PT811065E

PT811065E - Antagonistas da interleucina-15

Info

Publication number: PT811065E
Application number: PT96907112T
Authority: PT
Inventors: Kenneth H Grabstein; Dean K Pettit; Raymond J Paxton
Original assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CA2210491C; ES2271951T3; CA2637795A1; KR19980702238A; DE69636538T2; NO20060194L; AU708549B2; AU5027596A; US6177079B1; US5795966A; FI973361A; NZ303843A; CA2637795C; US6013480A; EP0811065A1; EP1770163A3; NO973705L; WO1996026274A1; ATE339505T1; DK0811065T4

Description

ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Antagonistas da interleucina-15"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a anticorpos monoclonais criados contra um polipéptido do factor de células T de mamífero derivado do epitélio referido aqui como interleucina-15 ("IL-15") que reduz significativamente a capacidade da IL-15 para estimular a proliferação de linfócitos T num ensaio de CTLL in vitro. No invento também estão incluídas utilizações destes anticorpos para o tratamento de vários estados de doença em mamíferos onde se requer uma redução na actividade da IL-15.

ANTECEDENTES DO INVENTO A interleucina-15 é um conhecido factor de crescimento de células T que pode sustentar a proliferação de uma linha celular dependente da IL-2, a CTLL-2. A IL-15 foi primeiro descrita por Grabstein et al., em Science, 264:965 (1994) como sendo uma citocina segregada que compreende um polipéptido precursor de 162 aminoácidos que contém uma sequência de comando de 48 aminoácidos que resulta numa proteína madura de 114 aminoácidos. Grabstein et al. também descrevem a clonagem do ADNc humano de comprimento inteiro codificante do precursor de 162 aminoácidos, o qual contém uma região não codificante de 316 pb a 5' e um enquadramento de leitura aberto de 486 pb (ou um enquadramento de leitura aberto de 489 pb se incluir os 3 pb para o codão de paragem) e uma região não codificante de 400 pb a 3'. A IL-15 partilha muitas propriedades com a IL-2. Estas propriedades incluem proliferação e activação de células T humanas e murinas, indução de actividade de células assassinas activadas por linfocina (LAK), actividade de células assassinas naturais (NK) e actividade de linfócitos T citotóxicos (CTL), e co-estimulação de proliferação e diferenciação de células B.

Adicionalmente, a IL-15 e a IL-2 são moléculas estruturalmente homólogas que são capazes de se ligar a pelo menos três subunidades distintas de receptores na superfície 2 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ da membrana de células T. Os receptores da IL-2 contêm pelo menos três subunidades, α, β e γ (Toshikazu et al., Science 257:379 (1992)). A IL-15 e a IL-2 partilham a ligação a um complexo de subunidades β-γ comum, enquanto cada uma de IL-15 e IL-2 se liga a uma subunidade α especifica dos receptores (IL-15Ra e IL-2Roí, respectivamente) . A IL-15Ra foi identificada recentemente e é o objecto do pedido co-pendente com o n.° de Série 08/300 903. Anticorpos dirigidos contra a cadeia α do receptor da IL-2 (anti-IL-2Ra) não têm efeito na ligação de IL-15 (Grabstein et al., Id.). Os anticorpos dirigidos contra a subunidade β do receptor da IL-2, i.e., TU27, TU11, ou Μίύβΐ, contudo, são capazes de bloquear a actividade da IL-15, sugerindo que a IL-15 usa a subunidade β para sinalização. Da mesma maneira, a cadeia γ do receptor da IL-2 é requerida para a transdução do sinal (Giri et al., EMBO J., jL3_:2822 (1994)). A combinação das subunidades β e γ do complexo receptor da IL-15, mas nenhuma das subunidades sozinhas, liga-se à IL-15 em células COS transfectadas.

Certos estados de doença e condições fisiológicas são mediadas por células T. Estas doenças incluem rejeição de transplante de órgãos, doença do enxerto-versus-hospedeiro, doenças auto-imunes, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, distúrbios dermatológicos, diabetes mellitus insulinodependente, distúrbios oculares e síndrome nefrótica idiopática/nefropatia membranosa idiopática. De facto, a rejeição de aloenxertos e a doença do enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) têm sido associadas com a expressão aumentada dos receptores da IL-2. As células T activadas em resposta a antigénios estranhos de histocompatibilidade parecem expressar o complexo receptor da IL-2. Várias terapias foram propostas e estudadas. Por exemplo, Tinubu et al. (J. Immunol., 153:4330 (1994)), relataram que o anticorpo monoclonal anti-IL-2R3, Mikpi, prolonga a sobrevivência de aloenxertos cardíacos em primatas. Há um aumento na expressão da subunidade IL-2R3 em células que expressam CD4 e CD8 em associação com a rejeição aguda de aloenxertos, o que indica que a expressão da subunidade Ιί-2Ηβ parece aumentar em células T alorreactivas. Refira-se, por exemplo, a Niguma et al., Transplantation, 52:296 (1991). 3 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

Contudo, anterior ao presente invento, não havia terapias que se focassem na interacção ligante-receptor de IL-15 como meio de tratamento de GVHD ou para promover a sobrevivência de aloenxertos.

