DE69816502T2

DE69816502T2 - Ein Interleukin-18 enthaltender Agent, der Osteoclastzellen inhibiert

Info

Publication number: DE69816502T2
Application number: DE69816502T
Authority: DE
Inventors: Matthew Todd Med. Res Gillespie; Nicole Joy Med. Res Horwood; Nobuyuki Kashiwa-shi Udagawa; Masashi Okayama-shi Kurimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-24
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2018-02-25
Also published as: TW570801B; US20030095946A1; JPH10236974A; US6896880B2; KR19980071708A; JP3955352B2; EP0861663B1; EP0861663A3; DE69816502D1; US20020150555A1; KR100520723B1; EP0861663A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines einen Interleukin-18 (im folgenden mit „IL-18" abgekürzt) oder sein funktionales Äquivalent umfassenden osteoklastogenen Hemmstoff zur Herstellung eines bei der Behandlung von und/oder Vorbeugung gegen mit Osteoklasten im Zusammenhang stehenden Erkrankungen wirksamen Arzneimittels.
In gesunden lebenden Organismen besteht ein gutes Gleichgewicht zwischen Knochenbildung durch Osteoklasten und der Knochenresorption durch Osteoklasten, wodurch der Normalzustand von Knochengeweben bewahrt wird, während alte Knochengewebe durch frische ersetzt werden, ohne dabei die ursprüngliche Knochenform zu verändern. Dieses Phänomen spielt bei der Aufrechterhaltung der Homöostase lebender Organismen, wie etwa der Regulation der Blutcalciumkonzentration innerhalb eines gewünschten Bereichs, eine wichtige Rolle. Wird dieses Gleichgewicht einmal verloren, vor allem wenn das Niveau der Knochenresorption über dem der Knochenbildung liegt, so können Knochenerkrankungen und andere Krankheiten induziert werden. Daher wird aufgrund ihrer wissenschaftlichen und klinischen Bedeutung auf die Aufklärung des gesamten Mechanismus der Knochenresorption in lebenden Organismen, insbesondere der Erforschung von Osteoklasten, ein besonderes Augenmerk gelegt.
Zwar wurden Interleukin 1 als ein Promotor und Interleukin 4 als ein Inhibitor entdeckt, doch wurde der Mechanismus der Osteoklastenbildung bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Dies liegt daran, daß, ähnlich wie bei verschiedenen Phänomenen in den Organismen, die Osteoklastenbildung in lebenden Organismen durch die enge und komplizierte Beziehung zwischen Promotoren und Inhibitoren reguliert wird. Es wird stark damit gerechnet, daß auf deren Grundlage unter dem Gesichtspunkt wissenschaftlicher und klinischer Aspekte ein wirksamer osteoklastogener Hemmstoff realisiert werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung wirksamer osteoklastogener Hemmittel. Zur Lösung der Aufgabe wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung energisch nach „IL-18", d. h. einem der als Signalübertragungssubstanzen in Immunsystemen vorliegenden Cytokine, das die Produktion von Interferon-γ (im folgenden mit „IFN-γ" abgekürzt), einer wichtigen biologisch aktiven Substanz für immunkompetente Zellen, und von Granulocyten/Macrophagenkoloniestimulierendem Faktor (im folgenden mit „GM-CSF" abgekürzt) induziert sowie die Cytotoxizität erhöht und die Bildung von Killerzellen induziert, geforscht. Bei seiner Entdeckung wurde IL-18 als ein Interferon-γ induzierender Faktor beschrieben, wie von Haruki OKAMURA den japanischen Patenten Kokai Nr. 27,189/96 und 193,098/96 und in Nature, Bd. 378, Nr. 6,552, S. 88–91 (1995), und daraufhin auf Vorschlag von Shimpei USHIO et al., in The Journal of Immunology, Bd. 156, S. 4,274–4,279 (1996) IL-18 genannt.
Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde entdeckt, daß ein bestimmtes Gen, das die Osteoklastenbildung aus Osteoklasten-Vorläuferzellen in vitro hemmen kann, in Mengen in aus Mausmyelom stammenden Stromazellen spezifisch exprimiert wird. Ihre weitere ausführliche Analyse zeigte, daß (i) das Gen IL-18 kodiert, in dem SEQ ID NO: 7 als Kernsequenz enthalten ist, (ii) IL-18 und dessen funktionale Äquivalente die Osteoklastenbildung effektiv hemmen und (iii) die Hemmung hauptsächlich aufgrund der Wirkung des von IL-18 induzierten und produzierten GM-CSF erfolgt.
Auf Grundlage dieser Punkte wurde von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung die vorliegende Aufgabe unter Verwendung eines osteoklastogen Hemmstoffs, der die IL-18 oder sein funktionales Äquivalent als wirksamen Bestandteil enthält, gelöst.
In 1 ist die Struktur der rekombinanten DNA pKGFHH2 gezeigt.
In 2 ist die Struktur der rekombinanten DNA pCSHIGIF/MUT35 gezeigt.
In 3 ist die Struktur der rekombinanten DNA pCSHIGIF/MUT42 gezeigt.
In 4 ist die Struktur der rekombinanten DNA pBGHuGF gezeigt.
In 5 ist die Struktur der rekombinanten DNA pKGFMH2 gezeigt.
In diesen Abbildungen bedeutet KGFHH2-cDNA eine cDNA, die das erfindungsgemäße IL-18 kodiert; IGIF/MUT35 eine DNA, die das erfindungsgemäße IL-18 kodiert; IGIF/MUT42 eine DNA, die das erfindungsgemäße IL-18 kodiert; HuIGIF eine chromosomale DNA, die das erfindungsgemäße IL-18 kodiert; KGFMH2-cDNA eine cDNA, die das erfindungsgemäße IL-18 kodiert; 5S ein Gen für die 5S-ribosomale RNA; Ptac einen tac-Promotor; rrnBTIT2 einen Terminationsbereich eines ribosomalen RNA-Operons; AmpR ein Ampicillin-Resistenzgen; pBR322ori einen Replikationsursprung von Escherichia coli; CMV einen Cytomegalovirus-Promotor; IFNss eine Nukleotidsequenz, die ein Signalpeptid für den α2b-Subtyp des menschlichen Interferon-α kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines osteoklastogenen Hemmstoffs, der IL-18 oder sein funktionales Äquivalent als wirksamen Bestandteil enthält, zur Herstellung eines bei der Behandlung von und/oder Vorbeugung gegen mit Osteoklasten im Zusammenhang stehenden Erkrankungen wirksamen Arzneimittels. Der Ausdruck „IL-18", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt Polypeptide mit der obigen Eigenschaft unabhängig von deren Quellen und Herkunft. So enthält beispielsweise das in der vorliegenden Erfindung verwendete IL-18 als interne Aminosäureteilsequenzen die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3, ebenso wie die von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5, und enthält die gesamte Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 7. Der Ausdruck „funktionales Äquivalent" bzw. „funktionale Äquivalente", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt (i) solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der IL-18-Aminosäuresequenz durch andere Aminosäuren ersetzt sind, (ii) solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren N- und/oder C-Termini der IL-18-Aminosäuresequenz angefügt sind, (iii) solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren innerhalb der IL-18 Aminosäuresequenz liegende Stellen eingefügt sind, (iv) solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in den N- und/oder C-terminalen Bereichen der IL-18-Aminosäuresequenz deletiert sind, und (v) solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in den innerhalb der IL-18-Aminosäuresequenz liegenden Bereichen deletiert sind; alle diese Modifikationen sollten innerhalb des Bereichs erfolgen, in dem die Eigenschaft der Osteoklastenbildung durch IL-18 unter den IL-18 gehörenden Eigenschaften nicht wesentlich eingebüßt wird. Solche funktionalen Äquivalente sind beispielsweise zusammen mit ihren ausführlichen Aminosäuresequenzen in der japanischen Patenanmeldung Nr. 20,906/97 von der Anmelderin der vorliegenden Erfindung beschrieben, d. h. Polypeptide, die die Produktion von Interferon-gamma durch immunkompetente Zellen induzieren können, wobei diese Polypeptide entweder eine Aminosäuresequenz, bei der eine oder mehrere Cysteine durch eine andere Aminosäure bzw. andere Aminosäuren ersetzt sind, während die jeweiligen Konsensussequenzen, wie in SEQ ID NOs: 1, 2 und 4 gezeigt, intakt bleiben, oder eine Sequenz, bei der eine oder mehrere Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen, einschließlich solcher in den Konsensussequenzen, jedoch nicht an denen mit dem ersetzten Cystein hinzugefügt, entfernt und/oder ersetzt werden, enthalten. Die das Cystein bzw. die Cysteine ersetzenden anderen Aminosäuren sind nicht auf bestimmte Arten beschränkt, solange das erhaltene Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die durch die andere Aminosäure bzw. anderen Aminosäuren ersetzt wurde, eine Aktivität der Induktion der Produktion von IFN-γ durch immunkompetente Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit eines entsprechenden Co-Faktors wie die SEQ ID NOs: 1, 2 und 4 als Konsensus-Aminosäureteilsequenzen enthaltenden Wildtyp-Polypeptide sowie eine Stabilität zeigt, die deutlich höher als die der Wildtyp-Polypeptide ist. Zu den anderen Aminosäuren gehören Serin, Threonin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin, von denen Serin oder Alanin die am meisten bevorzugte Aminosäure ist. Ausführungsformen der SEQ ID NOs: 1, 2 und 4 als Konsensus-Aminosäureteilsequenzen enthaltenden Aminosäuresequenzen, in denen ein oder mehrere Cysteine durch eine andere Aminosäure bzw. andere Aminosäuren zu ersetzen sind, sind die SEQ ID NO: 6 oder 7 enthaltenden Wildtyp-Polypeptide. SEQ ID NO: 6 enthält Cysteine an Position 38, 68, 76 und 127 vom N-Terminus aus. SEQ ID NO: 7 enthält Cysteine an Position 7, 75 und 125. Zu den Polypeptiden gehören diejenigen, die die Aminosäuresequenz einer der SEQ ID NOs: 20–26, die aus dem SEQ ID NO: 6 enthaltenden Wildtyp-Polypeptid stammen, enthalten, diejenigen, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 27 oder 28, die aus dem die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7 enthaltenden Wildtyp-Polypeptid stammen, enthalten sowie diejenigen, die eine von einer der SEQ ID NOs: 20–28 durch Hinzufügen, Entfernen und/oder Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren an und/oder in einer Position bzw.
