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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen von Interleukin-18.
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Das
Auftreten von Hauterkrankungen aufgrund von Umwelteinflüssen scheint
seit kurzem drastisch anzusteigen. Abgesehen von dem Einfluß einer
ständig
ansteigenden Anzahl und Vielfalt von Chemikalien aus verschiedenen
Quellen, einschließlich
Abgasen aus dem Verbrennen von fossilen Brennstoffen oder aus der
Herstellung von Plastiksubstanzen, spielt auch externe Strahlung
eine zunehmende Rolle bei der Entstehung von Hauterkrankungen. In
diesem Kontext wird der UV-Strahlung von sowohl natürlichem
Ursprung (d.h. Sonnenstrahlung) ebenso wie aus künstlichen Quellen eine führende Rolle
bei der Ätiologie
von Hautkrankheiten und -erkrankungen zugewiesen. Es gibt eine dramatische
Zunahme des Auftretens von sowohl Melanom- als auch Nicht-Melanom-Hautkrebs
in Europa, den Vereinigten Staaten und Australien. Der erhöhte Einfluß von UVB-Strahlung
aufgrund der Abnahme der Ozonschicht kann zu diesem Phänomen in
gewissem Ausmaße
beitragen, der Hauptgrund für
die Zunahme an UV-induziertem Hautkrebs ist sicherlich das Verhalten
der Bevölkerung.
Wegen einer konstanten Veränderung
hauptsächlich
in den Freizeitaktivitäten
hat die kumulative Lebenszeit-UV-Dosis der Bevölkerung im Durchschnitt über die
letzten Jahrzehnte zugenommen (Armstrong and Kricker, 2001, J Photochem
Photobiol B.; 63(1–3):8–18).
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In
der Tat ist die ultraviolette Sonnenstrahlung einer der wichtigsten
Umwelteinflüsse
im Hinblick auf die Haut von terrestrischen Lebensformen. Dies ist
insbesondere zutreffend für
den mittleren Bereich der UV-Strahlung (290–320 nm), da es dieser Bereich
ist, dem eine ursächliche
Rolle nicht nur für Sonnenbrand,
sondern auch für
die massive Zunahme des Auftretens an Hautkrebs, oben beschrieben, zugewiesen
wird. Von einem mechanistischen Standpunkt aus betrachtet wird davon
ausgegangen, daß der
schädliche
Effekt der UV-Strahlung auf Hautzellen durch die massive Schädigung verursacht wird,
die sie in der DNA von Hautzellen induziert, die einer solchen Strahlung
ausgesetzt worden sind. DNA absorbiert UV-Licht in der UVB-Region (290–320 nm)
und der UVC-Region (200–290
nm). Die Absorption von UV-Strahlung wird oft von Läsionen in
den betroffenen DNA-Molekülen
begleitet. UV-Strahlung im Bereich 290–320 nm induziert hauptsächlich zwei
Arten von Photoläsionen,
nämlich Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere
(CPD) und <6–4> Photoprodukte. Der
größte Teil
dieser Photoprodukte wird in normalen eukaryotischen Zellen durch
einen Mechanismus entfernt, der gewöhnlich als „Nukleotid-Excisions-Reparatur" (NER) bezeichnet
wird, der von äußerster
Wichtigkeit ist, da die DNA-Läsionen, die
zurückbleiben,
zu malignen Aberrationen der betroffenen Zellen führen können. (de
Laat et al., 1999, Genes Dev. 13:768–785). Die Wichtigkeit des NER-Mechanismus
wird durch eine genetische Krankheit beeindruckend demonstriert,
die durch die Abwesenheit eines funktionellen NER-Systems gekennzeichnet
ist, Xeroderma pigmentosum (XP). Entsprechend weisen Patienten,
die an Xeroderma pigmentosum leiden, eine dramatisch erhöhte Rate von
Hautkrebs auf (Kraemer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
94:1–14,
1997). Das eukaryotische NER-System hat sein prokaryotisches und
virales Gegenstück
in spezifischen Enzymen, die dazu vorgesehen sind, UV-induzierte DNA-Schädigung zu entfernen.
