DE60219495T2

DE60219495T2 - Verwendung von Interleukin-18 zur Behandlung von UV-assoziierten Hautkrankheiten

Info

Publication number: DE60219495T2
Application number: DE60219495T
Authority: DE
Inventors: Thomas Prof. Dr. Schwarz; Agatha Dr. Schwarz
Original assignee: Universitaetsklinikum Muenster
Current assignee: Universitaetsklinikum Muenster
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2022-12-28
Also published as: EP1433484A1; US20060115452A1; AU2003298219A1; DE60219495D1; AU2003298219B8; EP1433484B1; CA2511612A1; ATE359088T1; JP2006512383A; ES2284774T3; NZ541184A; WO2004058294A1; AU2003298219B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen von Interleukin-18.
Das Auftreten von Hauterkrankungen aufgrund von Umwelteinflüssen scheint seit kurzem drastisch anzusteigen. Abgesehen von dem Einfluß einer ständig ansteigenden Anzahl und Vielfalt von Chemikalien aus verschiedenen Quellen, einschließlich Abgasen aus dem Verbrennen von fossilen Brennstoffen oder aus der Herstellung von Plastiksubstanzen, spielt auch externe Strahlung eine zunehmende Rolle bei der Entstehung von Hauterkrankungen. In diesem Kontext wird der UV-Strahlung von sowohl natürlichem Ursprung (d.h. Sonnenstrahlung) ebenso wie aus künstlichen Quellen eine führende Rolle bei der Ätiologie von Hautkrankheiten und -erkrankungen zugewiesen. Es gibt eine dramatische Zunahme des Auftretens von sowohl Melanom- als auch Nicht-Melanom-Hautkrebs in Europa, den Vereinigten Staaten und Australien. Der erhöhte Einfluß von UVB-Strahlung aufgrund der Abnahme der Ozonschicht kann zu diesem Phänomen in gewissem Ausmaße beitragen, der Hauptgrund für die Zunahme an UV-induziertem Hautkrebs ist sicherlich das Verhalten der Bevölkerung. Wegen einer konstanten Veränderung hauptsächlich in den Freizeitaktivitäten hat die kumulative Lebenszeit-UV-Dosis der Bevölkerung im Durchschnitt über die letzten Jahrzehnte zugenommen (Armstrong and Kricker, 2001, J Photochem Photobiol B.; 63(1–3):8–18).
In der Tat ist die ultraviolette Sonnenstrahlung einer der wichtigsten Umwelteinflüsse im Hinblick auf die Haut von terrestrischen Lebensformen. Dies ist insbesondere zutreffend für den mittleren Bereich der UV-Strahlung (290–320 nm), da es dieser Bereich ist, dem eine ursächliche Rolle nicht nur für Sonnenbrand, sondern auch für die massive Zunahme des Auftretens an Hautkrebs, oben beschrieben, zugewiesen wird. Von einem mechanistischen Standpunkt aus betrachtet wird davon ausgegangen, daß der schädliche Effekt der UV-Strahlung auf Hautzellen durch die massive Schädigung verursacht wird, die sie in der DNA von Hautzellen induziert, die einer solchen Strahlung ausgesetzt worden sind. DNA absorbiert UV-Licht in der UVB-Region (290–320 nm) und der UVC-Region (200–290 nm). Die Absorption von UV-Strahlung wird oft von Läsionen in den betroffenen DNA-Molekülen begleitet. UV-Strahlung im Bereich 290–320 nm induziert hauptsächlich zwei Arten von Photoläsionen, nämlich Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPD) und <6–4> Photoprodukte. Der größte Teil dieser Photoprodukte wird in normalen eukaryotischen Zellen durch einen Mechanismus entfernt, der gewöhnlich als „Nukleotid-Excisions-Reparatur" (NER) bezeichnet wird, der von äußerster Wichtigkeit ist, da die DNA-Läsionen, die zurückbleiben, zu malignen Aberrationen der betroffenen Zellen führen können. (de Laat et al., 1999, Genes Dev. 13:768–785). Die Wichtigkeit des NER-Mechanismus wird durch eine genetische Krankheit beeindruckend demonstriert, die durch die Abwesenheit eines funktionellen NER-Systems gekennzeichnet ist, Xeroderma pigmentosum (XP). Entsprechend weisen Patienten, die an Xeroderma pigmentosum leiden, eine dramatisch erhöhte Rate von Hautkrebs auf (Kraemer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:1–14, 1997). Das eukaryotische NER-System hat sein prokaryotisches und virales Gegenstück in spezifischen Enzymen, die dazu vorgesehen sind, UV-induzierte DNA-Schädigung zu entfernen. Zum Beispiel kann eine Beschleunigung der DNA-Reparatur ebenfalls durch Anwendung von exogenen DNA-Reparaturenzymen erzielt werden, die dieselben biologischen UV-Effekte entfernen. Es ist gezeigt worden, daß das bakterielle DNA-Reparaturenzym T4N5-Endonuklease erfolgreich verschiedene UV-vermittelte Phänomene einschließlich Immunsuppression, Freisetzung des immunsuppresiven Cytokins Interleukin-10 und des Entzündungsmediators Tumornekrosefaktor α (TNF α) umkehrt, wenn es in Liposomen verkapselt ist. (Wolf et al, J. Invest. Dermatol., 114:149–156, 2000; Kibitel et al., Photochem. Photobiol. 67:541–546, 1998). Ähnliche Beobachtungen sind mit einem anderen Reparaturenzym, ebenso von bakteriellem Ursprung, Photolyase, gemacht worden, das Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere spezifisch bei Belichtung mit photoreaktivierendem Licht umkehrt, einem Reparaturprozeß, der auch als „Photoreaktivierung" bezeichnet wird (Stege et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:1790–1795). Die Einführung dieser Reparaturenzyme in Zellen wird durch ihren Einbau in Liposomen und anschließende Auftragung dieser Liposomen auf UV-bestrahlte Zellen in Kultur oder auf UV-bestrahlte Haut durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß die lokale Auftragung dieser Reparaturenzyme signifikant das Auftreten von Hauttumoren in chronisch UV-bestrahlten Mäusen verringert (Yarosh et al., 1992, Cancer Res. 52, 4227–4231). Darüberhinaus reduziert die topische Auftragung von T4N5-Endonuklease in signifikanter Weise das Risiko von Patienten mit Xeroderma pigmentosum, Strahlenkeratosen zu entwickeln (Yarosh et al., 2001, Lancet, 357:926–929). Jedoch haben diese Verfahren nicht ihren Weg in die normale Behandlung von Sonnenbrand und Hautschädigung gefunden. Herkömmlicher Schutz gegen Sonne unter Verwendung von topisch aufgetragenen UV-Filtern ist immer noch die effizienteste Art und Weise zum Verringern von UV-induzierter Schädigung der Haut. Herkömmliche UV-Filter haben jedoch oft unerwünschte Nebenwirkungen dahingehend, daß sie entweder allergische Reaktionen verursachen können, wenn sie UV-absorbierende aromatische Ringsysteme sind, oder sie bieten keinen wirksamen Schutz durch einfaches mechanisches Blockieren der UV-Strahlung (z.B. Metalloxidpigmente) und verursachen darüber hinaus eine Verschmutzung der getragenen Kleidungsstücke.
UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere können das Tumorsuppressorgen p53 aktivieren, das eine wesentliche Rolle bei der Bildung von apoptotischen Keratinocyten spielt, die in vivo als Sonnenbrandzellen in der Epidermis auftreten (Murphy et al., 2001, Exp. Dermatol., 10:155–160). Mäuse, die hinsichtlich eines funktionellen p53 defizient sind, entwickelten signifikant weniger Sonnenbrandzellen beim Aussetzen gegenüber UV-Bestrahlung als UV-bestrahlte Wildtyp-Mäuse (Ziegler et al., 1994, Nature, 372:773–776). Bestrahlung mit UV führt zu einem p53-abhängigen Zellzyklusarrest während der G1-Phase, um eine DNA-Reparatur vor der DNA-Synthese zu ermöglichen. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde angenommen, daß Sonnenbrandzellen Keratinocyten sind, die es nicht vermochten, in effizienter Weise beschädigte DNA zu reparieren und in Folge dessen Apoptose durchlaufen und damit dem Risiko entgehen, bösartig zu werden. Entsprechend wurde die Bildung von Sonnenbrandzellen als ein p53-Kontroll-Abfangphänomen („p53 control scavenging phenomenon") betrachtet, das Individuen davor schützt, UV-induzierten Hautkrebs zu entwickeln (Brash et al., 1996, J. Invest. Dermatol. Symposium Proceedings, 1:136–142). Im Hinblick auf die Tumor-unterdrückenden Eigenschaften von p53 sollten Keratinocyten mit einer Mutation davon gegenüber den Tumor-fördernden Effekten von UV empfindlich sein, während andere Zellen, die Wildtyp-p53 tragen, bei Belastung mit einer bestimmten Menge an DNA-Schädigung durch Apoptose eliminiert werden sollten (Brash et al., ibid.). Da UV bevorzugt p53 mutiert (Brash et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10124–10128), kann es einen selektiven Druck für die mutierten schädigungsresistenten Keratinocyten ausüben, wodurch es diesen Zellen ermöglicht, klonal zu expandieren und eine Strahlenkeratose zu bilden, der Vorstufe von Hautkrebs (Ziegler et al., ibid). Deshalb ist vorgeschlagen worden, daß die Heftigkeit einer DNA-Schädigung ein Hauptmediator der Apoptose ist und deshalb mit der Anzahl an Sonnenbrandzellen korreliert (Ziegler et al., ibid). Eine Zunahme an DNA-Reparatur sollte ebenfalls zu einer Verringerung der apoptotischen Antwort von Keratinocyten gegenüber einem Aussetzen gegenüber UV führen. Ein Beweis für diese Annahme wurde geliefert, als Epithelzellen (HeLa) einer verstärkten DNA-Reparatur nach einer UV-Bestrahlung unterzogen wurden. Eine Beschleunigung der DNA-Reparatur wurde mittels Photoreaktivierung erzielt über Zugabe des DNA-Reparaturenzyms Photolyase, verkapselt in Liposomen. Eine Photoreaktivierung führte zu einer signifikant jedoch nicht vollständig verringerten Apoptose rate bei Aussetzen gegenüber UV (Kulms et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:7974–7979). Ähnliche Ergebnisse waren in vivo erhalten worden, in denen gezeigt wurde, daß eine topische Auftragung des Reparaturenzyms T4N5 über Liposomenabgabe die Anzahl an Sonnenbrandzellen sowohl in Mäusen als auch Menschen verringerte (Wolf et al., 2000, IBID.; Stege et al., 2000, IBID). In der Zusammenschau zeigen diese und die oben erwähnten Daten deutlich, daß eine Schädigungen der Kern-DNA eine wichtige Rolle beim Vermitteln der biologischen Effekte von UV spielt.
Eine jüngere Studie (Schwarz et al., 2002, Nature Cell Biology, 4:26–31) hat gezeigt, daß Interleukin-12 eine UV-Strahlung-induzierte Apoptose unterdrückt durch Induzieren einer DNA-Reparatur durch die zelleigenen Reparatursysteme, insbesondere das Nukleotid-Excisions-Reparatursystem (NER). IL-12 ist ein immunstimulatorisches Cytokin und hat eine große Vielzahl von Effekten. Interleukin-12 wird von peripheren Lymphocyten nach der Induktion sezerniert. Es wird hauptsächlich von B-Zellen und zu einem geringeren Ausmaß von T-Zellen erzeugt. Hinsichtlich seiner Struktur ist Interleukin-12 ein heterodimeres 70kDa-Protein mit einer Untereinheit von 35 kDa und einer Untereinheit von 40 kDa (IL-12A = 35 kDa, 197 Aminosäuren; IL-12B = 40 kDa, 306 Aminosäuren). Das Heterodimer wird durch Disulfidbindungen gebildet, deren Bildung für die biologische Aktivität essentiell ist. Beide Untereinheiten und ihre Wechselwirkung scheinen für ein korrektes Funktionieren der Moleküle essentiell zu sein, da ein 40 kDa-Untereinheit-Homodimer antagonistische Funktionen aufweist (German et al., 1995, Immunol. Today; 16(10):500–501).
Hinsichtlich seiner Aktivitäten ist IL-12 der klassische Typ eines immunstimulatorischen Cytokins, wie bereits oben erwähnt, und scheint an einer großen Vielzahl von Reaktionen nach einer primären Immunantwort beteiligt zu sein. IL-12 stimuliert die Proliferation von humanen Lymphoblasten nach einer Zellaktivierung durch Phytohemagglutinin. Es aktiviert NK-Zellen, die für CD56 positiv sind, und arbeitet darüberhinaus synergistisch mit anti-CD-3-Antikörpern mit allogener Stimulierung in gemischten Lymphozytenkulturen beim Induzieren einer T-Zell-Proliferation zusammen. Darüberhinaus ist gezeigt worden, daß IL-12 die Synthese von IFN-γ und Interleukin-2 in peripheren Lymphozyten von T-Helferzellen vom Typ 1 (Th 1) induziert. Die Effekte von IL-12 auf natürliche Killerzellen werden durch TNF-α vermittelt, basierend auf dem Ergebnis, daß ein Antikörper, der gegen TNF-α gerichtet ist, die Effekte von IL-12 auf natürliche Killerzellen unterdrücken kann. IL-12 und TNF-α sind Co-Stimulatoren für die IFN-γ-Produktion, wobei IL-12 die IFN-γ-Antwort maximiert. Darü berhinaus fungiert IL-12 zusammen mit IL-2 bei der Förderung der Proliferation von einkernigen Zellen im peripheren Blut und bei der Förderung der Erzeugung von Lymphokinaktivierten Killerzellen (LAK-Zellen). Picomolare Konzentrationen von IL-12 sind ebenso effektiv wie nanomolare Konzentrationen von IL-2 beim Steigern der cytolytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen, die in vivo durch IL-2 expandiert worden sind. Darüberhinaus ist gemutmaßt worden, daß IL-12 an der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beteiligt ist, wie etwa Multipler Sklerose, Kontaktsensitivierung und Ekzem (Riemann et al., 1996, J. Immunol. 156(5):1799–1803; Leonard et al., 1997, Crit Rev. Immunol. 17(5–6):545–553). Da IL-12 es ermöglicht, die Dosierungen von IL-2 zu verringern, die für die Erzeugung von LAK-Zellen erforderlich sind, ist ihm eine potentielle Rolle für die adoptive Immuntherapie zugewiesen worden, wobei IL-2 normalerweise verwendet wird, da es ernsthafte Nebenwirkungen gibt, die mit Interleukin-2 verbunden sind, und deshalb ruht viel Hoffnung auf der gemeinsamen Verabreichung von IL-2 mit IL-12. Es ist ebenso gezeigt worden, daß IL-12 das Wachstum einer Vielzahl von experimentellen Tumoren in vivo inhibiert und einen antiangiogenen Effekt hat, von dem davon ausgegangen wird, daß er durch IFN-γ vermittelt wird.
Wie aus dem obigen gesehen werden kann, machte die große Vielzahl von Rollen, die IL-12 haben kann, die Verwendung von IL-12 in medizinischen Anwendungen zu einer außerordentlichen Aufgabe, da nicht klar vorhergesagt werden kann, was das Ergebnis einer solchen Anwendung sein wird angesichts der multifaktoriellen Natur der beteiligten Wechselwirkungen. Sogar noch zu einem geringeren Ausmaß kann die Erkenntnis und das Wissen, das von Experimenten mit IL-12 erhalten worden ist, in einfacher Weise auf andere Cytokine übertragen werden. Darüberhinaus ist die Verwendung von IL-12 in außerordentlicher Weise durch seine hohen Kosten und darüberhinaus durch seine relativ große Größe beschränkt, die zum Beispiel topische Anwendungen davon ausschließt.