Positionen, außer den Positionen, in denen das Cystein bzw. die Cysteine unter Beibehaltung der gewünschten biologischen Aktivitäten und Stabilität ersetzt wurde(n), abgeleitete Aminosäuresequenz enthalten. Unter dem Ausdruck „eine oder mehrere Aminosäuren" ist die Anzahl an Aminosäuren zu verstehen, die man normalerweise mit herkömmlichen Verfahren, wie z. B. stellengerichteter Mutagenese, hinzufügen, entfernen oder ersetzen kann. Die eine der SEQ ID NOs: 20–28 enthaltenden Polypeptide besitzen sowohl eine Stabilität und biologische Aktivitäten, die deutlich über denen der Wildtyp-Polypeptide liegen.
Zu den funktionalen Äquivalenten, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, gehören weiterhin glykosylierte Polypeptide des IL-18 sowie die obigen Polypeptide. Jedes dieser IL-18-Moleküle und ihrer funktionalen Äquivalente, die jeweils unter „IL-18" zusammengefaßt sind bzw. mit „IL-18" bezeichnet werden, falls nicht anders angegeben, läßt sich in der vorliegenden Erfindung unabhängig von seiner Herkunft verwenden; solche, die durch Abtrennung aus natürlichen Quellen, wie z. B. Zellkulturen, und aus unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie und Peptidsynthese künstlich synthetisierten Quellen hergestellt werden.
Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus werden vorteilhafterweise Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie eingesetzt; allgemein gesagt, läßt sich das gewünschte IL-18 dadurch erhalten, daß man IL-18 kodierende DNAs in geeignete, aus Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren stammende Wirte unter Bildung von Transformanten einführt, die Transformanten in herkömmlicher Weise in Kulturnährmedien kultiviert und die Kultivierungssysteme mit zur Reinigung von Cytokinen verwendeten herkömmlichen Verfahren reinigt. Als obige DNAs lassen sich alle DNAs einsetzen, solange sie eine IL-18-kodierende DNA enthalten und sich in geeigneter Weise je nach Zweck der Verwendung des vorliegenden osteoklastogenen Hemmstoffs bzw. der verwendeten rekombinanten DNA-Technologie selektionieren lassen. So sind beispielsweise aus den japanischen Patenten Kokai-Nr. 193,098/96, 231,598/96 und 27,189/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung ausführlich beschriebene Verfahren zur Herstellung von IL-18 durch Kultivierung transformierter Mikroorganismen, in die eine für IL-18 aus Maus oder Mensch kodierende cDNA enthaltende DNAs eingeführt werden, bekannt; und aus der japanischen Patentanmeldung Nr. 185,305/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung ist ein ausführlich beschriebenes Verfahren zur Herstellung von menschliches IL-18 kodierendem IL-18 durch Kultivierung transformierter tierischer Zellen, die eine eingeführte, eine menschliches IL-18 kodierende chromosomale DNA enthaltende DNA aufweisen, bekannt. Aus der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung ist ein ausführlich beschriebenes Verfahren zur Herstellung von IL-18 durch Kultivierung transformierter tierischer Zellen, die eine eingeführte DNA, welche eine für ein funktionales Äquivalent des menschlichen IL-18 kodierende DNA enthält, aufweisen, bekannt.
Die obenerwähnte rekombinante DNA-Technologie besitzt zwar einen wirtschaftlichen Vorteil, doch kann das so erhaltene IL-18 je nach den verwendeten Wirtszellen und DNA-Sequenzen physiochemische Eigenschaften aufweisen, die sich in gewisser Weise von denen des in vivo hergestellten und wirkenden IL-18 unterscheidet. In der japanischen Patentanmeldung Nr. 67,434/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wird ausführlich eine Herstellung von IL-18 unter Verwendung etablierter menschlicher Zellinien als natürliche Quellen offenbart, und in der japanischen Patentanmeldung Nr. 213,257/96 derselben Anmelderin wird ebenfalls ausführlich die Herstellung unter Verwendung eines Interleukin-1β umsetzenden Enzyms offenbart. Es läßt sich abschätzen, daß das in diesen Präparationen erhaltene IL-18 weitgehend dieselben oder gleichwertige physikochemische Eigenschaften wie die des in vivo produzierten und wirkenden IL-18 aufweist, wobei die Ausbeute als geringfügig niedriger eingeschätzt wird. Doch hat ein solches IL-18 einen Vorteil dahingehend, daß es weniger Nebenwirkungen aufweist, wenn es als Pharmazeutikum auf die Verabreichung an Warmblüter im allgemeinen, einschließlich Menschen, gerichtet verwendet wird. Bei der Anwendung von Reinigungsverfahren mit für IL-18 spezifischen monoklonalen Antikörpern, wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 231,598/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung offenbart, läßt sich ein IL-18 mit relativ hoher Reinheit mit minimalem Arbeits- und Kostenaufwand gewinnen.
Der vorliegende, das obengenannte IL-18 enthaltende osteoklastogene Hemmstoff umfaßt alle zur Hemmung der Osteoklastenbildung sowohl in vivo als auch in vitro verwendbaren Arten und Formen. Der vorliegende Stoff läßt sich vorteilhafterweise als Bestandteil von Zellkulturmedien für tierische Zellen, mit denen die Osteoklastenbildung ausreichend gehemmt und die gewünschten Zellen erhalten, vermehrt und/oder differenziert werden; als Komponente für Screening-Kits für Therapeutika von Knochenerkrankungen; als Regulationsmittel für die Knochenresorption; und als Mittel geeigneten mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Erkrankungen. Zu den Regulationsmitteln für die Knochenresorption gehören Arzneimittel und Reformkost, die eine osteoklastogene Hemmaktivität in vivo ausüben, die Knochenresorption im Normalzustand halten und ungünstige physische Erscheinungen, wie z. B. eine relativ insignifante Arthralgie verbessern. Zu den Mitteln gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehenden Erkrankungen gehören zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von durch übermäßige Osteoklasten bildung und/oder deren Funktion verursachten Erkrankungen verwendete Arzneimittel. Zu solchen Erkrankungen zählen beispielsweise Hypercalcämie, Osteoklastom, Behcet-Krankheit, Osteosarkom, Arthropathie, chronische rheumatoide Arthritis, Ostitis deformans, primäre Hyperthyreose, Osteopänie und Osteoporose. Je nach Art der Mittel und der zu behandelnden Erkrankungen wird das vorliegende Mittel normalerweise in eine flüssige, Pasten- oder feste Form, die 0,000002–100 w/w-%, vorzugsweise 0,0002–5 w/w-% IL-18 enthält, formuliert.