SUMARIO DO INVENTO O invento é dirigido a anticorpos monoclonais como aqui definido criados contra a IL-15 e a utilizações destes anticorpos no tratamento de doenças humanas. Em particular, este tratamento inclui promover a sobrevivência de aloenxertos em mamíferos e tratamento de GVHD. Os antagonistas da IL-15 são eficazes impedindo que a IL-15 efectue a transdução de um sinal a uma célula através das subunidades β ou γ do complexo receptor da IL-15, deste modo antagonizando a actividade biológica da IL-15. Alguns dos anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem interferir com a ligação da IL-15 às subunidades β ou γ do complexo receptor da IL-15, embora não interfiram substancialmente com a ligação da IL-15 a IL-15Ra.

Em adição, o invento abrange anticorpos monoclonais como aqui definido que imunorreagem com IL-15 madura e impedem a transdução de sinal ao complexo receptor da IL-15. O invento é também dirigido à utilização dos anticorpos monoclonais como aqui definido no tratamento de uma doença ou condição nas quais se requer uma redução na actividade da IL-15 em células T. Estas doenças incluem rejeição de transplante de órgãos, doença do enxerto-versus-hospedeiro, doenças auto-imunes, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, distúrbios dermatológicos, diabetes mellitus insulinodependente, distúrbios oculares e síndrome nefrótica idiopática/nefropatia membranosa idiopática. Em particular, na rejeição de aloenxertos, a actividade da IL-15 pode levar a uma resposta imunitária do hospedeiro contra o enxerto e eventual rejeição. Da mesma maneira, em GVHD, o enxerto, tipicamente um transplante da medula óssea, origina uma resposta imunitária contra o hospedeiro. A supressão destas actividades pelos anticorpos monoclonais contra a IL-15 de acordo com o invento pode ser vantajosa para promover e prolongar a sobrevivência do enxerto, e para tratar GVHD. 4 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

Vários investigadores relataram ο prolongamento da sobrevivência de enxertos com o emprego de anticorpos, tais como anti-TAC, um anticorpo monoclonal anti-humano dos receptores α da IL-2. Refira-se a Reed et al., Transplantation, _47g55-59 (1989), onde se mostra gue anti-TAC melhorou a transplantação de aloenxertos renais em primatas. Em adição, Brown et al., Proc. Natal. Acad. Sei., 88:2663 (1991) descrevem a utilização de anti-TAC humanizado no prolongamento da sobrevivência de aloenxertos cardíacos em primatas. Kirkman et al., Transplantation, 5_1 : 107 (1991), também descrevem um ensaio clinico envolvendo anti-TAC na prevenção da rejeição precoce de aloenxertos. Como a IL-15 possui muitas actividades biológicas similares a IL-2, e de facto partilha certas subunidades de receptores com a IL-2, a interferência com a actividade prejudicial da IL-15 em condições de doença tem um potencial terapêutico distinto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O invento é dirigido a um anticorpo monoclonal criado contra a interleucina-15 (IL-15) de SEQ. ID. NO:l ou 2 que especificamente previne a IL-15 de transduzir um sinal através das subunidades β ou γ do complexo receptor da IL-15.

Como empregue aqui, "Tecnologia de ADN recombinante" ou "recombinante" refere-se a técnicas e processos para produzir determinados polipéptidos a partir de células de micróbio (e.g., bactéria, insecto ou levedura) ou de mamífero ou a partir de organismos (e.g., transgénicos) que foram transformados ou transfectados com sequências de ADN clonadas ou sintéticas de forma a permitir a biossíntese de péptidos heterólogos. Padrões de glicosilação nativa só serão obtidos com sistemas de expressão em células de mamífero. A levedura proporciona um padrão de glicosilação distinto. A expressão em células procarióticas (e.g., E. coli) geralmente produzirá polipéptidos sem glicosilação.

Uma "sequência nucleotídica" refere-se a um polinucleótido na forma de um fragmento separado ou como um componente de uma construção maior de ADN, que foi derivado de ADN ou ARN isolados pelo menos uma vez na forma substancialmente pura (i.e., isenta de materiais endógenos contaminantes), e numa quantidade ou concentração que permite 5 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ identificação, manipulação e recuperação das suas sequências nucleotidicas componentes por métodos bioquímicos Standard (tais como aqueles descritos em Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI (1989)). Estas sequências são proporcionadas preferivelmente na forma de um enquadramento de leitura aberto sem interrupção por sequências internas não traduzidas, ou intrões, as quais estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. As sequências de ADN não traduzido podem estar presentes a 5' ou 3' de um enquadramento de leitura aberto, onde as mesmas não interferem com a manipulação ou expressão das regiões codificantes. "Vector recombinante de expressão" refere-se a um plasmideo que compreende uma unidade transcricional compreendendo uma disposição de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão de genes, por exemplo, promotores ou potenciadores, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que codifica a IL-15 ou uma muteina de IL-15, e (3) sequências de iniciação de transcrição e tradução apropriadas e, se desejado, sequências de terminação. Exemplos representativos de vários elementos reguladores que podem ser empregues são referidos adiante (refira-se a Técnicas de ADN Recombinante). Elementos estruturais para se utilizarem em sistemas de expressão de levedura incluem preferivelmente uma sequência de comando que possibilita a secreção extracelular de polipéptidos traduzidos por uma célula hospedeira de levedura. Alternativamente, num sistema bacteriano de expressão, o polipéptido recombinante pode incluir um resíduo de metionina N-terminal. O resíduo de metionina N-terminal pode ser subsequentemente clivado do polipéptido recombinante expresso de modo a proporcionar um produto adequado para purificação adicional. "Sistema microbiano recombinante de expressão" refere-se a uma monocultura substancialmente homogénea de microorganismos hospedeiros adequados, por exemplo, bactérias, tais como E. coli, ou levedura, tal como S. cerevisiae, que foram integrados estavelmente numa unidade transcricional recombinante em ADN cromossómico, ou transportam a unidade transcricional recombinante como componente de um plasmideo residente. Geralmente, as células hospedeiras que constituem o 6 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ sistema microbiano recombinante de expressão são a progénie de uma única célula ancestral transformada. Sistemas microbianos recombinantes de expressão expressarão polipéptidos heterólogos após indução dos elementos reguladores ligados a uma sequência nucleotídica estrutural a ser expressa.

