DE60129606T2 - Mittel und verfahren zur vorbeugung von durch chemotherapie ausgelöster alopezie - Google Patents

Mittel und verfahren zur vorbeugung von durch chemotherapie ausgelöster alopezie Download PDF

Info

Publication number
DE60129606T2
DE60129606T2 DE60129606T DE60129606T DE60129606T2 DE 60129606 T2 DE60129606 T2 DE 60129606T2 DE 60129606 T DE60129606 T DE 60129606T DE 60129606 T DE60129606 T DE 60129606T DE 60129606 T2 DE60129606 T2 DE 60129606T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
administration
stress protein
skin
stress
trigger
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60129606T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60129606D1 (de
Inventor
Richard Voellmy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of DE60129606D1 publication Critical patent/DE60129606D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60129606T2 publication Critical patent/DE60129606T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/30—Zinc; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/34—Copper; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/36—Arsenic; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Radiation-Therapy Devices (AREA)
  • Thermotherapy And Cooling Therapy Devices (AREA)
  • Electrotherapy Devices (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Bedingungen und Zusammensetzungen, die geeignet sind, die Stressantwort in Haarfollikeln zu induzieren, und Verfahren zur Verwendung der Bedingungen und Zusammensetzungen zur Verhinderung Chemotherapie-induzierter Alopezie.
  • HINTERGRUND
  • Chemotherapie induziert häufig Haarausfall. Mit Chemotherapie erfahren Patienten nicht nur eine verminderte Ausdauer und Unabhängigkeit, sondern müssen auch ein äußerliches Zeichen ihrer Krankheit, den Ausfall ihrer Haare, tragen. Dieser Haarausfall ist eine traumatische Erfahrung, die leicht zu einem geringeren Selbstbewusstsein und einer geringeren Widerstandsfähigkeit insgesamt führen kann. Es sind einige Patienten bekannt, die aus Angst, ihre Haare zu verlieren, Chemotherapie abgelehnt haben. Für mehrere Jahrzehnte wurden zum Verhindern Chemotherapie-induzierter Alopezie Kopfhaut-Tourniquets verwendet. Diese Technik beinhaltet die Platzierung eines pneumatischen Tourniquets um die Haarlinie zum Zeitpunkt der Verabreichung des chemotherapeutischen Arzneimittels. Das Tourniquet wird anschließend auf einen Druck über dem systolischen arteriellen Druck aufgeblasen, was den Blutfluß zu der Kopfhaut vermindert. Die Wirksamkeit dieser Technik wurde nie eindeutig nachgewiesen. Die Verwendung von Tourniquets wurde mehr oder weniger durch Kopfhaut-Hypothermie ersetzt. Bei dieser Technik wird die Kopfhauttemperatur durch Verwendung kalter Packungen, etc. vor Chemotherapie unter 24°C gesenkt. Es wurde berichtet, dass die Technik eine 50 bis 70%-ige gute bis ausgezeichnete haarschützende Wirkung ermöglicht. Allerdings bleiben die Ergebnisse notorisch schwankend. Darüber hinaus ist die Anwendung eher unangenehm und wird nur für eine kurze Zeit toleriert. Sie ist wahrscheinlich am wirksamsten für chemotherapeutische Mittel mit kurzen Halbwertszeiten. Zudem wurde von einigen Fällen von Kopfhautmetastasen bei Patienten berichtet, die Kopfhaut-Hypothermie verwendet haben. Letztendlich scheint die Technik wesentlich weniger gut für Kombinations-Chemotherapie zu funktionieren als für eine Therapie, die einzelne Mittel verwendet. Es wurden auch einige pharmakologische Ansätze zur Verhinderung von Chemotherapie-induziertem Haarausfall getestet. Für einen Überblick, siehe Dorr. 1998. Semin. Oncol. 25: 562-570. Die meisten getesteten Arzneistoffe versagten (z.B. alpha-Tocopherol, Minoxidil, Calcitriol) oder zeigten eine merkliche Geschlechtspräferenz (1,25-Dihydroxyvitamin D3). Erfolgversprechendere Ergebnisse wurden mit der immunmodulatorischen Substanz ammonium-trichlor(dioxyethylen-0,0')tellurat (AS101) erhalten. Sredni et al. 1996, Int. J. Cancer 65: 97-103. Allerdings wird auf eine Bestätigung dieser Studie noch gewartet. Darüber hinaus muß die Frage geklärt werden, ob der Immunmodulator nur wirksam ist, wenn er Wochen vor Chemotherapie verabreicht wird. In diesem Fall würde dies die Nützlichkeit der Verbindung etwas vermindern. Ein anderer Wirkstoffkandidat könnte ImuVert sein, der möglicherweise in Kombination mit Acetylcystein verwendet wird. ImuVert ist eine Membranvesikel-Ribosomen-Zubereitung aus Serratia marescens. Die Kombination von AS101 und Acetylcystein zeigte Wirksamkeit im Nagetiermodell, aber es sind keine humanen Daten verfügbar. Es könnte jedoch Vorsicht geboten sein, da ImuVert als ein biologischer Antwort-Modifikator das Potential aufweist, nicht zulässige Toxizitäten zu produzieren. Folglich gibt es keinen Arzneistoff auf dem Markt, der allgemein vor Chemotherapie-induzierter Alopezie schützt, und es gibt nur wenige Arzneistoffkandidaten, die unter aktueller Entwicklung stehen. Daher gibt es einen Bedarf für zusätzliche Arzneistoffkandidaten und Verfahren zum Schutz vor Chemotherapie-induzierter Alopezie.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Zellen, Gewebe, Organe und Gesamtorganismen antworten auf proteotoxischen Stress einer Erhöhung der Expression einer Gruppe an Proteinen, die Hitzeschock oder Stressproteine (Hsps) genannt werden. Diese Antwort wird hier als die Stressproteinantwort bezeichnet, und Bedingungen und Verbindungen, die diese Antwort auslösen, werden als Auslöser bezeichnet. Bedingungen, die die Antwort auslösen, werden spezifisch als physikalische Auslöser bezeichnet, und Verbindungen, die die Antwort auslösen, als chemische Auslöser. Basierend auf dem, was gegenwärtig über die wahrscheinlichen Konsequenzen einer Aktivierung der Stressproteinantwort in Krebszellen, Gewebe und Organen bekannt ist, ist es wichtig, die Aktivierung dieser Antwort während chemotherapeutischer Krebsbehandlung zu vermeiden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis der Erfinder, dass eine bestimmte Situation existiert, in der die schützenden Wirkungen der erhöhten Niveaus von Hsps genutzt werden können, um die behandlungsunabhängige Toxizität chemotherapeutischer Arzneistoffe zu verhindern, ohne die Wirksamkeit der gleichen Arzneistoffe gegenüber einem Tumor zu beeinträchtigen. Diese bestimmte Situation betrifft das Haupthaar eines Patienten, der eine Chemotherapie-Behandlung eines Tumors durchläuft, der sich nicht in der Kopfhaut befindet, oder die Körperbehaarung eines Säugetiers oder Teile davon, das einer Chemotherapie eines Tumors unterzogen wird, der sich nicht in der Haut befindet. Viele chemotherapeutische Arzneistoffe und Kombinationen solcher Arzneistoffe verursachen Haarausfall (Alopezie) vom Kopfhaar des Patienten oder von der Körperbehaarung des Tieres. Ein chemischer Auslöser der Stressproteinantwort kann auf der Kopfbaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres so angewendet werden, dass er die mitotisch aktiven Zellen der Haarfollikel vor Eintritt in den allgemeinen Kreislauf erreicht. Als Folge können Haarfollikelzellen und in Abhängigkeit von der Eigenschaft der Zusammensetzung, die den chemischen Auslöser umfaßt, einige andere Zellen der Haut einer Konzentration eines chemischen Auslösers ausgesetzt sein, die ausreichend hoch ist, die Stressproteinantwort in diesen Zellen zu aktivieren. Die Niveaus von Stressproteinen werden ansteigen, und als Folge werden die Haarfollikelzellen vor anschließendem Aussetzen gegenüber zytotoxischen chemotherapeutischen Mitteln für einen Zeitraum von üblicherweise ein bis zwei Tagen geschützt, und der Alopezie-Phänotyp wird nicht entwickelt. Während schließlich unvermeidlich ein Bruchteil der chemischen Auslöser-Moleküle in den allgemeinen Kreislauf eintreten wird, wird aufgrund der hohen Verdünnung des chemischen Auslösers im Kreislauf und da die Stressproteinantwort nicht aktiviert wird, bevor eine Schwellenwert-Konzentration des chemischen Auslösers erreicht wird, die Aktivierung der Stressantwort auf Haarfollikelzellen und möglicherweise Hautzellen begrenzt sein und nicht in einem signifikanten Ausmaß in Blutzellen oder Zellen anderer Organe auftreten. Daher wird ein topisch verabreichter chemischer Auslöser die schützende Stressproteinantwort nur in Haarfollikeln und möglicherweise in der Haut, aber nicht woanders im Körper aktivieren, und wird folglich die Wirksamkeit der Chemotherapie-Behandlung von Tumoren, die nicht in der Kopfhaut oder Haut lokalisiert sind, nicht negativ beeinträchtigen. Im Fall eines chemotherapeutischen Schemas, in dem ein chemotherapeutischer Arzneistoff nur einmal verabreicht wird, kann eine einzelne topische Vorbehandlung des Patienten oder Tieres mit einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser umfaßt, ausreichend sein, um die Haarfollikel-sichernde Wirkung herzustellen. Viele Chemotherapiebehandlungsschemata beinhalten mehrere Behandlungszyklen mit einem chemotherapeutischen Arzneistoff, wobei die Zyklen Tage oder Wochen voneinander getrennt sein können. In diesen Fällen kann eine topische Verabreichung einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser umfaßt, in ähnlicher Weise periodisch sein, indem sie jedem Behandlungszyklus mit einem chemotherapeutischen Arzneistoff vorausgeht. Mit dieser Art an Behandlungsschema wird der chemische Auslöser während jeden Behandlungszyklus entfernt und wird nie auf ein Niveau akkumulieren, das für eine systemische Aktivierung der Stressproteinantwort ausreichend ist.
  • Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Schützen eines humanen Patienten oder eines Säugetieres, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres befindet, unterzogen werden soll, vor Chemotherapie-induzierter Alopezie. Das Schützen eines humanen Patienten oder eines Säugetieres umfaßt Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie. Das Verfahren umfaßt Anwendung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, auf der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres. Die Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneistoffes wird für eine ausreichend lange Zeit verzögert, um die Auslösung der Stressproteinantwort und die Akkumulierung der Stressproteine in Haarfollikeln auf ein schützendes Niveau zu ermöglichen. Eine wirksame Menge einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser umfaßt, ist eine Menge, die wenigstens gleich der Menge ist, die notwendig ist, um eine nachweisbare Konzentrationszunahme von mindestens einem Stressprotein aus der Gruppe von Hsps, einschließlich Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein in Haarfollikeln zu bewirken, die sich in der Haut befinden, die der Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser umfaßt, ausgesetzt wird, und die eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel gegenüber chemotherapeutischer Arzneistoffe erzeugt. Eine nachweisbare Konzentrationszunahme eines Hsp ist eine Zunahme von mindestens 25% über der Konzentration, die vor Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung gemessen wird. Setzt man kultivierte Zellen einem chemischen Auslöser aus, führt dies üblicherweise zu einer schnellen Zunahme der Hsp-Expression und zu einer ausreichenden Zunahme der Hsp-Konzentrationen innerhalb von 2 bis 12 Stunden, um Zellen gegenüber Giftstoffen, einschließlich chemotherapeutischen Arzneistoffen, resistent zu machen. Allerdings stellt die Haut, einschließlich Haarfollikel, eine signifikante Barriere dar, und für einen chemischen Auslöser kann eine zusätzliche Zeit von bis zu 24 Stunden notwendig sein, um eine wirksame Konzentration in Haarfollikelzellen zu erreichen. Demzufolge wird ein chemotherapeutischer Arzneistoff vorzugsweise zwischen 2 und 36 Stunden nach Verabreichung einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, auf der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres verabreicht. Weiter bevorzugt wird die Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneistoffs bis zu 8 bis 24 Stunden verzögert. Es sind viele chemische Auslöser der Stressproteinantwort bekannt. Im Allgemeinen fungiert jede Verbindung, die gewissermaßen Proteotoxizität erzeugt, als ein chemischer Auslöser. Bevorzugte Auslöser sind Verbindungen der Benzochinonansamycin-Serie (z.B. Geldanamycin), Arsensalze (z.B. Natriumarsenit), Zinnsalze (z.B. Zinnchlorid), Zinksalze (z.B. Zinkchlorid) und Diamide. Ein weiterer bevorzugter chemischer Auslöser ist ein aktivierter Hitzeschocktranskriptionsfaktor 1 (HSF1), der als ein rekombinantes Protein oder als eine Nukleinsäure, die ein Gen für den Faktor in einer exprimierbaren Form enthält, verabreicht werden kann.
  • Das Verfahren der Erfindung umfaßt auch Vorbehandlung der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres mit Zusammensetzungen, die einen chemischen Auslöser und zusätzlich einen Penetrationsverstärker zum Erleichtern des Transports des Auslösers in die Haarfollikelzellen umfassen.
  • Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen zum Schutz vor Chemotherapie-induzierter Alopezie, wobei die Zusammensetzungen einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort, einen Penetrationsverstärker und ein geeignetes Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel umfaßt. Bevorzugte chemische Auslöser, die in diesen Zusammensetzungen verwendet werden, sind Diamid, Verbindungen der Benzochinonansamycin-Serie, Arsensalze, Zinnsalze, Zinksalze und aktiviertes HSF in Protein oder Nukleinsäureform.
  • Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines chemischen Auslösers der Stressproteinantwort zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz eines humanen Patienten oder eines Säugetieres, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors unterzogen werden soll, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres befindet, vor Chemotherapie-induzierter Alopezie, wobei eine wirksame Menge dieses Medikaments rechtzeitig vor Verabreichung des chemotherapeutischen Arzneistoffs auf der Kopfhaut des humanen Patienten oder der Haut des Säugetiers verabreicht wird. Eine wirksame Menge eines solchen Medikaments ist eine Menge, die wenigstens gleich der Menge ist, die notwendig ist, eine nachweisbare Konzentrationszunahme von mindestens einem Stressprotein aus der Gruppe von Hsps, einschließlich Hsp90. Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein in Haarfollikeln zu bewirken, die sich in der Haut befinden, die dem Medikament, das den chemischen Auslöser umfaßt, ausgesetzt wird, und die eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel gegenüber chemotherapeutischen Arzneistoffen bewirkt. Eine nachweisbare Konzentrationszunahme eines Hsp ist eine Zunahme von mindestens 25% über der Konzentration, die vor Verabreichung eines Medikaments der Erfindung gemessen wird. Vorzugsweise wird ein chemotherapeutischer Arzneistoff zwischen 2 und 36 Stunden nach Verabreichung eines Medikaments, das einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, auf der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres verabreicht. Weiter bevorzugt wird die Verabreichung eines chemothe rapeutischen Arzneistoffs um 8 bis 24 Stunden verzögert. Es sind viele chemische Auslöser der Stressproteinantwort bekannt. Im Allgemeinen fungiert jede Bedingung oder Verbindung, die eine gewisse Proteotoxizität erzeugt, als ein Auslöser. Bevorzugte chemische Auslöser zur Verwendung zur Herstellung eines Medikaments der Erfindung sind Verbindungen der Benzochinonansamycin-Serie (z.B. Geldanamycin), Arsensalze (z.B. Natriumarsenit), Zinnsalze (z.B. Zinnchlorid), Zinksalze (z.B. Zinkchlorid) und Diamid. Ein zusätzlicher bevorzugter chemischer Auslöser ist ein aktivierter Hitzeschocktranskriptionsfaktor 1 (ZSF1), der als ein rekombinantes Protein oder als eine Nukleinsäure, die ein Gen für den Faktor in einer exprimierbaren Form enthält, verabreicht werden kann. Von der Erfindung ist ebenso die Verwendung eines chemischen Auslösers der Stressproteinantwort und eines Penetrationsverstärkers, der die Abgabe des Auslösers in die Haarfollikeln erleichtert, zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz vor Chemotherapie-induzierter Alopezie umfaßt.
  • Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren, das einen physikalischen Auslöser der Stressproteinantwort, z.B. Hitze, verwendet zum Schützen eines humanen Patienten oder eines Säugetieres, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres befindet, unterzogen werden soll, vor Chemotherapieinduzierter Alopezie. Schützen eines humanen Patienten oder eines Säugetieres umfaßt Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren Anwendung einer wirksamen Hitzedosis auf der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres. Die Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneistoffes wird für eine ausreichend lange Zeit verzögert, um die Auslösung der Stressproteinantwort und die Akkumulierung der Stressproteine in Haarfollikeln auf ein schützendes Niveau zu ermöglichen. Eine wirksame Hitzedosis ist eine Dosis, die wenigstens gleich der Dosis ist, die notwendig ist, um eine nachweisbare Konzentrationszunahme von mindestens einem Stressprotein aus der Gruppe von Hsps, einschließlich Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein in Haarfollikeln zu bewirken, die sich in der Haut befinden, die der Hitzedosis ausgesetzt wird, und die eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel gegenüber chemotherapeutischen Arzneistoffen erzeugt. Eine nachweisbare Konzentrationszunahme eines Hsp ist eine Zunahme von mindestens 25% über der Konzentration, die vor Verabreichung einer Zusammensetzung der Erfindung gemessen wird. Setzt man kultivierte Zellen einer Hitzedosis aus, führt dies üblicherweise zu einer schnellen Zunahme der Hsp-Expression und zu einer ausreichenden Zunahme der Hsp-Konzentrationen innerhalb von 2 bis 24 Stunden, um Zellen gegen Giftstoffe, einschließlich chemotherapeutischer Arzneistoffe, resistent zu machen. Daher wird ein chemotherapeutischer Arzneistoff vorzugsweise zwischen 2 und 24 Stunden nach Verabreichung einer Hitzedosis auf der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres verabreicht. Weiter bevorzugt wird die Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneistoffs bis zu 6 bis 12 Stunden verzögert. Hitze kann durch mehrere unterschiedliche Mittel verabreicht werden. Ein Kontakt der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Tieres, die einer Behandlung bedürfen, mit einer erhitzen Oberfläche oder einer erhitzen Flüssigkeit (z.B. Wasser) wird der Haut oder den Haarfollikelzellen eine Hitzedosis verabreichen. Andere Mittel zum Erhitzen von Haut und Haarfollikelzellen, schließen ein Aussetzen gegenüber Ultraschall- oder Mikrowellen-, Infrarot- oder Hochfrequenzstrahlung ein.
  • Folglich beziehen sich die hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung auch auf ein Verfahren zur Krebsbehandlung eines hierfür bedürftigen humanen Patienten oder Säugetieres, umfassend (a) Anwenden einer wirksamen Dosis eines physikalischen Auslösers, wie z.B. Hitze, oder einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, auf der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres und (b) Unterziehen des humanen Patienten oder Tieres einer chemotherapeutischen Behandlung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Haar besteht aus der Haarwurzel, dem Haarbalg (dem Keimzentrum) und dem Haarschaft. Die Zellen proliferieren in dem Haarbalg, und das Haar wird von der Wurzel durch die Kopfhaut gedrückt. Das endgültige Produkt ist ein Strang aus fest verbundenem Kerstin. Haarwachstum findet in drei Phasen statt. Die erste Phase ist die Anagenphase, die die Wachstumsphase ist. 85 bis 90% der humanen Haarfollikel sind in der Anagenphase. Jeder Haarfollikel umfaßt einen Bulbus aus mitotisch aktiven Matrixzellen. Aus diesen differenzieren und wachsen alle Zellen des Haarschafts. Zellen bewegen sich reihenweise in den oberen Balg vor und verlängern sich vertikal. Letztendlich werden sie nach oben gedrückt und tauchen an der Hautoberfläche auf. Humane Haarbalgzellen teilen sich durchschnittlich alle 12 bis 24 Stunden. Aufgrund dieser erheblichen mitotischen Aktivität sind die Haarbalgzellen für zytotoxische Mittel besonders empfindlich. Die Anagenphase dauert zwischen 2 und 6 Jahre beim Menschen. Die zweite Phase ist die Katagenphase, die ein paar Wochen beim Menschen andauert. In dieser Phase wird die Haarwurzel vom Haarbalg getrennt, die Pigmentlagerung wird beendet, und das Wurzelende wird aus dem Balg gedrückt. Weniger als 1% humanes Haar ist in der Katagenphase. Die dritte Phase ist die Telogenphase, die durch einen Mangel an mitotischer Aktivität charakterisiert ist. Diese Phase dauert zwischen 3 und 6 Monate. Ungefähr 10% humanes Haar ist in der Telogenphase. Dorr. 1998, Semin. Oncol. 25: 562-570. Nussein. 1993. South. Med. J. 86: 489-496.
  • Alopezie oder Haarausfall wird häufig mit Krebschemotherapie assoziiert. Dorr. 1998. Semin. Oncol. 25: 562-570. Viele der allgemein verwendeten chemotherapeutischen Arzneistoffe lösen Haarausfall aus, obwohl es anscheinend Unterschiede in der Fähigkeit der verschiedenen Arzneistoffe, Alopezie auszulösen, gibt. Schwerste Wirkungen werden durch Cyclophosphamid, Daunorubicin, Docetaxel, Doxorubicin, Etoposid, Ifosfamid, Paclitaxel, Teniposid und Topotecan ausgelöst. Joss et al. 1988. Recent Res. Cancer Res. 108: 117-126. Perry (ed). The Chemotherapy Source Book, Baltimore, MD, Williams & Wilkins, 1996, Seiten 293-555, 595-606. Etwas weniger wirksam beim Auslösen von Haarausfall sind Actinomycin, 5-Fluoruracil, Hydroxyurea, Methotrexat, Mitomycin, Mitoxantron, Stickstoff-Lost, Vinblastin, Vincristin, Vindesin und Vinorelbin. Häufig werden diese zytotoxischen chemotherapeutischen Arzneistoffe in Kombination verwendet, was das Risiko von Alopezie gegenüber dem für jeden einzelnen Arzneistoff inhärenten Risiko erhöht.
  • Es hat relativ wenig Forschung gegeben, um den tatsächlichen Mechanismus/die tatsächlichen Mechanismen Chemotherapie-induzierter Alopezie aufzuzeigen. Dies liegt vermutlich an der Tatsache, dass die Hypothese, dass zytotoxische Mittel Haarfollikelzellen durch den gleichen Mechanismus abtöten, durch den sie Krebszellen und andere proliferierende Zellen abtöten, sofort plausibel ist. Dennoch wurde gezeigt, dass Doxorubicin Haarzellen durch Einleiten eines apoptotischen Mechanismus abtötet. Cece. 1996. Lab. Invest. 75: 601-609. Die gleiche Studie fand auch heraus, dass die Zielobjekte („Targets") der Doxorubintoxizität Matrix- und obere Balgzellen der Haarfollikel sind. Eine andere Studie berichtete, dass Cyclophosphamid massive Apoptosis bei Anagen-Haarfollikel hervorruft. Schilli et al. 1998. J. Invest. Dermatol. 111: 598-604.
  • Theoretisch scheint es mehrere Wege zu geben, Chemotherapie-induzierten Haarausfall zu verhindern, nämlich (1) Reduzierung der Menge eines chemotherapeutischen Mittels, das in den Balg abgegeben wird, (2) lokale Inaktivierung des chemotherapeutischen Arzneimittels und (3) Schutz der Balgzellen, wie es durch die hier offenbarte Erfindung vorgeschlagen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft bewusste lokale Auslösung der Stressproteinantwort in der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Säugetiers, das einer Chemotherapie bedarf, um Haarfollikel vor den zytotoxischen Wirkungen chemotherapeutischer Mittel und Kombinationen davon zu schützen, ohne die therapeutische Wirksamkeit der letzteren Mittel zu beeinträchtigen.
  • Zellen in jedem Organ und in jedem Gewebe antworten auf proteotoxischen Stress durch Erhöhen der Expression von sogenannten Hitzeschock- oder Stressproteinen (Hsps). Diese Antwort wird hier als Stressproteinantwort bezeichnet. Zum Überblick, siehe Voellmy. 1994. Crit. Ref. Eukaryotic Gene Expr. 4: 357-401. Voellmy. 1996. In: Stress-Inducible Cellular Responses (Feige et al. eds.), Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, Seiten 121-137. Parsell und Lindquist. 1993. Annu. Rev. Genet. 27: 437-496. Historisch wurde der Ausdruck "Hsp" zum Beschreiben solcher Proteine verwendet, deren Syntheseraten in Zellen erhöht waren, die dem prototypischen Stressfaktor Hitze ausgesetzt waren. Hsps wurden basierend auf den Molekulargewichten ihrer Untereinheiten unterschieden. Die wichtigen Hsps weisen Untereinheitengrößen von ungefähr 110, 90, 70, 60, 20-30 bzw. 10 kDa auf und werden als Hsp110, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp20-30 (oder kleines Hsp) bzw. Hsp10 bezeichnet. Es ist jetzt bekannt, dass die meisten dieser Hsps molekulare Chaperone sind, die Faltung und Rückfaltung von Proteinen, intrazelluläres Wandern („Trafficking") von Proteinen, Zusammenbau und Dissoziierung von Proteinkomplexen, Proteinabbau, etc. unterstützen. Es ist auch bekannt, daß Streßproteine bei der Regulierung der Aktivität und Stabilität wichtiger zellulärer regulatorischer Proteine, wie z.B. Steroid-Hormonrezeptoren, bestimmter Signalkinasen, einschließlich Raf und Ras, und Telomerase, beteiligt sind. In Übereinstimmung mit ihren physiologischen Funktionen sind Hsps nicht nur in gestressten Zellen, sondern auch in nicht-gestressten Zellen vorhanden. Bestimmte Hsps sind wichtige Proteine sogar in den nicht-gestressten Zellen. Zum Beispiel stellt Hsp90 1 bis 2% des zellulären Gesamtproteingehalts in Abwesenheit von Stress dar. Sind Zellen gestresst, steigen die Konzentrationen von Hsps weiter.
  • Es war lange bekannt, dass die meisten Hsps von Familien hochverwandter Gene kodiert werden. Während einige dieser Gene in starker Weise stressreguliert sind, sind andere bereits in nicht-gestressten Zellen wesentlich aktiv. Einige dieser Gene sind überhaupt nicht stressreguliert und exprimieren Stressproteine zu jeder Zeit. Die letzteren Gene werden auch als verwandte Stressproteingene („cognate stress Protein genes") und die durch sie kodierten Proteine als Stress- oder Hitzeschock-verwandte Proteine (Hscs im Gegensatz zu Hsps) bezeichnet. Die am besten bekannte Familie von Stressproteingenen kodiert Proteine mit Molekularge wichten der Untereinheiten von ungefähr 70 kDa (Hsp/c70). Menschen besitzen ein hsp70-Gen, das bereits in nicht-gestressten Zellen wesentlich aktiv ist und dessen Aktivität während Hitze-Stress ungefähr zehnfach erhöht ist. Dieses Gen ist auch als das hsp70A-Gen bekannt. Es gibt mindestens zwei weitere Gene, die als hsp70B- und hsp70B'-Gene bezeichnet werden, die in starker Weise hitzereguliert sind. Deren Aktivität erhöht sich in hitzegestressten Zellen ungefähr tausendfach. Humane Zellen weisen auch wenigstens ein hsc70-Gen auf, das ein Protein kodiert, das mit hsp70 stark verwandt ist. Dieses Gen ist im wesentlichen nicht Stressreguliert.
  • Wie oben diskutiert, ist die Aktivität von Stressregulierbaren hsp-Genen erhöht, wenn die Zelle einem proteotoxischen Stress ausgesetzt wird. Ein solcher proteotoxischer Stress kann z.B. durch Hitze, UV-Licht, elektromagnetisches Feld, Schwermetallionen, wie z.B. Cd-, Zn-, Sn- oder Cu-Ionen, anderen Sulfhydryl-reaktiven Verbindungen, wie z.B. Natriumarsenit (einem Arsensalz), Inhibitoren des Energiemetabolismus, im besonderen Inhibitoren der mitochondrialen Funktion, Aminosäureanaloga, wie z.B. Canavanin oder Azetidincarboxylat, Proteindenaturierende Mittel, wie z.B. Ethanol, oxidierende Mittel, wie z.B. Diamid (Diazindicarboxylsäure-bis(N,N-dimethylamid)) oder andere Mittel induziert werden, einschließlich, z.B. toxischer Stoffe, die Proteinaddukte, wie z.B. Acetaminophen bilden. Die Aktivität von hsp-Genen ist auch in Zellen erhöht, die Inhibitoren der Proteolyse, wie z.B. Lactacystin oder Verbindungen ausgesetzt sind, die die eigentliche Funktion eines Stressproteins stören. Beispiele für die letzte Verbindungsart sind die Benzochinonansamycine, einschließlich Geldanamycin und Herbimycin A, von denen bekannt ist, daß sie spezifisch an Hsp90 an seiner Nukleotidbindestelle binden. Das gegenwärtige Modell, das in diesem Bereich allgemein akzeptiert zu sein scheint, beinhaltet, dass irgendeine Stress-Exposition zu einer erhöhten Rate von Proteinentfaltung und folglich zu einer erhöhten Konzentration an nicht-nativem Protein führt. Ein ausreichend erhöhtes Niveau an nicht-nativem Protein löst erhöhte Expression von hsp-Genen aus. Quantitative Messungen weisen darauf hin, dass eine wesentlich erhöhte hsp-Genaktivität Denaturierung von etwa 1 bis 2% des zellulären Proteingehalts benötigt. Da ein Aussetzen gegenüber den oben genannten chemischen oder physikalischen Bedingungen zu erhöhter hsp-Genaktivität führt, werden diese chemischen oder physikalischen Bedingungen auch als chemische oder physikalische Auslöser der Stressproteinantwort bezeichnet. Es können sowohl chemische als auch physikalische Auslöser für die Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Stressregulierung der hsp-Gene wird durch einen Hitzeschocktranskriptionsfaktor (HSF) vermittelt. Säugetierzellen exprimieren mehrere unterschiedliche, aber verwandte HSF-Moleküle. Nur einer dieser Faktoren, HSF1, scheint normalerweise in der Stressregulierung der hsp-Gene involviert zu sein. HSF1 ist ein allgegenwärtig exprimierter Faktor, der inaktiv ist, d.h., nicht fähig, ein hsp-Gen in nicht-gestressten Zellen zu transaktivieren. Wenn die Zelle einem der oben beschriebenen Auslöser ausgesetzt wird, wird der Faktor aktiviert und erlangt Transaktivierungsfähigkeit. In der nicht-gestressten Zelle bildet HSF1 Teil eines dynamischen heterooligomeren Komplexes, der Hsp90 und möglicherweise andere Chaperone und Cofaktoren einschließt. Zou et al. 1998. Cell 94: 471-480. Wenn die Zelle gestresst ist, akkumulieren nicht-native Proteine. Diese nicht-nativen Proteine binden vorzugsweise Hsp90 und andere Chaperone, wobei sie mit HSF1 für die Bindung der gleichen Chaperone konkurrieren. Als Ergebnis dieser Konkurrenz ist ein Teil von HSF1 nicht mehr an Chaperon gebunden. Nicht-assoziiertes HSF1 homotrimerisiert schnell, und erlangt als Folge die Fähigkeit, sogenannte Hitzeschockelemente(HSE)-Sequenzen spezifisch zu binden, die in Promotoren der hsp-Gene vorhanden sind. Für eine vollständige Aktivierung muss HSF1 anscheinend darüberhinaus hyperphosphoryliert sein. Jüngere, nicht-veröffentlichte Beobachtungen werfen die Möglichkeit auf, dass aktivierende Phosphorylierungsereignisse durch Binden von Chaperonkomplexen an den trimeren Transkriptionsfaktor negativ reguliert werden.