Zum Beispiel kann eine Beschleunigung der DNA-Reparatur ebenfalls durch Anwendung
von exogenen DNA-Reparaturenzymen erzielt werden, die dieselben
biologischen UV-Effekte entfernen. Es ist gezeigt worden, daß das bakterielle
DNA-Reparaturenzym T4N5-Endonuklease erfolgreich verschiedene UV-vermittelte
Phänomene
einschließlich
Immunsuppression, Freisetzung des immunsuppresiven Cytokins Interleukin-10
und des Entzündungsmediators
Tumornekrosefaktor α (TNF α) umkehrt, wenn
es in Liposomen verkapselt ist. (Wolf et al, J. Invest. Dermatol.,
114:149–156,
2000; Kibitel et al., Photochem. Photobiol. 67:541–546, 1998). Ähnliche Beobachtungen
sind mit einem anderen Reparaturenzym, ebenso von bakteriellem Ursprung,
Photolyase, gemacht worden, das Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere spezifisch
bei Belichtung mit photoreaktivierendem Licht umkehrt, einem Reparaturprozeß, der auch
als „Photoreaktivierung" bezeichnet wird
(Stege et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1790–1795).
Die Einführung
dieser Reparaturenzyme in Zellen wird durch ihren Einbau in Liposomen und
anschließende
Auftragung dieser Liposomen auf UV-bestrahlte Zellen in Kultur oder
auf UV-bestrahlte Haut durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, daß die
lokale Auftragung dieser Reparaturenzyme signifikant das Auftreten
von Hauttumoren in chronisch UV-bestrahlten Mäusen verringert (Yarosh et
al., 1992, Cancer Res. 52, 4227–4231).
Darüberhinaus reduziert
die topische Auftragung von T4N5-Endonuklease in signifikanter Weise
das Risiko von Patienten mit Xeroderma pigmentosum, Strahlenkeratosen zu
entwickeln (Yarosh et al., 2001, Lancet, 357:926–929). Jedoch haben diese Verfahren
nicht ihren Weg in die normale Behandlung von Sonnenbrand und Hautschädigung gefunden.
Herkömmlicher
Schutz gegen Sonne unter Verwendung von topisch aufgetragenen UV-Filtern
ist immer noch die effizienteste Art und Weise zum Verringern von
UV-induzierter Schädigung
der Haut. Herkömmliche UV-Filter
haben jedoch oft unerwünschte
Nebenwirkungen dahingehend, daß sie
entweder allergische Reaktionen verursachen können, wenn sie UV-absorbierende
aromatische Ringsysteme sind, oder sie bieten keinen wirksamen Schutz
durch einfaches mechanisches Blockieren der UV-Strahlung (z.B. Metalloxidpigmente)
und verursachen darüber
hinaus eine Verschmutzung der getragenen Kleidungsstücke.
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UV-induzierte
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere können
das Tumorsuppressorgen p53 aktivieren, das eine wesentliche Rolle
bei der Bildung von apoptotischen Keratinocyten spielt, die in vivo
als Sonnenbrandzellen in der Epidermis auftreten (Murphy et al., 2001,
Exp. Dermatol., 10:155–160).
Mäuse,
die hinsichtlich eines funktionellen p53 defizient sind, entwickelten
signifikant weniger Sonnenbrandzellen beim Aussetzen gegenüber UV-Bestrahlung
als UV-bestrahlte
Wildtyp-Mäuse
(Ziegler et al., 1994, Nature, 372:773–776). Bestrahlung mit UV führt zu einem p53-abhängigen Zellzyklusarrest
während
der G1-Phase, um eine DNA-Reparatur
vor der DNA-Synthese zu ermöglichen.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angenommen, daß Sonnenbrandzellen
Keratinocyten sind, die es nicht vermochten, in effizienter Weise
beschädigte
DNA zu reparieren und in Folge dessen Apoptose durchlaufen und damit
dem Risiko entgehen, bösartig
zu werden. Entsprechend wurde die Bildung von Sonnenbrandzellen
als ein p53-Kontroll-Abfangphänomen
(„p53 control
scavenging phenomenon")
betrachtet, das Individuen davor schützt, UV-induzierten Hautkrebs
zu entwickeln (Brash et al., 1996, J. Invest. Dermatol. Symposium
Proceedings, 1:136–142).
Im Hinblick auf die Tumor-unterdrückenden Eigenschaften von p53
sollten Keratinocyten mit einer Mutation davon gegenüber den
Tumor-fördernden
Effekten von UV empfindlich sein, während andere Zellen, die Wildtyp-p53
tragen, bei Belastung mit einer bestimmten Menge an DNA-Schädigung durch
Apoptose eliminiert werden sollten (Brash et al., ibid.). Da UV
bevorzugt p53 mutiert (Brash et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88:10124–10128),
kann es einen selektiven Druck für
die mutierten schädigungsresistenten Keratinocyten
ausüben,
wodurch es diesen Zellen ermöglicht,
klonal zu expandieren und eine Strahlenkeratose zu bilden, der Vorstufe
von Hautkrebs (Ziegler et al., ibid). Deshalb ist vorgeschlagen
worden, daß die
Heftigkeit einer DNA-Schädigung
ein Hauptmediator der Apoptose ist und deshalb mit der Anzahl an Sonnenbrandzellen
korreliert (Ziegler et al., ibid). Eine Zunahme an DNA-Reparatur
sollte ebenfalls zu einer Verringerung der apoptotischen Antwort
von Keratinocyten gegenüber
einem Aussetzen gegenüber
UV führen.
Ein Beweis für
diese Annahme wurde geliefert, als Epithelzellen (HeLa) einer verstärkten DNA-Reparatur
nach einer UV-Bestrahlung unterzogen wurden. Eine Beschleunigung
der DNA-Reparatur wurde mittels Photoreaktivierung erzielt über Zugabe
des DNA-Reparaturenzyms Photolyase, verkapselt in Liposomen. Eine
Photoreaktivierung führte zu
einer signifikant jedoch nicht vollständig verringerten Apoptose rate
bei Aussetzen gegenüber
UV (Kulms et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:7974–7979). Ähnliche
Ergebnisse waren in vivo erhalten worden, in denen gezeigt wurde,
daß eine topische
Auftragung des Reparaturenzyms T4N5 über Liposomenabgabe die Anzahl
an Sonnenbrandzellen sowohl in Mäusen
als auch Menschen verringerte (Wolf et al., 2000, IBID.; Stege et
al., 2000, IBID). In der Zusammenschau zeigen diese und die oben
erwähnten
Daten deutlich, daß eine
Schädigungen
der Kern-DNA eine wichtige Rolle beim Vermitteln der biologischen
Effekte von UV spielt.
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Eine
jüngere
Studie (Schwarz et al., 2002, Nature Cell Biology, 4:26–31) hat
gezeigt, daß Interleukin-12
eine UV-Strahlung-induzierte Apoptose unterdrückt durch Induzieren einer
DNA-Reparatur durch die zelleigenen Reparatursysteme, insbesondere
das Nukleotid-Excisions-Reparatursystem (NER).
IL-12 ist ein immunstimulatorisches Cytokin und hat eine große Vielzahl
von Effekten. Interleukin-12 wird von peripheren Lymphocyten nach
der Induktion sezerniert. Es wird hauptsächlich von B-Zellen und zu
einem geringeren Ausmaß von
T-Zellen erzeugt. Hinsichtlich seiner Struktur ist Interleukin-12 ein
heterodimeres 70kDa-Protein
mit einer Untereinheit von 35 kDa und einer Untereinheit von 40
kDa (IL-12A = 35 kDa, 197 Aminosäuren;
IL-12B = 40 kDa, 306 Aminosäuren).
Das Heterodimer wird durch Disulfidbindungen gebildet, deren Bildung
für die
biologische Aktivität
essentiell ist. Beide Untereinheiten und ihre Wechselwirkung scheinen
für ein
korrektes Funktionieren der Moleküle essentiell zu sein, da ein 40
kDa-Untereinheit-Homodimer antagonistische Funktionen aufweist (German
et al., 1995, Immunol. Today; 16(10):500–501).
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Hinsichtlich
seiner Aktivitäten
ist IL-12 der klassische Typ eines immunstimulatorischen Cytokins,
wie bereits oben erwähnt,
und scheint an einer großen
Vielzahl von Reaktionen nach einer primären Immunantwort beteiligt
zu sein. IL-12 stimuliert die Proliferation von humanen Lymphoblasten
nach einer Zellaktivierung durch Phytohemagglutinin. Es aktiviert
NK-Zellen, die für CD56 positiv
sind, und arbeitet darüberhinaus
synergistisch mit anti-CD-3-Antikörpern mit
allogener Stimulierung in gemischten Lymphozytenkulturen beim Induzieren
einer T-Zell-Proliferation zusammen. Darüberhinaus ist gezeigt worden,
daß IL-12
die Synthese von IFN-γ und Interleukin-2
in peripheren Lymphozyten von T-Helferzellen vom Typ 1 (Th 1) induziert.
Die Effekte von IL-12 auf natürliche
Killerzellen werden durch TNF-α vermittelt,
basierend auf dem Ergebnis, daß ein
Antikörper,
der gegen TNF-α gerichtet
ist, die Effekte von IL-12 auf natürliche Killerzellen unterdrücken kann. IL-12
und TNF-α sind
Co-Stimulatoren
für die IFN-γ-Produktion,
wobei IL-12 die IFN-γ-Antwort
maximiert. Darü berhinaus
fungiert IL-12 zusammen mit IL-2 bei der Förderung der Proliferation von
einkernigen Zellen im peripheren Blut und bei der Förderung der
Erzeugung von Lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK-Zellen). Picomolare
Konzentrationen von IL-12 sind ebenso effektiv wie nanomolare Konzentrationen
von IL-2 beim Steigern der cytolytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen, die in
vivo durch IL-2 expandiert worden sind. Darüberhinaus ist gemutmaßt worden,
daß IL-12
an der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beteiligt ist, wie etwa
Multipler Sklerose, Kontaktsensitivierung und Ekzem (Riemann et al.,
1996, J. Immunol. 156(5):1799–1803;
Leonard et al., 1997, Crit Rev. Immunol. 17(5–6):545–553). Da IL-12 es ermöglicht,
die Dosierungen von IL-2 zu verringern, die für die Erzeugung von LAK-Zellen
erforderlich sind, ist ihm eine potentielle Rolle für die adoptive
Immuntherapie zugewiesen worden, wobei IL-2 normalerweise verwendet
wird, da es ernsthafte Nebenwirkungen gibt, die mit Interleukin-2
verbunden sind, und deshalb ruht viel Hoffnung auf der gemeinsamen
Verabreichung von IL-2 mit IL-12. Es ist ebenso gezeigt worden,
daß IL-12
das Wachstum einer Vielzahl von experimentellen Tumoren in vivo
inhibiert und einen antiangiogenen Effekt hat, von dem davon ausgegangen
wird, daß er
durch IFN-γ vermittelt
wird.
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Wie
aus dem obigen gesehen werden kann, machte die große Vielzahl
von Rollen, die IL-12 haben kann, die Verwendung von IL-12 in medizinischen
Anwendungen zu einer außerordentlichen Aufgabe,
da nicht klar vorhergesagt werden kann, was das Ergebnis einer solchen
Anwendung sein wird angesichts der multifaktoriellen Natur der beteiligten
Wechselwirkungen. Sogar noch zu einem geringeren Ausmaß kann die
Erkenntnis und das Wissen, das von Experimenten mit IL-12 erhalten
worden ist, in einfacher Weise auf andere Cytokine übertragen
werden. Darüberhinaus
ist die Verwendung von IL-12 in außerordentlicher Weise durch
seine hohen Kosten und darüberhinaus
durch seine relativ große Größe beschränkt, die
zum Beispiel topische Anwendungen davon ausschließt.
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Die
Verhinderung eines Ausbruchs von UV-induzierter Schädigung der
Haut nach einem Aussetzen gegenüber
Sonnenlicht und die Verhinderung einer vorzeitigen Alterung der
Haut bleibt nach wie vor zu lösen.
Herkömmliche
Mittel, wie etwa extern aufgetragene Sonnenfilter verhindern die
Schädigung
der Haut, sind aber nutzlos, wenn eine Schädigung bereits aufgetreten
ist. Dasselbe trifft für
mechanische Blocker zu, in der Form von Cremes, Salben, etc. oder
textilen Abdeckungen, die wiederum keinen Nutzen haben, wenn die
Schädigung
erst einmal aufgetreten ist. Alternative Verfahren, wie etwa die
zuvor erwähnte
Auftragung von IL-12, die sich als eine viel versprechende Route
herausstellen könnte, scheinen
jedoch nicht praktikabel zu sein aufgrund der hohen Kosten von IL-12
und seiner großen
molekularen Größe, die
eine effiziente Aufnahme in die Haut verhindert.
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Entsprechend
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung gewesen, ein alternatives
Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln von UV-induzierter Schädigung der
Haut bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, ein Medikament zum Verhindern und/oder Behandeln von
UV-induzierter Schädigung
der Haut bereitzustellen, das billiger und praktikabler als andere
auf dem Gebiet bekannte Medikament ist.
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Diese
Aufgaben werden gelöst
durch die Verwendung von Interleukin-18 zur Herstellung eines Medikaments
zur Verhinderung, Verringerung und Behandlung von Hauterkrankungen,
die mit einer Schädigung
assoziiert sind, welche durch UV-Strahlung induziert wird, wobei
die Erkrankung ausgewählt ist
aus der Gruppe, umfassend Sonnenbrand, Entzündung und verfrühte Hautalterung.
Bevorzugt ist die Erkrankung eine Erkrankung, die durch die Induktion
des Nukleotid-Excisions-Reparatur(NER)-wegs gemildert und/oder verhindert
werden kann.
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Es
wird bevorzugt, daß die
Erkrankung mit Apoptose assoziiert ist.
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In
einer Ausführungsform
deckt die UV-Strahlung wenigstens einen Wellenlängenbereich von 220 bis 350
nm, bevorzugt von 250 nm bis 330 nm, bevorzugter von 290 nm bis
320 nm ab.
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In
einer Ausführungsform
stammt die UV-Strahlung aus natürlichem
und/oder künstlichem Sonnenlicht.
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Bevorzugt
umfaßt
die Verwendung eine Verabreichung des Medikaments an einen dafür bedürftigen
Patienten, wobei bevorzugt die Verabreichung systemisch und/oder
topisch ist.
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In
einer Ausführungsform
erfolgt die Verabreichung mittels Verabreichung eines pharmazeutisch
akzeptablen Trägers
und/oder mittels Injektion, bevorzugt intrakutaner Injektion eines
pharmazeutisch akzeptablen Trägers,
wobei, bevorzugt, der Träger
ausgewählt
ist aus der Gruppe, umfassend Liposomen, Salben, Öle, Cremes,
Emulsionen und Dispersionen.
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In
einer Ausführungsform
erfolgt die topische Verabreichung in einem Dosisbereich von 1 ng/ml
bis 1000 ng/ml.
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In
einer Ausführungsform
erfolgt die systemische Verabreichung in einem Dosisbereich von
0,1 μg/kg
Körpergewicht
bis 100 μg/kg
Körpergewicht, wobei
bevorzugt die Verabreichung ein- bis achtmal täglich erfolgt.
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In
einer Ausführungsform
erfolgt die Verabreichung bevor, während und nachdem ein Patient UV-Strahlung
ausgesetzt wird.
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Bevorzugt
ist der bedürftige
Patient ein Säugetier,
bevorzugt ein Mensch.
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Bei
der vorliegenden Erfindung konnten die Erfinder zeigen, daß Interleukin-18
in der Lage ist, UV-induzierte Schädigung der Haut, die mit UV-Licht bestrahlt
worden ist, zu verhindern und/oder zu behandeln. Als eine Konsequenz
scheint es, als ob Interleukin-18 in der Lage ist, die Apoptose,
die normalerweise mit UV-Strahlung assoziiert ist, zu verringern.