Bei dem vorliegenden osteoklastogenen Hemmstoff kann es sich sowohl um IL-18 allein als auch um Zusammensetzungen handeln, die IL-18 und einen oder mehrere andere Bestandteile; wie z. B. Träger, Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel, Adjuvantien, Antibiotika sowie Proteine, wie z. B. Serumalbumin und Gelatine, als Stabilisatoren; Saccharide, wie z. B. Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Trehalose, Saccharose, Isomaltose, Laktose, Panose, Erlose, Palatinose, Laktosaccharose, Raffinose, Fructooligosaccharid, Galactooligosacchararid, Lentinan, Dextrin, Pullulan, sowie Zuckeralkohole, einschließlich Sorbit, Maltit, Lactit und Maltotriitol; Puffer, die vorwiegend Phosphate oder Citrate enthalten; und Reduktionsmittel, wie z. B. 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol und reduziertes Glutathion; sowie gegebenenfalls biologisch aktive Substanzen, wie z. B. Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-6, Interleukin-12, TNF-α, TNF-β, GM-CFS, Östrogen, Progesteron, Chlormadinonacetat, Calcitonin, Somatokin, Somatomedin, insulinähnlicher Wachstumsfaktor, Ipriflavon, Parathormon (PTH), Norethisteron, Busulfan, Ancitabin, Cytarabin, Fluoruracil, Tetrahydrofurfuryl-Fluoruracil, Methotrexat, Vitamin D₂, aktives Vitamin D, Krestin^® bzw. Polysaccharid K, L-Asparaginase und OK-432 bzw. Picibanil^®; und Calciumsalze, wie z. B. Calciumlaktat, Calciumchlorid, Calciummonohydrogenphosphat und L-Calcium-L-Aspartat, enthalten. Bei Verwendung als Mittel zur Verabreichung an Warmblüter im allgemeinen, einschließlich Menschen, d. h. Mittel gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Erkrankungen, läßt sich das vorliegende Mittel vorzugsweise in Zusammensetzungen formulieren, indem es in geeigneter Weise mit einer oder mehreren der obigen physiologisch unbedenklichen Substanzen kombiniert wird.
Der vorliegende osteoklastogene Hemmstoff umfaßt Arzneimittel in einer zur Verabreichung an Warmblüter im allgemeinen, einschließlich Menschen, verwendeten Einheitsdosisform. Unter dem Ausdruck „Einheitsdosisform" versteht man solche, die IL-18 in einer für eine tägliche Dosis geeigneten Menge oder in einer Menge von bis zum vierfachen in Ganzzahlschritten oder bis zu 1/40 der Dosis enthalten, und solche in einer physikalisch getrennten und formulierten Form, die sich für verordnete Verabreichungen eignet. Zu solchen Formulierungen gehören beispielsweise Injektionen, Flüssigkeiten, Puder, Granulate, Tabletten, Kapseln, Trochisken, Collyria, Nebulae und Zäpfchen.
Mit dem vorliegenden Mittel als osteoklastogenem Hemmstoff werden in wirksamer Weise mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Erkrankungen unabhängig von oralen und parenteralen Verabreichungen behandelt und verhindert. Je nach Art und Symptomen der Erkrankungen von Patienten läßt sich das vorliegende Mittel an die Patienten oral, intradermal, subkutan, muskulär oder intravenös mit einer Dosis von etwa 0,5 μg bis 100 mg pro Gabe, vorzugsweise mit einer Dosis von etwa 2 μg bis 10 ml IL-18 pro Gabe, 2–6mal am Tag oder 2–10mal pro Woche einen Tag bis zu einem Jahr lang verabreichen.
Im folgenden werden unter Bezugnahme auf Experimente die Herstellung, physikochemische Eigenschaft und biologische Aktivität des erfindungsgemäßen IL-18 beschrieben:
Experiment 1
Herstellung von menschlichem IL-18
Gemäß dem Verfahren im japanischen Patent Kokai-Nr. 231,598/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde eine autonom replizierbare rekombinante DNA, pKGFHH2, die mit einer menschliches IL-18 kodierenden cDNA verknüpft ist, hergestellt. Die Didesoxyribonukleotid-Sequenzanalyse zeigte, daß, wie in 1 dargestellt, in der rekombinanten DNA KGFHH2-cDNA, die die Basensequenz der SEQ ID NO: 8 enthält, mit dem stromaufwärts liegenden Ptac, einem tac-Promotor, verknüpft war. Die rekombinante DNA pKGFHH2 enthält die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 5; diese Aminosäuresequenzen wurden von den Nukleotiden 46–63, 88–105, 400–420, 151–165 bzw. 214–228 in SEQ ID NO: 8 kodiert.
Gemäß dem Verfahren im japanischen Patent Kokai-Nr. 231,598/96 wurde die rekombinante DNA pKGFHH2 in einen Escherichia coli-Y1090-Stamm, ATTC 37197, eingeführt, der dann kultiviert wurde. Das produzierte Polypeptid wurde über Immunoaffinitätschromatographie unter Erhalt eines gereinigten menschlichen IL-18 mit einer Reinheit von wenigstens 95% bei einer Ausbeute von etwa 25 mg/l Kultivierungssysteme gereinigt. Gemäß dem Verfahren im japanischen Patent Kokai-Nr. 193,098/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde das gereinigte menschliche IL-18 auf seine biologische Aktivität und physikochemische Eigenschaft hin wie unten dargestellt analysiert: bei der Kultivierung menschlicher Lymphozyten, die in herkömmlicher Weise einem gesunden Spender entnommen worden waren, in Gegenwart des gereinigten menschlichen IL-18 wurde eine von der IL-18-Konzentration abhängige IFN-γ-Produktion beobachtet, wodurch bestätigt wurde, daß IL-18 eine Aktivität zur Induktion der IFN-γ-Produktion in Lymphozyten als immunkompetente Zellen besitzt. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 227, S. 680–685 (1970) veöffentlichten Verfahren wurde das gereinigte IL-18 einer SDS-PAGE unterzogen, wobei eine Hauptbande mit einer IFN-γ-induzierenden Aktivität an einer Position erhalten wurde, die 18500 ± 3000 Dalton entspricht. Das IL-18 ergab einen pI von 4,9 ± 1,0, wie mit herkömmlicher Chromatofokussierung bestimmt wurde. Eine herkömmliche Analyse mit dem „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", einem Instrument der Fima Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA, zeigte, daß das IL-18 die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 9 aufwies, d. h. die Aminosäuresequenz, der SEQ ID NO: 8, wobei ein Methioninrest mit dem N-Terminus verknüpft war.
Experiment 2
Herstellung von menschlichem IL-18
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 67,434/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurden dorsale subkutane Gewebe neugeborener Hamster mit THP-1-Zellen, ATCC TIB 202, einer menschlichen Monozyten-Zellinie, die von einem männlichen Patienten mit akuter monozytischer Leukämie stammte, inokuliert und die Hamster danach drei Wochen lang gefüttert. Die sich in den subkutanen Geweben der Hamster gebildeten Tumormassen mit einem Gewicht von jeweils etwa 15 g wurden extrahiert, in Medien dispergiert und aufgeschlossen. Das aus den aufgeschlossenen Zellen erhaltene Polypeptid wurde mit Immunaffinitätschromatographie unter Erhalt eines gereinigten IL-18 mit einer Ausbeute von etwa 50 ng/Kopf gereinigt.
In ähnlicher Weise wurde gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 67,434/96 das gereinigte menschliche IL-18 hinsichtlich der biologischen Aktivität und physikochemischen Eigenschaft wie unten angedeutet analysiert und bestimmt: es konnte bestätigt werden, daß die Kultivierung menschlicher Lymphozyten, die gesunden Spendern in herkömmlicher Weise entnommen worden waren, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des menschlichen IL-18 zu einer von der IL-18-Dosis abhängigen IFN-γ-Produktion führte. Damit wurde gezeigt, daß das menschliche IL-18 eine biologische Aktivität zur Induktion, der IFN-γ-Produktion in Lymphozyten als immunkompetente Zellen aufwies. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 227, S. 680–685 (1970) veröffentlichten Verfahren wurde das gereinigte menschliche IL-18 einer SDS-PAGE mit 2% (w/v) Dithiothreitol als Reduktionsmittel unterzogen, wobei eine Hauptbande mit einer IFN-γ-Produktion-induzierenden Aktivität an einer Position, die 18000–19500 Dalton entspricht, erhalten wurde. Gemäß der in der japanischen Patentanmeldung Nr. 67,434/96 offenbarten Peptidkarte wurde das menschliche IL-18 mit dem von der Firma Sigma Chemical Company, Missouri, USA, kommerziell vertriebenen Clostripain unter Erhalt von Polypeptidfragmenten behandelt, die dann zur Auftrennung einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit „ODS-120T", einer von der Firma Tosoh Corporation, Tokio, Japan, kommerziell vertriebenen Säule, unterzogen wurden, wobei die Analyse der Aminosäuresequenzen der Fragmente vom N-Terminus die folgenden Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 10 bis 13 ergab. Diese Aminosäuresequenzen stimmten vollständig mit den Aminosäuren 148–157, 1–13, 45–58 und 80–96 in SEQ ID NO: 6 überein. Die Daten zeigen, daß das in Experiment 2 erhaltene menschliche IL-18 die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 und alle Aminosäureteilsequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 5 aufweist.