  • Mutagenesestudien von humanem HSF1 führten zu der Entdeckung von mutanten Faktoren, die nicht länger Stress-reguliert, aber geeignet sind, hsp-Gene in der Abwesenheit von jeglichem Stress zu transaktivieren. Zou et al. 1995. Mol. Cell. Bio. 15: 4319-4330. Xia et al. 1999. Cell Stress & Chaperones 4: 8-18. Diese mutanten Faktoren, die als chemische Auslöser der Stressproteinantwort fungieren, werden hier auch als aktiviertes HSF1 bezeichnet. Deletionen und Aminosäuresubstitutionen im Bereich zwischen etwa Aminosäuren 185 und 315 des 529-Reste-langen humanen HSF1-Polypeptids fuhren zu diesem deregulierten Phänotyp. Deletionen und Substitutionen im Bereich zwischen etwa Aminosäuren 200 und 315 sind bekanntermaßen konstitutiv transaktivierend, wenn sie von transfizierten Genen überexprimiert werden. Von besonderem Interesse sind Substitutionen und Deletionen im Bereich zwischen etwa Aminosäuren 185 und 200, die Faktoren ergeben, die sogar bei äußerst geringen Konzentrationen konstitutiv aktiv sind. Beispiele für Deletionen und Substitutionen, von denen bekannt ist, HSF1 zu ergeben, das konstitutiv transaktivierend ist, wurden in der Patentanmeldung PCT/US98/01038 ( WO98/31803 ) beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen wird. Es wird angemerkt, dass die Anmeldung WO98/31803 auch nicht-humanes HSF und chimäre Faktoren beschreibt, die geeignet sind, Hsp-Gene in der Abwesenheit von Stress zu transaktivieren. Während nicht jede Deletion oder Substitution im Bereich der Reste 185-315 zu einem deregulierten humanen HSF1 führt, wird die Identifizierung von deregulierten Mutationsfaktoren durch einen Fachmann mittels einem von mehreren Analyseverfahren leicht erreicht. Zum Beispiel kann ein Gen, das für ein zu testendes mutiertes HSF1 kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden. Das resultierende Expressionskonstrukt kann durch Transfektion in eine Zelle eingeführt werden, die ein oder mehrere Kopien eines hsp-Promotor-getriebenen Reportergens enthält. Ein Beispiel einer solchen Zellinie ist HeLa-CAT, eine humane Zellinie, die mehrere Kopien eines Chloramphenicol-Acetyltransferasegens unter der Kontrolle eines humanen hsp70B-Promotors enthält. Baler. et al. 1992. J. Cell Bio. 117: 1151-1159. Eine erhöhte Reportergenaktivität, die mit einem bequemen Assay auf Reporteraktivität gemessen werden kann, wird zeigen, dass ein mutiertes HSF1 geeignet ist, ein hsp-Gen in der Abwesenheit von Stress zu transaktivieren.
  • Es war lange bekannt, dass das Aussetzen von Zellen gegenüber einem nicht-letalen Hitzestress die Zellen gegen einen anschließenden heftigeren HitzeStress schützt, der für naive Zellen letal ist. Parsell und Lindquist. 1993. Annu. Rev. Genet. 27: 437-496. Hitzevorbehandlung schützt auch Zellen gegen bestimmte chemische Stresseinflüsse. Diese schützende Wirkung korreliert mit einer erhöhten Expression von Hsps. Transfektionsexperimente lieferten einen direkten Beweis, dass erhöhte Niveaus bestimmter einzelner Stressproteine Stresstoleranz erzeugen. Es wurde zum Beispiel gefunden, dass zur vorübergehenden Überexpression von Hsp70 transfizierte Zellen oder Zellinien, die dasselbe Hsp stabil überexprimieren, eine erhöhte Stressresistenz aufweisen. Li et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 1681-1685. Hout et al. 1991. Cancer Res. 51: 5245-5252. Jaattela et al. 1992. EMBO J. 11: 3507-3512. Analoge Beobachtungen wurden in Tierversuchen gemacht. Die Fähigkeit von Hsps, vor Ischämie/Reperfusionsschaden im Herzen zu schützen, wurde durch Hitzepräkonditionierende Experimente (Liu et al. 1992. Circulation 86: 11358-11363. Richard et al. 1996. Fund. Clin. Pharmacol. 10: 409-415. Joyeux et al. 1998. Cardiovasc. Res. 40: 124-130) sowie durch Studien, die transgene Tiere verwenden, gezeigt. In den letzteren Studien wurden Herze transgener Mäuse, die Hsp70 überexprimieren, einem ischämischen Ereignis unterworfen. Die Erholung der Herzen von einem ischämischen Trauma wurde nach einer 30-minütigen Reperfusion nach dem ischämischen Ereignis beurteilt. Wie anhand von Messungen der Kontraktionskraft und Kreatinkinasefreisetzung bewertet, zeigten Herze transgener Mäuse eine signifikante Verbesserung der Erholung im Vergleich mit Herzen nicht-transgener Tiere. Plumier et al. 1995. J. Clin. Invest. 95: 1854-1860. Marber et al. 1995. J. Clin. Invest. 95: 1446-1456. Es wurden ähnliche Ergebnisse bei Experimenten erhalten, in denen Herze erwachsener Ratten durch intrakoronare Infusion einer das hsp70-Gen enthaltenden HVJ-Liposomenformulierung mit einem hsp70-Gen transfiziert wurden. Suzuki et al. 1997. J. Clin. Invest. 99: 1645-1650. Transgene Mäuse, die Hsp70 im Hirn überexprimierten, zeigten ebenso einen verminderten Nervenschaden nach einer mittleren zerebralen Arterienokklusion. Plumier et al. 1997. Cell Stress & Chaperones 2: 162-167. Es wurde gefunden, dass Präkonditionierung von Kaninchen mit Hitze oder einem Zinnsalz Paralyse verhindert, die durch akute Rückenmarkischämie hervorgerufen wird. Perdrizet et al. 1999. Ami N.Y. Acad. Sci. 874: 320-325. Persönliche Mitteilung. In ähnlicher Weise wurde in einem Schweinemodell der Schutz der Nierenfuktion vor ischämischem Schaden gezeigt. Perdrizet et al. 1999. Ann. N.Y. Acad. Sci. 874: 320-325.
  • In Bezug auf schützende Wirkungen von Stressproteinen in der Haut wurde wiederholbar gezeigt, dass Hitze-Präkonditionierung das Überleben von Hautlappen („skin-flaps") erhöht. Dieses verbesserte Überleben korrelierte mit einer erhöhten Expression von Hsp70 in den Hautlappen („skin-flaps"). Koenig et al. 1992. Plast. Reconstr. Surg. 90: 659-694. Wang et al. 1998. Plast. Reconstr. Surg. 101: 776-784. Des weiteren schützte Hitze-Präkonditionierung Keratinozyten und Epithelzellkulturen vor UVB-induzierten Schaden. Diese schützende Wirkung wurde mit erhöhten Hsp-Niveaus, insbesondere Hsp70-Niveaus assoziiert. Trautinger et al. 1995. J. Invest. Dermatol. 105: 160-162. Die Injektion eines Hsp70-Antikörpers erhöhte die Empfindlichkeit der Keratinozyten gegenüber UVB-Schaden. Bayerl and Jung. 1999. Exp. Dermatol. 8: 247-253.
  • Zellen, die eine konstitutiv aktive HSF1-Mutante exprimieren, überexprimierten Hsps und zeigten eine erhöhte Resistenz gegenüber HitzeStress, simulierter Ischämie und Aussetzen gegenüber Cyclophospamid (getestet in Hepatozyten-abgeleiteten (HepG2)-Zellen). Xia et al. 1999. Cell Stress & Chaperones 4: 8-18. Die Überexpression des Stressproteins Hsp70 erhöhte die zelluläre Resistenz gegenüber Adriamycin. Roigas et al. 1998. Prostate 34: 195-202. Die Überexpression von Hsp27 führte auch zu Resistenz gegenüber Doxorubicin. Richards et al. 1996. Cancer Res. 56: 2446-2451. Oesterreich et al. 1993. Cancer Res. 53: 4443-4448. Das Labor um Karlseder und anderen berichtete in ähnlicher Weise, dass gezielte Überexpression von Hsp70 oder Hsp27 Zellen vor Doxorubicin-induzierter Apoptose schützt. Karlseder et al. 1996. Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 153-159. Richards et al. 1996. Cancer Res. 56: 2446-2451. Oesterreich et al. 1993. Cancer Res. 53: 4443-4448. Die Hsp70- oder Hsp27-Überexpression führte auch zu Zellen, die gegenüber Cisplatin resistent sind. Komatsuda et al. 1999. Nephrol. Dial. Transplant. 14: 1385-1390. Richards et al. 1996. Cancer Res. 56: 2446-2451. Oesterreich et al. 1993. Cancer Res. 53: 4443-4448. Diese Studien zeigten eindeutig, dass erhöhte Expression einzelner Hsps zum Schutz bestimmter Zelltypen vor der Toxizität zytotoxischer chemotherapeutischer Mittel führt. Aufgrund der konservierten Struktur und Funktion von Stressproteinen und der Konservierung der Stressproteinantwort wird erwartet, dass die letzteren Befunde in ähnlicher Weise für andere als die untersuchten Zelltypen, sowie für Zellen in Geweben gelten. Es wird ferner erwartet, dass Überexpression von Hsps Zellen auch vor anderen zytotoxischen als die in den oben genannten Studien getesteten Mittel schützt und dass Überexpression der gesamten Hsps-Gruppe mindestens eine vergleichbare schützenden Wirkung wie die Überexpression einzelner Hsps aufweist. Schließlich unterstützen mehrere Studien die Auffassung, dass Aktivierung der Stressproteinantwort auch eine Arzneistoffmultiresistenz induziert. Chin et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 221-6. Kim et al. 1998. Exp. Mol. Med. 30: 87-92. Diese Ergebnisse deuten an, dass eine Aktivierung der Stressproteinantwort die Wirksamkeit zytotoxischer chemotherapeutischer Arzneistoffe verringern wird, die alleine oder in Kombination mit einer Krebs-Chemotherapie verwendet werden. Daher ist eine Aktivierung der Stressproteinantwort während der Krebs-Chemotherapie-Behandlung eindeutig kontraindiziert.
  • Die schützende Wirkung einer aktivierten Stressproteinantwort bei Krebszellen kann durch andere Mechanismen etwas vermindert werden. Eine kontinuierliche Überexpression eines konstitutiv aktiven HSF1 inhibierte Zellwachstum. Xia et al. 1999. Cell Stress & Chaperones 4: 8-18. Wachstumsgehemmte Zellen können weniger anfällig auf zytotoxische Mittel als wachsende Zellen sein. Es schien allerdings, dass eine Wachstumshemmung aktivierter HSF1-überexprimierender Zellen auf der erfolgreichen Umschaltung dieser Zellen in Richtung Produktion übermäßiger Mengen an Hsps anstelle von anderen wesentlichen Proteinen beruhte. Es ist fraglich, ob diese Situation physiologisch relevant ist. Hsps weisen eine privilegierte Beziehung mit dem Immunsystem auf. In den späten 1980er hat eine Anzahl von Forschern erkannt, dass Hsps bevorzugte Zielobjekte („targets") für humorale und zelluläre Immunantworten auf Infektionen durch Bakterien, Pilze oder Protozoen sind. Diese Ergebnisse waren rätselhaft, da Stressproteine sogar von divergierenden Organismen hoch verwandt sind. Daher können Autoimmunreaktionen stattfinden. Tatsächlich exprimieren infizierte, geimpfte und sogar gesunde Patienten Antikörper und T-Zellen, die gegen Stressproteine gerichtet sind. Anscheinend sind Immunantworten gegen Stressproteine fein eingestellt, und schwere Autoimmunreaktionen werden vermieden. Erst kürzlich wurde entdeckt, dass Stressproteine die Immunogenität kovalent und nicht-kovalent gebundener Antigenen drastisch erhöhen. Interessanterweise, und das unterscheidet Stressproteine von den meisten anderen Hilfsstoffen, scheint die Stressproteinerhöhte Immunität überwiegend ein Th1-ähnlicher Typ zu sein, der Phagozyten und Aktivierung cytotoxischer Lymphocyten (CTL) stimuliert. Huang et al. 2000. J. Exp. Med., in Druck. Obwohl der zugrundeliegende Mechanismus für die immunologische Aktivität der Stressproteine nicht gut verstanden ist, wird angenommen, dass er Stimulierung von Antigenpräsentation involvieren kann. Während den letzten paar Jahren wurden mehrere Studien publiziert, die andeuten, dass erhöhte Expression von Stressproteinen alleine die Präsentation ihrer Antigene durch Tumorzellen erhöhen und daher Immunantworten, die gegen die Tumorzellen gerichtet sind, stimulieren können. Melcher et al. 1998. NatMed. 4: 581-587. Todryk 1999. J. Immunol. 163: 1398-1408. Wells et al. 1997. Scand. J. Immunol. 45: 606-612. Aber obwohl eine Antitumoraktivität von Zubereitungen, die mit antigenen Peptiden/Proteinen komplexierte Stressproteine enthalten, in Tumormodellen gezeigt werden konnte, bleibt der das Immunsystem betreffende Einfluss der Wirkungen, die aus Überexpression der Stressproteinen innerhalb der Tumorzellen herführen, ungewiß. Es scheint unwahrscheinlich, dass die letzteren Wirkungen geeignet wären, die cytoprotektiven Wirkungen überexprimierter Stressproteinen aufzuheben, wobei die cytoprotektiven Wirkungen die Wirksamkeit einer chemotherapeutischen Behandlung vermindern würden.