As moléculas de IL-15, maduras ou nativas de símio, têm a sequência de aminoácidos 49-162 de SEQ. ID NO:l e as moléculas humanas de IL-15 têm a sequência de aminoácidos 49-162 de SEQ. ID NO:2.

Preparação de IL-15 A IL-15 humana ou simiana pode ser obtida de acordo com os procedimentos descritos por Grabstein et al., Science 264:965 (1994), os quais são incorporados aqui por referência, ou por procedimentos convencionais tais como a reacção em cadeia da polimerase (PCR) . Um depósito de ADNc humano de IL-15 foi feito com a American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) em 19 de Fevereiro de 1993 e foi-lhe atribuído o número de acesso 69245. O depósito foi denominado "141-hETF". O depósito foi feito de acordo com os termos do Tratado de Budapeste.

Acredita-se que a Asp56 afecta a ligação com a subunidade β e que a Gin156 afecta a ligação com a subunidade γ do complexo receptor da IL-15. A produção recombinante de uma IL-15 requer primeiro o isolamento de um clone de ADN (i.e., ADNc) que codifica uma IL-15. Os clones de ADNc são derivados de células primárias ou linhas celulares que expressam polipéptidos de IL-15 de mamífero. Primeiro, o ARNm total das células é isolado e a seguir constrói-se uma biblioteca de ADNc a partir de ARNm por transcrição reversa. Um clone de ADNc pode ser isolado e identificado com a informação dada aqui das sequências de ADN, para se desenhar uma sonda de hibridação de espécies cruzadas ou iniciador de PCR como descrito atrás. Estes clones de ADNc têm a sequência de ácidos nucleicos 1-486 de SEQ. ID NO:l e SEQ. ID NO:2. 0 ADNc isolado está preferivelmente na forma de um enquadramento de leitura aberto sem interrupção por sequências 7 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ internas não traduzidas, ou intrões. O ADN genómico contendo as relevantes sequências nucleotidicas que codificam polipéptidos de IL-15 de mamífero também pode ser utilizado como uma fonte de informação genética útil na construção de sequências codificantes.

Os vectores recombinantes de expressão incluem fragmentos de ADN sintético ou derivado de ADNc que codificam uma IL-15. O ADN que codifica uma IL-15 está ligado operativamente a uma sequência nucleotídica adequada, transcricional ou traducional, reguladora ou estrutural, tal como uma derivada de genes de mamífero, micróbio, vírus ou insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem, por exemplo, uma sequência genética tendo um papel regulador na expressão de genes (e.g., promotores ou potenciadores transcricionais) , uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência codificante de locais de ligação dos ribossomas ao ARNm, e sequências apropriadas que controlam a iniciação e terminação da transcrição e da tradução. As sequências nucleotidicas encontram-se operativamente ligadas quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente ao gene estrutural. Por exemplo, uma sequência de ADN para um péptido de sinal (sequência de comando de secreção) pode estar operativamente ligada a uma sequência de ADN do gene estrutural para uma IL-15 se o péptido de sinal for expresso como parte de uma sequência precursora de aminoácidos e participa na secreção de uma IL-15. Além disso, uma sequência nucleotídica promotora está operativamente ligada a uma sequência de codificação (e.g., ADN do gene estrutural) se a sequência nucleotídica promotora controlar a transcrição da sequência nucleotídica do gene estrutural. Ainda mais, um local de ligação no ribossoma pode estar operativamente ligado a uma sequência nucleotídica codificante do gene estrutural para IL-15 se o local de ligação do ribossoma estiver posicionado no vector de forma a encorajar tradução.

As células hospedeiras adequadas para expressão de uma IL-15 incluem células de procariotas, levedura ou eucariotas superiores sob o controlo de promotores apropriados.

Procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli, ou bacilos. Células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação 8 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ incluem, por exemplo, Ε. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies dentro do género Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Como referido adiante em mais pormenor, exemplos de células hospedeiras adequadas também incluem levedura tal como S. cerevisiae, uma linha celular de mamífero tal como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células de insecto. Sistemas de tradução isentos de células também poderiam ser empregues para produzir uma IL-15 com ARN derivado das construções de ADN aqui divulgadas. Vectores de clonagem e expressão apropriados para utilização com hospedeiros celulares de bactéria, insecto, levedura e mamífero são descritos, por exemplo, em Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque, 1985.

Quando uma IL-15 é expressa numa célula hospedeira de levedura, a sequência nucleotídica (e.g., gene estrutural) que codifica uma IL-15 pode incluir uma sequência de comando. A sequência de comando pode permitir secreção extracelular melhorada de polipéptidos traduzidos por uma célula hospedeira de levedura. A IL-15 pode ser expressa em células hospedeiras de levedura, preferivelmente do género Saccharomyces (e.g., S. cerevisiae). Também se podem empregar outros géneros de levedura, tais como Pichia ou Kluyveromyces. Frequentemente, vectores de levedura conterão uma sequência da origem de replicação de um plasmídeo de levedura de 2μ, uma sequência que se replica autonomamente (ARS), uma região promotora, sequências para poliadenilação, e sequências para terminação da transcrição. Preferivelmente, os vectores de levedura incluem uma sequência da origem de replicação e um marcador seleccionável. Sequências promotoras adequadas para vectores de levedura incluem promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. T_:1A9, 1968; e Holland et al., Biochem. 1_7:4900, 1978), tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato- desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato-isomerase, isomerase 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-fosfoglicose-isomerase e glicoquinase. Outros 9 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ vectores e promotores adequados para utilização em expressão em levedura são descritos adicionalmente em Hitzeman, EP-A-73 657.

