DE10262193B4 - Kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs zur Stimulierung der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3, Verwendung eines solchen Wirkstoffs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen solchen Wirkstoff enthält und Verwendung eines solchen Wirkstoffs auf dem Gebiet der Geweberekonstruktion - Google Patents

Abstract

Kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Boldo-Extrakt, einem Kakao-Extrakt und Jasmonsäure, wobei der Extrakt erhalten wird durch wässrige Extraktion oder Extraktion mit Wasser-Butylenglycol zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandeltes Gewebe, durch direkte oder indirekte Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD2) und/oder vom Typ 3 (hBD3), ohne ein proinflammatorisches Molekül zu stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIP 3 alpha (Makrophageninflammationsprotein), IL8 und IL1.

Description

• Die Erfindung betrifft die kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs wie in den Ansprüchen definiert. Insbesondere betrifft die Erfindung die kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Boldo-Extrakt, einem Kakao-Extrakt und Jasmonsäure, wobei der Extrakt erhalten wird durch wässrige Extraktion oder Extraktion mit Wasser-Butylenglycol zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandeltes Gewebe, durch direkte oder indirekte Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD2) und/oder vom Typ 3 (hBD3), ohne ein proinflammatorisches Molekül zu stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIP 3 alpha (Makrophageninflammationsprotein), IL8 und IL1. Die Erfindung umfasst zudem die Verwendung von mindestens einem solchen Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe zur Behandlung oder Prävention von Akne, Bakterien- und Pilzdermatosen oder der Behandlung von Störungen, die mit Mikroben zusammenhängen, ausgewählt aus Schuppen, Akne, Vitiligo, Dermatitis und anderen Erkrankungen der Haut, Mukosa, Kopfhaut und Haaren und Nägeln. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung auf dem Gebiet der Geweberekonstruktion, wobei der bakterizide Effekt von beta-Defensinen bei der Erstellung von Epidermis und rekonstruierter Haut und der Lebenserhaltung von Hautbiopsien ausgenutzt wird.
• Stand der Technik
• Antibiotische Peptide sind kleine Moleküle (10 bis 50 Aminosäuren), die zur Zerstörung von Mikroorganismen fähig sind, wie Bakterien, Pilze oder Viren, indem sie ihre Zellmembran permeabilisieren. Seit der Entdeckung 1981 bei Arthropoden wurden fast 500 Moleküle mit solchen Eigenschaften in höheren Organismen identifiziert (Pflanzen, Insekten, Säugern, Menschen). Die gemeinsame Eigenschaft von antimikrobiellen Peptiden ist ihre amphipathische Struktur, das heißt die Verteilung von Aminosäuren in kationische (positiv geladene) Zonen, die sich von den hydrophoben Zonen unterscheiden. Es ist diese Struktur, die ihnen ihre Aktivität und Spezifität der Wirkung gegen bakterielle cytoplasmatische Membranen verleiht, da die Membranen eine große Anzahl an negativ geladenen anionischen Phospholipiden aufweisen, die an die kationischen Stellen der antibiotischen Peptide binden (M. Zalsoff, Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Nature 2002, 415: 389-395). In Abhängigkeit ihrer Struktur kann der Aktivitätsbereich dieser Peptide entweder sehr eng oder sehr breit sein.
• Man findet antimikrobielle Peptide hauptsächlich in der tierischen Welt: Bei Tiergiften (Skorpionen, Bienen, Spinnen), bei Drosophila oder Blaufliege, in Rinderneutrophilen, in Leukozyten und im Dünndarm des Schweins, in Milch, in Fröschen, in Muscheln des Mittelmeeres usw. in der Pflanzenwelt schützen die Thionine und Defensine die Pflanzensamen und vegetativen Gewebe gegen Bakterien.
• Die meisten antibakteriellen Peptide findet man in den Epithelgeweben von Tieren, wo sie einen wichtigen Teil als erste Immunbarriere spielen. Sie wurden in der Haut von Fröschen und Mäusen wie auch in Gastrointestinal- und Atemwegssystemen von Menschen und in der menschlichen Haut und der Mukosa gefunden.
• Die Defensine sind eine der am meisten untersuchten Klassen an antimikrobiellen Peptiden. Diese Klasse besteht aus Cystein-reichen Molekülen mit drei Disulfidbrücken. Sie finden sich bei Pflanzen, Insekten und verschiedenen Säugern. Beim Menschen findet man zwei Klassen an Defensinen, die sich voneinander in Bezug auf den Abstand und die Bindungen zwischen den sechs Cysteinresten unterscheiden:
• - Die α-Defensine (6 Typen), die aus Neutrophilen (HPN1 bis 4, humanes Neutrophilenpeptid) und den Paneth-Zellen des Gastrointestinaltrakts (α-Defensine 5 und 6) isoliert wurden.
• - Die β-Defensine, die länger und basischer sind, und in der Mukosa und in den Epithelzellen (Haut, Luftröhre, Zunge, Tonsillen, Speichel ...) exprimiert werden, treten in 3 Formen auf:
  • • einer konstitutiven Form, hBD1 (humanes β-Defensin 1), das vorwiegend in den Nieren, aber auch im Pankreas, Speichel, den Lungen, der Plazenta und der Haut gefunden wird.
  • • zwei induzierbaren Formen: hBD2 und hBD3 (humane β-Defensine 2 und 3):
    • →hBD2 wird in der Haut, der Luftröhre und den Lungen exprimiert, und die Expression wird durch eine bakterielle Stimulierung, TNFα (Tumornekrosefaktor) (J. Harder et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997, 387:861), LPS (Lipopolysacchariden) (E. Matthews et al., Production of beta-defensin antimicrobial peptides by the oral mucosa and salivary glands. Infect. Immun 1999, 67: 2740-2745), IL1α und IL1β (Interleukin 1) (A.Y. Liu et al., Human β-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of differentiation. J. Invest. Dermatol. 2002, 118: 275-281) ausgelöst, wobei alle diese Moleküle die Eigenschaft gemeinsam haben, dass sie in Entzündungsprozesse involviert sind. Die antibakterielle Aktivität von hBD2 richtet sich insbesondere auf Gramnegative Bakterien, wie Escherichia coli.
    • →hBD3 findet man in der Haut, der Luftröhre, den Tonsillen und der Zunge (J. Harder et al., Isolation and characterization of human β-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J. Biol. Chem. 2001, 276: 5707-5713), wie auch in Muskelgewebe und dem Herzen (Conejo Garcia et al., Identification of a novel, multifunctional β-defensin (human β-defensin-3) with specific antimicrobial activity. Cell tissue research 2001, 306: 257-264). hBD3 wird durch bakterielle Stimulierung, TNFα und speziell IFNy (gamma-Interferon) induziert, die auch die gemeinsame Eigenschaft haben, dass sie Moleküle sind, die an Entzündungsprozessen beteiligt sind. Das Aktivitätsspektrum von hBD3 ist breiter als das von hBD2, da es zur Lyse von Gram-negativen und Grampositiven Bakterien fähig ist, wie Staphylococcus aureus.
• Die Induktion dieser Defensine in der Haut ist die erste Verteidigungslinie des Körpers, um sich selbst gegen die steigende Anzahl an pathogenen Mikroorganismen zu schützen, mit denen er konfrontiert wird. Zusätzlich hat hBD3 chemotaktische Eigenschaften für unreife dendritische Zellen und Gedächtnis-T-Lymphozyten (D. Yang et al., Betadefensins: linking innate and adaptive immunology through dendritic and T cell CCR6. Science 1999, 286: 525-528) und scheint so eine wichtige Rolle bei der Förderung der Immunreaktion, Entzündung und Heilung zu spielen.
• Die Zunahme in der Menge an β-Defensinen in der menschlichen Haut trägt daher zur Konservierung des mikrobiellen Ökosystems der Haut durch den Schutz der Überinvasion durch bestimmte Spezies bei, die pathogen sein können (Staphylococcus aureus), wobei die Haut geschützt und gesund bleibt. Um dies auszuführen, können zwei Strategien ins Auge gefasst werden:
• - entweder topische Applikation der synthetischen Peptide mit Sequenzen oder Strukturen, die zu denen der bekannten antibiotischen Peptide ähnlich sind, die vom Fachmann beschrieben wurden,
• - oder provozierende Induktion von Defensinen durch topische oder orale Verabreichung eines Wirkstoffs, der zur Stimulierung der Synthese dieser Peptide in natürlichen Sekretionszellen fähig ist.
• Mit Ausnahme der vorher erwähnten Cytokine (TNFα, IFNy, IL1) wurden nur wenige Produkte beschrieben, die die Fähigkeit zur Induktion von β-Defensinen haben, außer bei Tieren, bei denen L-Isoleucin die Expression von hBD3 in Nierenepithelzelllinien vom Rind induziert (P. Fehlbaum et al., An essential amino acid induces epithelial β-defensin expression. PNAS 2000, 97: 12723-12728, Patent WO 0168085 M. Anderson et al., Method for stimulation of defensin production. 20-09-2001). Beim Menschen wurde festgestellt, dass die Keratinocytendifferenzierung die Bildung von hBD2 stimuliert (A.Y. Liu et al., Human β-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of differentiation. J. Invest. Dermatol. 2002, 118, 275-281).
• Untersuchungen bezüglich des Vorkommens von hBD2 und hBD3 Defensinen in der Haut werden auf Hautschnitten, Explantaten und kultivierten Zellen oder rekonstruierter Haut ausgeführt. Die Zunahme der Menge an Defensinen kann durch eine Vielzahl an Techniken sichtbar gemacht werden, aber bisher wurde keine dieser Techniken quantitativ auf die Screeningsuche für einen Wirkstoff angewendet, der zur Stimulierung von hBD2 und hBD3 in humanen Zellen fähig ist. Die deutsche Patentanmeldung DE 3319184 A1 beschreibt ein Verfahren zur Abtrennung von Arnikablüten mittels CO2-Hochdruckextraktion. Die internationale Patentanmeldung WO 01/76551 betrifft eine kosmetische Zusammensetzung zur topischen Anwendung zur Behandlung von posttraumatischen Ödemen. Die herkömmlich vom Fachmann verwendeten Techniken können in der Tat nicht auf das vorliegende Problem angewendet werden, in anderen Worten zur Suche nach Wirkstoffen, die zur Stimulierung von humanen Defensinen auf eine quantitativ bewiesene Art fähig sind (Fehlen an im Handel erhältlichen Antikörpern, was es unmöglich macht, quantitative Tests auf Proteine mittels ELISA Verfahren auszuführen, Fehlen an Molekularbiologieverfahren vom in situ Hybridisierungstyp, Fehlen an Northern Transfer, RT-PCR, die mehr qualitativ als quantitativ sind, Modellen von Humanzellen in sehr komplexen dreidimensionalen Kulturen, die nicht in Screeningverfahren verwendet werden können).
  Ein solcher Test wird hier beschrieben.
• Ziele der Erfindung
• Das Ziel war es, Wirkstoffe zu identifizieren, die zur Induktion der Expression von ß-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind, ohne die Entzündungsreaktion auszulösen, beispielsweise ohne Überstimulierung der Sekretion von Molekülen, die gewöhnlich in Entzündungsreaktionen exprimiert werden.
• Bisher haben alle Moleküle, die beschriebenermaßen die Fähigkeit zur Stimulierung von Defensinen beim Menschen haben (TNFα, IL1, LPS, Bakterien IFNγ ... ) auch proinflammatorische Eigenschaften. Sie stimulieren die Entzündungscytokine wie IL1α, IL8 oder MIP3α.
• Das Ziel der Erfindung ist es daher, das neue technische Problem der Bereitstellung der Verwendung eines Wirkstoffs zu lösen, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist ohne Auslösung von Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen.
• Das Ziel der Erfindung ist es, das neue technische Problem der Bereitstellung der Verwendung eines Wirkstoffs zu lösen, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder 3 fähig ist, ohne direkt oder indirekt die Synthese von proinflammatorischen Molekülen zu stimulieren oder nennenswert zu stimulieren, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Das Ziel der Erfindung ist es daher, das neue technische Problem der Bereitstellung der Verwendung einer Zusammensetzung zu lösen, die mindestens einen wie oben definierten Wirkstoff enthält.
• Das Ziel der Erfindung ist es, das neue technische Problem der Bereitstellung eines Gewebe- oder Zellmodells zu lösen, das das Screenen der wie oben definierten Wirkstoffe erlaubt.
• Das Ziel der Erfindung ist es, das technische Problem der Bereitstellung eines Screeningverfahrens für die oben definierten Wirkstoffe bereitzustellen.