Die Verhinderung eines Ausbruchs von UV-induzierter Schädigung der Haut nach einem Aussetzen gegenüber Sonnenlicht und die Verhinderung einer vorzeitigen Alterung der Haut bleibt nach wie vor zu lösen. Herkömmliche Mittel, wie etwa extern aufgetragene Sonnenfilter verhindern die Schädigung der Haut, sind aber nutzlos, wenn eine Schädigung bereits aufgetreten ist. Dasselbe trifft für mechanische Blocker zu, in der Form von Cremes, Salben, etc. oder textilen Abdeckungen, die wiederum keinen Nutzen haben, wenn die Schädigung erst einmal aufgetreten ist. Alternative Verfahren, wie etwa die zuvor erwähnte Auftragung von IL-12, die sich als eine viel versprechende Route herausstellen könnte, scheinen jedoch nicht praktikabel zu sein aufgrund der hohen Kosten von IL-12 und seiner großen molekularen Größe, die eine effiziente Aufnahme in die Haut verhindert.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung gewesen, ein alternatives Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln von UV-induzierter Schädigung der Haut bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Medikament zum Verhindern und/oder Behandeln von UV-induzierter Schädigung der Haut bereitzustellen, das billiger und praktikabler als andere auf dem Gebiet bekannte Medikament ist.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Verwendung von Interleukin-18 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung, Verringerung und Behandlung von Hauterkrankungen, die mit einer Schädigung assoziiert sind, welche durch UV-Strahlung induziert wird, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Sonnenbrand, Entzündung und verfrühte Hautalterung. Bevorzugt ist die Erkrankung eine Erkrankung, die durch die Induktion des Nukleotid-Excisions-Reparatur(NER)-wegs gemildert und/oder verhindert werden kann.
Es wird bevorzugt, daß die Erkrankung mit Apoptose assoziiert ist.
In einer Ausführungsform deckt die UV-Strahlung wenigstens einen Wellenlängenbereich von 220 bis 350 nm, bevorzugt von 250 nm bis 330 nm, bevorzugter von 290 nm bis 320 nm ab.
In einer Ausführungsform stammt die UV-Strahlung aus natürlichem und/oder künstlichem Sonnenlicht.
Bevorzugt umfaßt die Verwendung eine Verabreichung des Medikaments an einen dafür bedürftigen Patienten, wobei bevorzugt die Verabreichung systemisch und/oder topisch ist.
In einer Ausführungsform erfolgt die Verabreichung mittels Verabreichung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers und/oder mittels Injektion, bevorzugt intrakutaner Injektion eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers, wobei, bevorzugt, der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Liposomen, Salben, Öle, Cremes, Emulsionen und Dispersionen.
In einer Ausführungsform erfolgt die topische Verabreichung in einem Dosisbereich von 1 ng/ml bis 1000 ng/ml.
In einer Ausführungsform erfolgt die systemische Verabreichung in einem Dosisbereich von 0,1 μg/kg Körpergewicht bis 100 μg/kg Körpergewicht, wobei bevorzugt die Verabreichung ein- bis achtmal täglich erfolgt.
In einer Ausführungsform erfolgt die Verabreichung bevor, während und nachdem ein Patient UV-Strahlung ausgesetzt wird.
Bevorzugt ist der bedürftige Patient ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch.