Os vectores de levedura podem ser montados, por exemplo, utilizando sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação). Outras sequências de ADN de levedura que podem ser incluídas numa construção de expressão em levedura incluem um promotor de ADH2 reprimível por glicose e um comando de secreção do factor α. O promotor de ADH2 foi descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300:724, 1982). A sequência de comando do factor α de levedura dirige a secreção de polipéptidos heterólogos. A sequência de comando do factor α é frequentemente inserida entre a sequência promotora e a sequência do gene estrutural.

Refira-se a, e.g., Kurjan et al., Cell 3_0:933, 1982; e Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1:5330, 1984. Uma sequência de comando pode ser modificada perto da sua extremidade 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto facilitará a fusão da sequência de comando ao gene estrutural.

Os protocolos de transformação de levedura são conhecidos pelos peritos na especialidade. Um destes protocolos é descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 7_5:1929, 1978. 0 protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, onde o meio selectivo consiste em 0,67% de Yeast Nitrogen Base, 0,5% de casaminoácidos, 2% de glicose, 10 mg/ml de adenina e 20 mg/ml de uracilo.

As células hospedeiras de levedura transformadas por vectores contendo a sequência promotora de ADH2 podem ser crescidas para induzir expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é um que consiste em 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, e 1% de glicose suplementada com 80 mg/ml de adenina e 80 mg/ml de uracilo. Deixa de haver repressão do promotor de ADH2 quando a glicose do meio acaba.

Alternativamente, numa célula hospedeira procariótica, tal como E. coli, a IL-15 pode incluir um resíduo de metionina 10 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ N-terminal para facilitar a expressão do polipéptido recombinante numa célula hospedeira procariótica. A Met N-terminal pode ser clivada da IL-15 recombinante expressa.

Os vectores recombinantes de expressão que albergam a sequência nucleotidica do gene estrutural da IL-15 recombinante são transformados ou transfectados para um microorganismo hospedeiro adequado ou uma linha celular de mamífero.

Os vectores de expressão transfectados para células hospedeiras procarióticas geralmente compreendem um ou mais marcadores seleccionáveis fenotípicos. Um marcador seleccionável fenotípico é, por exemplo, um gene codificante de proteínas que conferem resistência antibiótica ou que satisfazem um requisito autotrófico, e uma origem de replicação reconhecida pelo hospedeiro para assegurar amplificação no hospedeiro. Outros vectores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem um marcador seleccionável de origem bacteriana derivado de plasmídeos comercialmente disponíveis. Este marcador seleccionável pode compreender elementos genéticos do vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e à tetraciclina e proporciona assim meios de identificação de células transformadas. As secções "esqueleto" de pBR322 são combinadas com um promotor apropriado e uma sequência do gene estrutural de uma L-15. Outros vectores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). É comum utilizarem-se sequências promotoras para vectores recombinantes de expressão em células hospedeiras procarióticas. Sequências promotoras comuns incluem β-lactamase (penicilinase), o sistema promotor de lactose (Chang et al., Nature 275:615, 1978; e Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), o sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8_:4057, 1980; e EPA 36 776) e o promotor tac (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Um sistema de expressão em células hospedeiras procarióticas particularmente útil emprega um promotor PL de fagos λ e uma 11 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ sequência repressora termolábil de cl857ts. Entre os vectores plasmídeos disponíveis da American Type Culture Collection que incorporam derivados do promotor λ PL constam os plasmídeos pHUB2 (residente na estirpe E. coli JMB9 (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente em E. coli RRI (ATCC 53082)).

Também se podem empregar sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou insecto para expressar IL-15 recombinante. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem as linhas COS-7 de células de rim de macaco (Gluzman et al., Cell 23_:175, (1981); ATCC CRL 1651), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células CHO, células HeLa (ATCC CCL 2), e linhas celulares BHK (ATCC CRL 10). Vectores adequados de expressão em mamíferos incluem elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, uma sequência promotora, um potenciador ligado ao gene estrutural, outras sequências não transcritas flanqueadoras a 5' ou 3' , tais como os locais de ligação nos ribossomas, um local de poliadenilação, locais dadores e aceitadores de splice, e sequências transcricionais de terminação.

Sequências transcricionais e traducionais de controlo em vectores de expressão em células hospedeiras de mamífero podem ser proporcionadas por fontes virais. Por exemplo, sequências promotoras de células de mamífero normalmente usadas são derivadas de polioma, adenovírus 2, vírus símio 40 (SV40), e citomegalovírus humano. Sequências de ADN derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, origem de SV40, promotores precoce e tardio, potenciador, splice e locais de poliadenilação podem ser usadas para se obter os outros elementos genéticos requeridos para expressão de uma sequência do gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores virais precoce e tardio são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos a partir de um genoma virai na forma de um fragmento que pode também conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 2 73:113, 1978) . Também se podem usar fragmentos maiores ou menores de SV40 desde que se inclua a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende do local Hind III no sentido do local Bgl I localizada no sítio da origem de replicação virai de SV40. 12 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

Vectores de expressão em mamíferos típicos podem ser construídos como divulgado por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. 3_:280, 1983). Descrevem-se outros vectores de expressão úteis em mamíferos no Pedido de Patente U.S. com o n° . de série 07/480 694 apresentado a 14 de Fevereiro de 1990 e na Patente U.S. 5 350 683.

