 25 Tv j Thr Glu Ser Asp 5 0* Vai His ?ro Ser Cys Lys Vai r*s — Ai a we- <0 Lys Cys ? he leu Leu 45 Giu Leu Gir. Vai Ile 50 Ser Xaa Giu Ser Giy Asp Xaa Xaa Ile His 50 As? — Vai Glu 55 Leu He ^ 1 e Leu .Ala 70 Asn Asr. Xaa Leu Ser T 5 Ser Asn Giy Asn Xaa 30 — Gin Ser Giy Cys S5 Lys Giu Cys Giu Giu SO Leu Glu Glu Lys Asn 55 lie Lys Gin ?ke Leu 100 Gin Ser ?he Vai His 105 lie vai Gin ϋβς ?he 110 Ile Asa Thr Ser em que o aminoácido 52 é Leu ou His, o aminoácido 57 é Ala ou Thr, o aminoácido 58 é Ser ou Asp, o aminoácido 73 é Ser ou lie e o aminoácido 80 é Vai ou Me: e (b) sequências de ADN que hibridam DE FORMA detectável com as sequências de ADN de (a) ou às suas cadeias complementares sob condições de alto rigor e que codificam em expressão para um polipéptido com actividade biológica de IL-1 5 de mamífero.

   84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 2/5
2. 2. Sequência de ADN isolada de acordo com a reivindicação 1, em qõe a referida sequência de ADN que codifica um polipéptido que exibe actividade de IL-15 de mamífero compreende uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) nucleótidos de 145 a 489 da sequência de ADN de SEQ ID No 1; (b) sequências de ADN que hibridam de forma detectável com as sequências de ADN de (a) ou com cadeias suas complementares sob condições de alto rigor e que codificam em expressão para um polipéptido com actividade biológica de IL-1 5 de mamífero; e (c) sequências de ADN que, devido à degenerescência do código genético, codificam um polipéptido codificado por qualquer uma das sequências de ADN anteriores.
3. 3. Sequência de ADN isolada de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sequência de ADN que codifica um polipéptido que exibe actividade de IL-15 de mamífero compreende uma sequência de ADN seleccionada do grupo que consiste em: (a) nucleótidos de 145 a 489 da sequência de ADN de SEQ ID No 4; (b) sequências de ADN que hibridam de forma detectável com as sequências de ADN de (a) ou com cadeias suas complementares, sob condições de alto rigor e que codificam em expressão para um polipéptido com actividade biológica de IL-15 de mamífero; e (c) sequências de ADN que, devido à degenerescência do código genético, codificam um polipéptido codificado por qualquer uma das sequências de ADN anteriores.
4. 4. Vector de expressão recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifica um polipéptido com actividade biológica de IL-15 de mamífero de acordo com a reivindicação 1.
5. 5. Vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação

   84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 3/5 4, em que a referida sequência de ADN que codifica um polipéptido q actividade biológica de IL-15 de mamífero é seleccionada do grupo que consiste em: (a) nucleótidos de 145 a 489 da sequência de ADN de SEQ ID No 1; (b) nucleótidos de 145 a 489 da sequência de ADN de SEQ ID No 4; (c) sequências de ADN que hibridam de forma detectável com sequências de ADN de (a) ou (b) ou com cadeias suas complementares sob condições de «· alto rigor e que codificam em expressão para um polipéptido com actividade biológica de IL-1 5 de mamífero; e - (d) sequências de ADN que, devido à degenerescência do código genético, codificam um polipéptido codificado por qualquer uma das sequências de ADN anteriores.
6. 6. Célula hospedeira transformada ou transfectada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 4 ou com a reivindicação 5.
7. 7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 em que a célula hospedeira é seleccionada do grupo que consiste em E. coli, Pseudomonas, BaciHus, Streptomyces, leveduras, fungos, células de insectos ou células de mamíferos.
8. 8. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7 em que a célula hospedeira de levedura é Saccharomyces cerevisiae.
9. 9. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7 em que a célula hospedeira de mamífero é de ovário de Hamster Chinês.
10. 10. Processo para preparação de um polipéptido IL-15, que compreende a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 ou com a reivindicação 7 sob condições que promovem a expressão e a recuperação de um polipéptido que exibe actividade biológica de IL-15, a partir da cultura.

    84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 4/5
11. 11. Composição de um polipéptido IL-15 isolado biologicamente activo que é capaz de estimular a proliferação e/ou a diferenciação de linfócitos T, que compreende uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ADN isolada de acordo com a reivindicação 1, o polipéptido definido por SEQ ID No 3, o polipéptido definido por SEQ ID No 2, o polipéptido definido por SEQ ID No 6 ou o polipéptido definido por SEQ ID No 5.
12. 12. Composição farmacêutica para estimulação da proliferação de linfócitos T que compreende o polipéptido IL-15 isolado de acordo com a reivindicação 11.
13. 13. Sequência de ADN isolada que codifica um polipéptido percursor do polipéptido IL-15 biologicamente activo que é capaz de estimular a proliferação e/ou a diferenciação de linfócitos T, em que a referida sequência de ADN é seleccionada do grupo que consiste em: uma sequência de ADN que codifica em expressão o polipéptido definido por SEQ ID No 2; e uma sequência de ADN que codifica em expressão o polipéptido definido por SEQ ID No 5.
14. 14. Sequência de ADN isolada de acordo com a reivindicação 13, em que a referida sequência de ADN que codifica um polipéptido percursor do polipéptido IL-15 biologicamente activo é seleccionada do grupo que consiste em: sequência de ADN de SEQ ID No 1; e sequência de ADN de SEQ ID No 4.
15. 15. Polipéptido tal como definido na reivindicação 11 para utilização em medicina.
16. 16. Utilização de um polipéptido tal como definido na reivindicação 11 na preparação de um agente para tratamento ou prevenção de anemia, carcinoma, melanoma, sarcoma, leucemia, linfoma ou para o tratamento ou prevenção de 84 774 ΕΡ Ο 772 624/ΡΤ 5/5 infecções causadas por Herpesviridae, incluindo Citomegalovírus, Polyomaviridae, Retrovirídae, incluindo HIV, vírus da influenza, Hepadnaviridae, incluindo hepatite A, hepatite B, hepatite C, hepatite delta ou hepatite D. Lisboa,

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