Bei der vorliegenden Erfindung konnten die Erfinder zeigen, daß Interleukin-18 in der Lage ist, UV-induzierte Schädigung der Haut, die mit UV-Licht bestrahlt worden ist, zu verhindern und/oder zu behandeln. Als eine Konsequenz scheint es, als ob Interleukin-18 in der Lage ist, die Apoptose, die normalerweise mit UV-Strahlung assoziiert ist, zu verringern. Darüberhinaus ist Interleukin-18 ebenso in der Lage, ein langfristiges Überleben von Keratinocyten sicher zu stellen, die durch UV-Licht bestrahlt worden sind. Darüberhinaus zeigte die Haut von Mäusen, die mit UV bestrahlt worden sind, weniger apoptotische Keratinocyten (Sonnenbrandzellen (SCs)), bei Injektion mit IL-18, als von Tieren ohne eine solche Injektion. Ohne durch irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, wird gegenwärtig davon ausgegangen, daß die Verringerung der UV-induzierten Apoptose einer gleichzeitigen Induktion des Reparatursystems von eukaryotischen Zellen, dem NER-System, zugeteilt sein kann. Die Unterdrückung der UV-induzierten Apoptose wird einer ausgeprägten Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung zugeordnet, was mit Southwestem-Dot-Blots gezeigt werden konnte (siehe unten). Während die Menge an UV-induzierter DNA-Schädigung in Gruppen von Mäusen, die mit IL-18 behandelt oder nicht-behandelt worden waren, unmittelbar nach der UV-Bestrahlung dieselbe war, war die UV-induzierte DNA-Schädigung signifikant reduziert in der Gruppe von Mäusen, die mit Interleukin-18 behandelt worden waren. Ähnliche Ergebnisse konnten ebenso in vivo mittels immun-histochemischer Experimente gefunden werden. UV-induzierte DNA-Schädigung war dieselbe in IL-18-behandelten oder nicht-behandelten Mäusen unmittelbar nach einer UV-Bestrahlung, während die DNA-Schädigung 18 Stunden nach der Bestrahlung signifikant reduziert war. Die Tatsache, daß ein solcher Effekt in Wildtyp-Mäusen erzielt werden konnte, aber nicht in Mäusen, die kein funktionelles NER-System haben, d.h. Mäuse mit einem defizienten Xpa-Gen, zeigt die Beteiligung des NER-Reparatursystems. Dies zeigt darüberhinaus, daß Interleukin-18 in der Lage ist, UV-induzierte Apoptose durch Induzieren des NER-Systems und dadurch Verringern der DNA-Schädigung zu verhindern, die durch die UV-Bestrahlung verursacht wird. Wegen einer solchen Verringerung der DNA-Schädigung hat IL-18 einen schützenden Effekt gegen Hautkrebs und verfrühte Hautalterung. Dies ist umso überraschender, da eine solcher Effekt bislang nur für Interleukin-12 beobachtet worden war, das funktionell überhaupt nicht mit Interleukin-18 in Verbindung gebracht worden war, oder nur in Gebieten, die deutlich nicht mit dem NER-System in Beziehung stehen.
Wie hierin verwendet, wird der Begriff Nukleotid-Excisions-Reparatur-Weg (NER) austauschbar mit dem Begriff „Nukleotid-Excisions-Reparatursystem" und „Nukleotid-Excisions-Reparaturmechanismus" verwendet und bezieht sich allgemein auf das System, wie z.B. beschrieben in de Laat et al., 1999 Genes Develop. 13:768–785.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Erkrankung, die mit Apoptose assoziiert ist" eine Erkrankung bezeichnen, die durch Apoptose von Zellen verursacht und/oder davon begleitet ist und/oder die sich selbst in der Apoptose von Zellen manifestiert.
Es wird nun Bezug genommen auf die Abbildungen, bei denen
1 die Unterdrückung von UV-induzierter Apoptose durch IL-18 zeigt,
2 zeigt, daß Interleukin-18 das Überleben von Keratinocyten nach UV-Bestrahlung ermöglicht,
3 eine Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung durch IL-18, in vitro, zeigt,
4 eine Verringerung der UV-induzierten DNA-Schädigung durch IL-18, in vivo, zeigt,
und 5 die Abwesenheit der Verringerung von Sonnenbrandzellen durch IL-18 in Xpa-defizienten Mäusen zeigt.
Die Erfindung wird nunmehr anhand der folgenden spezifischen Beispiele beschrieben, die nicht die Erfindung beschränken, sondern sie lediglich veranschaulichen sollen.
Beispiel 1
Die Zellinie KB (2 × 10⁵/ml) wurde mit 250 J/cm² UVB (290 nm–320 nm) bestrahlt. Vier Stunden vor der UV-Bestrahlung wurde humanes rekombinantes IL-18 (150 ng/ml) zugegeben (UV+IL-18). 16 Stunden nach der Bestrahlung wurde der apoptotische Zelltod mittels eines ELISA auf Apoptose gemessen, beruhend auf dem Prinzip der DNA-Fragmentierung. Für den Nachweis der DNA-Fragmentierung wurde ein Zelltod-Nachweis-ELISA (Boehringer Mannheim) verwendet. Die Anreicherung an Mono- und Oligonukleosomen, die in das Cytoplasma von Zellen freigesetzt wurden, wird mittels biotinylierten anti-Histon- und Peroxidase-gekoppelten Anti-DNA-Antikörpern nachgewiesen. Die Apoptoserate ist in der Zunahme der Extinktion, dargestellt auf der Y-Achse, reflektiert. Die optische Dichte wird auf der Y-Achse als ein Mittelwert ±SD von dreifachen Messungen gezeigt. Der Student's t-Test wurde verwendet, um die Signifikanzen der Unterschiede zu testen. *p < 0.05 (UV+IL-18 gg. UV). Ein Ergebnis dieses Experiments kann in 1 gesehen werden, die zeigt, daß IL-18 die UV-induzierte Apoptose unterdrückt.
Beispiel 2
Humane Wildtyp-Keratinocyten wurden mit 150 ng/ml IL-18 oder äquivalenten Mengen eines Verdünnungsmittels vier Stunden vor der UV-Bestrahlung (250 J/cm²) behandelt. Nach einer UV-Bestrahlung wurden die Zellen in einem Medium mit und ohne Interleukin-18 ausplattiert. 24 Stunden später wurde das Medium durch Keratinocyten-Wachstumsmedium ohne IL-18 ersetzt, und die Zellen wurden für 21 Tage kultiviert. Nach 21 Tagen wurden die Kolonien mit Kristallviolett gefärbt, wovon Ergebnisse in 2 gezeigt werden. Aus 2 wird deutlich, daß Interleukin-18 das Überleben von Keratinocyten nach einer UV-Bestrahlung ermöglicht.
Beispiel 3
KB-Zellen wurden mit UV-Licht 150 J/cm² (290–320 nm) in der Anwesenheit (UV+IL-18) oder Abwesenheit (UV) von IL-18 (150 ng/ml) bestrahlt. 10 Minunten, 3,5 bzw. 6,5 Stunden nach der UV-Bestrahlung wurde die genomische DNA extrahiert, und eine Soutwestern-dot-blot-Analyse wurde unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt, der spezifisch auf UV-induzierte DNA-Schädigung gerichtet war (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere). Genomische DNA wurde aus 1 × 10⁶ Zellen gemäß dem DNA-Extraktionsprotokoll von Biozym Diagnostik (Hessisch Oldendorf, BRD) isoliert. 2 μg genomische DNA wurden auf eine positiv geladene Nylonmembran durch Vakuum-Dot-Blotting übertragen und durch Backen der Membran für 15 Minuten bei 80°C fixiert. Ein monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen Thymin-Dimere (Kamiya Biomedical Company, Seattle, WA), wurde für eine Southwestern-Analyse verwendet. Der Nachweis wurde mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Anti-Maus-Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 3 gezeigt. 3 zeigt, daß UV-induzierte DNA-Schädigung durch IL-18 verringert werden kann.
Beispiel 4
C57BL/6-Mäuse wurden auf ihrem Rücken rasiert und dorsal mit 650 J/cm² UVB bestrahlt. Drei Stunden vor der UV-Bestrahlung wurden 300 ng IL-18 (b, d) und gleichen Mengen (100 μl) wäßriger Salzlösung (a, c) intrakutan injiziert. Hautbiopsien wurden 10 Minuten (a, b) und 16 Stunden (c, d) nach einer UV-Bestrahlung entnommen, und eine immunhistochemische Färbeprozedur wurde unter Verwendung eines Antikörpers durchgeführt, der spezifisch auf UV-induzierte DNA-Schädigung (Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere) gerichtet ist. Biopsien wurden in 7% gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, entwässert und in Paraffin eingebettet. Nach Deparaffinisierung mit Xylol und Ethanol in abnehmenden Konzentrationen wurden die Schnitte in eine wäßrige Lösung, enthaltend 0,1 M Zitronensäure/0,1 M Natriumcitrat, eingetaucht und anschließend für 15 Minuten Mikrowellen-behandelt, um antigenische Epitope zu demaskieren. Endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation mit 0,1% H₂O₂ und 0,6% Natriumazid in PBS für 20 Minuten blockiert. Nach Spülen mit PBS wurden unspezifische Bindungsstellen mit 2% BSA für 30 Minuten bei Zimmertemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit dem primären Antikörper, verdünnt in 1% BSA. Der Anti-Thymidin-Dimer-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:2000 verwendet. Die Färbung wurde durch eine indirekte Immunperoxidasetechnik unter Verwendung der folgenden Reagenzien erzielt: PBS, Peroxidase-konjugierte Anti-Maus-Antikörper (unverdünnt, Dako envision, Dako, Hamburg, Germany), 0,01% H₂O₂, 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma Corp., St. Louis, MO). In negativen Kontrollen wurde der erste Antikörper ausgelassen. Gefärbte Schnitte wurden mit herkömmlicher Lichtmikroskopie bewertet. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 4 gezeigt. Wie anhand von 4 gesehen werden kann, kann die UV-induzierte DNA-Schädigung durch IL-18 in vivo verringert werden.