Purificação de IL-15 Recombinante

Em geral, polipéptidos de IL-15 podem ser preparados pela cultura de células hospedeiras transformadas às condições de cultura requeridas para a expressão de polipéptidos de IL-15. A resultante IL-15 expressa pode depois ser purificada do meio de cultura ou dos extractos celulares. Uma IL-15 pode ser concentrada utilizando-se um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. O meio de cultura, com ou sem a etapa de concentração, pode ser aplicado a uma matriz de purificação tal como um meio de cromatografia hidrófoba. O meio preferido é Fenil-Sepharose® CL4B (Pharmacia). Alternativamente, pode empregar-se uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos empregues normalmente na purificação de proteínas.

Alternativamente, pode usar-se um meio de filtração em gel.

Por fim, uma ou mais etapas de cromatograf ia líquida de alta resolução de fase inversa (RP-HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrófobos, e.g., sílica-gel tendo grupos butilo ou outros grupos alifáticos pendentes, podem ser empregues para purificar ainda mais a IL-15. Também se pode empregar uma coluna de permuta catiónica de S-Sepharose (Pharmacia) como uma etapa de permuta com tampão final. Algumas ou todas as etapas de purificação convencionais precedentes, em várias combinações, podem também ser empregues para originar uma proteína recombinante substancialmente homogénea. A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana é normalmente isolada por ruptura inicial das células hospedeiras, centrifugação, extracção das peletes de células se for um polipéptido insolúvel, ou do sobrenadante se for um polipéptido solúvel, seguido de uma ou mais etapas de 13 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ concentração, salting-out, permuta iónica ou cromatografia de exclusão por tamanhos. Por fim, pode empregar-se RP-HPLC para as etapas finais de purificação. As células microbianas podem sofrer ruptura por gualguer método conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, ruptura mecânica, ou por utilização de agentes de lise celular.

As células hospedeiras de levedura transformadas são empregues preferivelmente para expressar uma IL-15 na forma de um polipéptido segregado. O polipéptido recombinante segregado de uma fermentação de células hospedeiras de levedura pode ser purificado por métodos análogos àgueles divulgados por Urdal et al. (J. Chromatog. 296 : 171, 1984). Urdal et al. descreve duas etapas seguenciais de HPLC em fase inversa para purificação de IL-2 recombinante humana numa coluna de HPLC preparativa.

Anticorpos Monoclonais Contra IL-15

De acordo com o invento, proporciona-se um anticorpo monoclonal contra IL-15 de SEQ. ID. NO:l ou 2 como aqui definido que interfere com a ligação de IL-15 a quaisquer subunidades α, β ou γ do complexo receptor. No contexto do invento, o termo "anticorpos" deverá ser entendido como incluindo anticorpos monoclonais, seus fragmentos tais como os fragmentos F(ab')2 e Fab, assim como parceiros de ligação produzidos recombinantemente. A afinidade de um anticorpo monoclonal ou parceiro de ligação pode ser facilmente determinada por alguém competente na matéria (refira-se a Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sei., _51_: 660 — 672 (1949)). Exemplos específicos destes anticorpos monoclonais são dados aqui no Exemplo 1.

Em geral, podem gerar-se anticorpos monoclonais contra IL-15 através do procedimento que se segue. IL-15 purificada, um seu fragmento, péptidos sintéticos ou células que expressam IL-15, podem ser empregues para gerar anticorpos monoclonais contra IL-15 por meio de técnicas conhecidas per se, por exemplo, as técnicas descritas na Patente U.S. 4 411 993.

Resumidamente, ratinhos são imunizados com IL-15 na forma de um imunogénio emulsionado com adjuvante completo de Freund ou adjuvante de RIBI (RIBI Corp., Hamilton, Montana), e injectados em quantidades de 10-100 pg subcutânea ou 14 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ intraperitonealmente. Dez a doze dias mais tarde, os animais imunizados recebem um reforço de IL-15 adicional emulsionada em adjuvante incompleto de Freund. A partir dai, os ratinhos recebem reforços periódicos num programa de imunização semanal a bissemanal. Amostras de soro são tiradas periodicamente, por sangramento retro-orbital ou por excisão na ponta da cauda, para análise de anticorpos contra IL-15 por ensaio dot blot ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou por inibição da actividade da IL-15 em células CTLL-2.

Após detecção de um titulo apropriado de anticorpos, os animais positivos recebem uma injecção intravenosa adicional de IL-15 em solução salina. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, células do baço são colhidas, e células do baço são fundidas com uma linha celular de mieloma murino, e.g., NS1, ou preferivelmente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). As fusões geram células de hibridoma que são plaqueadas em múltiplas placas de microtitulação num meio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina, e timidina) para inibir a proliferação de células de mieloma não fundidas e hibridos de mieloma. A reactividade das células de hibridoma contra IL-15 purificada é pesquisada por ELISA por adaptação das técnicas divulgadas em Engvall et ai., Immunochem. 8_:871, 1971 e na