• Das Ziel der Erfindung ist es, das neue technische Problem der Bereitstellung einer Verwendung des wie oben definierten Wirkstoffs zur Verwendung im Gebiet der Kosmetik und der Pharmazie zu lösen.
• Diese Verwendung wird im Wesentlichen ausgeführt, um eine bakterizide und/oder fungizide Aktivität vorzugsweise durch topische Anwendung auf Geweben auszulösen, beispielsweise Haut, Mukosa, Haaren und Nägeln oder Kopfhaut.
• Beschreibung
• Die Beschreibung verwendet den Ausdruck „Wirkstoff“ um potentielle zu screenende Wirkstoffe zu bezeichnen und den Ausdruck „Defensine“, um auf ß-Defensine vom Typ 2 und/oder 3 Bezug zu nehmen, wenn der Ausdruck zur Bezeichnung von Defensinen verwendet wird, die durch die hier beschriebenen Wirkstoffe stimuliert werden.
• Gemäß einem hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung einen Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, der keine Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursacht.
• Der Ausdruck „der keine Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursacht“ wird verwendet, um auszudrücken, dass die Verwendung der Wirkstoffe keine schädlichen Nebenwirkungen für den Anwender des Wirkstoffs hervorruft. Der Ausdruck „schädlich“ meint Reaktionen, wie Hautausschläge, Jucken, Reizung, erhöhte Hautempfindlichkeit usw.
• Vorteilhafterweise stimuliert der Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD 2) und/oder humanen beta-Defensinen vom Typ 3 (hBD3) fähig ist, nicht oder nicht nennenswert die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Der Ausdruck „die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht nennenswert zu stimulieren, die im Verlauf der Entzündungsprozesse gewöhnlich co-exprimiert werden“ bezieht sich auf die Tatsache, dass der Wirkstoff proinflammatorische Moleküle oder Moleküle nicht stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden oder stimuliert sie nur in einem Ausmaß, das geringer ist als das von TNF alpha (TNFα) oder gamma-Interferon (IFNy), vorzugsweise eine Stimulierung unter 75 % der maximalen Stimulierung, die durch TNF alpha oder gamma-Interferon induziert wird bei identischen Temperatur-, Kontaktzeit- und Ausführungsbedingungen.
• Vorteilhafterweise ist das proinflammatorische Molekül oder das Molekül, das gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen exprimiert wird, speziell MIP3 alpha oder IL8 oder IL1 oder ein anderes Interleukin oder Histamin, Tryptase, Substanz P, Leukotriene oder Prostaglandine.
• Vorteilhafterweise stimuliert der Wirkstoff die direkte oder indirekte Bildung von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht nennenswert, die im Verlauf von Entzündungsprozessen in Kulturen von humanen Epithelzellen, insbesondere Keratinocyten und/oder Corneocyten in Kultur oder von humanen Hautbiopsien, die am Überleben gehalten werden, oder in Modellen von rekonstruierter Epidermis oder in Modellen von rekonstruierter Haut oder in konstruierten oder nicht konstruierten Zellmatrizes oder von deepidermisierten Dermen. Solche Epithelzellen werden vorzugsweise als „normal“ bezeichnet.
• Der Ausdruck „normal“ wird verwendet, um Epithelzellen zu bezeichnen, die nicht von immortalisierten Zelllinien stammen, die aber Zellen sein können, die von pathologischen Geweben oder genetisch veränderten Zellen stammen.
• Vorteilhafterweise wird der Wirkstoff ausgewählt aus Wermutwurzel, Canadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, St. John's Kraut, Roßkastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.
• Vorteilhafterweise erhält man diese von Pflanzen stammenden Wirkstoffe durch Extraktion, vorzugsweise durch eine wässrige Extraktion, aber auch durch andere Extraktionsverfahren, wie beispielsweise in einem Wasser / Butylenglycolgemisch (von 1/99 bis 99/1 G/G). Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder eines der Peptide, aus denen alpha-MSH besteht, oder eine chemische Struktur, die diese Peptide nachahmt, Isoleucinester und Calcium oder irgendwelche organischen oder mineralischen Calciumsalze, werden, wie sie sind, in Wasser oder Ethanol oder anderen Lösemitteln verdünnt verwendet, die mit dem beschriebenen Modell kompatibel sind.
• Gemäß einem zweiten hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung eine Zusammensetzung, die zumindest einen wie oben definierten Wirkstoff umfasst.
• Vorteilhafterweise enthält die Zusammensetzung diesen Wirkstoff in einer Konzentration im Bereich von 0,001% bis 20 %, vorzugsweise 0,01% bis 10 %. Diese Konzentrationen werden als Gewichtsprozent ausgedrückt, insbesondere wenn der Prozentsatz nicht klar als Gewichtsprozent erwähnt ist.
• Die Konzentration wird so optimiert, dass der Wirkstoff zur Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, während er keine Reizung oder Entzündung induziert, insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht stimuliert oder nicht nennenswert stimuliert, die im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Gemäß einem dritten hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung die Verwendung von zumindest einem Wirkstoff, wie oben definiert, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff in einer Konzentration vorliegt, die zur Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, wobei sie keine Reizung oder Entzündung induziert, insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht stimuliert oder nicht nennenswert stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, wobei der Wirkstoff möglicherweise mit einem kosmetisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt wird.
• Gemäß einem vierten hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung die Verwendung von zumindest einem wie oben definierten Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff in einer Konzentration vorhanden ist, um die Expression der beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 zu stimulieren und keine Reizung oder Entzündung hervorzurufen und insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül nicht oder nicht merklich zu stimulieren, das gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, wobei der Wirkstoff möglicherweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt wird.
• Vorteilhafterweise umfasst die Zusammensetzung zumindest ein mikrobiozides und/oder mikrobiostatisches Mittel. Der Ausdruck „mikrobiozides Mittel“ wird verwendet, um auf die Gruppe an Mitteln mit einer zerstörenden Wirkung auf Bakterien Bezug zu nehmen und der Ausdruck „mikrobiostatisches Mittel“, um die Gruppe an Mitteln mit einem limitierenden Effekt auf die bakterielle Proliferation zu bezeichnen.
• Gemäß einem fünften hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung ein Zell- oder Gewebemodell, das das Screenen auf zumindest einen Wirkstoff ermöglicht, der die Expression der beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 stimuliert und keine Reizung oder Entzündung hervorruft, insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül nicht oder nicht merklich stimuliert, das gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird.
• Vorteilhafterweise umfasst das Zell- oder Gewebemodell Epithelzellen, beispielsweise Keratinozyten und/oder Corneozyten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen, insbesondere mit einem Calciumgehalt im Bereich von 0 bis 100 mM vorzugsweise 1,7 mM geeignet sind.
• Gemäß einem sechsten hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung ein Screeningverfahren für Wirkstoffe, die zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind und keine Reizung oder Entzündung hervorrufen und insbesondere nicht zur Stimulierung oder merklichen Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül fähig sind, das im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich co-exprimiert wird (diese Wirkstoffe werden hierin als „potentielle zu screenende Wirkstoffe“ beschrieben), das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:
1. a) Kultivierung eines Zell- oder Gewebemodells in Gegenwart von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die unter geeigneten Kulturbedingungen gescreent werden können, wobei das Verfahren auf mindestens einen potentiellen Wirkstoff angewendet werden kann, es aber vorteilhafter ist, eine große Anzahl an Wirkstoffen („oder Wirksubstanzen“) gleichzeitig zu testen,
2. b) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung der Expression der humanen beta Defensine vorn Typ 2 und/oder Typ 3 vorhanden ist, und
3. c) Identifizierung der nicht-reizenden und nicht-entzündlichen Eigenschaften der Wirkstoffe, insbesondere durch das Fehlen der Stimulierung einer direkten oder indirekten Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder von Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren einen zusätzlichen Schritt d), worin zumindest ein auf diese Weise getesteter Wirkstoff ausgewählt wird, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von ß-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist und gleichzeitig die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Dem Leser ist bewusst, dass die Beschreibung nicht durch die bestimmten Analyseverfahren beschränkt wird, die nur ein Mittel sind, um das Screeningprinzip der Erfindung auszuführen.
• Tatsächlich können in der Zukunft andere Analyseverfahren die derzeit verwendeten Verfahren ersetzen, wie Verfahren mittels Antikörper, die hBD2 und 3 erkennen (ELISA Verfahren, Immunblots, Immunhistologie usw.).
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt a) ein Zell- oder Gewebemodell, das Epithelzellen oder humane Hautbiopsien, die am Leben gehalten werden oder Modelle rekonstruierter Epidermis oder Modelle rekonstruierter Haut enthält, die Epithelzellen enthalten, beispielsweise Keratinozyten und/oder Corneozyten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen geeignet sind, die insbesondere einen Calciumgehalt im Bereich von 0 bis 100 mM, vorzugsweise 1,7 mM umfassen.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt a) das Vorkommen von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die mit dem Zell- oder Gewebemodell für einen Zeitraum von 6 bis 48 h, vorzugsweise etwa 16 h (Kontaktzeit) gescreent werden.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt b) eine Extraktion der Gesamt RNA und eine RT-PCR Analyse der Expression von mRNA, die für die oben zitierten humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt b) eine RT-PCR auf Actin (schwach stimuliertes Reportergen), so dass Erhöhungen der für hBD2 und hBD3 kodierenden mRNA auf die für Actin kodierende mRNA bezogen werden.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt b) die Auftragung der amplifizierten mRNA auf ein Agarosegel, das eine Nukleinsäureinsertion enthält, die unter UV sichtbar ist (wie Ethidiumbromid).
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt b) nach der Wanderung der Produkte auf einem Agarosegel einen Vergleich der Intensitätsverhältnisse von hBD2/Actin und hBD3/Actin Banden unter UV Licht.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt c) einen ELISA Test für proinflammatorische Moleküle oder Moleküle, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren in Schritt d) die Selektion von zumindest einem Wirkstoff, der zur Stimulierung der Expression von mRNA fähig ist, die für die humanen beta-Defensine vorn Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert ohne Stimulierung oder merkliche Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren die Selektion von Wirkstoffen, die die Expression der oben erwähnten humanen beta-Defensine stimulieren und nicht ein proinflammatorisches Molekül oder nicht ein Molekül stimulieren oder nennenswert stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich co-exprimiert wird, wie IL1, IL8 und MIP3α. Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren die folgenden Schritte
• - Zusammenbringen der potentiellen, zu screenenden Wirkstoffe mit normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in einem spezifischen Medium ohne Serum und mit Calcium angereichert, beispielsweise durch Einbeziehung einer unbehandelten Kontrolle und zwei parallelen Positivkontrollen (TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3),