Darüberhinaus
ist Interleukin-18 ebenso in der Lage, ein langfristiges Überleben
von Keratinocyten sicher zu stellen, die durch UV-Licht bestrahlt
worden sind. Darüberhinaus
zeigte die Haut von Mäusen,
die mit UV bestrahlt worden sind, weniger apoptotische Keratinocyten
(Sonnenbrandzellen (SCs)), bei Injektion mit IL-18, als von Tieren
ohne eine solche Injektion. Ohne durch irgendeine Theorie festgelegt
sein zu wollen, wird gegenwärtig
davon ausgegangen, daß die
Verringerung der UV-induzierten Apoptose einer gleichzeitigen Induktion
des Reparatursystems von eukaryotischen Zellen, dem NER-System,
zugeteilt sein kann. Die Unterdrückung
der UV-induzierten Apoptose wird einer ausgeprägten Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung zugeordnet,
was mit Southwestem-Dot-Blots gezeigt werden konnte (siehe unten).
Während
die Menge an UV-induzierter DNA-Schädigung in Gruppen von Mäusen, die
mit IL-18 behandelt oder nicht-behandelt worden waren, unmittelbar
nach der UV-Bestrahlung dieselbe war, war die UV-induzierte DNA-Schädigung signifikant reduziert
in der Gruppe von Mäusen,
die mit Interleukin-18 behandelt worden waren. Ähnliche Ergebnisse konnten
ebenso in vivo mittels immun-histochemischer Experimente gefunden
werden. UV-induzierte DNA-Schädigung
war dieselbe in IL-18-behandelten oder nicht-behandelten Mäusen unmittelbar nach einer
UV-Bestrahlung, während
die DNA-Schädigung 18
Stunden nach der Bestrahlung signifikant reduziert war. Die Tatsache,
daß ein
solcher Effekt in Wildtyp-Mäusen
erzielt werden konnte, aber nicht in Mäusen, die kein funktionelles NER-System
haben, d.h. Mäuse
mit einem defizienten Xpa-Gen, zeigt die Beteiligung des NER-Reparatursystems.
Dies zeigt darüberhinaus,
daß Interleukin-18
in der Lage ist, UV-induzierte
Apoptose durch Induzieren des NER-Systems und dadurch Verringern
der DNA-Schädigung zu
verhindern, die durch die UV-Bestrahlung verursacht wird. Wegen
einer solchen Verringerung der DNA-Schädigung hat IL-18 einen schützenden
Effekt gegen Hautkrebs und verfrühte
Hautalterung. Dies ist umso überraschender,
da eine solcher Effekt bislang nur für Interleukin-12 beobachtet
worden war, das funktionell überhaupt
nicht mit Interleukin-18 in Verbindung gebracht worden war, oder
nur in Gebieten, die deutlich nicht mit dem NER-System in Beziehung stehen.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff Nukleotid-Excisions-Reparatur-Weg
(NER) austauschbar mit dem Begriff „Nukleotid-Excisions-Reparatursystem" und „Nukleotid-Excisions-Reparaturmechanismus" verwendet und bezieht
sich allgemein auf das System, wie z.B. beschrieben in de Laat et
al., 1999 Genes Develop. 13:768–785.
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Wie
hierin verwendet, soll der Begriff „Erkrankung, die mit Apoptose
assoziiert ist" eine
Erkrankung bezeichnen, die durch Apoptose von Zellen verursacht
und/oder davon begleitet ist und/oder die sich selbst in der Apoptose
von Zellen manifestiert.
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Es
wird nun Bezug genommen auf die Abbildungen, bei denen
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1 die
Unterdrückung
von UV-induzierter Apoptose durch IL-18 zeigt,
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2 zeigt,
daß Interleukin-18
das Überleben
von Keratinocyten nach UV-Bestrahlung ermöglicht,
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3 eine
Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung durch IL-18, in vitro,
zeigt,
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4 eine
Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung durch IL-18, in vivo,
zeigt,
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und 5 die
Abwesenheit der Verringerung von Sonnenbrandzellen durch IL-18 in
Xpa-defizienten
Mäusen
zeigt.
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Die
Erfindung wird nunmehr anhand der folgenden spezifischen Beispiele
beschrieben, die nicht die Erfindung beschränken, sondern sie lediglich
veranschaulichen sollen.
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Beispiel 1
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Die
Zellinie KB (2 × 105/ml) wurde mit 250 J/cm2 UVB
(290 nm–320
nm) bestrahlt. Vier Stunden vor der UV-Bestrahlung wurde humanes
rekombinantes IL-18 (150 ng/ml) zugegeben (UV+IL-18). 16 Stunden
nach der Bestrahlung wurde der apoptotische Zelltod mittels eines
ELISA auf Apoptose gemessen, beruhend auf dem Prinzip der DNA-Fragmentierung.
Für den
Nachweis der DNA-Fragmentierung wurde ein Zelltod-Nachweis-ELISA
(Boehringer Mannheim) verwendet. Die Anreicherung an Mono- und Oligonukleosomen,
die in das Cytoplasma von Zellen freigesetzt wurden, wird mittels
biotinylierten anti-Histon- und Peroxidase-gekoppelten Anti-DNA-Antikörpern nachgewiesen.
Die Apoptoserate ist in der Zunahme der Extinktion, dargestellt
auf der Y-Achse, reflektiert. Die optische Dichte wird auf der Y-Achse
als ein Mittelwert ±SD
von dreifachen Messungen gezeigt. Der Student's t-Test wurde verwendet, um die Signifikanzen
der Unterschiede zu testen. *p < 0.05
(UV+IL-18 gg. UV). Ein Ergebnis dieses Experiments kann in 1 gesehen
werden, die zeigt, daß IL-18
die UV-induzierte Apoptose unterdrückt.
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Beispiel 2
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Humane
Wildtyp-Keratinocyten wurden mit 150 ng/ml IL-18 oder äquivalenten
Mengen eines Verdünnungsmittels
vier Stunden vor der UV-Bestrahlung (250 J/cm2)
behandelt. Nach einer UV-Bestrahlung wurden die Zellen in einem
Medium mit und ohne Interleukin-18 ausplattiert. 24 Stunden später wurde
das Medium durch Keratinocyten-Wachstumsmedium ohne IL-18 ersetzt,
und die Zellen wurden für 21
Tage kultiviert. Nach 21 Tagen wurden die Kolonien mit Kristallviolett
gefärbt,
wovon Ergebnisse in 2 gezeigt werden. Aus 2 wird
deutlich, daß Interleukin-18
das Überleben
von Keratinocyten nach einer UV-Bestrahlung
ermöglicht.
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Beispiel 3
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KB-Zellen
wurden mit UV-Licht 150 J/cm2 (290–320 nm)
in der Anwesenheit (UV+IL-18) oder Abwesenheit (UV) von IL-18 (150
ng/ml) bestrahlt. 10 Minunten, 3,5 bzw. 6,5 Stunden nach der UV-Bestrahlung
wurde die genomische DNA extrahiert, und eine Soutwestern-dot-blot-Analyse wurde
unter Verwendung eines Antikörpers
durchgeführt,
der spezifisch auf UV-induzierte DNA-Schädigung gerichtet war (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere).
Genomische DNA wurde aus 1 × 106 Zellen gemäß dem DNA-Extraktionsprotokoll
von Biozym Diagnostik (Hessisch Oldendorf, BRD) isoliert. 2 μg genomische
DNA wurden auf eine positiv geladene Nylonmembran durch Vakuum-Dot-Blotting übertragen
und durch Backen der Membran für
15 Minuten bei 80°C
fixiert. Ein monoklonaler Antikörper,
gerichtet gegen Thymin-Dimere (Kamiya Biomedical Company, Seattle,
WA), wurde für
eine Southwestern-Analyse verwendet. Der Nachweis wurde mit einem
Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörper durchgeführt. Die
Ergebnisse dieses Experiments werden in 3 gezeigt. 3 zeigt,
daß UV-induzierte
DNA-Schädigung
durch IL-18 verringert werden kann.
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Beispiel 4
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C57BL/6-Mäuse wurden
auf ihrem Rücken rasiert
und dorsal mit 650 J/cm2 UVB bestrahlt.
Drei Stunden vor der UV-Bestrahlung wurden 300 ng IL-18 (b, d) und
gleichen Mengen (100 μl)
wäßriger Salzlösung (a,
c) intrakutan injiziert. Hautbiopsien wurden 10 Minuten (a, b) und
16 Stunden (c, d) nach einer UV-Bestrahlung entnommen, und eine
immunhistochemische Färbeprozedur
wurde unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt, der
spezifisch auf UV-induzierte DNA-Schädigung (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere)
gerichtet ist. Biopsien wurden in 7% gepuffertem Paraformaldehyd
fixiert, entwässert
und in Paraffin eingebettet. Nach Deparaffinisierung mit Xylol und
Ethanol in abnehmenden Konzentrationen wurden die Schnitte in eine
wäßrige Lösung, enthaltend
0,1 M Zitronensäure/0,1
M Natriumcitrat, eingetaucht und anschließend für 15 Minuten Mikrowellen-behandelt,
um antigenische Epitope zu demaskieren. Endogene Peroxidaseaktivität wurde
durch Inkubation mit 0,1% H2O2 und
0,6% Natriumazid in PBS für
20 Minuten blockiert. Nach Spülen
mit PBS wurden unspezifische Bindungsstellen mit 2% BSA für 30 Minuten
bei Zimmertemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht
mit dem primären
Antikörper,
verdünnt
in 1% BSA. Der Anti-Thymidin-Dimer-Antikörper wurde
in einer Verdünnung
von 1:2000 verwendet. Die Färbung
wurde durch eine indirekte Immunperoxidasetechnik unter Verwendung der
folgenden Reagenzien erzielt: PBS, Peroxidase-konjugierte Anti-Maus-Antikörper (unverdünnt, Dako
envision, Dako, Hamburg, Germany), 0,01% H2O2, 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma Corp.,
St. Louis, MO). In negativen Kontrollen wurde der erste Antikörper ausgelassen.
Gefärbte
Schnitte wurden mit herkömmlicher
Lichtmikroskopie bewertet. Die Ergebnisse dieses Experiments werden
in 4 gezeigt. Wie anhand von 4 gesehen
werden kann, kann die UV-induzierte DNA-Schädigung durch IL-18 in vivo
verringert werden.
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Beispiel 5
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C57BL/6
(Wildtyp) und Xpa-defiziente Mäuse
(Xpa KO) wurden auf ihren Rücken
rasiert und dorsal mit 3000 J/cm2 UVB bestrahlt.
3 Stunden vor der UV-Bestrahlung wurde Interleukin-18 (300 ng) intrakutan
injiziert. 16 Stunden nach der UV-Bestrahlung wurden Hautbiopsien
entnommen, und die Anzahl an apoptotischen Keratinocyten (Sonnenbrandzellen,
SCs) wurde pro 6 mm Haut gezählt.
Um die SC-Bildung zu bewerten, wurden die Biopsien von den UV-exponierten
Hautflächen
entnommen, in Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte
(5 μm) wurden
mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt,
die Anzahl an SC-definiert
als apoptotische Zellen innerhalb der Epidermis, die ein geschrumpftes
eosinophiles Cytoplasma und einen kondensierten Kern aufwiesen – wurde
in der gesamten Epidermis der Schnitte pro Probe unter Verwendung
eines 1 × 1
cm Gitter gezählt,
das in ein herkömmliches
Mikroskop eingeführt
war. SC pro 6 Millimeter Länge
Epidermis wurden gezählt.
Wenigstens fünf
Felder von jeder Probe wurden bewertet und die Anzahl an SC (Mittelwert ±SD) berechnet.
Der Student's t-Test
wurde verwendet, um die Signifikanzen der Unterschiede zu testen.
Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 5 gezeigt.
Gemäß 5 kann
in Xpa-defizienten Mäusen
eine UV-induzierte Apoptose (Sonnenbrandzellen) nicht durch IL-18
verringert werden, was eine Rolle von IL-18 als einen direkten oder
indirekten Inducer des NER-Wegs nahelegt.