Patente U.S. 4 703 004. Uma técnica preferida de pesquisa é a técnica de captura de anticorpos descrita por Beckmann et al.r (J. Immunol. 144:4212, 1990) . As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singénicos para produzir ascites com concentrações elevadas de anticorpos monoclonais anti-IL-15. Alternativamente, células de hibridoma podem ser crescidas in vitro em matrazes ou frascos rolantes utilizando-se várias técnicas. Os anticorpos monoclonais produzidos em ascites de ratinho podem ser purificados por precipitação com sulfato de amónio seguida de cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, também se pode empregar cromatografia de afinidade baseada na ligação de anticorpos à proteína A ou à proteína G, assim como cromatografia de afinidade baseada na ligação a IL-15. 15 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

Podem preparar-se outros "anticorpos" utilizando a divulgação aqui apresentada, que assim caiem dentro do âmbito do invento. Os procedimentos usados para gerar anticorpos humanizados podem ser encontrados na Patente U.S. N°. 4 816 567 e WO 94/10332; em WO 94/09817 podem encontrar-se procedimentos para gerar microcorpos; e em GB 2 272 440 podem encontrar-se procedimentos para gerar anticorpos transgénicos; todas aqui incorporados por referência.

Para determinar que anticorpos monoclonais são antagonistas, é preferível levar a cabo um ensaio de pesquisa. Um ensaio de proliferação de CTLL-2 é preferido para este fim. Refira-se a Gillis e Smith, Nature 268:154 (1977), que é aqui incorporado aqui por referência.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento encontram utilização, como descrito atrás e em mais pormenor adiante, a promover a sobrevivência de aloenxertos e a tratar pacientes com doença do enxerto-versus-hospedeiro. Outra utilização credível para os antagonistas inclui o tratamento de leucemia/linforna de células T do adulto induzido por HTLV-I (vírus linfotrópico humano de células T) de fase tardia, refira-se a Burton et al.r Proc. Natl. Acad. Sei., 91:4935 (1994). Outras utilizações credíveis incluem a capacidade para prevenir a estimulação de células B ou células T in vitro, o estudo da interaeção receptor-ligante, kits de diagnóstico para doenças infecciosas e distúrbios do tracto gastrointestinal. Como resultado da actividade dos antagonistas de acordo com o invento, novas utilizações destes anticorpos monoclonais no tratamento de certas doenças encontram-se no âmbito do invento. Por exemplo, divulga-se a utilização destes anticorpos monoclonais na prevenção da rejeição de aloenxertos num paciente com sua necessidade, e uma utilização para tratar GVHD num paciente com sua necessidade, nas quais a composição farmacêutica compreende uma quantidade de um anticorpo monoclonal contra a IL-15 como aqui definido eficaz para inibir a actividade da IL-15, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Utilizações similares para tratar outras doenças estão definidas nas reivindicações anexadas e incluem, por exemplo, linfomas, carcinomas, leucemias, rabdossarcomas, e certos distúrbios auto-imunes tais como artrite reumatóide. 16 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

Composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo monoclonal criado contra a IL-15 como aqui definido também estão abrangidas pelo invento.

Administração de anticorpos monoclonais criados contra a IL-15 O presente invento proporciona composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo monoclonal como aqui definido num diluente ou transportador adequado. Um anticorpo monoclonal contra a IL-15 do invento pode ser formulado de acordo com métodos conhecidos usados na preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis. Um anticorpo monoclonal contra a IL-15 pode ser combinado numa mistura, ou como o único material activo ou com outros materiais activos conhecidos, com diluentes farmaceuticamente adequados (e.g. Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (e.g., Timerosal, álcool benzilico, parabeno), emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou transportadores. Transportadores adequados e suas formulações estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980, Mack Publishing Co. Além disso, estas composições podem conter um anticorpo monoclonal contra a IL-15 complexado com polietilenoglicol (PEG), iões metálicos, ou incorporados em compostos poliméricos tais como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogéis, etc., ou incorporados em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, fantasmas de eritrócitos ou esferoblastos. Estas composições influenciarão o estado físico, solubilidade, estabilidade, taxa de libertação in vivo, e a velocidade de dissipação in vivo de um anticorpo monoclonal contra a IL-15. Também se pode conjugar um anticorpo monoclonal contra a IL-15 com anticorpos contra receptores específicos para tecidos, ligantes ou antigénios, ou acoplar a ligantes de receptores específicos para tecidos.

Os anticorpos monoclonais contra a IL-15 do invento podem ser administrados pelas vias tópica, parentérica e rectal, ou por inalação. O termo "parentérico" inclui as injecções subcutânea, intravenosa, intramuscular e intracisternal, ou técnicas de infusão. Tipicamente, estas composições conterão uma quantidade eficaz de um anticorpo monoclonal contra IL-15, sozinho ou em combinação com uma quantidade eficaz de qualquer outro material activo. Estas dosagens e concentrações 17 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ desejadas de fármaco contidas nas composições podem variar com muitos factores, incluindo a utilização pretendida, o peso do corpo e idade do paciente, e via de administração. Doses preliminares podem ser determinadas de acordo com testes em animais, e a variação de escala de dosagens para administração a humanos pode ser realizada de acordo com práticas aceites na arte.

Além do anterior, também se dão os seguintes exemplos para ilustrar determinadas concretizações e não para limitar o âmbito do invento. EXEMPLO 1

Anticorpos Monoclonais Contra a IL-15

Este exemplo descreve um método para se obter três anticorpos monoclonais anti-IL-15 que funcionam como antagonistas da IL-15. Todos os métodos usados são técnicas convencionais, excepto quando mencionado em contrário.