  • Basierend auf dem, was gegenwärtig über die wahrscheinlichen Folgen einer Aktivierung der Stressproteinantwort in krebsartigen Zellen, Geweben und Organen bekannt ist, ist es daher äußerst wichtig, eine Aktivierung der Stressproteinantwort während der Chemotherapie-Behandlung von Krebs zu vermeiden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis durch den Erfinder, dass es in mindestens einer bestimmten Situation möglich ist, die schützende Aktivität erhöhter Niveaus von Hsps nutzbar zu machen, um eine behandlungsunabhängige Toxizität chemotherapeutischer Arzneistoffe zu verhindern, ohne die Wirksamkeit der Arzneistoffe gegenüber Chemotherapie-behandlungsbedürftigem Krebs zu vermindern. Dieser Zustand betrifft die Haarfollikel in der Kopfhaut eines Krebspatienten oder in der Haut eines Tieres, die chemotherapiebedürftig sind. Wie oben diskutiert, führt die behandlungsunabhängige Toxizität vieler chemotherapeutischer Arzneistoffe oder Kombinationen von Arzneistoffen zu einem Ausfall von Kopfhaar bei einem humanen Patienten oder Haarausfall von der Körperbehaarung behandelter Tiere. Ein chemischer Auslöser der Stressproteinantwort kann direkt auf der Kopfhaut eines Krebspatienten oder der Haut eines Tieres verabreicht werden, so dass es die mitotisch aktiven Zellen der Haarfollikel vor dem Eintreten in den Kreislauf erreicht, d.h., ohne große Verdünnung. Die Niveaus der Stressproteine in Auslöserexponierten Haarfollikelzellen und möglicherweise einigen anderen Zellen der Haut werden ansteigen und innerhalb ein paar Stunden werden die Haarfollikel vor anschließendem Aussetzen gegenüber cytotoxischen chemotherapeutischen Mitteln für einen Zeitraum von üblicherweise von 1 bis 2 Tagen geschützt sein. Schließlich wird ein Teil der Auslösermoleküle in den Blutstrom eintreten. Allerdings wird aufgrund der hohen Verdünnung des chemischen Auslösers im Blutstrom und da der chemische Auslöser eine Schwellenwertkonzentration erreichen muß, bevor eine Stressproteinantwort ausgelöst wird, eine Aktivierung der Stressproteinantwort auf Zellen der Haarfollikel und möglicherweise der Haut begrenzt bleiben und nicht in einem signifikanten Ausmaß in Zellen des Blutes oder anderen Organen auftreten. Daher wird ein chemischer Auslöser nie mehr als eine vernachlässigbare systemische Konzentration erreichen, wobei die Konzentration zu gering ist, um die Wirksamkeit einer Chemotherapie-Behandlung von Tumoren, die sich nicht in Haarfollikeln befinden, oder falls der topisch verabreichte chemische Auslöser nicht spezifisch auf Haarfollikel gerichtet ist, in der Haut, die dem Auslöser ausgesetzt wird, zu beeinträchtigen. Da Chemotherapieschemata häufig mehrere Verabreichungszyklen chemotherapeutischer Arzneistoffen beinhalten, die Tage oder Wochen auseinander liegen, kann eine Verabreichung eines chemischen Auslösers ebenso periodisch sein, die jedem Verabreichungszyklus chemotherapeutischer Arzneistoffe vorangeht. Falls sogar wiederholt verabreicht, wird mit dieser Art von Verabreichungsschema der chemische Auslöser während jedem Behandlungszyklus eliminiert sein und nie auf Niveaus akkumulieren, die ausreichend für eine systemische Aktivierung der Stressproteinantwort sind. Daher beinhaltet die vorliegende Erfindung die topische Verabreichung einer wirksamen Menge eines chemischen Auslösers der Stressproteinantwort auf der Kopfhaut eines Krebspatienten oder der Haut eines Tieres rechtzeitig vor der Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels zum Behandeln eines Krebses, der sich nicht in Auslöser-exponierten Zellen befindet, um selektiv eine schützende Stressproteinantwort in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres zu aktivieren. Ein chemischer Auslöser kann auch auf jede andere Region des menschlichen Körpers topisch verabreicht werden, die für eine Chemotherapie-induzierten Alopezie empfindlich ist, wie z.B. Augenbrauen, Bart und Oberlippenbartbereiche. Ferner wird auch erwartet, dass die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung auch für den Schutz vor Alopezie, die durch Bestrahlungsbehandlung verursacht wird, wirk sam sind. Daher umfaßt die Erfindung auch jede der beschriebenen Ausführungsformen für den Schutz eines humanen Patienten oder Tieres vor Betrahlungs-induzierter Alopezie. Wie hier verwendet, bezieht sich eine "wirksame Menge" auf eine Menge eines chemischen Auslösers (oder einer Auslöser-umfassenden Zusammensetzung), die die biologische Antwort von Haarfollikeln eines humanen Patienten oder Tieres oder die durch einen Forscher oder Mediziner vermutete medizinische Antwort eines humanen Patienten oder Tieres auslöst. Der Ausdruck "wirksame Menge" umfaßt jede Menge, die im Vergleich zu einem korrespondierenden Haarfollikel-enthaltenden Gewebe oder Mensch- oder Tiersubjekt, das eine solche Menge nicht erhalten hat, zu einer erhöhten Resistenz der Haarfollikel gegenüber Abtöten durch chemotherapeutische Mittel oder zu einer verbesserten Behandlung, Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierte Alopezie führt.
  • Alternativ kann ein physikalischer Auslöser der Stressproteinantwort, wie z.B. vorübergehende Hitze, direkt auf die Kopfhaut eines Krebspatienten oder die Haut eines Tieres gerichtet werden, so dass es die mitotisch aktiven Zellen der Haarfollikel erreicht, aber nicht weit unter die Haut eindringt. Die Niveaus der Stressproteine in Auslöser-exponierten Haarfollikelzellen und anderen Zellen der Haut werden ansteigen, und innerhalb von ein paar Stunden werden die Haarfollikel vor anschließendem Aussetzen gegenüber cytotoxischen chemotherapeutischen Mitteln für einen Zeitraum von üblicherweise 1 bis 2 Tagen geschützt sein. Aufgrund der gezielten Verabreichung des physikalischen Auslösers werden Stressprotein-Niveaus in anderen Zellen als Hautzellen nicht ansteigen, und die Wirksamkeit der Chemotherapie-Behandlung von Tumoren, die sich nicht in Haarfollikeln oder anderen Hautbereichen befinden, wird nicht vermindert werden. Da Chemotherapieschemata häufig mehrere Verabreichungszyklen chemotherapeutischer Arzneistoffe beinhalten, die Tage oder Wochen auseinander liegen, kann eine Verabreichung eines physikalischen Auslösers ebenso periodisch sein, die jedem Verabreichungszyklus chemotherapeutischer Arzneistoffe vorangeht. Daher beinhaltet die vorliegende Erfindung auch die gezielte Verabreichung einer wirksamen Dosis eines physikalischen Auslösers der Stressproteinantwort auf der Kopfhaut eines Krebspatienten oder der Haut eines Tieres rechtzeitig vor der Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels zur Behandlung eines Krebes, der sich nicht in Auslöser-exponierten Zellen befindet, um selektiv eine schützende Stressproteinantwort in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres zu aktivieren. Ein physikalischer Auslöser kann auch auf jede andere Region des menschlichen Körpers gerichtet werden, die für eine Chemotherapie-induzierte Alopezie empfindlich ist, wie z.B. Augenbrauen, Bart oder Oberlippenbartbereiche. Ferner wird erwar tet, dass diese Ausführungsform der Verfahren der Erfindung auch für den Schutz vor Alopezie, die durch Bestrahlungsbehandlung hervorgerufen wird, wirksam ist. Daher umfaßt die Erfindung auch jede der beschriebenen Ausführungsformen für den Schutz eines humanen Patienten oder eines Tieres vor Bestrahlungs-induzierter Alopezie. Wie hier verwendet, bezieht sich eine "wirksame Dosis" auf eine Dosis eines physikalischen Auslösers, die die biologische Antwort von Haarfollikeln eines humanen Patienten oder Tieres oder die durch einen Forscher oder Mediziner vermutete medizinische Antwort eines humanen Patienten oder Tieres auslöst. Der Ausdruck "wirksame Dosis" umfaßt jede Dosis, die, im Vergleich mit einem korrespondierenden Haarfollikel-enthaltenden Gewebe oder Mensch- oder Tiersubjekt, das eine solche Dosis nicht erhalten hat, zu einer erhöhten Resistenz der Haarfollikel gegenüber Abtöten durch chemotherapeutische Mittel oder zu einer verbesserten Behandlung, Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierte Alopezie führt.
  • AUSLÖSER
  • Wie zuvor diskutiert, schließen Auslöser der Stressproteinantwort physikalische Auslöser, wie z.B. Hitze, UV-Strahlung, elektromagnetisches Feld, und chemische Auslöser, wie z.B. Schwermetallionen, z.B. Cd, Zn, Sn oder Cu-Ionen, andere Sulfhydryl-reaktive Verbindungen, z.B. Natriumarsenit (ein Arsensalz), Inhibitoren des Energiemetabolismus, im besonderen Inhibitoren der mitochondrialen Funktion, Aminosäureanaloga, wie z.B. Canavanin oder Azetidincarboxylat, proteindenaturierende Mittel, z.B. Ethanol und Guanidiniumhydrochlorid, oxidierende Mittel, z.B. Diamid, und andere Mittel, z.B. toxische Mittel, die Proteinaddukte, wie z.B. Acetaminophen bilden, ein. Auslöser schließen auch Inhibitoren der Proteolyse, wie z.B. Lactacystin, und Verbindungen ein, die die eigentliche Funktion eines Hsp stören. Beispiele der letzteren Art von Verbindungen schließen Benzochinonansamycine, wie z.B. Geldanamycin und Herbimycin A ein, von denen bekannt ist, dass sie spezifisch an Hsp90 in seiner Nukleotidbindestelle binden. Für eine Liste von typischen Auslösern siehe Zou et al. 1998. Cell Stress & Chaperones 3: 130-141. Die oben erwähnte Liste ist nicht erschöpfend. Es sind auch viele weitere Chemikalien bekannt, die Auslöser der Stressproteinantwort sind. Einige dieser Chemikalien, einschließlich Biclomol, Cyclopentenone und bestimmte Prostaglandine, scheinen nicht in irgendeine der oben zitierten Gruppen zu passen. Ferner gibt es wenig Zweifel daran, dass in der Zukunft neue chemische Auslöser entdeckt werden, da im allgemeinen jede Verbindung, die einen gewissen Grad an Proteotoxizität aufweist, die Stressproteinantwort induzieren wird. Ob eine bestimmte Verbindung proteotoxisch sein wird, kann oder kann nicht leicht von ihrer Struktur abgeleitet werden. Daher scheint es eher angebracht zu sein, chemische Auslöser besser funktionell als strukturell zu definieren. Für den Zweck dieser Erfindung ist ein Auslöser eine Verbindung, die geeignet ist, die Hsp-Expression auf eine subletale Konzentration zu erhöhen oder eine subletale physikalische Bedingung, die Hsp-Expression stimuliert. Es gibt viele Verfahren, herauszufinden, ob eine Verbindung/physikalische Bedingung ein Auslöser ist oder nicht. Zum Beispiel können Säugetierzellen parallel einer Reihe von subletalen Konzentrationen einer zu testenden Substanz in der Anwesenheit einer radiomarkierten Aminosäure ausgesetzt werden. Nach einem ausreichenden Expositionszeitraum werden die Zellen geerntet und lysiert, und die Zelllysate werden einer SDS-PAGE und Autoradiographie oder Fluorographie unterworfen. Ist die getestete Substanz ein chemischer Auslöser, wird sie die Syntheserate von Polypeptiden mit für Hsps typischen Molekulargewichten (z.B. 90, 70, 25-27 kDa) erhöhen. Bei einer strengeren Ausführungsform des gleichen Tests wird ein bestimmtes Hsp aus den Zellysaten mittels eines anti-Hsp-Antikörper immunopräzipitiert und die relative Syntheserate des Hsps wird durch SDS-PAGE und Autoradiographie oder Fluorographie des immunopräzipitierten Proteins abgeschätzt. Anti-Hsp-Antikörper sind kommerziell erhältlich, z.B. von StressGen Biotechnologies Corp. of Victoria, B.C.
  • Es ist zu beachten, dass nicht nur kleine Molekülverbindungen, wie z.B. die zuvor diskutierten, chemische Auslöser der Stressproteinantwort sind. Chemische Auslöser schließen auch größere Moleküle, wie z.B. Proteine oder Nukleinsäuren ein. Nicht-begrenzende Beispiele für solche chemische Auslöser sind funktionelle Gene, die für ein konstitutiv aktives HSF1 kodieren, sowie konstitutiv aktive HSF1-Proteine. Deren Abgabe an Zellen wird die Stressproteinexpression induzieren, die durch den zuvor beschriebenen Test nachgewiesen werden kann. Ebenso eingeschlossen sind Gene für einzelne Stressproteine, wie z.B. Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein und die Proteine, die durch diese Gene kodiert werden. Ihre Abgabe an Zellen wird teilweise die Stressproteinantwort reproduzieren, d.h. zu einem erhöhten Niveau eines bestimmten Stressproteins führen, das durch die oben genannten Verfahren nachgewiesen werden kann.
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhalten die topische Verabreichung einer Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfasst, auf der Kopfhaut eines Krebspatienten oder der Haut eines Säugetieres. Aufgrund dieser Art von Verabreichung bleibt die systemische Konzentration des chemischen Auslösers gering. Folg lich gibt es eine relativ geringe Gefahr systemischer oder Organ-spezifischer Toxizität, die durch einen chemischen Auslöser hervorgerufen wird. Daher scheint es, dass im wesentlichen jeder chemische Auslöser in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden kann. Allerdings werden am ehesten chemische Auslöser bevorzugt, die bereits getestet oder bei Menschen verwendet wurden, wie z.B. Zinnsalze, Zinksalze und Arsensalze oder chemische Auslöser, von denen geplant ist, dass sie beim Menschen getestet werden, wie z.B. ein Benzochinonansamycin. Ebenso bevorzugt sind chemische Auslöser mit gut bekannter chemischer Reaktivität, wie z.B. Diamid, sowie chemische Auslöser, von denen erwartet wird, hochspezifische Aktivatoren der Stressproteinantwort zu sein, wie z.B. eine aktivierte Form von HSF1, das als Nukleinsäure oder Protein abgegeben wird.
  • FORMULIERUNGEN, DIE EINEN CHEMISCHEN AUSLÖSER UMFASSEN, UND ABGABE
  • In Abhängigkeit von seinen chemischen Eigenschaften (z.B. Lipophilie, Molekulargröße) kann ein chemischer Auslöser in einem Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol, Propylenglycol oder Glycerol, topisch verabreicht werden. Schilli et al. 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 598-604. Tata et al. 1994. J. Pharm. Sci. 83: 1508-1510. Sredni et al. 1996. Int. J. Cancer 65: 97-103. Normalerweise wird ein chemischer Auslöser in einer Formulierung verabreicht, die auch einen oder mehrere Penetrationsverstärker (oder Promotoren) enthält. Dermale und intrafollikuläre Abgabe sind hochaktive Bereiche der akademischen und industriellen Forschung, und ein Fachmann wird entsprechende Verfahren zur Abgabe eines bestimmten chemischen Auslösers kennen. Der Ausdruck "Penetrationsverstärker (oder Promotor)" wird hier in seinem weitesten Sinn verwendet, um jedes physikalische Verfahren oder jede chemische Zusammensetzung einzuschließen, die die Permeabilität der Haut durch eine vorübergehende Kompromittierung der Unversehrtheit und der physikochemischen Eigenschaften der Haut erhöht oder die zu einem gezielten Targeting der Haarfollikel führt. Er bedeutet auch Abgabevehikel, wie z.B. Liposomen, einschließlich deformierbarer oder ultradeformierbarer Liposomen, sowie aktive elektrische Verfahren, wie z.B. Iontophoresis, Ultraschallvibration und Elektroporation. Der Ausdruck schließt auch die Herstellung lipophiler Derivate der abzugebenden Moleküle ein. Zum Beispiel wurde vor allem bei Makromolekülen Tapestripping verwendet, um die Permeabilität der Haut zu erhöhen. Yang et al. 1995. Br. J. Dermatol. 133: 679-685. Wiederholtes Bürsten der Haut erlaubte eine wirksame Abgabe von sogar nackter DNA in die äußeren Schichten der Epidermis und der Haarfollikel. Yu et al. 1999. J. Invest. Dermatol. 112: 370-375. Gut bekannte chemische Penetrationsverstärker sind Azon, DegammaE oder n-Decylmethylsulfoxid. Hoogstraate et al. 1991. Int. J. Pharm. 76: 37-47. Bodde et al. 1989. Biochem. Soc. Trans. 17: 943-845. Choi et al. 1990. Pharm. Res. 7: 1099-1106. Siehe auch Marjukka Subonen et al. 1999. J. Controlled Release 59: 149-161. Neue Beispiele chemischer Permeationsverstärker sind N-Acetylprolinatester, Polyethylenglycol-8-glycerylcaprylat/caprat, SEPA und Hydrogele, wie z.B. Deoxycholat-Hydrogele. Tenjarla et al. 1999. Int. J. Pharm. 192: 147-158. Tran. 1999. J. Surg. Res. 83: 136-140. Diani et al. 1995. Skin Pharmacol. 8: 221-228. Valenta et al. 1999. Int. J. Pharm. 185: 103-111. Lipophile Derivatisierungen abzugebender Moleküle waren z.B. im Fall von IFNalpha erfolgreich. Acylderivate (Kettenlänge 12-16) zeigten eine gesteigerte kutane und perkutane Absorption gegenüber nicht-derivatisierten Molekülen. Foldvari et al. 1999. Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 129-137. Iontophoresis ist ein Verfahren, das auf einer elektrischen Stimulation der Hautpermeabilität für weitestgehend ionisierte Moleküle basiert. Es wurde erfolgreich für die Abgabe von kleinen Molekülen sowie von kleinen Polypeptiden in die Haut verwendet. Guy. 1998. J. Pharm. Pharmacol. 50: 371-374. Eine der neuesten elektrischen Verfahren ist Elektroporation, die verwendet wurde, um hydrophile Verbindungen in die Haut abzugeben. Banga and Prausnitz. 1998. Trends Biotechnol. 16: 408-412. Verfahren zur Abgabe von Nukleinsäuren in Haarfollikel sind auch verfügbar. WO 00/24895 und WO 98/46208 .