• - Extraktion und anschließender Test der Gesamt RNA mit einem Spektrophotometer, vorzugsweise bei einer Wellenlänge im Bereich von 260 bis 280 nm, wobei die RNA möglicherweise verdünnt wird,
• - Ausführung einer RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 mit der anfänglichen RNA,
• - Retrotranskription der Gesamt RNA und anschließende Amplifikation des retrotranskribierten Produkts (cDNA), die beispielsweise in einem Thermocycler gemäß einem Amplifikationsprogramm ausgeführt wird, das eventuell für Actin, hBD2 und hBD3 gleich ist,
• - Mischen der hBD2-, hBD3- und Actinamplifizierungsprodukte gefolgt von einer Zugabe eines Gemisches aus Beladungspuffer und Wasser (2/3), wobei die schließliche Lösung dann auf ein vorgegossenes Agarosegel aufgetragen wird, das Ethidiumbromid enthält. Die Proben wandern und die durch diese Technik erhaltenen Banden können unter UV sichtbar gemacht werden, vorzugsweise in einer Dunkelkammer und digital photographiert werden. Die Banden werden an dieser Stelle analysiert, um ihre Intensität zu quantifizieren. Da der Grundlevel der Defensinexpression (nicht behandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die aus der Positivkontrolle erhalten wurden (mit TNFα für hBD2 und INFγ für hBD3 behandelt) und zeigen eine Stimulierung der Expression des in Frage kommenden ß-Defensins.
• Vorteilhafterweise umfasst das Screeningverfahren den zusätzlichen Schritt
• - Selektion von potentiellen zu screenenden Wirkstoffen, die eine Wirkung auf die Expression der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 gezeigt haben. Die den Aktivitäten entsprechenden Überstände werden getestet, um die Mengen der Moleküle zu bestimmen, die gewöhnlich im Verlauf von proinflammatorischen Prozessen co-exprimiert werden, wie MIP3α, IL1 und IL8, die in das Kulturmedium unter der Einwirkung dieser Wirkstoffe sekretiert wurden. Beispielsweise können die Mengen auf die getestete RNA Konzentration bezogen werden, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.
• Vorteilhafterweise ermöglicht das Screeningverfahren die Detektion, dass ein Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus Wermutwurzel, Canadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuss, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnussblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, St. John's Kraut, Rosskastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.
• Gemäß einem siebten hier nicht beanspruchten Aspekt betrifft die Beschreibung die Verwendung eines Wirkstoffs zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, die zur Ausübung eines bakteriziden und/oder fungiziden Effekts auf behandelte Gewebe verwendet wird, insbesondere Haut, Mukosa, Haare und Nägel oder Kopfhaut. Im Fall der Kopfhaut kann diese kosmetische Zusammensetzung verwendet werden, um Schuppen zu verhindern oder zu behandeln.
• Durch die vorliegende Erfindung wird zudem eine kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs bereitgestellt (wie in den Ansprüchen definiert), wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Boldo-Extrakt, einem Kakao-Extrakt und Jasmonsäure, wobei der Extrakt erhalten wird durch wässrige Extraktion oder Extraktion mit Wasser-Butylenglycol zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe, durch direkte oder indirekte Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD2) und/oder vom Typ 3 (hBD3), ohne ein proinflammatorisches Molekül zu stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIP 3 alpha (Makrophageninflammationsprotein), IL8 und IL1. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der Wirkstoff zur Ausübung einer kosmetisch bakteriziden und/oder kosmetisch fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Haut, Mukosa, Haaren, Nägeln und Kopfhaut verwendet, wobei im Fall der Kopfhaut der Wirkstoff verwendet werden kann, um Schuppen zu verhindern oder zu behandeln.
• Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die hier beschriebenen Wirkstoffe mit anderen kosmetischen Wirkstoffen kombiniert werden, um den Schutz der Haut zu verstärken, die durch den Alterungsprozess anfällig gemacht wurde und/oder einem durch die Umgebung und/oder das Klima (Kälte, UV ...) und/oder Reinigungsverfahren, die für das Hautökosystem rauh sind, verursachten Stress ausgesetzt ist. Zusammensetzungen, die aus der Erfindung hervorgehen, können in jeder galenischen Form vorliegen, die für Kosmetika verwendet wird und insbesondere in Form einer wässrigen Lösung, möglicherweise geliert, einer Dispersion vom Lotionstyp, möglicherweise einer Zweiphasendispersion, einer Wasser/Öl oder Öl/Wasser Emulsion, einer Dreifachemulsion oder einer Vesikeldispersion. Die Erscheinungsform dieser Zusammensetzung kann trocken oder mehr oder weniger flüssig sein oder eine weiße oder gefärbte Creme, ein Serum oder ein Mousse sein. Sie kann in Form eines Aerosols oder eines Stifts auf die Haut aufgetragen werden. Sie kann als Schönheits- und/oder Make-up Produkt für die Haut und/oder als Reinigungsprodukt für die Haut, Mukosa, das Haar und die Nägel und die Kopfhaut angewendet werden. Die aus der Erfindung hervorgehende Zusammensetzung kann auch alle Additive enthalten, die in Kosmetika brauchbar sind, wie Geliermittel, Wirkstoffe, Konservierungsmittel, Öle, Lösemittel, Antioxidantien, Düfte, geladene Stoffe, Pigmente, Filter, Geruchsabsorptionsmittel und Farbstoffe.
• Vorteilhafterweise ist die Zusammensetzung, die zumindest ein mikrobiozides und/oder rnikrobiostatisches Mittel enthält, insbesondere im Gebiet der Kosmetika und der Pharmazeutika brauchbar, da sie den bakteriziden Effekt von beta-Defensinen der Haut mit der Wirkung dieser Mittel kombiniert, um insbesondere die Hautflora zu kontrollieren.
• Die vorliegende Erfindung stellt zudem die Verwendung von mindestens einem Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe zur Behandlung oder Prävention von Akne, zur Behandlung und/oder Prävention von Bakterien- oder Pilzdermatose, wobei der Wirkstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt ist und der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Boldo-Extrakt, einem Kakao-Extrakt und Jasmonsäure, wobei der Extrakt erhalten wird durch wässrige Extraktion oder Extraktion mit Wasser-Butylenglycol und wobei die bakterizide und/oder fungizide Wirkung auf behandelte Gewebe durch direkte oder indirekte Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD2) und/oder vom Typ 3 (hBD3) erfolgt, ohne ein proinflammatorisches Molekül zu stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIP 3 alpha (Makrophageninflammationsprotein), IL8 und IL1.
• Vorteilhafterweise ist die Zusammensetzung, die zumindest ein mikrobiozides und/oder mikrobiostatisches Mittel enthält insbesondere brauchbar im pharmazeutischen Gebiet, da sie den bakteriziden Effekt der beta-Defensine der Haut mit der Wirkung dieser Mittel kombiniert, nämlich zur Behandlung der Erkrankungen, die mit einem Mikroben zusammenhängen, wie Schuppen, Akne, Vitiligo, Dermatitis und anderen Erkrankungen der Haut, Mukosa, Kopfhaut, Haare und Nägel, die von Mikroben verursacht werden.
• Die vorliegende Erfindung stellt zudem die Verwendung eines Wirkstoffs auf dem Gebiet der Geweberekonstruktion bereit, um den bakteriziden Effekt von beta-Defensinen bei der Erstellung von Epidermis und rekonstruierter Haut und der Lebenserhaltung von Hautbiopsien auszunutzen, wobei der Wirkstoff ein Wirkstoff wie in Bezug auf die Verwendung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben ist.
• Es werden Analyseverfahren verwendet, die die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen zeigen, die im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich co-exprimiert werden, so dass Entzündungs-, Reiz- und Unterverträglichkeitsreaktionen identifiziert werden können.
• Die Erfindung kann auf eine unterschiedliche Weise ausgeführt werden, um Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen zu identifizieren, beispielsweise durch die Evaluierung des Juckens und des unangenehmen oder straffenden Gefühls bei der Anwendung auf dem zu behandelnden Gewebe.
• Gemäß einer weiteren vorteilhaften Eigenschaft der Erfindung, die für einen dieser Aspekte anwendbar ist, kann ein Wirkstoff ausgewählt werden, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist und die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht nennenswert stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, beispielsweise einem Cytokin, das gewöhnlich während Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, wie IL1α, IL8 oder MIP3α.
• Detaillierte Beschreibung
• Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Auswahl durch Screening und die anschließende Identifizierung von Wirkstoffen, die zur Erhöhung der Menge an hBD2 und/oder hBD3 mRNA in Epidermiszellen fähig sind, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Wirkstoffe keine oder keine nennenswerten Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursachen.
• Das Screeningverfahren umfasst die folgenden Schritte:
• Normale humane Epithelzellen, vorzugsweise normale humane Keratinozyten werden als Monoschicht in einem spezifischen Medium ohne Serum mit einer Calciumkonzentration im Bereich von 0 bis 100 mM, vorzugsweise 1,7 mM kultiviert. Bei einem Maß an Konfluenz, vorzugsweise zwischen 75 % und 95 %, vorzugsweise 80 %, werden die Zellen mit den potentiellen zu screenenden Wirkstoffen für eine Zeitspanne von 6 bis 48 h, vorzugsweise 16 h zusammengebracht. Es können zumindest eine unbehandelte Kontrolle und zumindest eine Positivkontrolle parallel angesetzt werden, vorzugsweise auf derselben Kulturplatte, um das Screening zu erleichtern. Die Positivkontrollen sind TNFα für hBD2 und IFNy für hBD3, die den zu screenenden Wirkstoff ersetzen. Vorteilhafterweise liegen ihre Konzentrationen im Bereich von 1 bis 500 ng/ml, vorzugsweise 100 ng/ml. Nach der Kontaktaufnahme auf diese Weise werden die Überstände gewonnen, und die Zellen können trocken eingefroren werden, beispielsweise bei -80°C, nachdem sie in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen wurden. Die Gesamt RNA wird extrahiert und durch Spektrophotometrie getestet, vorzugsweise zwischen 260 und 280 nm und die Gesamt RNA wird vorzugsweise auf eine Konzentration im Bereich von 2 bis 50 ng/ml, vorzugsweise 5 ng/ml verdünnt. Die qualitative RT-PCR wird auf Actin, hBD2 und hBD3 ausgeführt. Die verwendeten Primer werden aus der Literatur entnommen (für hBD2: J. Harder et al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997, 387: 861 und für hBD3:J. Harder et al., Isolation and characterization Oberfläche human ß-Defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem 2001, 276: 5707-5713) und sind die folgenden:
• - Actin:
  • Sinn: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', (SEQ ID Nr. 1)
  • Antisinn: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGTATTC-3', (SEQ ID Nr. 2)
• - hBD2:
  • Sinn: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3', (SEQ ID Nr. 3)
  • Antisinn 5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3', (SEQ ID Nr. 4)
• - hBD3:
  • Sinn: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', (SEQ ID Nr. 5)
  • Antisinn: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', (SEQ ID Nr. 6)
• Die für die RT-PCR verwendeten Primersequenzen können sich von den angegebenen unterscheiden solange sie für die untersuchten Gene spezifisch bleiben (Actin, hBD2, hBD3).
• Die RT-PCR wird vorzugsweise mit einer Menge an anfänglicher MRNA von 10 bis 100 ng, vorzugsweise 50 ng in einem Thermocycler möglicherweise mit einem gemeinsamen Programm ausgeführt. Dieser Schritt amplifiziert die anfängliche RNA. Die Temperatur und Zeitparameter für die RT-PCR können sich als Funktion der Primer oder des verwendeten Materials verändern (Thermocycler, RT-PCR Kit-Hersteller ... ).
