DE69636538T2

DE69636538T2 - Antagoniste von interleukin-15

Info

Publication number: DE69636538T2
Application number: DE69636538T
Authority: DE
Inventors: H. Kenneth Mercer Island GRABSTEIN; K. Dean Seattle PETTIT; J. Raymond Bellevue PAXTON
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1995-02-22
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: JPH11500908A; EP1770163A2; ES2271951T3; FI20060080A; EP0811065B2; FI973361A0; NZ303843A; US6177079B1; DK0811065T3; CA2210491A1; FI973361A; US5795966A; US6168783B1; FI121571B; EP1770163A3; KR19980702238A; DE69636538D1; NO973705D0; AU5027596A; US6165466A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die gegen ein Säugetierepithelium-abgeleitetes T-Zell-Faktor-Polypeptid, hierin als Interleukin-15 („IL-15") bezeichnet, gezüchtet sind, die die Fähigkeit von IL-15, die Proliferation von T-Lymphozyten in einer in vitro CTLL-Untersuchung zu stimulieren, signifikant reduzieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Interleukin-15 ist ein bekannter T-Zellwachstumsfaktor, der die Proliferation einer IL-2-abhängigen Zelllinie, CTLL-2, unterstützen kann. IL-15 wurde als erstes durch Grabstein et al., in Science, 264:965 (1994) als ein sezerniertes Zytokin berichtet, welches ein 162-Aminosäure-Vorläufer-Polypeptid aufweist, das eine 48-Aminosäure-Leitsequenz enthält, was zu einem 114-Aminosäure reifen Protein führt. Grabstein et al. beschreibt auch das Klonieren der humanen cDNA voller Länge, die den 162-Aminosäure-Vorläufer kodiert, welcher eine 316 bp 5'-nichtkodierende Region und einen 486 bp offenen Leserahmen (oder einen 489 bp offenen Leserahmen, wenn die 3 bp für das Stoppkodon eingebunden sind) und eine 400 bp 3'-nichtkodierende Region enthält.
IL-15 teilt viele Eigenschaften mit IL-2. Zu diesen Eigenschaften zählen die Proliferation und Aktivierung von humanen und murinen T-Zellen, die Induktion der Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK)-Aktivität, die natürliche Killerzellen (NK)-Aktivität, und die zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Aktivität, und die Co-Stimulation der B-Zellen-Proliferation und Differenzierung.
Zusätzlich sind IL-15 und IL-2 strukturell-homologe Moleküle, die in der Lage sind, zumindest drei unterschiedliche Rezeptoruntereinheiten auf der T-Zellmembranoberfläche zu binden. IL-2 Rezeptoren enthalten zumindest drei Untereinheiten, α, β, und γ (Toshikazu et al., Science, 257:379 (1992)). Sowohl IL-15 als auch IL-2 teilen die Bindung an einen gewöhnlichen β-γ-Untereinheitkomplex, während jedes von IL-15 und IL-2 an eine spezifische α-Rezeptoruntereinheit (IL-15Rα bzw. IL-2Rα) binden. Der IL-15Rα wurde kürzlich entdeckt und ist der Gegenstand der gleichzeitig anhängenden Anmeldungsseriennummer 08/300.903. Gegen die α-Kette des IL-2 Rezeptors gerichtete Antikörper (Anti-IL-2Rα) haben keine Wirkung auf die IL-15 Bindung (Grabstein et al., Id.). Gegen die β-Untereinheit des IL-2 Rezeptors gerichtete Antikörper, d.h. TU27, TU11, oder Mikβ1, sind jedoch in der Lage, die Aktivität von IL-15 zu blockieren, was darauf hinweist, dass IL-15 die β-Untereinheit für die Signalgebung verwendet. Ähnlicherweise wird die γ-Kette des IL-2 Rezeptors für die Signaltransduktion benötigt (Giri et al., EMBO J., 13:2822/1994). Die Kombination der β- und der γ-Untereinheiten des IL-15 Rezeptorkomplexes, aber keine der Untereinheit allein, band IL-15 auf transfizierten COS-Zellen.
Bestimmte Krankheitszustände und physiologische Bedingungen werden durch T-Zellen vermittelt. Zu solchen Krankheiten zählen die Organtransplantat-Abstoßung, Transplantat-Wirt-Krankheit, Autoimmunkrankheit, Gelenksrheumatismus, entzündliche Darmkrankheit, dermatologische Krankheiten, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Augenkrankheiten und idiopathisch-nephrotisches Syndrom/idiopathische Membrannephropathie. Tatsächlich wurde die Allotransplanat-Abstoßung und Transplantat-Wirt-Krankheit (GVHD) mit einer gesteigerten IL-2 Rezeptorexpression in Verbindung gebracht. In Reaktion auf fremde Histokompatibilitätsantigene aktivierte T-Zellen scheinen den IL-2 Rezeptorkomplex zu exprimieren. Verschiedene Therapien wurden vorgeschlagen und untersucht. Zum Beispiel berichtete Tinubu et al. (J. Immunol., 153:4330 (1994)), dass der Antil-IL-2Rβ monoklonale Antikörper, Mikβ1, das Herzallotransplantat-Überleben von Primaten verlängert. Es gibt einen Anstieg in der IL-2Rβ-Untereinheitexpression auf CD4- und CD8-exprimierenden Zellen in Verbindung mit akuter Allotransplantat-Abstoßung, was darauf hinweist, dass sich die IL-2Rβ-Untereinheitexpression auf alloreaktiven Z-Zellen zu erhöhen scheint. Siehe zum Beispiel, Niguma et al., Transplantation, 52:296 (1991).
Vor der vorliegenden Erfindung gab es jedoch keine Therapien, die sich auf die IL-15 Ligand-Rezeptor-Interaktion als ein Mittel zum Behandeln von GVHD oder zum Fördern des Allotransplantat-Überlebens konzentriert haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf monoklonale Antikörper, wie hierin definiert, die gegen IL-15 gezüchtet sind, und auf die Verwendung von solchen Antikörpern zum Behandeln von einer humanen Krankheit gerichtet. Insbesondere beinhaltet eine solche Behandlung das Fördern des Allotransplantat-Überleben in Säugetieren und das Behandeln von GVHD. Die IL-15 Antagonisten sind beim Verhindern wirksam, dass IL-15 ein Signal zu einer Zelle durch entweder die β- oder γ-Untereinheiten des IL-15 Rezpetorkomplexes überträgt, dadurch Entgegenwirken der biologischen Aktivität von IL-15. Bestimmte der monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können mit der Bindung von IL-15 an die β- oder γ-Untereinheiten des IL-15-Rezeptorkomplexes interferieren, während sie mit der Bindung von IL-15 an IL-15Rα nicht wesentlich interferieren.
Zusätzlich umfasst die Erfindung monoklonale Antikörper, wie hierin definiert, die mit reifem IL-14 immunreagieren und die Signaltransduktion an den IL-15 Rezeptorkomplex verhindern.
Die Erfindung ist ebenfalls auf die Verwendung der monoklonalen Antikörper, wie hierin definiert, zum Behandeln einer Krankheit oder eines Zustandes, bei welcher(m) eine Reduktion der IL-15 Aktivität auf T-Zellen gewünscht ist, gerichtet. Zu solchen Krankheiten zählen Organtransplantat-Abstoßung, Transplantat-Wirt-Krankheit, Autoimmunkrankheit, Gelenksrheumatismus, entzündliche Darmkrankheit, dermatologische Krankheiten, Insulinabhängiger Diabetes mellitus, Augenkrankheiten und idiopathisch-nephrotisches Syndrom/idiopathische Membrannephropathie. Insbesondere bei der Allotransplantat-Abstoßung kann die IL-15 Aktivität zu einer Wirtsimmunreaktion gegen das Transplantat und eventuellt zu Abstoßung führen. Ähnlichweise bei GVHD vermittelt das Transplantat, üblicherweise ein Knochenmarktransplantat, eine Immunreaktion gegen den Wirt. Die Unterdrückung solcher Aktivitäten durch die IL-15 monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung kann beim Fördern und Verlängern des Transplantat-Überlebens und beim Behandeln von GVHD vorteilhaft sein.
Verschiedene Untersucher haben die Verlängerung des Transplantat-Überlebens durch die Verwendung von Antikörpern, wie Anti-TAC, einem Anti-humanen IL-2α-Rezeptor monoklonalen Antiköper, berichtet. Siehe Reed et al., Transplantation, 47:55-59 (1989), worin gezeigt ist, dass Anti-TAC eine verbesserte Primaten Nierenallotransplantat-Transplantation hat. Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2663 (1991) beschreibt ebenfalls die Verwendung von humanisiertem Anti-TAC beim Verlängern des Primaten-Herzallotransplantat-Überlebens. Kirkmann et al., Transplantation, 51:107 (1991) beschreibt ebenfalls einen klinischen Versuch, der Anti-TAC beim Verhindern der frühen Allotransplantat-Abstoßung enthält. Da IL-15 viele zu IL-2 ähnliche biologische Aktivitäten besitzt, und tatsächlich bestimmte Rezeptor-Untereinheiten mit IL-2 teilt, hat das Beeinträchtigen der schädlichen Aktivität von IL-15 bei krankhaften Zuständen ein eindeutiges therapeutisches Potential.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf einen gegen Interleukin-15 (IL-15) der SEQ ID NR: 1 oder 2 gezüchteten Antikörper gerichtet, der IL-15 spezifisch daran hindert, dass ein Signal durch entweder die β- oder γ-Untereinheit des IL-15 Rezeptorkomplexes übertragen wird.
So wie hierin verwendet, bezieht sich „rekombinante DNA Technologie" oder „rekombinant" auf Techniken und Verfahren zum Herstellen spezifischer Polypeptide aus mikrobiellen (z.B., Bakterien, Insekten, oder Hefe) oder Säugetierzellen oder Organismen (z.B. Transgene), die mit klonierten oder synthetischen DNA Sequenzen transformiert oder transfiziert wurden, um die Biosynthese von heterologen Peptiden zu ermöglichen. Native Glycosylierungsmuster werden nur mit Säugetierzell-Expressionssystemen erreicht. Hefe liefert ein unverwechselbares Glycosylierungsmuster. Prokaryotische Zellexpression (z.B. E. coli) wird im Allgemeinen Polypeptide ohne Glycosylierung erzeugen.
Eine „Nukleotidsequenz" bezieht sich auf ein Polynukleotid in Form eines getrennten Fragments oder als Teil eines größeren DNA Konstrukts, das von DNA oder RNA abgeleitet ist, welche zumindest einmal in einer im Wesentlichen reinen Form (i.e. frei von kontaminierenden endogen Materialien) und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, die die Identifikation, Manipulation und Gewinnung seiner Komponenten-Nukleotidsequenzen durch biochemische Standardverfahren ermöglicht (wie jene, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens bereitgestellt, der nicht durch interne nicht-translatierte Sequenzen, oder Introns, unterbrochen ist, die üblicherweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind. Sequenzen von nicht-translatierter DNA kann 5' oder 3' des offenen Leserahmens vorhanden sein, wo die selbigen mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen nicht interferieren.
„Rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Plasmid, welches eine transkriptionale Einheit aufweist, die eine Anordnung von (1) einem genetischen Element oder Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, zum Beispiel, Promotoren oder Enhancer, (2) einer strukturellen oder kodierenden Sequenz, die IL-15 oder ein IL-15-Mutein kodiert, und (3) geeigneten Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen und, falls gewünscht, Terminationssequenzen enthält. Die repräsentativen Beispiele von verschiedenen regulatorischen Elementen, die verwendet werden können, werden später diskutiert (siehe rekombinante DNA Techniken). Zu strukturellen Elementen, die für die Verwendung in Hefe-Expressionssystemen beabsichtigt sind, zählen vorzugsweise eine Leitsequenz, die die extrazelluläre Sekretion des translatierten Polypeptids durch eine Hefe-Wirtszelle ermöglicht. Alternativ kann in einem bakteriellen Expressionssystem das rekombinante Polypeptid einen N-terminalen Methionin-Rest enthalten. Der N-terminale Methionin-Rest kann nachfolgend von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid abgespalten werden, um ein Produkt, welches für die weitere Reinigung geeignet ist, bereitzustellen.
„Rekombinantes mikrobielles Expressionssystem" bezieht sich auf eine im Wesentlichen homogene Monokultur eines geeigneten Wirtsmikroorganismus, zum Beispiel, Bakteria, wie E. coli, oder Hefe, wie S. cerevisiae, die eine rekombinante transkriptionale Einheit in die chromosomale DNA stabil integriert haben oder die rekombinante transkriptionale Einheit als eine Komponente eines ansässigen Plasmids tragen. Im Allgemeinen sind die Wirtszellen, die ein rekombinantes mikrobielles Expressionssystem ausmachen, die Nachkommenschaft einer einzelnen transformierten Stammzelle. Rekombinante mikrobielle Expressionssysteme werden die heterologen Polypeptide nach der Induktion der regulatorischen Elemente, die mit einer zu exprimierenden Strukturnukleotidsequenz verbunden sind, exprimieren.
Die reife, oder native, Affen-IL-15-Moleküle haben die Aminosäuresequenz 49-162 der SEQ ID NO: 1 oder die humanen IL-15 Moleküle haben die Aminosäuresequenz 49-162 der SEQ ID NO: 2.
Herstellung von IL-15
Humanes oder Affen IL-15 kann gemäß den von Grabstein et al., Science, 264:965 (1994), beschriebenen Verfahren, welche durch Bezugnahme hierin aufgenommen wurden oder durch konventionelle Verfahren, wie Polymerase-Kettenrektion (PCR), erhalten werden. Eine Hinterlegung der humanen IL-15 cDNA wurde bei der American Typ Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) am 19. Februar 1993 gemacht und die Hinterlegungsnummer 69245 zugeordnet. Die Hinterlegung wurde „I41-hETF" bezeichnet. Die Hinterlegung wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags gemacht.
Es wird geglaubt, dass das Asp⁵⁶ die Bindung mit der β-Untereinheit beeinflusst und dass das Gln¹⁵⁶ die Bindung mit der γ-Untereinheit des IL-25 Rezeptorkomplexes beeinträchtigt.
Die rekombinante Produktion eines IL-15 erfordert zuerst die Isolierung eines DNA Klons (d.h. cDNA), der IL-15 kodiert. cDNA Klone sind von Primärzellen oder Zelllinien abgeleitet, die Säugetier-IL-15-Polypeptide exprimieren. Zuerst wird die gesamte mRNA isoliert, dann wird eine cDNA Bibliothek aus der mRNA durch Umkehrtranskription hergestellt. Ein cDNA Klon kann unter Verwendung der hierin bereitgestellten DNA Sequenzinformation isoliert und identifiziert werden, um eine Kreuzspezies-Hybridisierungssonde oder PCR Primer, wie oben beschrieben, zu entwickeln. Solche cDNA Klone weisen die Nukleinsäuresequenzen 1-486 der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 auf.
Die isolierte cDNA liegt vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmes vor, der durch interne nicht-translatierte Sequenzen, oder Introns, nicht unterbrochen ist. Genomische DNA, die die relevanten Nukleotidsequenzen enthalten, die die Säugetier IL-15 Polypeptide kodieren, können auch als ein Quelle von genetischer Information verwendet werden, die zum Herstellen von kodierenden Sequenzen nützlich ist.
Rekombinante Exprssionsvektoren beinhalten synthetische oder cDNA-abgeleitete DNA-Fragmente, die ein IL-15 kodieren. Die DNA, die ein IL-15 kodiert, ist wirkungsmäßig mit einer geeigneten transkriptionalen oder translatorischen, regulatorischen oder strukturellen Nukleotidsequenz, wie eine die von Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengenen abgeleitet ist, verbunden. Zu Beispielen von regulatorischen Sequenzen zählen, zum Beispiel, eine genetische Sequenz mit einer regulatorischen Rolle in der Genexpression (z.B. transkriptionale Promotoren oder Enhancer), eine fakultative Operatorsequenz, um die Transkription zu steuern, eine Sequenz, die geeignete mRNA ribosomale Bindungsstellen kodiert, und geeignete Sequenzen, die die Transkriptions- und Translationsinitiation und Termination steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn sich die regulatorische Sequenz funktionell auf das Strukturgen bezieht. Zum Beispiel kann ein DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (Leitsequenz) mit einer Strukturgen-DNA Sequenz für ein IL-15 wirkungsmäßig verbunden sein, wenn das Signalpeptid als Teil einer Vorläufer-Aminosäuresequenz exprimiert wird und an der Sekretion eines IL-15 teilnimmt. Weiters ist eine Promotor-Nukleotidsequenz wirkungsmäßig mit einer kodierenden Sequenz (z.B. Strukturgen DNA) verbunden, wenn die Promotor-Nukletoidsequenz die Transkription der Sturkturgen-Nukleotidsequenz steuert. Noch weiters kann eine Ribosomenbindungsstelle mit einer Strukturgen-Nukleotidkodierungssequenz für IL-15 wirkungsmäßig verbunden sein, wenn die Ribosomenbindungsstelle innehalb des Vektors positioniert ist, um die Translation zu unterstützen.
Geeignete Wirtszellen für die Expression eines IL-15 umfassen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen, unter der Steuerung von geeigneten Promotoren. Zu Prokaryoten zählen Gram-negative oder Gram-positive Organismen, zum Beispiel, E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation umfassen, zum Beispiel, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. Wie später detaillierter diskutiert wird, zählen zu Beispielen von geeigneten Wirtszellen Hefe, wie S. cerevisiae, eine Säugetier-Zelllinie, wie chinesische Hamsterovarium-(CHO) Zellen, oder Insektenzellen. Zellfreie Translationssysteme könnten ebenfalls eingesetzt werden, um ein IL-15 unter Verwendung von RNAs, die von den hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, zu erzeugen. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit bakteriellen, Insekten-, Hefe- und Säugetier zellulären Wirten sind beschrieben, zum Beispiel, in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985.
Wenn ein IL-15 in einer Hefe-Wirtszelle exprimiert wird, kann die Nukleotidsequenz (z.B. Strukturgen), die ein IL-15 kodiert, eine Leitsequenz enthalten. Die Leitsequenz kann eine verbesserte extrazelluläre Sekretion von translatiertem Polypeptid durch eine Hefe-Wirtszelle ermöglichen.
IL-15 kann in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefefaktoren werden oft eine Replikationsursprungssequenz von einem 2μ Plasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für die Polyadenylierung, und Sequenzen für die Transkriptionstermination enthalten. Vorzugsweise enthalten die Hefevektoren eine Replikationsursprungssequenz und einen selektierbaren Marker. Zu geeigneten Promotorsequenzen für Hefevektoren zählen Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase, und Glucokinase. Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefeexpression sind in Hitzeman, EP-A-73.657 beschrieben.
Hefevektoren können zum Beispiel unter Verwendung von DNA Sequenzen von pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp-Gen und Replikationsursprung) zusammengesetzt werden. Andere Hefe-DNA-Sequenzen, die in ein Hefeexpressionskonstrukt eingebaut werden können, umfassen einen Glucose-reprimierbaren ADH2 Promotor und eine α-Faktor-Leitsequenz. Der ADH2 Promotor wurde von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beer et al. (Nature 300:724, 1982) beschrieben. Die Hefe α-Faktor Leitsequenz lenkt die Sekretion von heterologen Polypeptiden. Die α-Faktor Leitsequenz wird häufig zwischen die Promotorseugenz und die Strukturgensequenz eingefügt. Siehe, z.B., Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Eine Leitsequenz kann in der Nähe ihres 3' Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies wird die Fusion der Leitsequenz mit dem Strukturgen erleichtern.
Hefe-Transformationsprotokolle sind Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll ist von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Die Methodenvorschrift nach Hinnen et al. wählt Trp⁺-Transformanten in einem selektiven Medium aus, wobei das selektive Medium aus 0,67 % Hefe-Stickstoffbase, 0,5 % Caseinhydrolysat (casamino acid), 2 % Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 mg/ml Uracil besteht.
Mit Vektoren, die eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können transformierte Hefe-Wirtszellen gezüchtet werden, um die Expression in einem "reichen" Medium zu bewirken. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist ein solches, das aus 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 1 % Glucose, angereichert mit 80 mg/ml Adenin und 80 mg/ml Uracil, besteht. Eine Repression des ADH2-Promotors wird verloren, wenn die Glucose in dem Medium erschöpft ist.
Alternativ kann in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. coli, das IL-15 einen N-terminalen Methionin-Rest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in einer prokaryotischen Wirtszelle zu fördern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten IL-15 gespalten werden.
Die rekombinanten Expressionvektaren, die die rekombinante IL-15 Strukturgen-Nukleotidsequenz tragen, werden in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus oder Säugetierzelllinie transfiziert oder transformiert.
Expressionsvektoren, die in prokaryotische Wirtzellen transfiziert sind, weisen im Allgemeinen einen oder mehrere phänotypisch-selektierbare Marker auf. Ein phänotypisch selektierbarer Marker ist, zum Beispiel, ein Gen, welches Proteine kodiert, die Anitbiotika-Resistenz verleiht oder die eine autotrophe Anforderung bereitstellt, und einen Replikationsursprung, der durch den Wirt erkannt wird, um die Amplifikation innerhalb des Wirts sicherzustellen. Andere nützliche Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen beinhalten einen selektierbaren Marker bakteriellen Ursprungs, der von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet ist. Dieser selektierbare Marker kann genetische Elemente des Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) aufweisen. pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und bietet somit einfache Mittel für das Identifzieren von transformierten Zellen. Die pBR322 „Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und einer IL-15 Strukturgensequenz kombiniert. Andere kommerziell erhältliche Vektoren umfassen, zum Beispiel, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, USA).
Promotorsequenzen werden häufig für rekombinante prokaryotische Wirtszellen-Expressionsvektoren verwendet. Zu häufigen Promotorsequenzen zählen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EPA 36.776) und tac-Promotor (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtszell-Expressionssystem verwendet einen Phage λ P_L-Promotor und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, die Derivate des λ P_L-Promotors enthalten, umfassen das Plasmid pHUB2 (wohnhaft im E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (wohnhaft im E. coli RR1 (ATCC 53082)).
Außerdem könnten Säuger- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme benutzt werden, um rekombinantes IL-15 zu exprimieren. Zu Beispielen von geeigneten Säuger-Wirtszelllinien zählen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (Gluzman et al., Cell 23:175, (1981); ATCC CRL 1651), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), CHO-Zellen, HeLa-Zellen (ATCC CCL2), und die BHK-(ATCC CRL 10) Zelllinie. Geeignete Säugetier-Expressionsvektoren enthalten nichttranskribierte Elemente, wie einen Replikationsursprung, eine Promotorsequenz, einen an das Strukturgen gebundenen Enhancer, andere 5' oder 3' flankierende nicht-transkribierte Sequenzen, wie Ribosomenbindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, einen Spleißdonator und Akzeptorstellen, und transkriptionale Terminationssequenzen.
Transkriptions- und Translationssteuerungssequenzen für Säugerwirtszellen-Expressionsvektoren können durch virale Quellen bereitgestellt werden. Gemeinhin benutzte Säugetierzellen-Promotorsequenzen und Enhancersequenzen stammen zum Beispiel vom Polyoma, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und von dem menschlichen Zytomegalievirus ab. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40 Virusgenom gewonnen sind, beispielsweise SV40-Replikationsursprung, früher und später Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylationsstellen, können benutzt werden, um weitere genetische Elemente für eine Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugerwirtszelle zu schaffen. Vitale frühe und späte Promotoren sind besonders zweckmäßig, denn sie werden beide leicht als Fragment aus einem Virusgenom gewonnen, wobei das Fragment außerdem einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et.al.: Nature 273:113, 1978). Es können auch kürzere oder längere SV40-Fragmente benutzt werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 Basenpaare umfassende Sequenz, die sich von der Stelle Hind III zu der Stelle Bgl I erstreckt, die sich in dem SV40-viralen Replikationsursprung befindet, ist eingeschlossen.
Beispielhafte Säugetier-Expressionsvektoren können, wie in Okoyama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart ist, hergestellt werden. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren sind im U.S. Patent Anmeldungsseriennummer 07/480.694, eingereicht am 14. Februar 1990 und U.S. Patent 5.350.683 beschrieben.
Reinigung von rekombinantem IL-15
Im Allgemeinen können IL-15 Polypeptide durch Kultivieren transformierter Wirtszellen unter Kulturbedingungen, die notwendig sind, um IL-15 Polypeptide zu exprimieren, hergestellt werden. Das resultierende, exprimierte IL-15 kann dann aus den Kulturmedien oder Zellextrakten gereinigt werden. Ein IL-15 kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters konzentriert werden, zum Beispiel, einer Amicon oder Millipore-Pellicon Ultrafiltrationseinheit. Mit oder ohne Konzentrationsschritt können die Kulturmedien auf eine Reinigungsmatrix, wie ein hydrophobes Chromatographiemedium, aufgetragen werden. Phenyl-Sepharose^® CL-4B (Pharmacia) ist das bevorzugte Medium. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere in der Proteinreinigung häufig eingesetzten Arten sein. Alternativ kann ein Gelfiltrationsmedium verwendet werden.
Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte, die hydrophobe RP-HPLC-Medien, z.B. Silicagel mit anhängenden Butyl oder anderen aliphatischen Gruppen verwenden, eingesetzt werden, um IL-15 weiters zu reinigen. Eine S-Sepharose (Pharmacia) Kationenaustauscher-Säule kann ebenfalls als ein letzter Pufferaustauschschritt verwendet werden. Eine oder alle der vorangehenden Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, können ebenfalls verwendet werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
In Bakterienkultur erzeugtes rekombinantes Protein wird üblicherweise durch anfängliche Zerstörung der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus den Zellpellets, wenn ein unlösliches Polypeptid, oder aus dem Überstand, wenn ein lösliches Polypeptid, gefolgt von einem oder mehreren Konzentrations-, Aussalzungs-, Ionenaustauscher- oder Größenausschlußchromatographie-Schritten isoliert. Schlussendlich kann RP-HPLC für die letzten Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch jedes herkömmliche Verfahren, einschließlich Gefrier/Auftau-Zyklen, Sonikation, mechanische Zerstörung, oder die Verwendung von Zell-Lysemittel zerstört werden.
Transformierte Hefe-Wirtszellen werden vorzugsweise eingesetzt, um ein IL-15 als ein sezerniertes Polypeptid zu exprimieren. Sezerniertes rekombinantes Polypeptid aus einer Hefe-Wirtszellfermentation kann durch Verfahren gereinigt werden, die zu jenen analog sind, die in Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) offenbart sind. Urdal et al. beschreibt zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPLC Schritte für die Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 an einer präparativen HPLC-Säule.
Monoklonale Antikörper gegen IL-15
Gemäß der Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper gegen IL-15 der SEQ ID NR: 1 oder 2, wie hierin definiert, bereitgestellt, der mit der Bindung von IL-15 an jede der α-, β- oder γ-Untereinheiten des Rezeptorkomplexes interferiert.
Innerhalb des Inhalts der Erfindung sollte der Begriff „Antikörper" verstanden werden, dass er monoklonale Antikörper, Fragmente davon wie F(ab')2 und Fab-Fragmente, sowie rekombinant erzeugte Bindungspartner umfasst. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers oder Bindungspartners kann leicht durch einen Durchschnittsfachmann bestimmt werden (siehe Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660-672 (1949)). Spezifische Beispiele von solchen monoklonalen Antikörpern sind hierin im Beispiel 1 vorgesehen.
Im Allgemeinen können monoklonale Antikörper gegen IL-15 unter Verwendung der folgenden Prozedur erzeugt werden. Gereinigtes IL-15, ein Fragment davon, synthetische Peptide oder Zellen, die IL-15 exprimieren, können verwendet werden, um monoklonale Antikörper gegen IL-15 unter Verwendung von an sich bekannten Verfahren herzustellen, zum Beispiel, jene Techniken, die im U.S. Patent 4.411.993 beschrieben sind. In Kürze, Mäuse werden mit IL-15 als ein in vollständigem Freund's Adjuvans oder RIBI Adjuvans (RIBI Corp., Hamilton, Montana) emulgiertes Immunogen immunisiert, und in Mengen im Bereich von 10-100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem IL-15, welches in unvollständigem Freund's Adjuvans emulgiert ist, aufgefrischt. Die Mäuse werden danach gemäß einem wöchentlichen oder zweiwöchentlichen Immunisierungszeitplan aufgefrischt. Serumproben werden periodisch durch retroorbitale Blutung oder Schwanzspitzen-Entfernung genommen, um auf IL-15 Antikörper durch Dot-Blot-Untersuchungen, ELISA (Enzymgebundene Immunosorbent-Untersuchung) oder Inhibierung der IL-15 Aktivität auf CTLL-2-Zellen zu testen.
Im Anschluss an die Detektion eines angemessenen Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine zusätzliche intravenöse Injektion von IL-15 in Salzlösung gegeben. Drei bis vier Tage später werden die Tiere getötet, die Milzzellen geerntet und die Milzzellen werden mit einer murinen Myelom-Zelllinie, z.B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, welche in mehrere Mikrotiterplatten in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) selektiven Medium ausplattiert, um die Proliferation von nicht-fusionierten Myelom-Zellen und Myelom-Hybride zu inhibieren.
Die Hybridomazellen werden durch ELISA auf Reaktivität gegen gereinigtes IL-15 durch Adaptionen der in Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971 und im U.S. Patent 4.703.004 offenbarten Techniken gescreent. Eine bevorzugte Screening-Technik ist die Antikörper-Einfangtechnik, die in Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990) beschrieben ist. Positive Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenische Balb/c Mäuse injiziert werden, um Asciten, die hohe Konzentrationen an Anti-IL-15 monoklonalen Antikörpern enthalten, zu erzeugen. Alternativ können Hybridomzellen in vitro in Flaschen oder Roller-Flaschen durch verschiedene Techniken gezüchtet werden. In Maus-Asciten produzierte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Präzipitation, gefolgt durch Gelausschluß-Chromatographie gereinigt werden. Alternativ kann die Affinitätschromatographie, die auf der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G basiert, verwendet werden, ebenso wie die Affinitätschromatographie basierend auf Bindung an IL-15 verwendet werden kann.
Andere „Antikörper" können durch Ausnutzen der hierin gebotenen Offenbarung hergestellt werden und fallen somit in den Umfang der Erfindung. Die verwendeten Verfahren, um humanisierte Antikörper herzustellen, können im U.S. Patent No. 4.816.457 und WO94/10332 gefunden werden; Verfahren um Mikrokörper herzustellen, können im WO94/09817 gefunden werden; und Verfahren, um transgene Antikörper zu erzeugen, können im GB 2 272 440 gefunden werden, von denen alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
Um zu bestimmen, welche monoklonalen Antikörper Antagonisten sind, wird die Verwendung einer Screeninguntersuchung bevorzugt. Eine CTLL-2 Proliferationsuntersuchung wird für diesen Zweck bevorzugt. Siehe Gillis und Smith, Nature 268:154 (1977), welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung finden Verwendung, wie oben und detaillierter unten beschrieben ist, beim Fördern des Allotransplantat-Überlebens und für die Verwendung beim Behandeln von Patienten mit Transplantat-Wirt-Krankheit. Eine andere glaubhafte Verwendung für die Antagonisten umfasst die Behandlung von Spätphasen HTLV (humanes T-Zellen lymphotrophes Virus) I-induzierte Erwachsenen T-Zell-Leukämie-Lymphoma, siehe Burton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4935 (1994). Andere glaubwürdige Verwendungen umfassen die Fähigkeit, die B-Zellen- oder T-Zellen-Stimulation in vitro zu verhindern, um Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu studieren, in diagnostischen Ausrüstungssätzen für infektiöse Krankheiten und Krankheiten des Gastrointestinaltraktes. Aufgrund der Aktivität der Antagonisten gemäß der Erfindung sind neue Verwendungen von solchen monoklonalen Antikörpern für das Behandeln bestimmter Krankheiten innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Es ist zum Beispiel die Verwendung von solchen monoklonalen Antikörpern für das Verhindern von Allotransplantat-Abstoßung in einem Patient, der einen Bedarf dafür hat, und eine Verwendung für das Behandeln von GVHD in einem Patienten, der einen Bedarf dafür hat, offenbart, in welcher die pharmazeutische Zusammensetzung eine Menge an IL-15 monoklonalen Antikörper, wie hierin definiert, die wirksam ist, die IL-15 Aktivität zu inhibieren, und ein(en) pharmazeutisch-akzeptablen(s) Träger oder Verdünnungsmittel aufweist. Ahnliche Verwendungen für das Behandeln anderer Krankheiten sind in den angefügten Ansprüchen definiert und beinhalten, zum Beispiel, Lymphoma, Karzinome, Leukämien, Rhabdosarkome, und bestimmte Autoimmunerkrankungen, wie Gelenksrheumatismus.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche einen monoklonalen Antikörper, der gegen IL-15, so wie hierin definiert, gezüchtet ist, aufweist, sind ebenfalls durch diese Erfindung umfasst.
Verabreichung von gegen IL-15 gezüchtete monoklonale Antikörper
Die vorliegende Erfindung bietet pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen wie hierin definierten monoklonalen Antikörper in einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger aufweist. Ein IL-15 monoklonaler Antikörper der Erfindung kann gemäß bekannter Verfahren, die verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, formuliert werden. Ein IL-15 monoklonaler Antikörper kann in einer Beimengung, entweder als das einzige aktive Material oder mit anderen bekannten aktiven Materialien, mit pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmittel (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), Konservierungsmittel (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Solubilisatoren, Adjuvanzien, und/oder Träger kombiniert werden. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Science, 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co. beschrieben. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen einen IL-15 monoklonalen Antikörper enthalten, der mit Polyethylenglycol (PEG) Metallionen komplexiert ist oder in polymere Verbindungen, wie Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, etc. eingebunden ist, oder in Liposome, Mikroemulsionen, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythorzytenschatten oder Sphäroblasten eingebaut ist. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die Rate der in vivo Freisetzung, und die Rate der in vivo Klärung eines IL-15 monoklonalen Antikörpers beeinflussen. Ein IL-15 monoklonaler Antikörper kann ebenfalls mit Antikörpern, gegen gewebsspezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigen, konjugiert werden oder an Liganden der gewebsspezifischen Rezeptoren gekoppelt werden.
Die IL-15 monoklonalen Antikörper der Erfindung können topisch, parenteral, rektal oder durch Inhalation verabreicht werden. Der Begriff „parenteral" umfasst subkutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intracisternale Injektions- oder Infusionstechniken. Diese Zusammensetzungen werden typischerweise eine wirksame Menge an IL-15 monoklonalem Antikörper allein oder in Kombination mit einer wirksamen Menge jedes anderen aktiven Materials enthalten. Solche Dosierungen und gewünschten Arzneimittelkonzentrationen, die in den Zusammensetzungen enthalten sind, können in Abhängigkeit vieler Faktoren, einschließlich der beabsichtigten Verwendung, den Körpergewicht und Alter des Patienten, und dem Verabreichungsweg variieren. Vorläufige Dosen können gemäß Tierversuchen bestimmt werden und die Rationierung der Dosierungen für die menschliche Verabreichung kann gemäß der im Fach akzeptierten Praxis durchgeführt werden.
Zusätzlich zu dem obigen, werden die folgenden Beispiele bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen zu illustrieren und nicht um den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Monoklonale Antikörper gegen IL-15
Dieses Beispiel beschreibt das verwendete Verfahren, um drei Anti-IL-15 monoklonale Antikörper zu erhalten, die als Antagonisten von IL-15 wirken. Alle verwendeten Verfahren sind konventionelle Techniken, außer wo angegeben.
Balb/c Mäusen wurde intraperitoneal an zwei Gelegenheiten in 3 Wochenintervallen 10 ug Hefe-abgeleitetes humanes IL-15 in der Gegenwart von RIBI Adjuvans (RIBI Corp., Hamilton, Montana) injiziert. Mausserum wurde dann durch konventionelle Dot-Blot-Technik, Antiköper-Einfang (ABC) und Neutralisierungsuntersuchung (CTLL-2 Untersuchung) untersucht, um zu bestimmen, welches Tier das Beste ist, um fusioniert zu werden. Drei Wochen später wurde den Mäusen eine intravenöse Auffrischung von 3 μg humanes IL-15, welches in sterilem PBS suspendiert ist, gegeben. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milzzellen wurden mit Ag8.653 Myelomzellen (ATCC) durch Nacharbeiten etablierter Protokolle fusioniert. In Kürze, Ag8.653 Zellen wurden mehrere Male in Serum-freien Medien gewaschen und mit Maus-Milzzellen bei einem Verhältnis von drei Milzzellen zu einer Myelomzellen fusioniert. Das Fusioniermittel war 50% PEG:10% DMSO (Sigma). Die Fusionen wurden in zwanzig 96-Kammer Flachbodenplatten (Corning), die HAT, mit DMEM-Medien supplementiert, enthalten, ausplattiert und für acht Tage wachsen gelassen. Die Überstände von den resultierenden Hybridoma wurden gesammelt und zu einer 96-Kammerplatte für 60 Minuten, die zuerst mit Ziegen-anti-Maus Ig beschichtet wurde, hinzugefügt. Im Anschluss an die Waschungen wurde ¹²⁵I-IL-15 zu jeder Kammer hinzugefügt, für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und vier Mal gewaschen. Positive Kammern wurden nachfolgend durch Autoradiographie bei 70°C unter Verwendung von Kodak-X-Omat S Film detektiert. Positive Klone wurden in Massenkultur gezüchtet und die Überstände wurden nachfolgend über eine Protein A-Säule (Pharmacia) gereinigt. Jeder der als M110, M111 und M112 bezeichneten Klone wurden im Anschluss als IgGi monoklonale Antikörper isotypisiert. Hybridome, die monoklonale Antikörper M110, M111 und M112 erzeugen, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt. Alle Hinterlegungen wurden in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Budapester Vertrags gemacht.
Die erzeugten monoklonalen Antikörpern können auf IL-15 Antagonistaktivität unter Verwendung der CTLL-2 Untersuchung untersucht werden, wie im Wesentlichen durch Gillis et al., Id. Beschrieben ist.
Beispiel 2
Inhibierung der IL-15 Aktivität in der CTLL-2 Untersuchung
Dieses Beispiel illustriert weiters ein Verfahren zum Bestimmen der Verhinderung der Signaltransduktion von IL-15 durch die β- und γ-Rezeptoruntereinheiten des IL-15 Rezeptorkomplexes durch die Antagonisten gemäß der Erfindung.
Antagonistaktivität von monoklonalen Antikörpern kann unter Verwendung einer modifizierten CTLL-2 Zellen ³H-Thymidin-Einbauuntersuchung (Gillis et al., Id.) beurteilt werden. Reihenverdünnungen von Antagonisten können in 96-Kammer-Flachboden-Gewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA) in DMEM Medium (ergänzt mit 5% FCS, NEAA, NaPyruvat, HEPES, pH 7,4, 2-me, PSG) bei einem Endvolumen von 50 μl gemacht werden. Eine suboptimale Menge IL-15 (Endkonzentration 20-40 pg/ml) wird dann zu allen Untersuchungskammern (5 μl/Kammer) nach serieller Verdünnung der Proben und vor der Zugabe der Zellen hinzugefügt. Gewaschene CTLL-2-Zellen wurden hinzugefügt (etwa 2000 pro Kammer in 50μl) und die Platten werden für 24 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 10 % CO₂ in Luft inkubiert. Die wurde durch eine fünfstündige Inkubation mit 0,5 μCi ³H-Thymidin (25 Ci/mMol, Amersham, Arlington Heights, IL) gefolgt. Die Kulturen wurden dann auf einem Glasfaser-Filter geerntet und durch Lawinengasionisierung, entweder mit einem Multidetektor Direkt-Beta-Zähler (Matrix 96, Packard Instrument Company, Meridien, CT) oder einem Beta-Szintillationszähler gezählt. Die durch die Untersuchung erzeugten Zählungen pro Minute (CPM) werden in prozentuelle Inhibierung umgewandelt und die prozentuellen Inhibierungswerte von jeder titrierten Antagonistprobe werden verwendet, um die Antiagonistaktivität in Einheiten/ml zu berechnen.
Daten, die die benötigte Konzentration zeigen, um 40 pg/ml IL-15 in einer CTLL-Inhibierungsuntersuchung zu neutralisieren, sind in Tabelle 1 unten bereitgestellt. Tabelle II unten zeigt die Aktivität von IL-15 (Agonistaktivität) in CTLL und CTLL-Inhibierungsuntersuchungen. Tabelle I Spezifische Aktivität von IL-15 Antagonisten Die benötigte Antagonist-Konzentration, um 40pg/ml IL-15 in einer CTLL-Inhibierungsuntersuchung zu neutralisieren:
Tabelle II Aktivität von IL-15 in CTLL und CTLL-Inhibierungsuntersuchungen
Sequenzprotokoll

Claims

Monoklonaler Antikörper, der gegen Interleukin 15 (IL-15) der SEQ ID NO: 1 oder 2 gezüchtet ist, welcher spezifisch IL-15 daran hindert, ein Signal durch eine der β- oder γ-Subeinheiten des IL-15 Rezeptorkomplexes umzuformen.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper humanisiert ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder Anpruch 2, wobei der Antikörper transgen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen monoklonalen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und ein(en) pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung bei der Behandlung von Organtransplantatabstoßung, Transplantat-versus-Wirt-Krankheit, Autoimmunkrankheit; rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Lymphom, Karzinom, Leukämie, Rhabdosarkom, einer Hautstörung, einer Störung des Gastro-Intestinal-Traktes, Insulin abhängiger Diabetes mellitus, einer Augenkrankheit, idiopathischem nephrotischem Syndrom/idiopathischer Membrannephropathie und HTLV-1 induziertem Leukämie-Lymphom.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zur Verwendung bei der Behandlung einer dermatologischen Störung.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpesr nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Organtransplantatabstoßung, Transplantatversus-Wirt-Krankheit, Autoimmunkrankheit, rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Lymphom, Karzinom, Leukämie, Rhabdosarkom, einer Hautstörung, einer Störung des Gastro-Intestinal-Traktes, Insulin abhängiger Diabetes mellitus, einer Augenkrankheit, idiopathischem nephrotischem Syndrom/idiopathischer Membrannephropathie und HTLV-1 induziertem Leukämie-Lymphom.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von rheumatoider Arthritis.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer dermatologischen Störung.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Transplantat versus Wirt Krankheit.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verlängerung des Transplantatüberlebens in einem Patienten.