  • Die Verwendung von Verkapselungstechnologien für die Abgabe in die Haut und besonders für die intrafollikuläre Abgabe von wirksamen Molekülen wurde ein bevorzugter Ansatz in den letzten Jahren. Eine Studie durch Fresta und Puglisi legt nahe, dass Stratum torneu-Lipidbasierende, unilamellare Liposomen geeignete Vorrichtungen für die dermale Abgabe von Wirkstoffen sein können. Fresta and Puglisi. 1996. J. Drug Target 4: 95-101. Von großem Interesse ist die neueste Entwicklung von ultradeformierbaren Liposomen, die verwendet worden sind, um eine Vielzahl von kleinen und großen Molekülen in die Haut abzugeben. Zum Beispiel wurden Vesikel, die Phosphatidylcholin enthalten, das mit Rand-(„Edge-")Aktivatoren, wie z.B. Sodiumcholat, Span 80 und Tween 80 gemischt wird, erfolgreich für die Abgabe des Hormons Ostradiol verwendet. El Maghraby et al. 2000. Int. J. Pharm. 196: 63-74. Cevc. 1996. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 257-388. Besonders relevant sind die Ergebnisse, dass kationische, lipidbasierende Formulierungen kleine und große Moleküle, einschließlich Oligonucleotide, in die Haarfollikel abgeben können. Diese Abgabe kann eine ausgezeichnete Spezifität aufweisen, da sie über die Verbindung der internen und externen Wurzelscheide stattfindet. Lieb et al. 1997. J. Pharm. Sci. 86: 1022-1029. Hoffman zeigte, dass Phosphatidylcholin-basierende Liposomen Farbstoffe, Melanine, Gene und Proteine selektiv in Haarfollikeln freisetzen. Hoffman. 1998. J. Drug Target 5: 67-74. Abgegebene Gene sind in dem Follikel aktiv und machen das Follikel zum Zielobjekt („Target") für selektive Gentherapie. Li and Hoffman. 1995. Nat. Med. 1: 705-706. Hoffman. 2000. Nat. Biotechnol. 18: 20-21.
  • DOSIERUNG UND VERABREICHUNG EINES CHEMISCHEN AUSLÖSERS
  • In der Anwendung der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser umfaßt, auf der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines nicht-humanen Säugetiers vor Aussetzen des Patienten oder des Säugetiers gegenüber einem cytotoxischen, chemotherapeutischen Mittel, angewendet. Um Haarfollikelzellen vor dem Abtöten durch das chemotherapeutische Mittel zu schützen, muß der chemische Auslöser eine Konzentration in den Haarfollikeln erreichen, die ausreichend hoch ist, die Stressproteinantwort in den Follikelzellen zu aktivieren, was zu einem objektiv messbaren Anstieg der Konzentration von wenigstens einem Stressprotein führt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein. Weiter bevorzugt sind die Niveaus von mehreren oder von all diesen Stressproteinen erhöht. Eine Zunahme von etwa 25% der Konzentration eines Stressproteins ist leicht durch Western-Blot-Analyse mittels eines Antikörpers gegen das Stressprotein nachweisbar. Während die Konzentrationsbereiche, die eine nachweisbare Stressproteinantwort in Säugetierzellkulturen verursachen, für viele chemische Auslöser bekannt sind (siehe z.B. Zou et al. 1998. Cell Stress & Chaperones 3: 130-141, das hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird) und die als ein anfänglicher Leitfaden für die Dosisfindungsstudien dienen können, werden die Konzentrationen, die in Zusammensetzungen für eine topische Verabreichung auf der Kopfhaut eines Patienten (oder Haut eines anderen Säugetiers) notwendig sind, vorzugsweise empirisch für jede Zusammensetzung bestimmt. Es wird klar sein, dass die Auslöserkonzentration, die in den Haarfollikeln erreicht wird, von den chemischen Eigenschaften des Auslösers und von der Wirksamkeit des gewählten Pentrationsverstärkers abhängig ist und für jeden chemischen Auslöser und Penetrationsverstärker durch den Fachmann, wie es hier weiter beschrieben wird, oder durch jedes andere im Stand der Technik bekannte Verfahren, bestimmt werden kann. Es können herkömmliche klinische Dosisfindungsstudien durchgeführt werden, um vorauszusagen, wie stark die Niveaus von Stressproteinen in Haarfollikeln für einen maximalen Schutz der Zellen vor verschiedenen chemotherapeutischen Arzneistoffen erhöht sein müssen. Der relevanteste zu messende klinische Parameter ist die Haardichte vor und nach Chemotherapie. Diese Messungen können quantitativ (Haarzählung in einem Hautbereich von definierter Größe) oder semiquantitativ (Abschätzen der Stufen an Alopezie) sein. Alternativ oder zusätzlich können Hautbiopsien genommen werden und auf Dichte und/oder Morphologie der Haarfollikel untersucht werden. Als ein unvollkommener Ersatz kann eine Endpunkt-(siehe oben)Aktivierung der Stressproteinantwort in Haarfollikelzellen vor Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneimittels in Kopfhautbiopsien durch immunocytochemische Verfahren (Hashizume et al. 1997. Int. J. Dermatol. 36: 578-592. Yu et al. 1999. J. Invest. Dermatol. 112: 370-375) oder durch Western Blot mittels eines Stressproteinantikörpers, abgeschätzt werden.
  • Der Zeitpunkt, an dem eine Auslöser-umfassende Zusammensetzung, relativ zu dem Zeitpunkt des Beginns eines Chemotherapie-Behandlungszyklus, auf der Kopfhaut eines Patienten (oder Haut eines anderen Säugetiers) am besten angewendet wird, kann ebenso empirisch gemäß herkömmlicher Protokolle bestimmt werden. Die Abgabekinetiken eines chemischen Auslösers in die Haarfollikel werden mit der Eigenschaft des gewählten Auslösers und Penetrationsverstärkers variieren. In Zellkultur führt ein Aussetzen gegenüber einer ausreichenden Konzentration eines chemischen Auslösers zu einer schnellen Aktivierung der Stressproteinantwort, und cytoprotektive Niveaus von Stressproteinen werden innerhalb von etwa 2 bis 12 Stunden erreicht. Da Haut eine signifikante Barriere für eine Abgabe von Molekülen darstellt, kann ein Erreichen von cytoprotektiven Niveaus von Stressproteinen in Haarfollikeln in Abhängigkeit von der Eigenschaft des gewählten chemischen Auslösers und Penetrationsverstärkers um bis zu 24 Stunden verzögert sein. Daher kann eine Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, zwischen etwa 2 und 36 Stunden vor Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels verabreicht werden. Vorzugsweise wird eine Zusammensetzung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, zwischen etwa 8 und 24 Stunden vor Chemotherapie verabreicht. Sobald cytoprotektive Niveaus von Stressproteinen in den Zellen der Haarfollikel erreicht werden, werden die Haarfollikel gegenüber chemotherapeutischen Mitteln eine erhöhte Resistenz für ungefähr 1 bis 2 Tage beibehalten. Mit diesem Leitfaden wird ein Fachmann befähigt, mit lediglich routinemäßigem Experimentieren eine geeignete Dosierung und ein geeignetes Verabreichungsschema einer bestimmten Zusammensetzung empirisch zu bestimmen, die einen chemischen Auslöser umfaßt, der einen wirksamen Schutz der Haarfollikel vor chemotherapeutischen Mitteln bereitstellt.
  • DOSIERUNG UND VERABREICHUNG EINES PHYSIKALISCHEN AUSLÖSERS
  • In einem anderen Aspekt der Anwendung der vorliegenden Erfindung wird die Kopfhaut eines Patienten oder die Haut eines nicht-humanen Säugetiers einem physikalischen Auslöser der Stressproteinantwort vor Aussetzen des Patienten oder des Säugetiers gegenüber einem cytotoxischen chemotherapeutischen Mittel ausgesetzt. Um Haarfollikelzellen vor dem Abtöten durch das chemotherapeutische Mittel zu schützen, muß die Dosis des verabreichten physikalischen Auslösers ausreichend hoch sein, die Stressproteinantwort in den Follikelzellen zu aktivieren, was zu einem objektiv meßbaren Anstieg der Konzentration von wenigstens einem Stressprotein führt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und P-Glycoprotein. Weiter bevorzugt sind die Niveaus von mehreren oder von all diesen Stressproteinen erhöht. Eine Zunahme von etwa 25% der Konzentration eines Stressproteins ist leicht durch Western-Blot-Analyse mittels eines Antikörpers gegen das Stressprotein nachweisbar. Ein bevorzugter physikalischer Auslöser ist Hitze. Hitze kann in einem Zielgewebe durch verschiedene Mittel, einschließlich durch direkten Kontakt mit einer erhitzten Oberfläche oder erhitzten Flüssigkeit, Ultraschall, Infrarotstrahlung oder Mikrowellen- oder Hochfrequenzstrahlung, abgegeben oder erzeugt werden. Bei der praktischen Anwendung der Erfindung beinhaltet ein bevorzugtes Mittel zur Abgabe von Hitze auf der Kopfhaut eines Patienten oder der Haut eines Säugetiers den direkten Kontakt mit einer erhitzten Flüssigkeit, wie z.B. Wasser. In einem nicht-begrenzenden Beispiel wird einem Patienten eine Vorrichtung bereitgestellt, die einer Duschkappe ähnelt und die die Kopfhaut des Patienten bedeckt. Die Kappe erstreckt sich leicht über die Haarlinie des Patienten hinaus und bildet direkt angrenzend an der Haarlinie eine wasserfeste Abdichtung mit der Haut. Das Innere der Kappe enthält ein entsprechendes Wasservolumen oder eine andere physiologische wäßrige Lösung, die mittels eines entsprechenden Einlasses oder Auslasses, Ventile, verbundener Röhren und einer Wasserpumpe in Verbindung mit einem Temperatur-kontrollierten Wasserbad steht. Der Bereich von Hitzedosen, der eine nachweisbare Stressproteinantwort in Säugetierzellkulturen auslöst, ist bekannt und kann als ein anfänglicher Leitfaden für Dosisfindungsstudien dienen. Der übliche Bereich erhöhter Temperaturen erstreckt sich von etwa 39°C bis etwa 45°C und die übliche Dauer der erhöhten Temperaturexposition ist zwischen etwa 2 Stunden und 15 Minuten. Die geeigneten auf der Kopfhaut eines Patienten (oder Haut eines anderen Säugetiers) angewendeten Hitzedosen werden vorzugsweise empirisch ermittelt. Es können herkömmliche klinische Dosisfindungsstudien durchgeführt werden, um vorauszusagen, wie stark die Niveaus von Stressproteinen in Haarfollikeln für einen maximalen Schutz der Zellen vor verschiedenen chemotherapeutischen Arzneistoffen erhöht sein müssen. Der relevanteste zu messende klinische Parameter ist die Haardichte vor und nach Chemotherapie. Diese Messungen können quantitativ (Haarzählung in einem Hautbereich von definierter Größe) oder semiquantitativ (Abschätzen der Stufen an Alopezie) sein. Alternativ oder zusätzlich können Hautbiopsien genommen werden und auf Dichte und/oder Morphologie der Haarfollikel untersucht werden. Als ein unvollkommener Ersatz kann eine Endpunkt-(siehe oben)Aktivierung der Stressproteinantwort in Haarfollikelzellen vor Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneimittels in Kopfhautbiopsien durch immunocytochemische Verfahren (Hashizume et al. 1997. Int. J. Dermatol. 36: 578-592. Yu et al. 1999. J. Invest. Dermatol. 112: 370-375) oder durch Western Blot mittels eines Stressproteinantikörpers abgeschätzt werden.
  • Der Zeitpunkt, an dem eine geeignete Hitzedosis, relativ zu dem Zeitpunkt des Beginns eines Chemotherapie-Behandlungszyklus, auf der Kopfhaut eines Patienten (oder Haut eines anderen Säugetiers) am besten angewendet wird, kann ebenso empirisch gemäß herkömmlicher Protokolle bestimmt werden. In Zellkulturen führt ein Aussetzen gegenüber einer entsprechenden Hitzedosis zu einer schnellen Aktivierung der Stressproteinantwort, und cytoprotektive Niveaus von Stressproteinen werden innerhalb mehrerer Stunden erreicht. Da Haut eine signifikante Barriere für die Abgabe von Hitze darstellen kann und der Hitzeexport über den Kreislauf den Erhitzungsprozeß verlangsamen kann, kann ein Erreichen von cytoprotektiven Niveaus von Stressproteinen in Haarfollikeln um mehrere Stunden verzögert sein. Daher kann eine geeignete Hitzedosis zwischen etwa 2 und 24 Stunden vor Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels verabreicht werden. Vorzugsweise wird die Hitzedosis zwischen etwa 6 und 12 Stunden vor Chemotherapie verabreicht. Die letzteren Zeitverzögerungen beziehen sich auf Beginn einer Chemotherapie-Behandlung nach Beginn von Erhitzen. Sobald cytoprotektive Niveaus von Stressproteinen in den Zellen der Haarfollikel erreicht werden, werden die Haarfollikel gegenüber chemotherapeutischen Mitteln eine erhöhte Resistenz für üblicherweise 1 bis 2 Tage beibehalten. Mit diesem Leitfaden wird ein Fachmann befähigt, mit lediglich routinemäßigem Experimentieren eine geeignete Hitzedosis und ein geeignetes Verabreichungsschema der Hitzedosis empirisch zu bestimmen, die einen wirksamen Schutz der Haarfollikel vor chemotherapeutischen Mitteln bereitstellt.