Experiment 3
Herstellung funktionaler Äquivalente
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde eine autonom replizierbare rekombinante DNA, pCSHIGIF/MUT35, hergestellt, mit einer ein funktionales Äquivalent des menschlichen IL-18 kodierenden DNA, wobei die Cysteine 38, 68 und 76 in SEQ ID NO: 6 durch Serin, Serin bzw. Alanin ersetzt waren, verknüpft. Die Didesoxyribonukleotid-Sequenzanalyse zeigte, daß, wie in 2 gezeigt, in der rekombinanten DNR die DNA IGIF/MUT35 mit der SEQ ID. NO: 14 mit einer ein Signalpeptid des α2b-Subtyps in menschlichem Interferon-α kodierenden und stromaufwärts liegenden Basensequenz im selben Leseraster verknüpft wurde, wie von K. Henco et al., in Journal of Molecular Biology, Bd. 185, S. 227–260 (1985) berichtet, wobei weiter stromabwärts ein Stopkodon für die Proteinsynthese vorhanden war. Wie parallel in SEQ ID NO: 14 gezeigt, entsprach die von der rekombinanten DNA kodierte Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, wobei die Cysteine 38, 68 und 76 in SEQ ID NO: 6 durch Serin, Serin bzw. Alanin ersetzt waren. Die rekombinante DNA enthielt ein Nukleotid, die alle Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 4 sowie die der SEQ ID NO: 5, wobei Cystein als Aminosäure 5 in der SEQ ID NO: 5 durch Alanin ersetzt war, kodiert. Diese Aminosäuresequenzen wurden von den Nukleotiden 46–63, 88–105, 400–420, 151–165 bzw. 214–228 in SEQ ID NO: 14 kodiert.
Gemäß dem Verfahren der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde die rekombinante DNA pCSHIGIF/MUT35 in COS-1-Zellen, ATCC CRL 1650, einer etablierten, aus der Niere des mit SV40 transformierten „African Green Monkey" stammenden Zellinie eingeführt, woraufhin die transformierten Zellen kultiviert wurden. Das in dem Kultivierungssystem produzierte Polypeptid wurde mit Immunaffinitätschromatographie unter Erhalt eines gereinigten funktionalen Äquivalents des menschlichen IL-18 bei einer Ausbeute von etwa 40 ng/ml Kultivierungssystem gereinigt. Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 wurde das gereinigte funktionale Äquivalent auf seine biologische Aktivität und physikochemische Eigenschaft wie unten angegeben analysiert und bestimmt: bei der Kultivierung von KG-1-Zellen, ATCC CCL 246, einer etablierten, aus Patienten mit akuter myelogener Leukämie stammenden Zellinie, in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen an dem gereinigten funktionalen Äquivalent des menschlichen IL-18 wurde eine von der Konzentration des IL-18 abhängige IFN-γ-Produktion beobachtet, wodurch gezeigt wurde, daß das IL-18 eine biologische Aktivität zur Induktion der IFN-γ-Produktion in KG-1-Zellen als immunkompetente Zellen aufweist. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 227, S. 680–685 (1970) veröffentlichten Verfahren wurde das gereinigte funktional Äquivalent einer SDS-PAGE in Gegenwart von 2% (w/v) Dithiothreitol als Reduktionsmittel unterzogen, wobei eine Hauptbande mit IFN-γ-Produktion-induzierender Aktivität an einer Position, die 18000–19500 Dalton entspricht, erhalten wurde. Eine herkömmliche Analyse mit dem „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A" einem Instrument der Firma Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA, ergab, daß der N-terminale Bereich des funktionalen Äquivalents die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15, die der Aminosäuresequenz im N-terminalen Bereich, wie parallel in SEQ ID NO: 14 gezeigt, entsprach, aufwies.
Experiment 4
Herstellung eines funktionalen Äquivalents
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde eine autonom replizierbare rekombinante DNA, pCSHIGIF/MUT42, hergestellt, die mit einer für ein funktionales Äquivalant des menschlichen IL-18, wobei die Cysteine 38, 68, 76 und 127 in SEQ ID NO: 6 durch Serin, Serin, Alanin bzw. Serin ersetzt waren, kodierenden DNA verknüpft wurde. Die Didesoxyribonukleotidsequenzierung ergab, daß, wie in 3 gezeigt, in der rekombinanten DNA die DNA IGIF/MUT42 mit SEQ ID NO: 16 mit einer ein Signalpeptid für den α2b-Subtyp des menschlichen Interferon-α im selben Leseraster kodierenden, stromaufwärts liegenden Basensequenz, wie von K. Henco et al., in Journal of Molecular Biology, Bd. 185, S. 227–260 (1985) berichtet, verknüpft war und weiter stromabwärts ein Stopkodon für die Proteinsynthese aufwies. Wie parallel in SEQ ID NO: 16 gezeigt, entsprach die von der rekombinanten DNA kodierte Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6, wobei die Cysteine 38, 68, 76 und 127 in SEQ ID NO: 6 durch Serin, Serin, Alanin bzw. Serin ersetzt waren. Die rekombinante. DNA enthielt eine Nukleotidsequenz, die alle Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 4 und die der SEQ ID NO: 5, wobei Cystein 5 in SEQ ID NO: 5 durch Alanin ersetzt war, kodiert. Diese Aminosäuresequenzen wurden von den Nukleotiden unter den Nukleotidnummern 46–63, 88–105, 400–420, 151–165 bzw. 214–228 in SEQ ID NO: 16 kodiert.
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde die rekombinante DNA pCSHIGIF/MUT42 in COS-1-Zellen eingeführt, woraufhin die Zellen kultiviert wurden. Das in dem Kultivierungssystem produzierte Polypeptid wurde mit Immunaffinitätschromatographie unter Erhalt eines gereinigten funktionalen Äquivalents des menschlichen IL-18 bei einer Ausbeute von etwa 20 ng/ml Kultivierungssystem gereinigt. Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 20,906/97 wurde das gereinigte funktionale Äquivalent auf seine biologische Aktivität und physikochemische Eigenschaft wie unten angegeben analysiert und bestimmt: bei der Kultivierung von KG-1-Zellen in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des gereinigten funktionalen Äquivalents wurde eine dosisabhängige IFN-γ-Produktion beobachtet, wodurch gezeigt wurde, daß das funktionale Äquivalent eine biologische Aktivität zur Induktion der IFN-γ-Produktion in KG-1-Zellen als immunokompetente Zellen aufwies. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 227, S. 680–685 (1970) veöffentlichten Verfahren wurde das gereinigte funktionale Äquivalent einer SDS-PAGE in Gegenwart, von 2%. (w/v) Dithiothreitol als Reduktionsmittel unterworfen, wobei eine Hauptbande mit einer IFN-γ-induzierenden Aktivität an einer Position, die 18000 ± 19500 Dalton entsprach, erhalten wurde. Eine herkömmliche Analyse mit dem „PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", einem Instrument der Fima Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA, zeigte, daß der N-terminale Bereich des funktionalen Äquivalents die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 aufwies, die vollkommen der Aminosäuresequenz im N-terminalen Bereich, wie parallel in SEQ ID NO: 16 gezeigt, entsprach.