Ratinhos Balb/c foram injectados intraperitonealmente em duas ocasiões com intervalos de 3 semanas com 10 pg de IL-15 humana derivada de levedura na presença de adjuvante de RIBI (RIBI Corpo., Hamilton, Montana). Os soros dos ratinhos foram depois analisados pela técnica convencional de dot blot, captura de anticorpos (ABC) e ensaio de neutralização (ensaio de CTLL-2) para se determinar qual seria o melhor animal para a fusão. Três semanas mais tarde, os ratinhos receberam um reforço intravenoso de 3 pg de IL-15 humana suspensa em PBS esterilizado. Três dias mais tarde, os ratinhos foram sacrificados e células do baço foram fundidas com células do mieloma Ag8.653 (ATCC) por meio de protocolos estabelecidos. Resumidamente, as células Ag8.653 foram lavadas várias vezes em meio isento de soro e fundidas a células do baço de ratinho a uma razão de três células de baço para uma célula de mieloma. O agente de fusão era PEG a 50%:DMSO a 10% (Sigma). A fusão foi plaqueada em vinte placas de fundo plano (Corning) de 96 poços contendo meio DMEM suplementado com HAT e deixou-se a crescer durante oito dias. Os sobrenadantes dos hibridomas resultantes foram colhidos e colocados durante 60 minutos numa placa de 96 poços que tinha sido primeiro revestida com Ig anti-ratinho de cabra. A seguir às lavagens, adicionou-se 125I-IL-15 a cada poço, incubou-se durante 18 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ 60 minutos à temperatura ambiente, e lavou-se quatro vezes. Os poços positivos foram subsequentemente detectados por autorradiografia a 70°C usando-se um filme Kodak X-Omat S. Os clones positivos foram crescidos em cultura geral e os sobrenadantes foram subsequentemente purificados numa coluna de Proteína A (Pharmacia). Os clones designados como M110, Ml 11 e M112 foram subsequentemente isotipados como anticorpos monoclonais IgGl. Os hibridomas produtores dos anticorpos monoclonais M110, Mlll e M112 foram depositados com a American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC). Todos os depósitos foram feitos de acordo com os termos do Tratado de Budapeste.

Os anticorpos monoclonais gerados podem ser analisados quanto à sua actividade antagonista de IL-15 por meio de um ensaio de CTLL-2 como basicamente descrito por Gillis, et al., Id. EXEMPLO 2

Inibição da Actividade da IL-15 no Ensaio de CTLL-2 Este exemplo ilustra adicionalmente um método para determinar a prevenção pelos antagonistas de acordo com o invento do sinal de transdução da IL-15 através das subunidades β e γ dos receptores do complexo receptor da IL-15. A actividade antagonista de anticorpos monoclonais pode ser avaliada por meio de um ensaio modificado de incorporação de 3H-timidina em células CTLL-2 (Gillis, et al., Id.). Diluições em série do antagonista podem ser feitas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano (Costar, Cambridge, MA) em meio DMEM (suplementado com FCS a 5%, NEAA, Piruvato de Na, HEPES pH 7,4, 2-me, PSG) até a um volume final de 50 μΐ. Uma quantidade sub-óptima de IL-15 (concentração final de 20-40 pg/ml) foi então adicionada a todos os poços de ensaio (5 μΐ/poço) após diluições em série das amostras e antes da adição de células. As células CTLL-2 lavadas foram adicionadas (cerca de 2000 por poço em 50 μΐ) e as placas foram incubadas durante 24 horas a 37°C numa atmosfera humidificada de CO2 a 10% em ar. Isto foi seguido por uma incubação de cinco horas com 0,5 pCi de 3H-Timidina (25 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heights, IL). As culturas são 19 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ então colhidas em filtros de fibra de vidro e contadas por ionização de gás em avalanche num contador beta directo multidetector (Matrix 96, Packard Instrument Company, Meridien, CT) ou num contador beta de cintilação. As contagens por minuto (CPM) geradas no ensaio são convertidas a percentagem de inibição e os valores de percentagem de inibição de cada amostra de antagonista titulada são usados para calcular a actividade antagonista em unidades/ml.

Os resultados que mostram a concentração necessária para neutralizar 40 pg/ml de IL-15 num ensaio de inibição de CTLL são dados na Tabela 1 a seguir. A Tabela II apresenta a actividade de IL-15 (actividade agonista) em CTLL e ensaios de inibição de CTLL.

Tabela I

Actividade Especifica de Antagonistas da IL-15

Concentração de antagonista requerida para neutralizar 40 pg/ml de IL-15 num ensaio de inibição de CTLL:

Antagonista Concentração Método determinação de proteína Ml10, Ml11 5 ng/ml DO

Ml 12 40 ng/ml DO DO = densidade óptica (absorvância) a 280 nm; coeficiente de extinção de 1,35

Tabela II

Actividade de IL-15 em CTLL e Ensaios de Inibição de CTLL

Ensaio de CTLL unidades/ml Ensaio Inibição de CTLL

Amostra (Actividade Agonista) unidades/ml (Actividade Antagonista) IL-15 7,09 x 10b 279

IL-15 3,7 x 108 NA

IL-15 5,6 x 108 NA NA: não foi analisado 20 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Grabstein, Kenneth

Paxton, Raymond Pettit, Dean (ii) TÍTULO DO INVENTO: Antagonistas da IL-15 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Immunex Corporation (B) RUA: 51 University Street (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 98101 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7, Word 5.1a (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: —por atribuir— (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21 de Fevereiro de 1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Malaska, Stephen L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32 655