  • TIERMODELLE VON CHEMOTHERAPIE-INDUZIERTER ALOPEZIE
  • Obwohl nicht perfekte Ersatzmodelle für den menschlichen Patienten, können Alopezie-Tiermodelle verwendet werden, um Auslöser und Schutzverfahren zu evaluieren. Menschliches Haarwachstum scheint sich von dem vieler Tiere zu unterscheiden, da bei Menschen 90%, der Follikel in der Anagenphase sind, während bei erwachsenen Tieren, wie z.B. Nagetieren, dieser Prozentsatz drastisch geringer ist. Zwei Tiermodelle, die im Zusammenhang mit der Wachstumsphase an die Situation beim Menschen herankommen, sind neugeborene (8-Tage-alte) Ratten (Nussein et al. 1990. Science 249: 1564-1566) und C57/BL/6-Mäuse nach Enthaarung eines Teils der Körperbehaarung. Paus et al. 1990. Br. J. Dermatol. 122: 777-784. Paus et al. 1994. Am. J. Pathol. 144: 719-734. In dem ersten Modell wird der Vorteil der aktiven Haarwachstumsphase bei neugeborenen Ratten genutzt, und in dem zweiten Modell wird Nachwachsen der Haare durch Enthaarung synchronisiert. In dem Mausmodell werden ruhende (telogene) Haarfollikel in der enthaarten Haut von 6-bis 8-Wochen-alten weiblichen C57BL/6-Mäusen dazu induziert, aktives Haarwachstum (anagen) aufzunehmen. Dies wird durch Bestreichen des gesamten Rückens oder eines gewünschten Teils des Pelzes anästhesierter Tiere (30 mg/kg Pentobarbital) mit einer Wachs- und Harzmischung erreicht, wobei die Mischung nach Aushärtung abgezogen wird. Paus et al. 1990. Br. J. Dermatol. 122: 777-784. Schilli et al. 1998. J. Invest. Dermatol. 111: 598-604. Pharmakologische Zusammensetzungen werden üblicherweise etwa 5 Tage nach Enthaarung topisch verabreicht, wobei sich zu diesem Zeitpunkt alle Haarfollikel in der Anagenphase III-IV des Haarzyklus befinden. Daher wird eine Formulierung, die einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort enthält, oder eine Dosis eines physikalischen Auslösers, wie z.B. Hitze, zu dem späteren Zeitpunkt verabreicht. Die zwei Modelle wurden umfangreich in Alopeziestudien verwendet, wobei die Alopezie durch chemotherapeutische Mittel, einschließlich Adriamycin und Cyclophosphamid induziert wurde, verwendet. Balsari et al. 1994. FASER J. 8: 226-230. Schilli et al. 1998. J. Invest. Dermatol. 111: 598-604. Jimenez and Yunis. 1992. Cancer Res. 52: 413-415. Die Tiermodelle können verwendet werden: für Experimente zum grundsätzlichen Beweis der Theorie („proof-of-principle"), zur Evaluierung potentieller Penetrationsverstärker bezüglich deren Fähigkeit, die Abgabe eines chemischen Auslösers in die Haarfollikel zu verbessern, zum Abschätzen der lokalen Toxizität eines chemischen Auslösers, zur Demonstration, das eine lokale Abgabe eines chemischen Auslösers oder ein lokales Aussetzen gegenüber einem physikalischen Auslöser nicht zu einer erhöhten systemischen Konzentration des chemischen Auslösers und nicht zu einer allgemeinen Aktivierung der Stressproteinantwort durch den physikalischen oder chemischen Auslöser, etc., führt. Daher umfaßt die Erfindung auch Verfahren zum Identifizieren von Mitteln (d.h. chemischen Auslösern oder Kombinationen chemischer Auslöser und Penetrationsverstärkern) zur Verwendung zum Schutz eines Menschen oder Tieres vor Chemotherapie-induzierter Alopezie, umfassend (a) Verabreichen eines zu testenden Mittels einem Tiermodell für Chemotherapie-induzierter Alopezie und (b) Bestimmen, ob dieses Mittel geeignet ist, die Stressproteinantwort in dem Tiermodell zu induzieren. Ebenso umfaßt sind Verfahren zur Identifizierung von Mitteln für die Verwendung zum Schutz eines Menschen oder Tieres vor Chemotherapie-induzierter Alopezie, umfassend (a) Auswählen eines Mittels, das geeignet ist, die Stressproteinantwort zu induzieren und (b) Verabreichung dieses zu testenden Mittels in einem Tiermodell für Chemotherapieinduzierter Alopezie und Bestimmen, ob dieses Mittel vor Chemotherapie-induzierter Alopezie schützt.
  • Um die Erfindung weiter zu veranschaulichen, werden nicht-beschränkende Beispiele von Experimenten, die die oben erwähnten Tiermodelle für Alopezie verwenden, in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
  • Eine ausgewählte pharmakologische Behandlung oder physikalische Behandlung (z.B. Hitzebehandlung) muss zeigen, dass sie die Stressproteinantwort in einer Vielzahl relevanter Haarfollikelzellen induzieren kann. Ferner wird es für die Optimierung eines Behandlungsschemas wichtig sein, das relative Ausmaß und die Dauer der induzierten Stressproteinantwort in Haarfollikel beurteilen zu können. Für diese Zwecke wird ein immunohistochemischer Assay verwendet, der in Haarfollikelzellen und anderen Zellen der Haut die Niveaus der wichtigen stressinduzierbaren Form von Hsp70 abschätzt. Es gibt mindestens zwei stichhaltige Gründe für die Wahl des induzierbaren Hsp70 als einen bevorzugten Indikator für die Stressproteinantwort. Erstens, Hsp70 ist eines der am meisten vorkommenden Hsps, und es wurde gezeigt, dass es selbst cytoprotektiv ist. Liu et al. 1992. Cancer Res. 52: 3667-3672. Li et al. 1995. Exp. Cell Res. 217: 460-468. Zweitens, ist es aus einer großen Anzahl vorheriger Studien, die Zellinien und Tiergewebe verwendeten, offenkundig, dass eine Expression der wichtigen induzierbaren Form von Hsp70 bei Nagetieren streng geregelt ist. Welch et al. 1983. J. Bio. Chem. 258: 7102-7111. Bei Abwesenheit von Stress ist das Niveau in allen Zellinien und den meisten Geweben sehr gering bis nicht vorhanden. Für die Dauer von und im Anschluss an Stress akkumuliert das Protein schnell auf ein drastisch erhöhtes Niveau. Eine Studie durch Hashizume et al. (Hashizume et al. 1997. Int. J. Dermatol. 36, 587-592) untersuchte die Niveaus von induzierbarem Hsp70 in der C57/BL/6-Maus und fand heraus, dass die induzierbare Hsp70-Expression in den Anagen-Haarfollikeln gering ist. Nur während der Anagen- Katagen-Transformation stiegen die Niveaus von induzierbarem Hsp70 signifikant an. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch induzierbares Hsp70 in kultivierten Nagetierzellen und in frischen und fixierten Gewebeabschnitten nachweist, ist kommerziell erhältlich («C92», StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC (cat.#:SPA-810)).
  • Experimente zum Validieren des immunohistochemischen Assays verlangen, dass die Expression von Hsp70 induziert wird, da, wie zuvor diskutiert, dieses Protein normalerweise nicht oder nur auf einem sehr geringen Niveau vorhanden ist. Es können zwei verschiedene Verfahren zur Induktion des Hsp70 verwendet werden. Das erste beinhaltet ein Aussetzen der Tiere gegenüber einer Hyperthermie des gesamten Körpers (durch Eintauchen in ein Wasserbad). Während die optimale Temperatur und die Dauer der Hitzeexposition experimentell bestimmt werden müssen, stellen vorherige Zellkulturexperimente einen ausreichenden anfänglichen Leitfaden bereit, um wenigstens ohne zusätzliches Experimentieren ein Induktionsniveau von Hsp70 zu erreichen, das immunohistochemisch nachweisbar ist. Das zweite Verfahren basiert auf bisherigen Beobachtungen durch Li und Hoffman. Li and Hoffman. 1995. Nat. Med. 1: 705-706. Diese Forscher haben gefunden, dass Liposomen, die ein CMV-Promotorkontrolliertes β-Galactosidase-Gen enthalten, wirksam und selektiv das β-Galactosidase-Gen an mitotisch aktive Zellen (Matrixzellen und vermutliches Follikelstammzellen) der Maus-Anagen-Haarfollikel abgegeben haben, wo das Gen aktiv exprimiert wurde. Das gleiche Protokoll kann zum Einführen eines Expressionskonstruktes für ein aktiviertes humanes HSF1 (mutante HSF1d202-316, hier als HSF1(+) bezeichnet) in Follikelzellen verwendet werden. Es ist bekannt, dass HSF1(+) eine Expression von induzierbarem Hsp70 in verschiedenen Zelltypen stark erhöht. Xia et al. 1999. Cell Stress & Chaperones 4: 8-18.
  • Für Experimente zur Assay-Validierung werden neugeborene Ratten und erwachsende Mäuse nach Enthaarung eines Teils ihrer Körperbehaarung einer mittelschweren Gesamtkörperhyperthermie ausgesetzt. Alternativ oder zusätzlich werden Liposomen, die ein CMV-Promotorgetriebenes hsf1(+)-Gen oder als Kontrolle ein β-Galactosidase-Gen enthalten, auf Bereiche am Rücken neugeborener Ratten oder auf enthaarte Bereiche der erwachsenen Mäuse verabreicht. Nach einer angemessenen Zeit (6 bis 48 Stunden nach Hitzeexposition oder 1, 3 oder 5 Tage nach Transduktion) werden die behandelten und nicht-behandelten Tiere getötet, und Hautproben werden genommen. Diese Proben können mittels eines herkömmlichen immunohistochemischen Protokolls bearbeitet werden. Zur Bereitstellung eines Beispielprotokolls: die Hautproben können in O.T.C. (Miles) eingebettet und tiefgekühlt werden. Yu et al. 1999. J. Invest. Dermatol. 112: 370-375. Gefrorene Proben können mit einem Kryostat (5 μm) geschnitten und auf saubere, geladene Objektträger gesammelt werden. Im Anschluß an eine Lufttrocknung und Fixierung in Aceton können die Objektträger gewaschen, blockiert und einem Hsp70-Antiköper C92 ausgesetzt werden. Ein C92-Antikörper kann auf den Proben mit einem entsprechenden enzymmarkierten zweiten Antikörper nachgewiesen werden. Alternativ, und falls aufgrund eines hohen Hintergrunds notwendig, kann ein biotinylierter C92-Antikörper (kommerziell erhältlich) verwendet werden, um den Bedarf für einen zweiten Antikörper zu beseitigen.
  • Es wird angemerkt, dass eine spezifische Nukleinsäurehybridisierung als ein alternativer Assay für erhöhte hsp70-Genexpression bei dem unwahrscheinlichen Ereignis verwendet werden kann, dass sich eine Antikörperbindung als nicht erfolgreich erweist. Es wurden Ratten- und Maus hsp70-Gene kloniert (Perry et al. 1994. Gene 146: 273-278. Longo et al. 1993. J. Neurosci. 36: 325-335) und daher können Hybridisierungsproben leicht hergestellt werden.
  • Wie auch zuvor diskutiert wurde, wurde es über die letzten zehn Jahre offensichtlich, dass eine vorrangige und wirksame Abgabe von Arzneistoffsubstanzen mit kleinen Molekulargewichten sowie von großen Molekülen, wie z.B. Nukleinsäuren und Proteinen, an mitotisch aktiven Haarfollikelzellen durch eine topische Verabreichung lipidbasierender Formulierungen und Liposomen, die die aktive Substanz von Interesse enthalten, erreicht werden kann. Balsari et al. 1994. FASER J. 8: 226-230. Li and Hoffman. 1995. Nat. Med. 1: 705-706. Lieb et al. 1992. J. Invest. Dermatol. 99: 108-113. Lieb et al. 1997. J. Pharmaceutical Sciences 86: 1022-1029. Li et al. 1993. In Vitro Cell. Dev. Biol. 29A: 192-194. Li et al. 1993. In Vitro Cell. Dev. Biol. 29A: 258-260. Li and Hoffman. 1995. In Vitro Cell. Dev. Biol. 31A: 11-13. Hoffman. 1997. J. Drug. Targeting 5: 67-74. Foldvari et al. 1999. Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 129-137. Es wurde für Liposomen ferner gezeigt, dass es nur eine geringe Freisetzung der Arzneistoffsubstanz in den Kreislaufvorhanden ist. Balsari et al. 1994. FASER J. 8: 226-230. Li and Hoffman 1997. J. Derm. Sci. 14: 101-108. In den vorliegenden Beispielexperimenten werden liposomale Formulierungen verwendet, wie durch die Hoffman-Gruppe beschrieben (Hoffman. 1997. J. Drug Targeting 5: 67-74), um Arzneistoffsubstanzen (chemische Auslöser), die die Stressproteinantwort induzieren, an Haarfollikeln abzugeben. Die Liposomen nach Hoffman für kleine Moleküle und Proteine waren Phosphatidylcholin-basierend, und die Liposomen für Nukleinsäuren enthielten entweder Phosphatidylcholin alleine oder Phosphatidylcholin:Cholesterol:Phosphatidylethanolamin in einem 5:3:2-Verhältnis.
  • In den Beispielexperimenten werden zwei Arten von chemischen Auslösern der Stressproteinantwort (einzeln) getestet, die kleine Molekülverbindung Natriumarsenit und HSF1(+). HSF1(+) kann als eine Nukleinsäure, die HSF1(+) kodiert, oder als ein rekombinantes Protein abgegeben werden. Die Nukleinsäure kann ein Plasmidvektor sein, der ein hsf1(+)-Gen unter Kontrolle eines konstitutiv aktiven Cytomegalovirus(CMV)-Promotor enthält. In einer therapeutischen Situation wird es wünschenswert sein, dass die Stressproteinantwort nur vorübergehend induziert wird. Obwohl das plasmidgetragene hsf1(+)-Gen mit der Zeit inaktiviert wird, kann diese Inaktivierung als zu langsam betrachtet werden. Eine Alternative wäre, einen unterschiedlichen (eukaryotischen) Expressionsvektor zu verwenden, der eine regulierte Expression des hsf1(+)-Gens erlaubt. Genetische Schalter, die durch vermutlich ungefährliche Verbindungen mit kleinen Molekulargewichten aktiviert/unterdrückt werden (z.B. Tetracyclin, RU486, etc.), sind bekannt und leicht erhältlich. Gossen et al. 1996. Science 268: 1766-1769. Gossen and Bujard. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551. Wang et al. 1997. Nat. Biotechnol. 15: 239. Wang et al. 1997. Gene Therapy 4: 432-441. Der zuletzt genannte Punkt ist ohne Belang, wenn HSF1(+) als ein rekombinantes Protein abgegeben wurde. Wenn Wildtyp-humanes HSF1 und HSF1(+) aus ähnlichen Konstrukten in Säugetierzellen exprimiert wurden, akkumulierte das Wildtyp-HSF1 auf ein signifikant höheres Niveau als HSF1(+) (nicht-veröffentlichte Daten), was zur Annahme führt, dass das mutante Protein (d.h., HSF1(+)) wesentlich weniger stabil als das Wildtyp-Protein ist. Anschließende Experimente führte zu einer Schätzung der Halbwertszeit von HSF1(+) auf 6 bis 8 Stunden. Daher kann eine Einführung von rekombinantem HSF1(+) in Zellen nur eine vorübergehende Induktion der Stressproteinantwort auslösen. HSF1(+) kann z.B. als ein FLAG-markiertes Protein oder als eine Glutathiontransferasefusion in E. coli. erzeugt werden. Voellmy. 1996. In Stress-Inducible Cellular Responses, U. Feige, R. I. Morimoto, I. Yahara, and B. S. Polla, eds. (Basel: Birkhaeuser Verlag). Seiten 121-137. Guo, Y., Guettouche, T., Fenna, M., Boellmann, F., Pratt, W. B., Toft, D. O., Smith, D. F., and Voellmy, R. Nicht-veröffentliche Daten. FLAG-markiertes HSF1(+) und das Glutathiontransferasefusionsprotein können durch Affinitätschromatographie-Verfahren gereinigt werden. Der Glutathiontransferaserest kann während der Reinigung abgeschnitten werden, was HSF1(+) ergibt. Da es nicht die HSF1(+)-Funktion verhindert (nicht-veröffentlichte Daten), wird das Entfernen des Markers vom FLAG-markierten HSF1 als nicht notwendig erachtet. Es können im wesentlichen reine rekombinante Proteine erhalten werden. Es sei hiermit angemerkt, dass es aufgrund der relativen Instabilität von HSF1(+) vorteilhaft wäre, einen Herstellungs-Bakterienstamm zu verwenden, der eine geringe proteolytische Aktivität aufweist. Während HSF1(+) in bakteriellen Expressionssysteme exprimiert werden kann, kann es auch in eukaryotischen Expressionssystemen, einschließlich Baculovirus-infizierte Insektenzellen, exprimiert und aus diesem aufgereinigt werden.