Experiment 5
Herstellung von menschlichem IL-18
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 185,305/96 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung wurde eine autonom replizierbare rekombinante DNA, pBGHuGF, erhalten, die mit einer menschliches IL-18 kodierenden chromosomalen DNA verknüpft war. Die Didesoxyribonukleotid-Sequenzanalyse ergab, daß, wie in 4 gezeigt, in der rekombinanten DNA eine chromosomale DNA, die menschliches IL-18 kodiert, d. h. die DNA HuIGIF mit SEQ ID NO: 17, mit einer stromaufwärts liegenden Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms Hind III verknüpft war. Wie in SEQ ID NO: 17 gezeigt, besteht die chromosomale DNA HuIGIF aus 11464 bp, wobei das Exon durch vier Introns mit den Nukleotidpositionen 83–1453, 1466–4848, 4984–63127 bzw. 6452–11224 fragmentiert war. Von der übrigen Nukleotidsequenz ohne diese Introns bilden die Nukleotide 3–11443 vom 5'-Terminus den Teil, der ein Vorläufermolekül des menschlichen IL-18 kodiert, und die Nukleotide 4866–4983 den Teil, der ein aktives menschliches IL-18 kodiert. Die chromosomale DNA enthielt Nukleotidsequenzen, die die SEQ ID NOs: 1 bis 5 kodieren; diese Aminosäuresequenzen wurden von den Nukleotiden 4911–4928, 4953–4970, 11372–11392, 6350–6364 bzw. 6413–6427 in SEQ ID NO: 17 kodiert.
Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 185,305/96 wurde die rekombinante DNA pBGHuGF in CHO-K1-Zellen, ATCC CCL 61, einer aus „Chinese Hamster Ovary" stammenden etablierten Zellinie eingeführt, woraufhin die Zellen kultiviert wurden. Der Kultivierungssystemüberstand wurde mit einem Überstand eines aus einer THP-1-Zellkultur hergestellten Zellaufschluß in Kontakt gebracht, so daß ein Polypeptid produziert wurde, das danach mit Immunaffinitätschromatographie unter Erhalt eines gereinigten menschlichen IL-18 bei einer Ausbeute von etwa 15 mg/l Kultivierungssystem gereinigt wurde. Gemäß dem Verfahren in der japanischen Patentanmeldung Nr. 185,305/96 wurde das Polypeptid auf seine biologische Aktivität und physikochemische Eigenschaft wie unten angegeben analysiert und bestimmt: es konnte bestätigt werden, daß menschliche Lymphozyten, die einem gesunden Spender entnommen worden waren, IFN-γ in Abhängigkeit von der Konzentration des gereinigten menschlichen IL-18 produzierten, wenn sie bei unterschiedlichen Konzentrationen des menschlichen IL-18 kultiviert wurden, wodurch gezeigt wurde, daß das menschliche IL-18 eine biologische Aktivität zur Induktion der IFN-γ-Produktion in Lymphozyten als immunokompetente Zellen aufweist. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd: 227, S. 680–685 (1970) veöffentlichten Verfahren wurde das gereinigte menschliche IL-18 einer SDS-PAGE in Gegenwart von 2% (w/v) Dithiothreitol als Reduktionsmittel unterworfen, wobei eine Hauptbande mit einer IFN-γ-induzierenden Aktivität an einer Position, die 18000 ± 19500 Dalton entsprach, erhalten wurde. Der N-terminale Bereich des menschlichen IL-18 enthielt die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15, die vollständig der Aminosäuresequenz im N-terminalen Bereich der SEQ ID NO: 17 für eine aktive IL-18 entsprach.
Experiment 6
Herstellung von IL-18 aus Maus
In ein 0,5-ml Reaktionsröhrchen wurden 8 μl 25 mM Magnesiumchlorid, 10 μl 10 × PCR-Puffer, ein μl 25 mM dNTP-Mix, 1 μl 2,5 Einheiten/μl Amplitaq DNA-Polymerase, ein ng einer rekombinanten DNA, die IL-18 aus Maus mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 18 und der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7, hergestellt aus einem Phagen-DNA-Klon gemäß dem Verfahren im japanischen Patent Kokai-Nr. 27,189/96 kodiert, sowie ausreichende Menge an Sense- und Antisense-Primer mit den durch 5'-ATAGAATTCAAATGAACTTTGGCCGACTTCACTG-3' bzw. 5'-ATAAAGCTTCTAACTTTGATGTAAGTT-3' dargestellten Nukleotidsequenzen, die chemisch auf Grundlage der Nähe der Aminosäuresequenzen zur N- bzw. C-Terminus der SEQ ID NO: 7 chemisch synthetisiert wurden, gegeben, und das Lösungsgemisch wurde mit sterilisiertem destilliertem Wasser auf ein Volumen von 100 μl gebracht. Die so erhaltene Lösung wurde in der üblichen Weise einer PCR-Reaktion mit den folgenden drei Cyclen aufeinanderfolgender Inkubationen von einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 43°C und einer Minute bei 72°C sowie weiterer 40 Cyclen aufeinanderfolgender Inkubationen von jeweils einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 60°C und einer Minute bei 72°C unterworfen.
Das durch die PCR-Reaktion erhaltene Produkt sowie „PCR-Script SK (+)", ein von der Firma Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA, kommerziell vertriebener Plasmidfaktor, wurden in herkömmlicher Weise unter Verwendung einer DNA-Ligase zu einer rekombinanten DNA ligiert, die dann in „XL-1 Blue MRF'Kan", einem von der Firma Stratagene Cloning Systems, Kalifornien, USA, kommerziell vertriebenem Escherichia coli-Stamm eingeführt, so daß ein Transformant erhalten wurde. L-Broth (pH 7,2) mit 50 μg/ml Ampicillin wurde mit diesem Transformanten angeimpft, und anschließend wurde 18 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Das Kultivierungssystem wurde dann zentrifugiert, um die sich vermehrten Transformanten zu erhalten, die dann zur Isolierung einer rekombinanten DNA einem herkömmlichen Alkali-SDS-Verfahren unterzogen wurden. Ein Teil der isolierten rekombinanten DNA wurde über Didesoxyribonukleotid-Sequenzierung analysiert, wobei sich zeigte, daß die rekombinante DNA Restriktionsstellen für Eco RI und Hind III am 5'- bzw. 3'-Terminus von SEQ ID NO: 18 enthielt sowie eine DNA, die ein Methioninkodon zur Initiation der Polypeptidsynthese sowie ein TAG-Kodon zur Termination der Polypeptidsynthese, die sich unmittelbar vor dem N- bzw. hinter dem C-Terminus der Aminosäuresequenz, wie parallel in SEQ ID NO: 18 gezeigt, befanden, enthielt. Die rekombinante DNA enthielt die Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 1 bis 5. Diese Aminosäuresequenzen wurden von Nukleotiden 46–63, 85–102, 394–414, 148–162 und 211–225 in SEQ ID NO: 18 kodiert.
Der restliche Teil der rekombinanten DNA wurde in herkömmlicher Weise mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Hind II geschnitten, und das entstandene 0,1 μg eines unter Verwendung des „DNA LIGRTION KIT VER 2", eines von der Firma Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen DNA-Ligationskits, erhaltenen Eco RI-Hind III-DNA-Fragments sowie 10 ng pKK223-3, einem von der Firma Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, kommerziell vertriebenen Plasmidvektor, der mit einem Restriktions enzym geschnitten worden war, wurden durch 30minütige Inkubation bei 16°C miteinander verknüpft, so daß eine autonom replizierbare rekombinante DNA, pKGFMH2, erhalten wurde. Unter Verwendung des Verfahrens mit kompetenten Zellen wurde ein Escherichia coli Y1090-Stamm, ATCC 37197, mit der rekombinanten pKGFMH2-DNA und anschließend L-Broth (pH 7,2) mit 50 μg/ml Ampicillin mit dem erhaltenen Transformanten, KGFMH2, angeimpft, und anschließend wurde 18 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Das Kultivierungssystem wurde zur Gewinnung der sich vermehrten Transformanten zentrifugiert und anschließend wurde zur Extraktion der rekombinanten pKGFMH2-DNA ein Teil der Transformanten einem herkömmlichen SDS-Alkali-Verfahren unterzogen. Die Didesoxyribonukleotid-Sequenzanalyse ergab, daß, wie in 5 gezeigt, die die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 18 enthaltende KGFMH2-cDNA mit dem stromaufwärts liegenden tac-Promotor in der rekombinante pKGFMMH2-DNA verknüpft war.