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 2831-WO (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 206-587-0430 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 486 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (iv) ANTI-SENTIDO: Não (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..342 21 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:l: ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC TAC 48 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gin Cys Tyr 1 5 10 15 CTG TGT TTA CTT CTA AAG AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT 96 Leu Cys Leu Leu Leu Lys Ser Kis Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTC CCT AAA ACA GAA GCC 144 Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT ATT 192 Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACA GAA AGT GAT GTT CAC 240 Gin Ser Met Kis Ile Asp Ala Thr Leu Tyx Thr Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 80 CCC AGT TGC AAG GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTG CAA 288 Pro Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 95 GTT ATT TCA CAT GAG TCC GGA GAT ACA GAT ATT CAT GAT ACA GTA GAA 336 Vai Ile Ser Hís Glu Ser Gly Asp Thr Asp Ile His Asp Thr Vai Glu 100 105 110 AAT ATC ATC CTA GCA AAC AAC ATC TTG TCT TCT AAT GGG AAT ATA 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ile Leu Ser Ser Asn Gly Asn Ile 115 120 125 ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTA GAG GAA AAA AAT ATT 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC 480 Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 ACT TCT TGA 489

Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 489 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..489 22 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:2: ATG AGA ATT TCG AAA CCA CAT TTG AGA AGT ATT TCC ATC CAG TGC TAC 48 Met Ar g Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gin Cys Tyr 1 5 10 15 TTG TGT TTA CTT CTA AAC AGT CAT TTT CTA ACT GAA GCT GGC ATT CAT 96 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 GTC TTC ATT TTG GGC TGT TTC AGT GCA GGG CTT CCT AAA ACA GAA GCC 144 Vai Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 AAC TGG GTG AAT GTA ATA AGT GAT TTG AAA AAA ATT GAA GAT CTT ATT 192 Asn Trp Vai Asn Vai Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 CAA TCT ATG CAT ATT GAT GCT ACT TTA TAT ACG GAA AGT GAT GTT CAC 240 Gin Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Vai His 65 70 75 80 CCC AGT TGC AAA GTA ACA GCA ATG AAG TGC TTT CTC TTG GAG TTA CAA 288 Pr o Ser Cys Lys Vai Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin 85 90 35 GTT ATT TCA CTT GAG TCC GGA GAT GCA AGT ATT CAT GAT ACA GTA GAA 336 Vai Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Vai Glu 100 105 110 AAT CTG ATC ATC CTA GCA AAC AAC AGT TTG TCT TCT AAT GGG AAT GTA 384 Asn Leu ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Vai 115 120 125 ACA GAA TCT GGA TGC AAA GAA TGT GAG GAA CTG GAG GAA AAA AAT ATT 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 AAA GAA TTT TTG CAG AGT TTT GTA CAT ATT GTC CAA ATG TTC ATC AAC 480 Lys Glu Phe Leu Gin Ser Phe Vai His Ile Vai Gin Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 ACT TCT TGA 489 Thr Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:3: AATGTAATAA GTTGTTTGAA AAAAATT 27 23 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:4: AATGTAATAA GTTCTTTGAA AAAAATT 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:5: GTTGATGAAC ATGCAGACAA TATG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:6: GTTGATGAAC ATAGAGACAA TATG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 24 ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO: 7: GTCCTCGCAA CTAAGTCGAC TAACTGGGTG AATGTAATA 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:8: GAGTCATTCT CGACTTGCGG CCGCACCAGA AGTGTTGATG AACAT 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:9: AATATGGTAC CTTTGGATAA AAGAGACTAC AAGGACGACG ATGACAAGAA CTGGGTGAAT GTAATAAGT 69 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 69 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ. ID NO:10 GCGATATATC CATGGTCAAG AAGTGTTGAT GAACAT 36

Lisboa

Claims

ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal criado contra a interleucina-15 (IL-15) de SEQ. ID NO: 1 ou 2 que impede especif icamente a IL-15 de transduzir um sinal através das subunidades β ou γ do complexo receptor da IL-15.
2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é humanizado.
3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o anticorpo é transgénico.
4. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal como definido em qualquer umas das reivindicações 1 a 3, e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
5. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para se utilizar no tratamento de rejeição de transplante de órgãos, doença do enxerto-versus-hospedeiro, doença auto-imune, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, linfoma, carcinoma, leucemia, rabdossarcoma, um distúrbio dermatológico, um distúrbio do tracto gastrointestinal, diabetes mellitus insulinodependente, um distúrbio ocular, sindrome nefrótica idiopática/nefropatia membranosa idiopática e leucemia/linforna induzidos por HTLV-1.
6. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar no tratamento de artrite reumatóide.
7. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar no tratamento de um distúrbio dermatológico.
8. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no fabrico de um medicamento para o tratamento de rejeição de transplante de órgãos, doença do enxerto-versus-hospedeiro, doença auto-imune, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, linfoma, carcinoma, leucemia, rabdossarcoma, um distúrbio ΕΡ Ο 811 065 /ΡΤ 2/2 dermatológico, um distúrbio do tracto gastrointestinal, diabetes mellitus insulinodependente, um distúrbio ocular, sindrome nefrótica idiopática/nefropatia membranosa idiopática e leucemia/linforna induzidos por HTLV-1.
9. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 na preparação de um medicamento para o tratamento de artrite reumatóide
10. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio dermatológico.
11. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 no fabrico de um medicamento para o tratamento da doença de enxerto-versus-hospedeiro.
12. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 no fabrico de um medicamento para prolongar a sobrevivência de aloenxertos num paciente. Lisboa,