• Nach der Amplifizierung werden die Produkte miteinander gemischt, und es wird ein Beladungspuffer und Wasser (2/3) zugegeben. Die schließliche Lösung wird auf ein vorgegossenes Agarosegel aufgetragen, das eine Nukleinsäureinsertion enthält, die unter UV sichtbar ist (wie Ethidiumbromid), beispielsweise mit 2 %. Die Proben wandern und die Banden werden unter UV in einer Dunkelkammer sichtbargemacht und digital photographiert. Die Photos des Gels werden durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Bandenintensitäten quantifiziert. Wenn der Grundlevel der Defensinexpression (unbehandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die für die Positivkontrolle erhalten werden (behandelt mit TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3) und ermöglichen die Detektion jeder Stimulierung der Expression des in Frage kommenden ß-Defensins.
• Am Ende dieses ersten Schritts werden die Wirkstoffe ausgewählt, die eine Wirkung auf die ß-Defensinexpression ausüben.
• Die den Wirkstoffen entsprechenden Überstände werden dann mittels eines ELISA Kits getestet, um ihren Gehalt an MIP3α, IL1 und IL8 zu bestimmen, die unter der Wirkung der Wirkstoffe in das Kulturmedium sekretiert wurden. Die getesteten Konzentrationen werden mit den RNA Konzentrationen in Bezug gesetzt, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Potentielle zu screenende Wirkstoffe, die eine Überstimulierung von MIP3α, IL1 und IL8 induzieren (signifikant höher als 75 % der maximalen Stimulierung durch TNFα oder IFNy) werden aus dem Screening eliminiert.
• Die Gele werden dann durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Bandenintensitäten quantifiziert. Die Bandenvisualisierung kann praktisch mit jedem Nukleinsäureelektrophoresesystem ausgeführt werden, da der Insertionstyp und die Menge an Produkten, die aus der RT-PCR resultieren, variieren können, aber unter der Lichtsättigung bleiben.
• Eine Validierung der erhaltenen Ergebnisse kann durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren ausgeführt werden, das auf eine „Dosis-Wirkungs-Untersuchung“ mit einer quantitativen RT-PCR angewendet wird, wie dies später beschrieben wird, die aber nicht auf das bestimmte Verfahren beschränkt ist, da der Fachmann auch andere Verfahren als geeignet erkennt. Die Echtzeit-RT-PCR Technik ist derzeit das bevorzugte Verfahren, das quantifizierbare Ergebnisse bezüglich Unterschieden in der mRNA Expression ergibt.
• Es wird eine Cytotoxizitätsstudie für die ausgewählten Wirkstoffe mit steigenden Dosierungen von 0,001 % bis 10 %, vorzugsweise 0,01 % bis 10 % ausgeführt. Die Lebensfähigkeit muß eingestellt werden und liegt vorzugsweise über 65 % und noch bevorzugter über 75 %. Diese Lebensfähigkeit setzt das nicht-cytotoxische Konzentrationslimit.
• Die potentiellen zu screenenden Wirkstoffe werden daher mit mehreren Konzentrationen, vorzugsweise von 0,001 % bis zum Limit der nichtcytotoxischen Konzentration auf normalen Epithelzellen, vorzugsweise normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in einem spezifischen Medium getestet, das kein Serum aufweist, wie dies später beschrieben ist.
• Dann werden die Überstände gewonnen, und die Zellen werden dann nach dem Waschen in PBS trocken bei -80°C eingefroren. Die Gesamt RNA wird extrahiert und auf denselben Konzentrationsbereich wie vorher verdünnt. Die verdünnte RNA wird für die quantitative RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 verwendet.
• Diese Technik wird vorzugsweise mit denselben Mengen an anfänglicher RNA ausgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde, vorzugsweise unter Verwendung eines Einschrittkits, der SYBR® Green enthält. Jedoch kann der RT-PCR Kit auch auf einer anderen Technik als SYBR® Green basieren, wie Scorpion®, Molecular beacons®, Taqman® Sonden usw., vorteilhafterweise in einem Fluoreszenzthermocycler mit denselben Primern wie oben, wobei ein Amplifizierungsprogramm ausgeführt wird, das zum vorher beschriebenen Programm identisch sein kann.
• Die Ausführung einer Untersuchung mit Fusionsgraphen ermöglicht es, die Spezifität der amplifizierten Produkte zu verifizieren. Der Fluoreszenzgraph ergibt als Funktion der Anzahl an Zyklen den C(T) Wert, der der Anzahl an Zyklen entspricht, die erforderlich sind, um die Initiation des Fluoreszenzsignals zu erhalten. Je stärker eine mRNA exprimiert wird, desto niedriger ist der C(T). Die Berechnung von S_Gen = (1/2)^C(T) für jede RNA berücksichtigt die exponentielle Zunahme der Anzahl an Kopien während einer Amplifikation. Die S_Gen hBD2/S_Gen Actin und S_Gen hBD3/S_Gen Actin Verhältnisse können mit einer unbehandelten Kontrolle verglichen werden, um die hervorgerufene prozentuale Stimulierung zu erhalten.
• Unbehandelte Kontrollen können zu denen im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens identisch sein.
• Die Überstände der zu screenenden potentiellen Wirkstoffe, deren Fähigkeit zur Induktion der Defensine bestätigt wurde, können mittels eines ELISA Kits getestet werden, um die Mengen an MIP3α, IL8 und IL1α zu testen.
• Vorzugsweise werden die Tests mit dem Überstand ausgeführt. Die Mengen werden mit der getesteten RNA Konzentration jeder Probe verglichen. Die nicht-entzündliche Art der ausgewählten Wirkstoffe kann so bestätigt werden und/oder die optimale Dosis für die Defensinstimulierung ohne der Induktion der Sekretion von Entzündungsmolekülen kann so ermittelt werden.
• Die Beschreibung betrifft auch durch dieses Screeningverfahren getestete Wirkstoffe, da es das vorrangige Ziel war, Wirkstoffe zu finden, die zur Stimulierung der Expression der ß-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 ohne der Stimulierung der Sekretion dieser Moleküle fähig sind.
• Unter Screeninggesichtspunkten wird eine Kultur von normalen humanen Epithelzellen, vorzugsweise normalen Keratinozyten, bevorzugt, wenn sie in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgeführt wird. Die Expression von hBD2 und hBD3 Defensinen ist im Fall von undifferenzierten, basalen Keratinozyten sehr gering und variiert stark als Funktion des Donors und dem Ort der Probenahme. hBD2 wird insbesondere in 100 % der Proben von Gesichtshaut und Vorhaut und nur in 50 % der abdominalen oder Brustoperationsproben gefunden (R.S. Ali et al., Expression of the peptides antibiotics hBD1 und hBD2 in normal human skin. J. Invest. Dermatol 2001, 117: 106-111).
• Hierin wird ein reproduzierbares Modell beschrieben, das es erlaubt, eine große Vielzahl an potentiellen Wirkstoffen zu testen und die Expression der hBD2 und hBD3 mRNA zu detektieren.
• Die Beschreibung betrifft ein System zur Kultivierung von Keratinozyten in einem spezifischen Calciummedium. Die unter diesen Kulturbedingungen induzierte Differenzierung ermöglicht es, den basalen Expressionsspiegel der mRNA von hBD2 und hBD3 Defensinen zu erhöhen, und dies erleichtert die Detektion der Stimulierung.
• Die Kultivierung von Zellen in einem Modell mit 96 Vertiefungen, das das Screenen auf den gewünschten Effekt und qualitative und quantitative Analysen erlaubt, ist gut an das Format der 96 Vertiefungen angepasst.
• Die qualitative RT-PCR ermöglicht es, eine große Vielzahl an Wirkstoffen auszuwählen, und die Verifizierung dieser durch quantitative RT-PCR ist ein essentieller Schritt in der Validierung der Ergebnisse. Die Positivkontrollen für die Stimulierung (TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3) ergibt einen Induktionswert für Defensine und Entzündungsmoleküle, die als Referenz diesen und die quantitative RT-PCR Technik validieren.
• Der Test in den Überständen auf die Sekretionsmenge der Markermoleküle der Entzündung erlaubt es, nicht-entzündliche Wirkstoffe auszuwählen.
• Die obige erwünschte Aktivität wurde durch dieses Screeningverfahren in den folgenden Wirkstoffen gefunden:
• Wermutwurzel, Canadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuss, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnussblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, St. John's Kraut, Rosskastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.
• In den Beispielen ist jede Eigenschaft, die in Bezug auf den Stand der Technik neu erscheint, ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung, und es wird ein Schutz sowohl in Bezug auf die Funktion als auch die allgemeinen Aspekte angemeldet.
• Darüber hinaus werden in der Beschreibung und den Ansprüchen alle Prozentsätze als Gewichtsprozente angegeben, und die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, falls nichts anderes angegeben ist.
• Beispiel 1
• Erster Schritt im Screeningverfahren
• Eine Konzentration mit 1 % der Wirkstoffe wird auf normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem spezifischen Medium mit Calcium und ohne Serum (Endkonzentration 1,7 mM) getestet.
• Bei 80 % Konfluenz werden die Zellen mit den Wirkstoffen (1 Wirkstoff pro Vertiefung) für 16 h in Kontakt gebracht. Eine unbehandelte Kontrolle und 2 Positivkontrollen (TNFα 100 ng/ml für hBD2 und IFNy 100 ng/ml für hBD3) werden parallel auf derselben Kulturplatte angesetzt. Nach 16 h werden die Überstände gewonnen und die Zellen werden bei -80°C nach dem Waschen mit PBS trocken gefroren. Die gesamte RNA wird mittels eines Extraktionskits für 96 Vertiefungen auf Silicasäulen extrahiert und unter Verwendung eines Spektrophotometers für 96 Vertiefungen bei 260 nm und 280 nm getestet. Die RNA wird auf 5 ng/ml verdünnt.
• Es wird eine qualitative Einschritt-RT-PCR mit 50 ng anfänglicher RNA in 96 Vertiefungen auf Actin, hBD2 und hBD3 ausgeführt. Die Primer werden bei einer Konzentration von 0,5 µM verwendet und werden aus der Literatur entnommen: hBD2 Sinn: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3', hBD2 Antisinn 5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3' (J. Harder et al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997, 387: 861), hBD3 Sinn: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', hBD3 Antisinn: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', Actin Sinn: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', Actin Antisinn: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGTTTC-3' (J. Harder et al., Isolation and characterization of human ß-Defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem 2001, 276: 5707-5713).
• Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und folgen einem gemeinsamen Amplifizierungsprograrnm: 50 °C, 30 min, 94 °C, 2 min (94 °C, 30 s, 60°C, 30 s, 68°C, 30 s), 32 Zyklen für die Defensine und 30 Zyklen für Actin, 72°C, 10 min, 14°C Dauerschaltung.
• Nach der Amplifizierung werden die Produkte in einem Verhältnis von 3 µl Actin Amplifizierungsprodukte + 6 µl hBD2 Amplifizierungsprodukte + 6 µl hBD3 Amplifizierungsprodukte gemischt. 5 µl eines Gemisches aus Auftragspuffer und Wasser (2/3) werden zugegeben und die schließlichen 20 µl werden auf ein vorgegossenes 2 % Agarosegel aufgetragen. Die Proben wandern für 30 Minuten, und die Banden werden unter UV in einer Dunkelkammer sichtbargemacht und dann digital photographiert.
• Die Photos der Gele werden durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Intensität der Banden quantifiziert. Da der Grundlevel der Defensinexpression (unbehandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die für die Positivkontrollen erhalten werden (behandelt mit TNFα für hBD2 und mit IFNy für hBD3) und zeigen jede Stimulierung der Expression des in Frage kommenden ß-Defensins an.
• Am Ende des ersten Schritts werden die Wirkstoffe, die einen Effekt auf die β-Defensinexpression ausüben, selektiert, und die diesen Wirkstoffen entsprechenden Überstände werden dann mittels eines ELISA Kits getestet, um die Mengen an MIP3α, IL1 und IL8 zu bestimmen, die unter der Einwirkung der Wirkstoffe in das Kulturmedium sekretiert wurden. Die Mengen werden dann auf die RNA Konzentration bezogen, die in jeder Vertiefung getestet wurde, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.
• Ergebnistabellen für den ersten Schritt:
• Da der Grundlevel der Defensinexpression im Allgemeinen nicht detektierbar ist, wird die Stimulierung von hBD2 und hBD3 als Prozentsatz der Positivkontrollen (TNFα für hBD2 und IFNy für hBD3) ausgedrückt. Die Mengen an IL8 und MIP3α werden als pg/ml/RNA Konzentration (in ng/µl) angegeben. Effekte der Wirkstoffe auf die hBD2 Expression (Tabelle I)

  Wirkstoffe (verwendet mit 1 % G/G)	hBD2	MIP3α	IL8
  Kontrolle	0%	6,7	30,9
  TNFα	100 %	33	186
  Spirulin	137 %	28,8	87
  Quinoamehl	85%	-	-
  Wermutwurzel	76%	7,2	30,2
  Hollunderbeerrinde	65%	7,5	17,9
  Sonnenblume	58%	10,9	68,6
  Canadisches Berufkraut	50%	6,1	29,4
  Ananassaft	50%	7,6	39
  Bruchkraut	44%	7,8	55
  Kakao	39%	4,9	22,5+
  Kürbis	35%	5,2	33,1
  Pfefferm i nze	26%	1	4,8
  Sarsaparillewurzel	26%	4,7	15,4
  Betelnuss	1%	0	25,7
  Arnicablüte	0%	3,9	27,8
  Pfingstrose	0%	0	2
  St. John's Kraut (Johanniskraut)	0%	2,81	19,37
  Rosskastanie	0%	0,6	36,7
  Boldostrauch	0%	1,8	20,1
  Walnussblatt	0%	1,4	19,4
  Hibiskusblüte	0%	6,5	29,3
  Basilikumblatt	0%	-	-
  Schwarzer Chinatee	0%	-	-
  Himbeere	0%	-	-
  L-Isoleucin 10 µg/ml	0%	-	-
  D,L-Isoleucin 100 µg/ml	0%	5,6	30,6
  Isoleucinmethylester 100 µg/ml	16 %	3,8	7,7
  Jasmonsäure 100 µg/ml	7%	6	25,3

  Effekte von Wirkstoffen auf die hBD3 Expression (Tabelle II)

  Wirkstoffe (verwendet mit 1 % G/G)	hBD2	MIP3α	IL8
  Kontrolle	0%	6,7	30,9
  TNFα	100%	13,8	97
  Arnikablüte	460%	3,9	27,8
  Pfingstrose	192 %	0	2
  St John's Kraut	126 %	2,81	19,7
  Rosskastanie	103%	0,6	36,7
  Boldostrauch	86%	1,8	20,1
  Bruchkraut	73 %	7,8	55
  Hibiskusblüte	50%	6,5	29,3
  Betelnuss	45%	0	25,7
  Pfefferminze	40%	1	4,8
  Walnussblatt	27%	1,4	19,4
  Kakao	15 %	4,9	22,5
  Spirulin	6%	28,8	87
  Basilikumblatt	0%	-	-
  Schwarzer Chinatee	0%	-	-
  Himbeere	0%	-	-
  Wermutwurzel	0%	7,2	30,2
  Canadisches Berufkraut	0%	6,1	29,4
  Hollunderbeerrinde	0%	7,5	17,9
  Ananassaft	0%	7,6	39
  Quinoamehl	0%	8	39
  Sarsaparillewurzel	0%	4,7	15,4
  Sonnenblume	0%	10,9	68,6
  Kürbis	0%	5,2	33,1
  L-Isoleucin 10 µg/ml	0%	-	-
  D,L-Isoleucin 100 µg/ml	0%	5,6	30,6
  Isoleucinmethylester 100 µg/ml	6%	3,8	7,7
  Jasmonic Säure 100 µg/ml	0%	6	25,3

• Unter diesen Wirkstoffen sind die, welche die Kriterien für den ersten Schritt befriedigen, das heißt, die hBD2 und/oder hBD3 ohne Auslösung der Expression von MIP3 und IL8 Cytokinen stimulieren, die folgenden: Wermutwurzel, Canadisches Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruckkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuss, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnussblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingsrose, St. John's Kraut, Rosskastanie oder einer ihrer Extrakte, Jasmonsäure und deren Derivate und Vorläufer und Isoleucinester.
• Spirulin stimuliert hBD2 stark, aber löst die IL8 oder MIP3 Sekretion aus und wird daher nicht ausgewählt. Andere Wirkstoffe stimulieren die Defensine nicht. Es wurden L-Isoleucin und mehrere Derivate getestet, und es wird keine signifikante Stimulierung der humanen Defensine 2 und 3 durch eine qualitative RT-PCR festgestellt.
• Beispiel 2
• Zweiter Schritt des Screeningmodells
• Die Wirkstoffe, die am besten die Kriterien für den ersten Schritt erfüllen werden einer Dosis-Wirkungsanalyse unterzogen.
• Eine Untersuchung der Cytotoxizität der ausgewählten Wirkstoffe wird durch die Erhöhung der Dosen von 0,01 % auf 10 % ausgeführt. Die Lebensfähigkeit von 75 % wird als Grenze für die nicht-cytotoxische Konzentration angesetzt (% maximale Lebensfähigkeit).
• Die Wirkstoffe werden dann in 5 Konzentrationen (von 0,001 % bis zur max Lebensfähigkeit) in vierfachen Ansätzen auf normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem spezifischen Medium getestet, das mit Calcium angereichert und frei von Serum ist (CaCl₂ 1,7 mM) (selbe Bedingungen wie in Beispiel 1).
• Nach 16 h werden die Überstände gewonnen, und die Zellen werden nach dem Waschen mit PBS bei -80°C trocken eingefroren.
• Die gesamte RNA wird mittels eines Extraktionskits mit Silicasäulen für 96 Vertiefungen extrahiert und mittels eines Spektrophotometers für 96 Vertiefungen bei 260 nm und 280 nm getestet. Die RNA wird auf 5 ng/µl verdünnt.
• Es wird eine quantitative RT-PCR in 96 Vertiefungen auf Actin, hBD2 und hBD3 anfänglich mit 50 ng RNA mittels eines Einschrittkits, der Sybrgreen enthält, in einem Fluoreszenzthermocycler mit denselben Primern wie vorher (0,5 µM) ausgeführt. Das Amplifizierungsprogramm ist wie folgt: 50°C, 30 min, 94°C, 15 min, (94°C, 15s, 60°C, 30s, 72°C, 30s) x 50 Zyklen, 90°C, 1 min, 30°C, 1 min, 50°C bis 95°C (10 s für jedes °C), 14°C Dauerschaltung.
• Eine Untersuchung der Fusionsgraphen macht es möglich, die Spezifität der amplifizierten Produkte zu verifizieren. Der Fluoreszenzgraph ergibt als Funktion der Anzahl an Zyklen den C(T) Wert, der der Anzahl der Zyklen entspricht, die erforderlich ist, um ein Fluoreszenzsignal auszulösen. Je stärker eine mRNA exprimiert wird, desto niedriger ist der C(T) Wert. Die Berechnung von S_Gen = (1/2)^C(T) für jede RNA berücksichtigt die exponentielle Zunahme der Anzahl an Kopien während einer Amplifizierung. Die S_Gen hBD2 / S_Gen Actin und S_Gen hBD3 / S_Gen Actin Verhältnisse können mit denen der unbehandelten Kontrolle verglichen werden, um den Prozentsatz der gebildeten Stimulierung zu erhalten.
• Die Überstände der Wirkstoffe, deren Fähigkeit zur Induktion von Defensinen bestätigt, werden mittels eines ELISA Kits getestet, um die Mengen an MIP3α, IL8 und IL1α zu testen. Diese Tests werden mit demselben Überstand (200 µl) durch die Ausführung einer Verdünnungsreihe durchgeführt (um 1,5, um MIP3α und IL8 zu testen, dann um 2, um IL1 zu testen). Die Mengen werden dann auf die RNA Konzentration bezogen, die in jedem Test gemessen wird, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.
• Somit ist es möglich, die nicht-entzündliche Art der ausgewählten Wirkstoffe zu bestätigen und/oder die optimale Dosis für die Defensinstimulierung ohne die Auslösung der Sekretion von Entzündungscytokinen zu finden.
• Ergebnistabellen für den zweiten Schritt:
• Die quantitative RT-PCR macht es möglich, einen basalen Wert für die Defensinexpression für die unbehandelten Kontrollen zu erhalten. Die Ergebnisse werden daher als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Cytokinmengen an IL8, IL1 und MIP3 werden als pg/ml/RNA Konzentration angegeben (in ng/µl). Dosiseffekte der im ersten Schritt ausgewählten Wirkstoffe (Tabelle III)

  Wirkstoff	Konzentration	Lebensfähigkeit	hBD2	hBD3	MIP3α	IL8	IL1α
  Kontrolle		100 %	100%	100 %	5,6	47,4	26,9
  TNFα	100 ng/ml	-	1755 %	774%	23,6	175	21,8
  IFNy	100 ng/ml	-	472%	4631 %	11,6	100,5	40,1
  Boldostrauch	0,1 %	84%	182 %	168 %	2,2	33,6	28,2
  	0,5%	87%	92%	213 %	1,45	27,5	25,3
  	1%	76%	72%	703 %	0,4	31,7	20,2
  Arnica	0,01 %	93 %	117%	173 %	4,6	51,2	30,1
  	0,1 %	91%	128 %	561 %	2,5	34,1	38,5
  	0,3 %	75%	138 %	1830 %	4,1	24,1	37,9
  Quinoa	0,1 %	83%	143 %	102%	6	58,7	23,4
  	1%	91%	264 %	112%	5,8	50,2	17,7
  	5%	90%	401 %	237%	12,4	150,2	34,4
  	10%	92%	92%	438%	7,6	102,8	40,8
  Wermut	0,1 %	87%	88%	103%	3,2	36,9	39,5
  	1%	75%	117 %	116%	2,9	35	34,9
  	5%	78%	130%	452 %	3,2	61,6	22,3
  	10%	83 %	104 %	3962 %	2,3	66,3	25,8
  Betelnuss	0,1 %	87%	88%	84%	2,8	32,2	28,3
  	1%	77%	35%	261 %	0,28	23,7	39,5
  	2%	70%	98%	2781 %	0	7,6	44,8
  L-Isoleucin µg/ml	3,125	-	110%	89%	5,2	36,9	21
  	6,25	-	107%	94%	4,9	33,6	22,3
  	12,5	-	95 %	101%	5,9	42,2	25,3
  	25	-	110 %	106%	4,5	35,1	22,8
  Jasmonsäure ug/ml	100	-	86%	477%	4,6	37,9	31,2
  	500	-	134%	26919%	13,6	103,3	97,1
  α-MSH µg/ml	1	-	198 %	254%	4,5	34,6	24,7
  	100	-	186 %	217 %	3,9	41,7	26,1

• Die quantitative RT-PCR Technik macht es somit möglich, die stimulierende Wirkung von Boldostrauch, Arnika und Betelnuss auf hBD3 ohne die Induktion von proinflammatorischen Cytokinen zu bestätigen. 10 % Wermut stimuliert hBD3 ohne eine signifikante Stimulierung der Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen und Quinoasamenmehl stimuliert hBD2 ab einer Wirkstoffkonzentration von 1 %. Bei 5 % stimuliert es hBD2 und hBD3.
• L-Isoleucin wird mit den 4 Konzentrationen (3,125, 6,25, 12,5 und 25 µg/ml) getestet, von denen beschrieben wurde, dass sie zur Stimulierung von Defensin-3 beim Rind fällig sind (P. Fehlbaum et al., An essential amino acid induces epithelial ß-Defensin expression, PNAS 2000, 97: 12723-12728). Es wurde nicht festgestellt, dass diese Aminosäure zur Induktion von hBD2 und hBD3 in normalen humanen Keratinocyten fähig ist.
• 100 µg/ml Jasmonsäure und α-MSH sind auch zur Induktion der Defensine 2 und/oder 3 fähig.
• Unter diesen Wirkstoffen sind die, welche die erfindungsgemäßen Kriterien erfüllen, diejenigen, welche hBD2 und/oder hBD3 ohne Auslösung der Expression von MIP3, IL8 oder IL1 Cytokinen stimulieren, folgende: Boldostrauch, Arnica, Quinoa, Wermut oder einer der Extrakte hiervon, Jasmonsäure und deren Derivate und Vorläufer, α-MSH oder eines der Peptide, aus denen sich α-MSH zusammensetzt, oder eine chemische Struktur, die eines dieser Peptide nachahmt.
• Beispiel 3:
• Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 werden Retinolsäure und Retinol auf ihre Fähigkeit getestet, um hBD2 und/oder hBD3 zu stimulieren.
• Die Ergebnisse sind die folgenden:

  Wirkstoffe	Konzentration	hBD2	hBD3
  Kontrolle		100%	100%
  TNFα	100 ng/ml	1755 %	774%
  IFNy	100 ng/ml	472 %	4631 %
  Rentinolsäure	0,005 %	26%	161 %
  Retinol	0,01 %	168 %	17562 %

• Es wird beobachtet, daß Retinolsäure bei 0,005 % die hBD3 Synthese schwach stimuliert und dass Retinol (oder Vitamin A) hBD2 schwach und hBD3 stark stimuliert. Um festzustellen, ob diese Produkte Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen auslösen, werden 3 kosmetische Formulierungen gemäß Beispiel 4 mittels der folgenden Variationen hergestellt:
• - Plazebocreme A: Es wird kein Produkt zur Formulierung zugegeben, das heißt, die „Produkte der Erfindung“ gemäß diesem Beispiel werden nicht zur Formulierung gegeben
• - Creme B: Das „Produkt der Erfindung“ gemäß dem Beispiel ist Retinolsäure und die in der Formulierung verwendete Konzentration ist 0,005 %.
• - Creme C: Das „Produkt der Erfindung“ gemäß dem Beispiel ist Retinol, und die in der Formulierung verwendete Konzentration ist 0,01 %.
• Diese drei Formulierungen werden auf zwei verschiedene Arten getestet:
1. 1) Durch wiederholte Anwendung bei Tieren, um den primären Hautreizungsindex der Präparationen zu bestimmen.
2. 2) Durch wiederholte Pflasteranwendung bei humanen Freiwilligen, um das reizende oder sensibilisierende Potential der Formulierungen zu bestimmen.
• Mit diesen drei Formulierungen, wie sie in beiden Studien verwendet werden, wird keine Reizung oder Allergie gefunden, und Retinolsäure und Retinol (wie auch ihre Vorläufer und Derivate) können daher bei den verwendeten Konzentrationen nicht als Auslöser für eine Entzündungs-, Reiz- oder Intoleranzreaktion betrachtet werden.
• Beispiel 4: Antifaltencreme

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Glycerin	5
  Carbomer®	0,2
  Tetranatrium-EDTA	0,1
  Camelia sinensis Blattöl	2
  Hydriertes Polyisobuten	8
  Glycerylstearat SE	2
  Dimethicon	1
  Glycerylstearat und PEG-I00 Stearat	1,5
  Triethylhexanoin	5
  Stearinsäure	2
  Cetylalkohol	1
  Silica	1
  Dicaprylylmaleat	6
  Gylcerylstearat	1
  Dimethicom	3,5
  Wasser	2,3
  Triethanolamin	0,5
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,7
  Duft	0,3
  Tocopherolacetat	0,5
  Retinol	0,1
  Natriumhyaluronat	0,03
  Centella asiatica Extrakt	1
  Hydrolysiertes Sojaprotein	0,4
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

• Beispiel 5: Antipickelserum

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Trinatrium-EDTA	0,1
  Hydroxymethylcellulose	0,1
  Xanthangummi	0,3
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethyl paraben	0,56
  Butylenglycol	5
  Polysorbat 20	1
  Duft	0,05
  Tocopherolacetat	0,1
  Natriumcitrat	0,65
  Magnesiumascorbylphosphat	1
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

• Beispiel 6: Grundlage

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Magnesiumaluminiumsilicat	0,5
  Cellulosekautschuk	0,35
  Glycerin	3
  Polyvinylpyrrolidon	5
  Dipropylenglycol	0,05
  Propylenglycol	2
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	1
  Xanthan kautschuk	0,2
  Triethanolamin	0,7
  Isopropylpalmitat	4
  Mineralöl	2
  Hexyldecanol	3
  Glycerylstearat	2
  Stearinsäure	2,4
  Ölsäure	0,5
  Polysorbat 80	0,7
  Tocopherol	0,5
  Titandioxid	7
  Eisenoxid	4
  Nylon-2	6
  Natriumhyaluronat	0,01
  Duft	0,05
  Propylenglycoldicaprylat/Dicaprat	7,2
  Produkte der Erfindung	0,05

• Beispiel 7: UVA/UVB schützende Bleichcreme

• INCI Name	Menge
  Octylmethoxycinnamat	4
  Cetyl-PEG / PPG-10 / 1 Dimethicon	3
  Bis-PEG / PPG-14 /14 Dimethicon	3
  Dimethicon	6
  Cyclomethicon	4
  Polydecen	4
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,65
  Tocopherol	0,5
  Duft	0,8
  PPG-3 Myristylether	0,5
  Titandioxid	8
  Phenoxyethanol	0,35
  Natriumcitrat	0,65
  Magnesiumascorbylphosphat	3
  Wasser	ad 100 g
  Xanthankautschuk	0,4
  Butylenglycol	2
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

• Beispiel 8: Schlankheitsgel

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Tetranatrium-EDTA	0,2
  Carbomer®	0,5
  Glycerin	3,0
  Polyglycerylmethacrylat und Propylenglycol	5,0
  Dipropylenglycol	3,0
  Butylenglycol	5,0
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,65
  Triethanolamin	0,5
  Koffein	2
  Ruscus aculeatus Extrakt	1
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

• Beispiel 9: Feuchtigkeitscreme

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Carbomer®	0,35
  Tetranatrium-EDTA	0,1
  Polysorbat 60	3
  Sorbita nstea rat	2,6
  Isopropylpalmitat	2,5
  Cetylpalmitat	4
  Ethylhexylpalmitat	5,1
  Squalen	1
  Cetylalkohol	2,5
  Cyclomethicon	1
  Dimethicon	0,5
  Triethanolamin	0,53
  Butylenglycol	5
  Duft	0,3
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	0,65
  Tocopherolacetat	0,5
  Natriumhyaluronat	0,03
  Süßmandelölprotein und Glycerin	2
  Polyglycerylmethacrylat	5
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

• Beispiel 10: Shampoo

• INCI Name	Menge
  Wasser	ad 100 g
  Xanthangummi	0,8
  Citronensäure	0,8
  Natriumlaurylsulfat	40
  Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben	2
  Produkte der Erfindung	0,001 bis 20

Claims (10)

1. Kosmetische Verwendung eines Wirkstoffs, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Boldo-Extrakt, einem Kakao-Extrakt und Jasmonsäure, wobei der Extrakt erhalten wird durch wässrige Extraktion oder Extraktion mit Wasser-Butylenglycol zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandeltes Gewebe, durch direkte oder indirekte Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD2) und/oder vom Typ 3 (hBD3), ohne ein proinflammatorisches Molekül zu stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIP 3 alpha (Makrophageninflammationsprotein), IL8 und IL1.
2. Kosmetische Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Extrakt ein Boldo-Extrakt ist, der durch eine wäßrige Extraktion oder eine Extraktion mit Wasser-Butylenglycol erhalten wird.
3. Kosmetische Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in einer kosmetischen Zusammensetzung in einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 20 Gewichtsprozent vorhanden ist.
4. Kosmetische Verwendung von mindestens einem Wirkstoff wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert zur Ausübung einer kosmetisch bakteriziden und/oder kosmetisch fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Haut, Mukosa, Haaren und Nägeln und Kopfhaut, wobei im Fall der Kopfhaut der Wirkstoff verwendet werden kann, um Schuppen zu verhindern oder zu behandeln.
5. Kosmetische Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Wirkstoff in Kombination mit zumindest einem mikrobioziden oder mikrobiostatischen Mittel vorliegt.
6. Verwendung von mindestens einem Wirkstoff wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf behandelte Gewebe zur Behandlung oder Prävention von Akne, wobei der Wirkstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt ist.
7. Verwendung von mindestens einem Wirkstoff wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Ausübung einer bakteriziden und/oder fungiziden Wirkung auf das behandelte Gewebe zur Behandlung und/oder Prävention von Bakterien- oder Pilzdermatose, wobei der Wirkstoff mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt ist.
8. Verwendung gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest ein mikrobiozides oder mikrobiostatisches Mittel enthält.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8 zur Behandlung von Störungen, die mit Mikroben zusammenhängen, ausgewählt aus Schuppen, Akne, Vitiligo, Dermatitis und anderen Erkrankungen der Haut, Mukosa, Kopfhaut und Haare und Nägel.
10. Verwendung von mindestens einem Wirkstoff wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert im Gebiet der Geweberekonstruktion, um den bakteriziden Effekt von beta-Defensinen bei der Erstellung von Epidermis und rekonstruierter Haut und der Lebenserhaltung von Hautbiopsien auszunutzen.