  • Natriumarsenit wird in Wasser oder in phosphatgepufferter Saline bei oder in der Nähe maximaler Löslichkeit gelöst. HSF1(+)-Protein oder Nukleinsäure wird bei der höchsten praktischen Konzentration gelöst. Diese Lösungen und Verdünnungsreihen werden anschließend in Liposomen, wie durch Hoffman beschrieben, eingeführt. Hoffman. 1997. J. Drug Targeting 5: 67-74. Kontrollen schließen leere Liposomen bzw. Liposomen ein, die ein Protein oder eine Nukleinsäure enthalten, das/die nicht mit HSF1(+) verwandt ist. Diese liposomalen Zubereitungen werden auf Bereiche am Rücken, Seite oder Bauch von neugeborenen Ratten (8 Tage alt) oder auf enthaarten Bereichen erwachsener Mäusen (5 Tage nach Enthaarung) verabreicht. Die Verabreichung kann einmal oder mehrmals mit entsprechenden Intervallen (z.B. täglich) sein. Zu bestimmten Zeiten (12 Stunden, 1 bis 10 Tage) nach der letzten Verabreichung werden die Tiere getötet. Es werden Hautproben genommen, und Schnitte werden präpariert und sowohl durch den zuvor beschriebenen immunohistochemischen Assay als auch mikroskopisch analysiert, um Dichte und Morphologie der Haarfollikel zu beurteilen.
  • Diese Experimente können mehrere Fragen beantworten. Für jeden chemischen Auslöser können Abschätzungen über die minimalen und am besten geeigneten Konzentrationen zum Induzieren der Stressproteinantwort sowie der maximalen Konzentration erhalten werden, bei der der Auslöser verabreicht werden kann, ohne Schaden bei Haarfollikeln zu verursachen (nur für Natriumarsenit relevant). In Bezug auf die letzte Information soll der Leser daran erinnert werden, dass die Stressproteinantwort als Antwort auf einen geringen proteotoxischen Stress induziert wird. Daher werden übermäßige Konzentrationen eines chemischen Auslösers, wie z.B. Natriumarsenit, eine signifikante Cytotoxizität aufweisen und Haarfollikelzellen abtöten. Aus diesem Grund ist es entscheidend, Konzentrationsbereiche zu bestimmen, bei denen der chemische Auslöser die Hsp-Überexpression auslöst, ohne einen irreversiblen Schaden zu verursachen. Eine übermäßige Konzentration eines Auslösers kann durch eine verminderte Stressproteinantwort im Vergleich zu der, die bei einer geringeren Konzentration induziert wird, als auch durch Veränderungen der Morphologie und Dichte von Haarfollikeln nachgewiesen werden.
  • Zweitens können die Experimente zeigen, ob die liposomalen Zubereitungen alle oder fast alle Haarfollikelmatrixzellen (und putativen Follikelstammzellen) gezielt erreichen. Falls gefunden wird, dass Auslöser-enthaltende Liposomen, die gemäß der durch Hoffman bereitgestellten Anweisungen hergestellt werden (Hoffman. 1997. J. Drug Targeting 5: 67-74), nur einen kleinen Bruchteil an mitotisch aktiver Matrix und putativen Stammzellen gezielt erreichen, können analoge Experimente zu den oben beschriebenen durchgeführt werden, um Liposomen bezüglich verschiedener Zusammensetzungen oder anderer Penetrationsverstärker zu testen.
  • Drittens bestimmen die Experimente für jeden Auslöser den Zeitablauf einer Aktivierung der Stressproteinantwort sowie deren Fortdauer. Diese Information ist für das Design wirksamer Alopezie-Verhinderungsschemata bei den Tiermodellen notwendig. Ein optimaler Schutz wird sich nur ergeben, wenn chemotherapeutische Arzneistoffe verabreicht werden, nachdem eine Aktivierung der Stressproteinantwort aufgetreten ist und die Hsp-Konzentrationen zu adäquat erhöhten Niveaus angestiegen sind. Es ist zu beachten, dass die aus den obigen Experimenten erhaltenen Daten nur eine minimale Verzögerung zwischen Vorbehandlung mit einem Auslöser und Behandlung mit einem chemotherapeutischen Arzneimittel bestimmen, d.h. sie werden nur anfängliche Bedingungen für die unten beschriebenen Experimente bereitstellen. Es werden die letzteren Experimente sein, die das Niveau von induzierbarem Hsp70 bestimmen, das mit einem optimalen Schutz vor Alopezie korreliert, die durch ein chemotherapeutisches Mittel induziert wird. Die Daten über die Fortdauer der Stressproteinantwort erlauben ein Abschätzen, ob eine einmalige Induktion der Antwort wahrscheinlich Schutz für den gesamten Zeitraum bereitstellt, für dessen Dauer von einem chemotherapeutischen Mittel erwartet wird, in einer wirksamen Konzentration vorhanden zu sein. Zusätzlich stellen sie Informationen bereit, ob induzierte Niveaus von Hsps für eine ausreichend lange Zeit fortdauern, um bei Tieren potentiell schützend zu sein, die Behandlungsschemata unterworfen werden, die eine mehrfache Verabreichung eines chemotherapeutischen Arzneistoffes beinhalten. Letztendlich sagen sie aus, ob eine sequentielle Verabreichung mehrerer Dosen an Auslöser-enthaltenden Liposomen wirksam den Zeitraum verlängert, für dessen Dauer die Konzentrationen von Hsps erhöht sind.
  • Viertens können die Experimente auch aufzeigen, ob eine wiederholte Verabreichung von Auslöser-enthaltenden Liposomen zusätzlich zum Verlängern der Dauer der Stressprotein antwort, eine stärkere Antwort und/oder einen Anstieg des Bruchteils der Matrix und mutmaßlichen Stammzellen der Haarfollikel erzeugen, die eine Stressproteinantwort erzeugen.
  • MODELLEXPERIMENTE ZUM ETABLIEREN VON BEDINGUNGEN ZUM OPTIMALEN SCHUTZ VON HAARFOLLIKELN VOR AUSGEWÄHLTEN THERAPEUTISCHEN MITTELN
  • Die nachfolgenden Experimente können die Bedingungen ermitteln, die zum optimalen Schutz der Haarfollikel vor verschiedenen chemotherapeutischen Mittel in den Tiermodellen führen. Obwohl chemotherapeutische Mittel häufig in Kombinationen verwendet werden, werden die Tiere in diesen Experimenten nur einem einzelnen Arzneistoff ausgesetzt. Da Fragen mit Bezug auf den jeweiligen Einfluß eines einzelnen Arzneistoffes in einer bestimmten Kombination vermieden werden, erlaubt diese Vereinfachung eine schlüssige Darstellung, dass Induktion der Stressproteinantwort vor Haarfollikeltoxizität eines bestimmten Arzneistoffes schützt. Die unten beschriebenen Experimente konzentrieren sich auf mehrere Arzneistoffsubstanzen, die schwere Alopezie bei Menschen hervorrufen und die in vielen der herkömmlich verwendeten therapeutischen Kombinationen vorhanden sind. Ausgewählte chemotherapeutische Arzneimittel sind Cyclophosphamid, Adriamycin, Taxol, Etoposid und Vincristin.
  • Mit Anfangsexperimenten werden Bedingungen etabliert, bei denen einzelne intraperitoneale Injektionen der verschiedenen ausgewählten chemotherapeutischen Arzneimittel schwere Alopezie auslösen (Stufe 3, die durch im wesentlichen völliges Fehlen von Haarwachstum/Nachwachsen bei den meisten Tieren gekennzeichnet ist; siehe unten). Vorherige Studien können einen nützlichen Leitfaden bereitstellen. Zum Beispiel wurde die Induktion von Alopezie bei neugeborenen Ratten durch Adriamycin und Cyclophosphamid von Nussein et al. (Nussein et al. 1990. Science 249: 1564-1566), Jimenez and Yunis (Jimenes and Yunis. 1992. Cancer Res. 52: 5123-5125), Balsari et al. (Balsari et al. 1994. FASER J. 8: 226-230) und Jimenez et al. (Jimenez et al. 1995. Am. J. Med. Sci. 310: 43-47), und durch Etoposid von Davis et al. (Davis et al. 2001, Science 291: 134-137) beschrieben. Alopezie im C57/BL/6-Mausmodell, die durch Aussetzen gegenüber Cyclophosphamid herrührt, wurde von Paus und Mitarbeitern untersucht. Paus et al. 1994. Am. J. Pathol. 144: 719-734. Schilli et al. 1998. J. Invest. Dermatol. 111: 598-604. Andere Forscher beschrieben Alopezie in Mäusen im Anschluß einer Verabreichung von Adriamycin. Malkinson et al. 1993. J. Invest. Dermatol. 101: 1358-1375. D'Agostini et al. 1998. Int. J. Oncol. 13: 217-224. Um Ergebnisse zu erhalten, die statistisch aussagekräftig sind, werden Gruppen, die aus mindestens 10 Tieren für jeden Datenpunkt bestehen, in diesen und in den nachfolgenden Experimenten verwendet. Der primäre Assay für Alopezie ist eine makroskopische Auswertung, die durch zwei Beobachter unabhängig voneinander durchgeführt wird. Es werden vier Stufen unterschieden: 0. Stufe: keine Alopezie, 1. Stufe: milde Alopezie, die mit weniger als 50% Haarausfall definiert wird, 2. Stufe: mittelschwere Alopezie, die mit mehr als 50% Haarausfall definiert wird, und 3. Stufe mit vollständiger oder praktisch vollständiger (> 90%) Alopezie. Nussein et al. 1990. Science 249: 1564-1566. Sredni et al. 1996. Int. J. Cancer 65: 97-103. Eine Bestätigung dieser Befunde kann aus mikroskopischer Untersuchung von Hautabschnitten erhalten werden, wobei die Untersuchung Dichte und Morphologie von Haarfollikel beurteilt. Es ist zu beachten, dass wenigstens für das Mausmodell eine erhöhte Pigmentierung und Hautdicke bekanntermaßen mit der Anagenentwicklung korreliert (erklärt in Paus et al. 1990. Br. J. Dermatol. 122: 777-784). Sollte daher die Notwendigkeit entstehen, kann die Beurteilung der Hautpigmentierung und Dicke als Ersatzassay für Haarwachstum dienen. Diese Anfangsexperimente bestimmen für jedes chemotherapeutische Mittel die optimale Konzentration, bei der nahezu vollständige Alopezie ausgelöst wird, den Bereich am Körper des Tieres, an dem der Alopezie-Phänotyp am leichtesten beobachtet wird (Experimente werden mit Mäusen durchgeführt, die dorsal, lateral und ventral enthaart sind.), die Zeit nach Verabreichung, bei der Expression des Phänotyps am leichtesten bestimmt wird, sowie die Reproduzierbarkeit der Expression des Phänotyps. Man beachte, dass, um experimentelle Protokolle so einfach wie möglich zu halten, die Einzelverabreichung eines chemotherapeutischen Mittels am meisten bevorzugt wird.
  • Um die schützenden Wirkungen einer aktivierten Stressproteinantwort vor Alopezie, die durch ein chemotherapeutisches Mittel induziert wird, zu beurteilen und zu optimieren, werden Gruppen mit mindestens zehn 8-Tage-alten Ratten oder C57/BL/6-Mäusen, 5 Tage nach Enthaarung topisch (ein oder mehrmals, wie angezeigt) mit liposomalen Zubereitungen, die einen gewählten Auslöser (hier Natriumarsenit und HSF1(+)) der Stressproteinantwort enthalten, behandelt. Es werden drei unterschiedliche Zubereitungen getestet, wobei die erste einen Auslöser mit der geringsten Konzentration enthält, bei der ein meßbarer Anstieg des Niveaus an induzierbarem Hsp70 nach 12 oder 24 Stunden ausgelöst wird (wie in den zuvor beschriebenen Experimenten abgeschätzt) und die zweite und dritte sukzessiv höhere Konzentrationen enthalten. Die Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels erfolgt entweder 12 oder 24 Stunden nach der (letzten) Verabreichung Auslöser-enthaltender Liposomen oder etwa 12 Stunden oder 24 Stunden später. Eine vorbestimmte Menge eines chemotherapeutischen Mittels (wie in den vorherigen Absätzen bestimmt) wird intraperitoneal in alle Auslöser-behandelten Tieren und einer Gruppe von schein-behandelten Tieren induziert (mit leeren Liposomen bei Experimenten, die Natriumarsenit verwenden, oder mit Liposomen, die ein Kontrollprotein oder Nukleinsäure enthalten, bei Experimenten, die HSF1(+)-Protein oder Gen verwenden). Zusätzliche Auslöser- und schein-behandelte Gruppen werden nur mit Vehikeln gespritzt. Um die schützenden Wirkungen einer aktivierten Stressproteinantwort vor Alopezie, die durch den physikalisch Auslöser Hitze induziert wird, zu beurteilen und zu optimieren, werden Gruppen mit mindestens zehn 8-Tage-alten Ratten oder C57/BL/6-Mäusen, 5 Tage nach Enthaarung, topisch behandelt (ein oder mehrmals, wie angezeigt) und den lokalen Hitzebehandlungen unterschiedlicher Intensitäten unterworfen (Hitzeexposition von 39 bis 45°C für 15 bis 120 Minuten) oder unbehandelt gelassen. Die lokale Hitzebehandlung kann durch mehrere unterschiedliche Verfahren verabreicht werden. Ein einfaches Verfahren beinhaltet das Plazieren eines anästhesierten Tieres auf einem eingedrückten Metallsieb, das auf einem Wasserbad in einer Art fixiert ist, dass der eingedrückte Teil des Siebs und als Folge davon der Teil der Körpers des Tieres, das sich auf dem eingedrückten Teil befindet, in Wasser eingetaucht wird. Die Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels kann entweder 12 oder 24 Stunden nach der (letzten) Verabreichung einer Hitzedosis erfolgen. Eine vorbestimmte Menge eines chemotherapeutischen Mittels (wie in den vorherigen Absätzen bestimmt) wird allen Tiergruppen intraperitoneal injiziert.
  • Die Tiere werden anschließend in ihre Quartiere zurückgegeben, und zu einem Zeitpunkt, der zuvor als optimal für die Beurteilung des Alopeziephänotyps bestimmt wurde, werden die Stufen von Alopezie in allen Tieren aufgenommen. Die Tiere werden anschließend getötet, und Hautproben werden genommen, fixiert und geteilt. Die Schnitte werden mikroskopisch auf Haarfollikeldichte und -morphologie untersucht. Um die Stressproteininduktion zu bestätigen, können mehrere zusätzliche Tiere in jede Gruppe aufgenommen werden. Diese Tiere werden zu dem Zeitpunkt der Verabreichung des chemotherapeutischen Mittels getötet, und es werden Hautproben genommen und für eine immunohistochemische Abschätzung des Niveaus von induzierbarem Hsp70, d.h des Grades an Induktion der erhaltenen Stressproteinantwort verarbeitet.