Beispiel 5
C57BL/6 (Wildtyp) und Xpa-defiziente Mäuse (Xpa KO) wurden auf ihren Rücken rasiert und dorsal mit 3000 J/cm² UVB bestrahlt. 3 Stunden vor der UV-Bestrahlung wurde Interleukin-18 (300 ng) intrakutan injiziert. 16 Stunden nach der UV-Bestrahlung wurden Hautbiopsien entnommen, und die Anzahl an apoptotischen Keratinocyten (Sonnenbrandzellen, SCs) wurde pro 6 mm Haut gezählt. Um die SC-Bildung zu bewerten, wurden die Biopsien von den UV-exponierten Hautflächen entnommen, in Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Gewebeschnitte (5 μm) wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, die Anzahl an SC-definiert als apoptotische Zellen innerhalb der Epidermis, die ein geschrumpftes eosinophiles Cytoplasma und einen kondensierten Kern aufwiesen – wurde in der gesamten Epidermis der Schnitte pro Probe unter Verwendung eines 1 × 1 cm Gitter gezählt, das in ein herkömmliches Mikroskop eingeführt war. SC pro 6 Millimeter Länge Epidermis wurden gezählt. Wenigstens fünf Felder von jeder Probe wurden bewertet und die Anzahl an SC (Mittelwert ±SD) berechnet. Der Student's t-Test wurde verwendet, um die Signifikanzen der Unterschiede zu testen. Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 5 gezeigt. Gemäß 5 kann in Xpa-defizienten Mäusen eine UV-induzierte Apoptose (Sonnenbrandzellen) nicht durch IL-18 verringert werden, was eine Rolle von IL-18 als einen direkten oder indirekten Inducer des NER-Wegs nahelegt.

Claims

Verwendung von Interleukin-18 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung, Verringerung und Behandlung von Hauterkrankungen, die mit einer Schädigung assoziiert sind, welche durch UV-Strahlung induziert wird, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Sonnenbrand, Entzündung und verfrühte Hautalterung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die UV-Strahlung wenigstens einen Wellenlängenbereich von 220 nm bis 350 nm abdeckt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die UV-Strahlung wenigstens einen Wellenlängenbereich von 250 nm bis 330 nm abdeckt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die UV-Strahlung wenigstens einen Wellenlängenbereich von 290 nm bis 320 nm abdeckt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2–4, wobei die UV-Strahlung aus natürlichem und/oder künstlichem Sonnenlicht stammt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend eine Verabreichung des Medikaments an einen hierfür bedürftigen Patienten.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Verabreichung systemisch und/oder topisch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5–6, wobei die Verabreichung mittels Verabreichung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers und/oder mittels Injektion erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Verabreichung mittels intrakutaner Injektion eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8–9, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Liposomen, Salben, Öle, Cremes, Emulsionen und Dispersionen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7–10, wobei die topische Verabreichung in einem Dosisbereich von 1 ng/ml bis 1000 ng/ml erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7–10, wobei die systemische Verabreichung in einem Dosisbereich von 0,1 μg/kg Körpergewicht bis 100 μg/kg Körpergewicht erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Verabreichung ein- bis achtmal täglich erfolgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6–13, wobei die Verabreichung erfolgt, bevor, während und nachdem ein Patient UV-Strahlung ausgesetzt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6–14, wobei der bedürftige Patient ein Säugetier ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der bedürftige Patient ein Mensch ist.