Zu L-Broth (pH 7,2), das durch Autoklavieren sterilisiert worden war, wurde Ampicillin mit einer Konzentration von 50 μg/ml zugegeben, das Medium auf 37°C abgekühlt und mit dem Transformanten KGFMH2 angeimpft, wonach 18 Stunden bei 37°C kultiviert wurde. Achtzehn Liter desselben, frisch hergestellten Kulturmediums wurden in einen 20-l-Fermentertopf gegeben, in ähnlicher Weise wie oben sterilisiert, mit Ampicillin versetzt, auf 37°C abgekühlt und mit einem % (v/v) der oben erhaltenen Animpfkultur angeimpft, wonach 8 Stunden unter Belüften und Aufrühren kultiviert wurde. Die erhaltene Kultur wurde zur Gewinnung der kultivierten Zellen zentrifugiert, die dann in einem Lösungsgemisch (pH 7,3) mit 150 mM Natriumchlorid, 16 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 4 mM Natriumdihydrogenphosphat suspendiert, mit Ultraschall aufgeschlossen und zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert wurden, wodurch etwa zwei Liter eines Überstands erhalten wurden.
Zu etwa zwei Litern des Überstands gab man 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) mit Ammoniumsulfat unter Erhalt einer 40%igen Sättigung mit Ammonium. Der erhaltenen Niederschlag wurde abzentrifugiert und der Überstand mit Ammoniumsulfat versetzt, so daß eine 85%ige Sättigung mit Ammonium erhalten wurde, 18 Stunden bei 4°C stehen gelassen und dann bei etwa 8000 UpM 30 min zentrifugiert, wobei sich wiederum ein Niederschlag bildete. Der so erhaltene Niederschlag wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) mit 1,5 M Ammoniumsulfat und einem Gesamtvolumen von etwa 1300 ml gelöst, und nach Filtrieren der Lösung wurde damit eine mit etwa 800 ml „PHENYL SEPHAROSE CL-6B", einem von der Firma Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, kommerziell vertriebenen Gel, gepackte Säule geladen, die anschließend mit einer frischen Präparation desselben Puffers gewaschen und dann mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,6) mit einem von 1,5 M bis 0 M linear abnehmendem Ammoniumsulfatgradienten mit einer Belastung SV („Space Velocity") von 1,5 beladen. Die bei ungefähr 1 M Ammoniumsulfat eluieren Fraktionen wurden vereinigt, unter Verwendung eines Membranfilters konzentriert und gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) 18 Stunden bei 4°C dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine mit etwa 55 ml „DEAE-5PW", einem von der Firma Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, kommerziell vertriebenen Gel, gepackte Säule, die mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit einer frischen Präparation desselben Puffers gewaschen und mit einem von 0 M bis 0,5 M ansteigenden linearen Natriumchloridgradienten in 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) bei SV 5,5 beladen, und anschließend wurden die bei etwa 0,2 M Natriumchlorid eluierten Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden danach vereinigt und in ähnlicher Weise wie oben auf konzentriert, so daß ein Konzentrat von etwa neun Millilitern erhalten wurde, das dann gegen PBS („Phosphate Buffered Saline" = phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 18 Stunden bei 4°C dialysiert wurde, und die dialysierte Lösung wurde dann auf eine mit „SUPERDEX 75", einem von der Firma Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, kommerziell vertriebenen Gel, gepackte Säule, die mit einer frischen Präparation derselben PBS-Lösung äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde zur Gewinnung der Fraktionen mit einer IFN-γ-Produktion-γ induzierenden Aktivität mit einer frischen Präparation derselben PBS-Lösung beladen, und die Fraktionen wurden dann vereinigt und mit einem Membranfilter konzentriert, so daß ein gereinigtes Maus-IL-18 mit einer Ausbeute von etwa 350 μg/l Kultur erhalten wurde.
Gemäß dem Verfahren des japanischen Patents Kokai-Nr. 27,189/96 wurde das gereinigte Maus-IL-18 auf seine biologische Aktivität und physikochemische Eigenschaft wie unten angegeben analysiert und bestimmt: die Kultivierung von Milzzellen aus der Maus, die auf herkömmliche Weise entnommen wurden, mit unterschiedlichen Konzentrationen des Maus-IL-18 ergab eine von den Konzentrationen des Maus-IL-18 abhängige IFN-γ-Produktion, wodurch gezeigt wurde, daß das Maus-IL-18 eine Aktivität zur Induktion der IFN-γ-Produktion in Milzzellen als immunkompetente Zellen aufweist. Gemäß dem von U. K. Laemmli in Nature, Bd. 227, S. 680–685 (1970) veröffentlichten Verfahren wurde das gereinigte menschliche IL-18 einer SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen unterworfen, wobei eine Hauptbande mit einer IFN-γ-induzierenden Aktivität an einer Position, die 19000 ± 5000 Dalton entsprach, erhalten wurde. Der N-Terminalbereich des Maus-IL-18 enthielt die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 19, die dem N-terminalen Bereich der SEQ ID NO: 18 entsprach.
Unter Bezugnahme auf das Experiment 7 wird nun die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen IL-18 näher beschrieben, wobei Experiment 8 die Cytotoxizität des IL-18 beschreibt:
Experiment 7
Biologische Aktivität
Experiment 7-1
Induktion der GM-CFS-Produktion
Mit einer heparinisierten Spritze wurde einer gesunden freiwilligen Person Blut entnommen und mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH 7,4) auf das doppelte Volumen verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde auf Ficoll geschichtet und zentrifugiert, und die gesammelten Lymphozyten wurden mit RPMI 1640-Medium (pH 7,4), das mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum supplementiert war, gewaschen und in einer frischen Präparation desselben Mediums unter Erhalt einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert, woraufhin die Zellsuspension auf eine 12-Well-Mikroplatte mit jeweils zwei ml/Well verteilt wurde.
Unter Verwendung des mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum supplementieren RPMI 1640-Mediums (pH 7,4) wurde eine mit dem Verfahren in Experiment 1 erhaltene IL-18-Präparation als eine μg/ml-Lösung hergestellt, die dann auf die obige Mikroplatte mit 20–200 μl/Well verteilt wurde. Auf die Mikroplatte wurde weiterhin eine frische Präparation desselben Puffers, die mit 500 μl/ml Concanavalin A supplementiert war, mit jeweils 10 μl/Well gegeben, woraufhin 48 Stunden in einem 5% Co₂ (v/v)-Inkubator bei 37°C inkubiert wurde. Nach Beendigung der Kultur wurden von den Überständen in jedem Well jeweils 0,1 ml/Well abgenommen und auf ihren GM-CSF-Gehalt him mit, einem herkömmlichen Enzym-Immunoassay bestimmt. Parallel dazu wurde ein IL-18-freies Kultursystem als Kontrolle hergestellt und in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Die Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt: Tabelle 1
Anmerkung: Das Symbol „*" bedeutet, daß IL-18 zu dem Kultursystem in Gegenwart von 2,5 μg/ml Concavalin A gegeben wurde.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 deuten an, daß Lymphozyten als immunkompetente GM-CSF in Abhängigkeit von der IL-18-Konzentration produzierten, wenn sie mit IL-18 in Gegenwart von Concavalin A als Cofaktor in Kontakt gebracht wurden. Es konnte ebenso bestätigt werden, daß alle IL-18-Präparationen und deren funktionale Äquivalente, die mit dem Verfahren in den Experimenten 2 bis 5 erhalten wurden, die GM-CSF-Produktion induzierten, selbst wenn sie analog zu oben allein verwendet wurden. Eine mit dem Verfahren in Experiment 6 erhaltene IL-18-Präparation wurde gemäß Experiment 7-1 getestet, außer daß anstelle der menschlichen Lymphozyten in herkömmlicher Weise präparierte Milzzellen aus Maus in dem Experiment verwendet wurden, wobei sich zeigte, daß die IL-18-Präparation ebenfalls die GM-CSF-Produktion induziert.
Experiment 7-2
Hemmung der Osteoklastenbildung
Experiment 7-2(a)
Wie von T. J. Martin und K. W. Ng in Journal of Cellular Biochemistry, Bd. 56, S. 357–366 (1994) berichtet, wird es als erforderlich angesehen, daß für die allgemeine Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen in reife Osteoklasten die aus hämatopoetischen Stammzellen abgeleiteten Osteoklasten- Vorläuferzellen mit Osteoklasten oder Knochenmarkstromazellen in Kontakt gebracht werden müssen. Wie von G. D. Roodman in Endrocine Reviews, Bd. 17, Nr. 4, S. 308–332 (1996) beschrieben, gilt für Osteoklasten allgemein, daß sie den Charakter multinukleärer Zellen besitzen sowie einen gegen Weinsäure („Tartaric Acid") resistente saure Phosphatase (im folgenden mit „TRAP" abgekürzt)-Aktivität und einen Calcitonin-Rezeptor aufweisen. In einem Co-Kultivierungssystem von Osteoblasten und Knochenmarkszellen, wie von Nobuyuki UDRGAWA et al., in Journal of Experimental Medicine, Bd. 182, S. 1461–1468 (1995) beschrieben, reagieren diese Zellen auf Faktoren wie z. B. 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, Prostaglandin E₂, NNR-Hormon, Interleukin 1, Interleukin 6 und Interleukin 11 unter Bildung von Osteoklasten-ähnlichen Zellen (die sich im folgenden als „OCL" abkürzen lassen). Die gebildeten OCL besitzen die Charakteristika von Osteoklasten in vivo. Daher spiegelt das Co-Kultivierungssystem in vitro die Vorgänge bei der Osteoklastenbildung in vivo gut wieder. Mit diesem System lassen sich Experimente zur Osteoklastenbildung und hinsichtlich osteoklastogener Hemmstoffe durchführen.
Die osteoklastogene Hemmaktivität des erfindungsgemäßen IL-18 wurde mit dem obigen Co-Kultivierungssystem untersucht. Die in diesem Experiment verwendeten Osteoblasten wurden in herkömmlicher Weise durch Behandlung der Calvaria einer neugeborenen Maus mit 0,1 (w/v) von der Firma Worthington Biochemical Co., Freefold, Australia, kommerziell vertriebener Collagenase und 0,2% (w/v) von der Firma Godo Shusei Co., Ltd., Tokio, Japan, kommerziell vertriebener Disease präpariert. Die Knochenmarkszellen wurden aus einer erwachsenen Maus in herkömmlicher Weise präpariert. Als Negativkontrolle wurden jeweils 2 × 10⁴ Zellen einer primären Osteoblasten-Zellkultur und 5 × 10⁵ Knochenmarkszellen pro Well einer 48-Well-Mikroplatte mit 0,4 ml/Well α-MEM-Medium, supplementiert mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (im folgenden im gesamten Experiment 4-2 mit „Medium" bezeichnet), 7 Tage in einem 5% CO₂ (v/v)-Inkubator bei 37°C co-kultiviert. Als Positivkontrolle wurden die oben angegebenen beiden Zellarten in ähnlicher Weise wie bei der Negativkontrolle co-kultiviert, außer daß sie in anderen Wells mit 10^–8 M 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, kommerziell vertrieben von Wako Pure Chemicals, Tokio, Japan, und 10^–7 M Prostaglandin E₂ kommerziell vertrieben von Sigma Chemical Company, Missouri, USA, kultiviert wurden. Die beiden obengenannten Zellarten wurden in ähnlicher Weise wie die Positivkontrolle co-kultiviert, außer daß sie in anderen Wells mit 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, kommerziell vertrieben von Wako Pure Chemicals, Tokio, Japan, und Prostaglandin E₂ kommerziell vertrieben von Sigma Chemical Company, Missouri, USA, wobei dieselben Konzentrationen wie bei der Positivkontrolle verwendet wurden, sowie einer mit dem Verfahren in Experiment 6 hergestellten IL-18-Präparation mit einer Konzentration von 0,01–10 ng/ml kultiviert wurden. Bei jedem Co-Kultivierungssystem wurden die Medien in jedem Well jeweils mit frischen Präparationen derselben, in den Co-Kultivierungssystem verwendeten Medien am 3. Tag nach Start jeder Kultur ersetzt. Gemäß dem Verfahren von Nobuyuki UDAGAWR in Journal of Experimental Medicine, Bd. 182, S. 1461–1468 (1995) wurden die Zellen am 6. Tag nach dem Start jeder Kultur fixiert und auf Grundlage der TRAP-Aktivität gefärbt, woraufhin die gefärbten Zellen (im folgenden „TRAP-positive Zellen" genannt) pro Well gezählt wurden. Während des gesamten Experiments 4-2 wurden jeweils vier identische Wells unter denselben Bedingungen für jedes Co-Kultivierungssystem vorgesehen, wobei jeweils der Mittelwert für die TRAP-positiven Zellen pro Well in jedem System berechnet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt:
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde in der Negativkontrolle im wesentlichen keine Bildung TRAP-positiver Zellen beobachtet, doch wurde in der positiven Kontrolle eine deutliche Bildung beobachtet. In den Co-Kultivierungssystemen, d. h. der zusätzlich mit IL-18 supplementierten Positivkontrolle, wurde die Bildung TRAP-positiver Zellen in Abhängigkeit von der IL-18-Konzentration gehemmt, wobei festgestellt wurde, daß die Maximalhemmung, d. h. ein dem der Negativkontrolle entsprechendes Niveau, bei einer IL-18-Konzentration von acht ng/ml oder höher vorlag. Diese Daten deuten stark darauf hin, daß IL-18 eine konkrete Aktivität der Hemmung der OCL-Bildung in vitro aufweist und ebenso die Osteoklastenbildung hemmt.
Experiment 7-2(b)
Wie im vorhergehenden beschrieben, konnte bestätigt werden, daß es Faktoren gibt, die die Bildung Osteoklasten-ähnlicher Zellen in den im Experiment 7-2 verwendeten Co-Kultivierungssystemen induzieren. Daher wurde in diesem Experiment 7-2(b) untersucht, ob die in Experiment 7-2(a) beobachtete Hemmaktivität von IL-18 gegenüber der Osteoklastenbildung für einige Faktoren spezifisch war oder nicht; die Osteoklasten-ähnlichen Zellen wurden mit demselben Verfahren wie dem in der Negativkontrolle in Experiment 7-2(a) verwendeten kultiviert, außer daß ein mit 10^–8 M 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ bzw. 10^–7 M Prostaglandin E₂, 200 ng/ml Parathormon, 100 ng/ml Interleukin 1 oder 20 ng/ml Interleukin 11 supplementiertes Medium verwendet wurde. Diese Kultivierungssysteme dienten als Positivkontrollen. Parallel dazu wurden Zellen in anderen Wells mit demselben, bei den Positivkontrollen verwendeten Verfahren kultiviert, außer daß ein Medium verwendet wurde, das neben einem der obigen Faktoren in derselben Konzentration 10 ng/ml einer mit dem Verfahren in Experiment 6 erhaltenen IL-18-Präparation enthielt. Nach Beendigung der Kultivierungen wurden die TRAP-positiven Zellen in jedem Well gezählt und die Zahlenwerte ähnlich wie in Experiment 7-(a) miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 auf geführt:
Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde in allen Positivkontrollen eine deutliche Bildung TRAP-positiver Zellen beobachtet, doch wurde diese Bildung in Gegenwart von IL-18 fast vollständig gehemmt. Dies deutet stark darauf hin, daß IL-18 eine breite und allgemeine Aktivität der Inhibierung der Osteoklastenbildung unabhängig von mit der Osteoklastenbildung in Zusammenhang stehenden Faktoren aufweist.
Experiment 7-2(c)
Es wurde untersucht, ob die in den Experimenten 7-2(a) und 7-2(b) bestätigte osteoklastogene Hemmung durch IL-18 durch die Wirkung des von IL-18 induzierten GM-CSF verursacht wurde. Für die Positiv- und Negativkontrollen wurden dieselben, wie in Experiment 7-2(a) eingesetzten Co-Kultivierungssystemene verwendet. Unter Verwendung weiterer Wells wurde die Co-Kultivierung von Osteoblasten und Knochenmarkszellen in ähnlicher Weise wie das für die Positivkontrollen verwendete Verfahren durchgeführt, außer daß ein mit 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ und Prostaglandin E₂ in denselben, wie in der Positivkontrolle verwendeten Konzentrationen, sowie mit (i) 10 μg/ml eines polyklonalen Anti-Maus-GM-CSF-Antikörpers, kommerziell vertrieben von R&D Systems, Minnesota, USA, (ii) 10 ng/ml einer mit dem Verfahren in Experiment 6 erhaltenen IL-18-Präparation, (iii) (ii) plus 10 μg/ml eines polyklonalen Anti-Maus-Antikörpers, (iv) 0,1 ng/ml eines Maus-GM-CSF, kommerziell vertrieben von R&D Systems, Minnesota, USA, oder (v) (iv) plus 10 μg/ml eines polyklonalen Anti-Maus-GM-CSF-Antikörpers supplementiertes Medium verwendet wurde. Nach Abschluß der Kultivierung wurden TRAP-positive Zellen in jedem Well gezählt und die Zahlenwerte in ähnlicher Weise wie in Experiment 7-2(a) miteinander verglichen. Die Daten sind in Tabelle 4 dargestellt, wobei die Symbole „i" bis „v" mit den in den Co-Kultivierungssystemen mit Ausnahme der Kontrollsysteme verwendeten Symbole übereinstimmen.
Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde die Bildung TRAP-positiver Zellen fast vollständing durch IL-18 gehemmt, vgl. Co-Kultivierungssystem (ii), doch wurde die Hemmung fast vollständig durch Zugabe des polyklonalen Anti-Maus-Antikörpers gehemmt, vgl. Co-Kultivierungssystem (iii). Maus-GM-CSF zeigte eine ähnliche Aktivität der Hemmung der Bildung TRAP-positiver Zellen wie IL-18, vgl. Co-Kultivierungssystem (iv), wobei die Hemmung fast vollständig durch Zugabe des polyklonalen Anti-Maus-GM-CSF-Antikörpers gehemmt wurde, vgl. Co-Kultivierungssystem (v). Die alleinige Verwendung des polyklonalen Anti-Maus-GM-CSF-Antikörpers hatte keinen Einfluß auf die Bildung TRAP-positiver Zellen, vgl. Co-Kultivierungssystem (i). Diese Daten weisen stark darauf hin, daß die osteoklastogene Hemmung durch IL-18 auf die Wirkung des IL-18-induzierten GM-CSF zurückzuführen war.
Experiment 8
Test zur akuten Toxizität
Acht-Wochen-alte Mäuse wurden in herkömmlicher Weise mit einer der mit den Verfahren in Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen perkutan, oral oder intraperetoneal injiziert. Die Ergebnisse zeigten, daß diese IL-18-Präparationen unabhängig vom Verabreichungsweg einen LD₅₀-Wert von etwa ein mg/kg oder höher in Mäusen aufwiesen. Die Daten weisen darauf hin, daß IL-18 in Pharmazeutika für Warmblüter im allgemeinen, einschließlich Menschen, eingebaut werden kann, ohne daß dadurch ernste Nebenwirkungen verursacht werden.
Wie in Nikkei Biotechnology Annual Report 1996, S. 498–499 (1995), veröffentlicht von Nikkei BP Publisher, Tokio, Japan (1995), beschrieben, wurde der IL-18-induzierte GM-CSF in Japan bisher noch nicht klinisch eingesetzt, doch wurde er in den USA und in Europa klinisch angewendet. Die Fakten sollten zeigen, daß IL-18 im wesentlichen keine ernsten Nebenwirkungen aufweist. Diese Fakten deuten darauf hin, daß der erfindungsgemäße osteoklastogene Hemmstoff nacheinander an Warmblüter, einschließlich Menschen, verabreicht werden kann, um so die Osteoklastenbildung zu induzieren und eine zufriedenstellende therapeutische und/oder prophylaktische Wirkung auf mit Osteoklasten in Zusammenhang stehenden Erkrankungen auszuüben, ohne daß ernste Nebenwirkungen verursacht werden.
Mit den nachfolgenden Beispielen wird der vorliegende erfindungsgemäße osteoklastogene Hemmstoff beschrieben:
Beispiel 1
Flüssigkeit
Eine der mit den Verfahren in den Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen wurde in physiologischer Kochsalzlösung mit einem % (w/v) humanem Serumalbumin als Stabilisator gelöst, so daß eine Konzentration von zwei mg/ml der IL-18-Präparation erhalten wurde. Die erhaltenen Lösungen wurden in herkömmlicher Weise zur Sterilisation membranfiltriert, so daß Flüssigkeiten erhalten wurden.
Die Flüssigkeiten besitzen eine zufriedenstellende Stabilität und können willkürlich als Bestandteile von Zellkulturen und Mitteln in Form einer Injektion, einer ophthalmischen Lösung oder ein Collunarium zur Regulierung der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehenden Erkrankungen verwendet und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoclastoma, Osteoporose, usw. gerichtet werden.
Beispiel 2
Mittel in Trockenform
Fünfzig Milligramm einer der mit den Verfahren in den Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen wurden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem % (w/v) gereinigter Gelatine als Stabilisator gelöst. Die so erhaltenen Lösungen wurden in herkömmlicher Weise zur Sterilisation membranfiltriert, in Röhrchen von jeweils einem Milliliter verteilt, lyophilisiert und mit Deckeln verschlossen.
Die Produkte besitzen eine zufriedenstellende Stabilität und lassen sich willkürlich als Bestandteile für die Zellkultur und als Mittel in Form einer Trockeninjektion zur Regulation der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Krankheiten einsetzen und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoklastom, Osteoporose, usw. richten.
Beispiel 3
Mittel in Trockenform
Fünfzig Milligramm einer der mit den Verfahren in den Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen wurden in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem % (w/v) Trehalose als Stabilisator gelöst. Die Lösungen wurden in herkömmlicher Weise zur Sterilisation membranfiltriert, in Röhrchen von jeweils einem Milliliter verteilt, lyophilisiert und mit Deckeln verschlossen.
Die Produkte besitzen eine zufriedenstellende Stabilität und lassen sich willkürlich als Bestandteile für die Zellkultur und als Mittel in Form einer Trockeninjektion zur Regulation der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Krankheiten einsetzen und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoklastom, Osteoporose, usw. richten.
Beispiel 4
Salbe
„HIVIS WAKO GEL^® 104", ein von der Firma Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, kommerziell vertriebenes Carboxyvinylpolymer, sowie eine hochreine Trehalose wurden in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst, so daß Konzentrationen von 1,4% (w/w) bzw. 2,0% (w/w) erhalten wurden, und die Lösung wurde anschließend homogen mit einer der mit den Verfahren in den Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen homogen vermischt und der pH-Wert auf pH 7,2 eingestellt, so daß eine Paste mit etwa einem mg einer IL-18-Präparation pro g Produkt erhalten wurde.
Jedes der so erhaltenen Produkte besitzt eine zufriedenstellende Streichfähigkeit und Stabilität und läßt sich willkürlich als Mittel in Form einer Salbe zur Regulation der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Erkrankungen einsetzen und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoklastom, Osteoporose usw. richten.
Beispiel 5
Tablette
„FINETOSE^®", ein von der Firma Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japan, kommerziell vertriebenes wasserfreies kristallines α-Maltose-Pulver, wurde mit einer der mit den Verfahren in den Experimenten 1 bis 6 erhaltenen IL-18-Präparationen sowie „LUMIN" bzw. 1,1'-1''-Trihepthyl-11-chinolyl(4)-4,4'-penthamethinchynocyanin-11''-diiodid homogen gemischt. Die Gemische wurden dann in herkömmlicher Weise tablettiert, so daß Tabletten erhalten wurden, die jeweils ein Gewicht von etwa 200 mg aufwiesen und etwa zwei Milligramm einer der IL-18-Präparationen sowie etwa zwei Milligram LUMIN pro Tablette enthielten.
Die Produkte lassen sich in zufriedenstellender Weise schlucken, besitzen eine zufriedenstellende Stabilität und zellaktivierende Aktivität und lassen sich willkürlich als Mittel in Form einer Tablette zur Regulation der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Erkrankungen einsetzen und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoklastom, Osteoporose, usw. richten.
Wie oben beschrieben, hemmt der erfindungsgemäße osteoklastogene Hemmstoff in wirksamer Weise die Osteoklastenbildung. Daher läßt sich das Mittel willkürlich als Bestandteil für Zellkultur und von Mitteln zur Regulation der Knochenresorption und gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehende Krankheiten einsetzen und auf die Behandlung und/oder Vorbeugung von Hypercalcämie, Osteoklastom, Osteoporose, usw. richten.
Somit handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung mit diesen nützlichen Aktivitäten und Funktionen um eine signifikante Erfindung, die einen großen Beitrag auf diesem Gebiet leisten sollte.
Obwohl das, was zur Zeit als bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gilt, beschrieben wurde, versteht es sich, daß sich daran verschiedene Modifikationen durchführen lassen, und daher sollen mit den beigefügten Ansprüchen alle solchen Modifikationen, wie im Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten sind, abgedeckt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Interleukin-18 oder seines funktionalen Äquivalents zur Herstellung eines bei der Behandlung von und/oder Vorbeugung gegen mit Osteoklasten in Zusammenhang stehenden Erkrankungen wirksamen Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-18 die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 als Aminosäure-Teilsequenzen umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-18 die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 als Aminosäure-Teilsequenzen umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-18 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-18 menschlichen Ursprungs ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Interleukin-18 die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Arzneimittel ein Protein, einen Puffer oder ein Saccharid als Stabilisator enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Arzneimittel in Form einer Flüssigkeit, Paste oder eines Feststoffs vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Arzneimittel 0,000002–100 Gew.-% des Interleukin-18 enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Arzneimittel als osteoklastogener Hemmstoff wirkt.