  • Für Experimente, in denen Alopezie ausgewertet wird, werden einzelne Tiere einer Alopezie-Bewertung, die von 0 bis 3 (siehe oben) reicht, zugeordnet. Die Alopeziewerte für jede Behandlungsgruppe werden durch Berechnen der mittleren und Standardabweichung der Alopeziewerte einzelner Tiere zusammengefaßt. Behandlungsgruppen werden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. Falls Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen durch ANOVA nachgewiesen werden, kann ein Post-Hoc-Test (d.h., ein Scheffe Test oder Student-Newman-Keuls-Test) verwendet werden, um zu bestimmen, welche Gruppen sich voneinander unterscheiden. Das Kriterium für eine statistische Signifikanz ist ein p-Wert von < 0,05.
  • Zum Vermeiden einer möglichen systemischen/organischen Toxizität chemischer Auslöser sowie einer Beeinträchtigung der therapeutischen Wirksamkeit chemotherapeutischer Mittel, die sich ergeben würde, falls die Stressproteinantwort auch in den zu behandelnden Tumorzellen induziert werden würde, verwendeten die oben beschriebenen Experimente topisch verabreichte liposomale Formulierungen, um chemische Auslöser der Stressproteinantwort speziell an die relevanten Haarfollikelzellen abzugeben. Aufgrund dieser topischen Abgabe sollten nur die letzteren Zellen, nicht aber andere Zellen, einschließlich der durch die Chemotherapie-Behandlung bezielten Tumorzellen, vor einer Toxizität der chemotherapeutischen Mittel geschützt werden. Basierend auf den vorherigen und oben zitierten Berichten kann erwartet werden, daß die topische Verabreichung von liposomalen Formulierungen chemischer Auslöser, zu der gewünschten stark lokalisierten Abgabe des Auslösers führt. Auch wenn kleine Mengen eines chemischen Auslösers, wie z.B. Natriumarsenit, im Kreislauf enden können, wird seine Konzentration aufgrund der Verdünnung minimal sein und, da sie weit unter der notwendigen Schwellenwertkonzentration liegt, wird sie nicht die Stressproteinantwort systemisch aktivieren können. In ähnlicher Weise wird erwartet, daß die systemische Konzentration von HSF1(+) äußerst gering sein wird, und eine Aktivierung der Stressproteinantwort in Blutzellen und Organen sollte höchstens in ein paar vereinzelten Zellen vorkommen. Es ist zu beachten, dass sich die obige Diskussion nicht auf Behandlungsansätze bezieht, in denen eine therapeutische Stressproteinantwort durch lokalisierte Hitzebehandlung induziert wird.
  • In einem Experiment, das auf die Ermittlung abzielt, dass topisch verabreichte chemische Auslöser nicht in dem Kreislauf und den Hauptorganen auf Niveaus akkumulieren, die für die Induktion der Stressproteinantwort ausreichend sind, wird den Tieren eine liposomale Formu lierung, die einen chemischen Auslöser (Natriumarsenit oder eine Form von HSF1(+)) enthält, in einer Menge und unter Bedingungen verabreicht, von der/von denen aus den vorherigen Experimenten bekannt ist, wirksam beim Verhindern von Alopezie zu sein, die durch chemotherapeutische Arzneistoffe hervorgerufen wird, und nach einer entsprechenden Verzögerung wird ein chemotherapeutisches Arzneimittel injiziert. Kontrollen sind Tiere, die ähnlich, aber mit leeren Liposomen bzw. Liposomen, die ein Kontrollprotein bzw. – Nukleinsäure enthalten, behandelt werden. Um die Beiträge des chemotherapeutischen Mittels und der Lipidbestandteile der Liposomen zur Induktion der Stressproteinantwort abzuschätzen, können weitere Kontrollen Tiere umfassen, die kein chemotherapeutisches Mittel erhalten haben (Vehikel-injiziert) oder die nicht mit chemischen Auslöser-enthaltenden Liposomen oder Kontroll-Liposomen vorbehandelt wurden. Zu verschiedenen Zeiten vor und im Anschluss an den Verabreichungszeitpunkt eines chemotherapeutischen Arzneimittels werden die Tiere getötet und seziert. Extrakte von PBL, Herz, Lunge, Hirn, Leber und Niere werden mittels üblichen Methoden präpariert und durch Western Blot mit Antikörpern gegen induzierbares Hsp70 (C92) analysiert. Die Niveaus von induzierbarem Hsp70 werden verglichen. Wie oben diskutiert, wird stark erwartet, dass dieses Experiment zeigt, dass eine Induktion der Stressantwort in den Haarfollikelzellen lokalisiert ist.

Claims (24)

  1. Kosmetisches Verfahren zur Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie in einem menschlichen Patienten oder Säugetier, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres befindet, unterzogen werden soll, wobei das Verfahren umfaßt: Anwendung einer Zusammensetzung auf der Kopfhaut des Patienten oder Haut des Säugetiers, wobei die Zusammensetzung einen chemischen Auslöser der Stressproteinantwort beinhaltet, wobei die Zusammensetzung in einer ausreichenden Menge und rechtzeitig vor der Verabreichung eines chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird, um eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel in der Kopfhaut oder Haut gegen das Medikament zum Zeitpunkt der Verabreichung des Medikaments zu bewirken.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge und zeitliche Abstimmung der Anwendung der Zusammensetzung zum Zeitpunkt der Verabreichung des Medikaments außerdem eine detektierbare Konzentrationszunahme mindestens eines Stressproteins aus der Gruppe der Hsps, einschließlich Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und des P-Glycoproteins in den Haarfollikeln bewirkt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentrationszunahme des Stressproteins mindestens ca. 25% beträgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der chemische Auslöser der Stressproteinantwort aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Diamid, einem Benzochinonansamycin, einem Arsensalz, einem Zinnsalz, einem Zinksalz und einem aktivierten HSF1 in Nukleinsäure- oder Proteinform.
  5. Vefahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zusammensetzung außerdem einen Penetrationsverstärker beinhaltet.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zusammensetzung, die den chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, zwischen 2 und 36 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung, die den chemischen Auslöser der Stressproteinantwort umfaßt, zwischen 8 und 24 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  8. Kosmetisches Verfahren zur Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie in einem menschlichen Patienten oder Säugetier, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder der Haut des Tieres befindet, unterzogen werden soll, wobei das Verfahren umfaßt: Anwendung einer Hitzedosis auf der Kopfhaut des Patienten oder Haut des Säugetiers, wobei die Hitzedosis in einer ausreichenden Menge und rechtzeitig vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird, um eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel in der Kopfhaut oder Haut gegen das Medikament zum Zeitpunkt der Verabreichung des Medikaments zu bewirken.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Menge und zeitliche Abstimmung der Anwendung der Hitzedosis zum Zeitpunkt der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments außerdem eine nachweisbare Konzentrationszunahme mindestens eines Stressproteins aus der Gruppe der Hsps, einschließlich Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und des P-Glycoproteins in den Haarfollikeln bewirkt.
  10. Vefahren nach Anspruch 9, wobei die Konzentrationszunahme des Stressproteins mindestens ungefähr 25% beträgt.
  11. Vefahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei es sich bei der Hitzedosis um eine Dosis handelt, die die Haarfollikelzellen für ungefähr 15 Minuten bis 2 Stunden einer Temperatur zwischen ungefähr 39 und 45°C aussetzt.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Hitzedosis zwischen 2 und 24 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Hitzedosis zwischen 6 und 12 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Hitzedosis mit einem der folgenden Mittel angewendet wird, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus direktem Kontakt mit einer erhitzen Oberfläche oder Flüssigkeit, Infrarotstrahlung, Mikrowellenstrahlung, Ultraschall und Hochfrequenzstrahlung.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie, wobei die Zusammensetzung chemischen Auslöser der Stressproteinantwort, einen Penetrationsverstärker und ein Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel umfaßt.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der chemische Auslöser ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diamid, einem Benzochinonansamycin, einem Arsensalz, einem Zinnsalz, einem Zinksalz und einem aktivierten HSF1 in Nukleinsäure oder Proteinform.
  17. Verwendung eines chemischen Auslösers der Stressproteinantwort zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Milderung von Chemotherapie-induzierter Alopezie in einem menschlichen Patienten oder Säugetier, das einer Chemotherapie-Behandlung eines Tumors, der sich nicht in der Kopfhaut des Patienten oder Haut des Tieres befindet, unterzogen werden soll.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Medikament zur Anwendung in einer ausreichenden Menge und rechtzeitig vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments dient, um eine erhöhte Resistenz der Haarfollikel gegen das Medikament zum Zeitpunkt der Verabreichung des Medikaments zu bewirken.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Menge und zeitliche Abstimmung der Anwendung der Zusammensetzung zum Zeitpunkt der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments außerdem eine nachweisbare Konzentrationszunahme mindestens eines Stressproteins aus der Gruppe der Hsps, einschließlich Hsp90, Hsp70, Hsp25-27 und des P-Glycoproteins in den Haarfollikeln bewirkt.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Konzentrationszunahme des Stressproteins mindestens ungefähr 25% beträgt.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei das Medikament außerdem einen Penetrationsverstärker beinhaltet.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das Medikament zwischen 2 und 36 Stunden vor der Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Medikament zwischen 8 und 24 Stunden vor Verabreichung des chemotherapeutischen Medikaments angewendet wird.
  24. Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei der chemische Auslöser der Stressproteinantwort ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Diamid, einem Benzochinonansamycin, einem Arsensalz, einem Zinnsalz, einem Zinksalz und einem aktivierten HSF1 in Nukleinsäure- oder Proteinform.
DE60129606T 2001-09-03 2001-09-03 Mittel und verfahren zur vorbeugung von durch chemotherapie ausgelöster alopezie Expired - Lifetime DE60129606T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2001/001607 WO2003020227A1 (en) 2001-09-03 2001-09-03 Compositions and methods relating to prevention of chemotherapy-induced alopecia

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60129606D1 DE60129606D1 (de) 2007-09-06
DE60129606T2 true DE60129606T2 (de) 2008-05-21

Family

ID=11004163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60129606T Expired - Lifetime DE60129606T2 (de) 2001-09-03 2001-09-03 Mittel und verfahren zur vorbeugung von durch chemotherapie ausgelöster alopezie

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1427383B1 (de)
JP (1) JP2005504063A (de)
AT (1) ATE367806T1 (de)
AU (1) AU2001282400B2 (de)
DE (1) DE60129606T2 (de)
ES (1) ES2291339T3 (de)
WO (1) WO2003020227A1 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9101463B2 (en) * 2007-02-15 2015-08-11 Dignitana Ab Head cooler
WO2012028730A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Thermather Sarl Device for thermal treatment of the scalp
JP5578997B2 (ja) * 2010-09-16 2014-08-27 国立大学法人 大分大学 がん化学療法誘発脱毛に対する抗脱毛用組成物
JP6458731B2 (ja) * 2013-09-04 2019-01-30 大正製薬株式会社 男性型脱毛症評価モデル
GB201317609D0 (en) 2013-10-04 2013-11-20 Cancer Rec Tech Ltd Inhibitor compounds
GB201505658D0 (en) 2015-04-01 2015-05-13 Cancer Rec Tech Ltd Inhibitor compounds
GB201617103D0 (en) 2016-10-07 2016-11-23 Cancer Research Technology Limited Compound
JP2019040648A (ja) * 2017-08-23 2019-03-14 株式会社東芝 磁気ディスク装置及びライト方法
WO2021043673A1 (en) * 2019-09-02 2021-03-11 Syddansk Universitet P-gp inducers as protectors against chemotherapy-induced side effects, such as peripheral neuropathy (cipn) and hair loss

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3724259A1 (de) * 1987-07-22 1989-02-02 Friedrich Bruenen Mittel zur bekaempfung von haarausfall, insbesondere von androgenetischem haarausfall
US5486509A (en) * 1991-06-28 1996-01-23 University Of Miami Method of preventing and treating chemotherapy-induced alopecia
EP0656201A1 (de) * 1993-11-09 1995-06-07 Transcend Therapeutics, Inc. Verwendung von glutathionsynthesefordernden Substanzen als Haarwuchsmittel
AU1861495A (en) * 1994-03-03 1995-09-18 Procyte Corporation Preventive and remedy for secondary depilation
US5955111A (en) * 1996-10-08 1999-09-21 Hartford Hospital Methods and compositions for inducing production of stress proteins
US5830177A (en) * 1996-11-22 1998-11-03 Anticancer, Inc. Skin vibration method for topical targeted delivery of beneficial agents into hair follicles
EP1007664B1 (de) * 1997-01-21 2009-07-15 Voellmy, Richard Verwendung des mutierten hitzeschock-transkriptionfaktors
WO1998046208A1 (en) * 1997-04-17 1998-10-22 The Regents Of The University Of Michigan Hair follicle dna delivery system
US7405080B2 (en) * 2000-03-23 2008-07-29 Voellmy Richard W Compositions and methods relating to prevention of chemotherapy-induced alopecia

Also Published As

Publication number Publication date
DE60129606D1 (de) 2007-09-06
EP1427383B1 (de) 2007-07-25
ATE367806T1 (de) 2007-08-15
EP1427383A1 (de) 2004-06-16
WO2003020227A1 (en) 2003-03-13
AU2001282400B2 (en) 2009-04-23
JP2005504063A (ja) 2005-02-10
ES2291339T3 (es) 2008-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8257686B2 (en) Compositions and methods relating to prevention of chemotherapy-induced alopecia
DE10262193B4 (de) Kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3, Verwendung eines solchen Wirkstoffs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen solchen Wirkstoff enthält und Verwendung eines solchen Wirkstoffs auf dem Gebiet der Geweberekonstruktion
US8461136B2 (en) Compositions and methods for protecting cells during cancer chemotherapy and radiotherapy
DE69909794T2 (de) Verwendung eines dipeptids für wiederherstellungsprozesse
Yazihan et al. Erythropoietin improves oxidative stress following spinal cord trauma in rats
CN101820765A (zh) 包含雄激素受体降解(ard)增强剂的组合物和预防性或治疗性治疗皮肤病与脱发的方法
DE60129606T2 (de) Mittel und verfahren zur vorbeugung von durch chemotherapie ausgelöster alopezie
EP1176200A2 (de) Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
AU2001282400A1 (en) Compositions and methods relating to prevention of chemotherapy-induced alopecia
DE10024383B4 (de) Mit toxischen Substanzen beladene dendritische Zellen
DE60002979T2 (de) Vorbehandlung gegen zelltot
EP2200585B1 (de) Verwendung von deuteriumoxid zur behandlung von virus-basierten erkrankungen der haut
US20210213137A1 (en) Compositions to treat ultraviolet (uv)-induced skin injury
US20190083455A1 (en) Methods and compositions for the modulation of beta-endorphin levels
Tsai Safety of intravitreally administered recombinant erythropoietin (an AOS thesis)
EP1372786B1 (de) Zytoprotektion durch phosphotyrosin
Goncharov et al. The Protective Effect of a Chimeric PSH Antioxidant Enzyme in Renal Ischemia–Reperfusion Injury
CN114796113A (zh) 一种艾纳香油纳米乳剂在制备抗肿瘤药物及创伤修复药物中的应用
DE10122206A1 (de) Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende NukleInsäuren einer 2&#39;-5&#39;- Oligoadenylate Synthetase und/oder RNAseL zur Diagnose, Prävention oder Behandlung von Hauterkrankungen oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Identifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
Sibarov et al. Effects of intranasal administration of epitalon on neuron activity in the rat neocortex
DE102005011111A1 (de) Pharmazeutischer Wirkstoff zur Beladung dendritischer Zellen und dessen Lösungsmittel
JP2019508411A (ja) 構成型一酸化窒素合成酵素（ｃＮＯＳ）を標的とすることによる、ＵＶＢ照射傷害を阻害するための組成物及び方法
Petty et al. Targeting Brain Trauma and Stroke
DE19934458A1 (de) Mittel zur Behandlung von Pigmentierungsstörungen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition