DE10251709C5

DE10251709C5 - Screening-Verfahren für Wirkstoffe zur Stimulierung der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3

Info

Publication number: DE10251709C5
Application number: DE10251709A
Authority: DE
Inventors: Eric Perrier; Ingrid Pernet; Anne Guezennec; Corinne Reymermier; Joëlle Guesnet
Original assignee: Yves Saint Laurent Parfums SA; Engelhard Lyon SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS; Yves Saint Laurent Parfums SA
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2002-11-06
Publication date: 2011-02-24
Anticipated expiration: 2022-11-07
Also published as: DE10251709B4; GB0225886D0; JP5226257B2; JP2004067660A; JP2012250992A; JP4824901B2; US20040091493A1; US20160361250A1; GB2391476B; DE10251709A1; DE10262193B4; KR100697360B1; FR2843125B1; JP2008019264A; FR2843125A1; GB2391476A; KR20040012426A

Abstract

Screening-Verfahren für Wirkstoffe, die zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen β-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind und nicht zur Stimulierung oder merklichen Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül fähig sind, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Kultivierung eines Zell- oder Gewebemodells, in Gegenwart von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die unter geeigneten Kulturbedingungen gescreent werden können, wobei das Zell- oder Gewebemodell Epithel-Zellen oder Hautbiopsien, die am Leben gehalten werden, oder Modelle einer rekonstruierten Epidermis oder Modelle einer rekonstruierten Haut enthält, die Epithel-Zellen enthalten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen geeignet sind,
b) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung der Expression der humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 vorhanden ist, und
c) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung von proinflammatorischen Molekülen oder von Molekülen vorhanden...

Description

Die Erfindung betrifft Screeningverfahren für Wirkstoffe, die zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind.
Stand der Technik
Antibiotische Peptide sind kleine Moleküle (10 bis 50 Aminosäuren), die zur Zerstörung von Mikroorganismen fähig sind, wie Bakterien, Pilze oder Viren, indem sie ihre Zellmembran permeabilisieren. Seit der Entdeckung 1981 bei Arthropoden wurden fast 500 Moleküle mit solchen Eigenschaften in höheren Organismen identifiziert (Pflanzen, Insekten, Säugern, Menschen). Die gemeinsame Eigenschaft von antimikrobiellen Peptiden ist ihre amphipathische Struktur, das heißt die Verteilung von Aminosäuren in kationische (positiv geladene) Zonen, die sich von den hydrophoben Zonen unterscheiden. Es ist diese Struktur, die ihnen ihre Aktivität und Spezifität der Wirkung gegen bakterielle cytoplasmatische Membranen verleiht, da die Membranen eine große Anzahl an negativ geladenen anionischen Phospholipiden aufweisen, die an die kationischen Stellen der antibiotischen Peptide binden (M. Zalsoff, Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Nature 2002, 415: 389–395). In Abhängigkeit ihrer Struktur kann der Aktivitätsbereich dieser Peptide entweder sehr eng oder sehr breit sein.
Man findet antimikrobielle Peptide hauptsächlich in der tierischen Welt: Bei Tiergiften (Skorpionen, Bienen, Spinnen), bei Drosophila oder Blaufliege, in Rinderneutrophilen, in Leukozyten und im Dünndarm des Schweins, in Milch, in Fröschen, in Muscheln des Mittelmeeres usw. In der Pflanzenwelt schützen die Thionine und Defensine die Pflanzensamen und vegetativen Gewebe gegen Bakterien.
Die meisten antibakteriellen Peptide findet man in den Epithelgeweben von Tieren, wo sie einen wichtigen Teil als erste Immunbarriere spielen. Sie wurden in der Haut von Fröschen und Mäusen wie auch in Gastrointestinal- und Atemwegssystemen von Menschen und in der menschlichen Haut und der Mukosa gefunden.
Die Defensine sind eine der am meisten untersuchten Klassen an antimikrobiellen Peptiden. Diese Klasse besteht aus Cystein-reichen Molekülen mit drei Disulfidbrücken. Sie finden sich bei Pflanzen, Insekten und verschiedenen Säugern. Beim Menschen findet man zwei Klassen an Defensinen, die sich voneinander in Bezug auf den Abstand und die Bindungen zwischen den sechs Cysteinresten unterscheiden:

– Die α-Defensine (6 Typen), die aus Neutrophilen (HPN1 bis 4, humanes Neutrophilenpeptid) und den Paneth-Zellen des Gastrointestinaltrakts (α-Defensine 5 und 6) isoliert wurden
– Die β-Defensine, die länger und basischer sind, und in der Mukosa und in den Epithelzellen (Haut, Luftröhre, Zunge, Tonsillen, Speichel ...) exprimiert werden, treten in 3 Formen auf: • einer konstitutiven Form, hBD1 (humanes β-Defensin I), das vorwiegend in den Nieren, aber auch im Pankreas, Speichel, den Lungen, der Plazenta und der Haut gefunden wird. • Zwei induzierbaren Formen: hBD2 und hBD3 (humane β-Defensine 2 und 3):

Die Induktion dieser Defensine in der Haut ist die erste Verteidigungslinie des Körpers, um sich selbst gegen die steigende Anzahl an pathogenen Mikroorganismen zu schützen, mit denen er konfrontiert wird. Zusätzlich hat hBD3 chemotaktische Eigenschaften für unreife dendritische. Zellen und Gedächtnis-T-Lymphozyten (D. Yang et al., Betadefensins: linking innate and adaptive immunology through dendritic and T cell CCR6. Science 1999, 286: 525–528) und scheint so eine wichtige Rolle bei der Förderung der Immunreaktion, Entzündung und Heilung zu spielen.
Die Zunahme in der Menge an β-Defensiven in der menschlichen Haut trägt daher zur Konservierung des mikrobiellen Ökosystems der Haut durch den Schutz der Überinvasion durch bestimmte Spezies bei, die pathogen sein können (Staphylococcus aureus), wobei die Haut geschützt und gesund bleibt. Um dies auszuführen, können zwei Strategien ins Auge gefaßt werden:

– entweder topische Applikation der synthetischen Peptide mit Sequenzen oder Strukturen, die zu denen der bekannten antibiotischen Peptide ähnlich sind, die vom Fachmann beschrieben wurden,
– oder provozierende Induktion von Defensinen durch topische oder orale Verabreichung eines Wirkstoffs, der zur Stimulierung der Synthese dieser Peptide in natürlichen Sekretionszellen fähig ist.

Mit Ausnahme der vorher erwähnten Cytokine (TNFα, IFNγ, IL1) wurden nur wenige Produkte beschrieben, die die Fähigkeit zur Induktion von β-Defensiven haben, außer bei Tieren, bei denen L-Isoleucin die Expression von hBD3 in Nierenepithelzellinien vom Rind induziert (P. Fehlbaum et al., An essential amino acid induces epithelial β-defensin expression. PNAS 2000, 97: 12723–12728, Patent WO 01/68085 A1 M. Anderson et al., Method for stimulation of defensin production. 20-09-2001). Beim Menschen wurde festgestellt, daß die Keratinocytendifferenzierung die Bildung von hBD2 stimuliert (A. Y. Liu et al., Human β-defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of differentiation. J. Invest. Dermatol 2002, 118, 275–281).
Untersuchungen bezüglich des Vorkommens von hBD2- und hBD3-Defensinen in der Haut werden auf Hautschnitten, Explantaten und kultivierten Zellen oder rekonstruierter Haut ausgeführt. Die Zunahme der Menge an Defensinen kann durch eine Vielzahl an Techniken sichtbar gemacht werden, aber bisher wurde keine dieser Techniken quantitativ auf die Screeningsuche für einen Wirkstoff angewendet, der zur Stimulierung von hBD2 und hBD3 in humanen Zellen fähig ist.
So beschreiben bspw. Harder et al. (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Vol 22, pp. 714–721, 2000), dass TNFα und IL1β, jedoch nicht IL6, die Expression von humanem Defensin-2 in respiratorischen Epithelschichten induziert. Harder et al. (2000) beschreiben weiterhin einen Assay zur Bestimmung der Wirkung der Testsubstanzen TNFα, IL1β und IL6.
Ogushi et al. (Journal of Biological Chemistry, Vol 276. No 32, Issue of August, pp. 30521–30526, 2001) zeigen, daß ein aus Salmonella enteritidis isoliertes Flagella-Filament-Protein (FliC) die Produktion humaner β-Defensin-2 mRNA durch Caco-2-Zellen induziert. Ogushi et al. (2001) bestimmen die Wirkung von Salmonella enteritidis, Salmonella typhi und Salmonella dublin sowie von Kulturüberständen dieser Bakterien auf die Induktion der Expression humaner β-Defensin-2-mRNA durch Caco-2-Zellen.
Chang et al. (American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol 22, pp. 502–510, 2000) haben einen neuen Mechanismus der Retinsäure(all-trans-retinoic acid, ATRA)-unterstützten Interleukin-8-Expression in Epithelschichten der Atemwege bestimmt. Chang et al. (2000) beschreiben Dosis-Effekte von ATRA auf die Interleukin-8-Expression sowie Assays, mit denen die Expression von Interleukin-8 nachgewiesen werden konnte.
In einer von Affymetrix publizierten Druckschrift (Gene Expression Monitoring) wird in allgemeiner Form gewebe- und zellspezifische Expression über die Verwendung eines GenChips mit dem Humanen Genom U133 Set (HG-U133A und HG-U133B) beschrieben.
Jia et al. (Gene 263 (2001), 211–218) zeigen die Entdeckung des humanen β-Defensins HBD-3 über einen Genom-basierten Ansatz. Jia et al. (2001) konnten dabei eine Expression von HBD-3 z. B. in Hautzellen nachweisen.
US 5,679,374 A beschreibt Zusammensetzungen zur Behandlung von Akne, insbesondere zur simultanen Behandlung der Oberflächen-Schichten und der tieferen Schichten der Haut. US 5,679,374 A beschreibt in diesem Zusammenhang eine Zusammensetzung, enthaltend Vitamin A (Retinol) als Wirkstoff, zur Behandlung von Akne. Defensine werden in US 5,679,374 A nicht beschrieben.
Auch EP 0 608 433 A1 zeigt Zusammensetzungen für dermatologische Anwendungen, enthaltend Vitamin A (Retinol) als Wirkstoff. EP 0 608 433 A1 gibt jedoch keinen Hinweis auf Defensine.
Die ältere, aber nachveröffentlichte Druckschrift EP 1 366 772 A1 offenbart Regulatoren der GM-CSF- und/oder Defensin-Expression in Epithelzellen, umfassend einen ETS-Transkriptionsfaktor oder ein diesen Faktor kodierendes Gen. EP 1 366 772 A1 diskutiert dabei die Beteiligung von ETS-Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Expression des GM-CSF-Gens aufgrund chronischer Entzündungen, welche typischerweise Asthma in Epithelzellen umfassen, oder bei der Regulation der Expression des Defensin-Gens aufgrund von Infektionen. EP 1 366 772 A1 stellt dabei ausschließlich auf Epithelzellen der Atemwege ab. Diese Druckschrift offenbart ein Screeningverfahren, bei dem eine Substanz gesucht wird, welche die GM-CSF-Bildung unterdrückt und die Bildung des β-Defensin-Proteins aktiviert.
In Nagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis (Berlin [u. a.], 1992, 5. Auflage, Band 4, S. 346–352) werden in allgemeiner Form die antibakterielle und die antiphlogistische Wirkung von Arnikablüten beschrieben. Dort wird jedoch kein Zusammenhang zwischen Arnikablüten und Defensinen hergestellt oder Wirkstoffe beschrieben, die zur Stimulation von humanen β-Defensiven geeignet sind.
Die Japanische Patentanmeldung JP 2002-186 485 offenbart ein Messverfahren zur Bestimmung von EOTAXIN, RANTES oder β-Defensin-2-mRNA oder -cDNA. Auch JP 2002-186 485 offenbart keine Screeningverfahren oder Zusammensetzungen unter Verwendung von Wirkstoffen, die zur Stimulation von humanen β-Defensiven geeignet sind.
Abschließend diskutieren z. B. Cutuli et al. (Journal of Leukocyte Biology, Volume 67, Seiten 233–235, Februar 2000) antimikrobielle Effekte von α-MSH-Peptiden, beschreiben diesbezüglich jedoch ebenfalls keine Screeningverfahren oder Zusammensetzungen.
Die herkömmlich vom Fachmann verwendeten Techniken können in der Tat nicht auf das vorliegende Problem angewendet werden, in anderen Worten zur Suche nach Wirkstoffen, die zur Stimulierung von humanen Defensinen auf eine quantitativ bewiesene Art fähig sind (Fehlen an im Handel erhältlichen Antikörpern, was es unmöglich macht, quantitative Tests auf Proteine mittels ELISA-Verfahren auszuführen, Fehlen an Molekularbiologieverfahren vom in-situ-Hybridisierungstyp, Fehlen an Northern-Transfer, RT-PCR die mehr qualitativ als quantitativ sind, Modellen von Humanzellen in sehr komplexen dreidimensionalen Kulturen, die nicht in Screeningverfahren verwendet werden können).
Ein solcher Test wird innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung entwickelt.
Ziele der Erfindung
Das Ziel war es, Wirkstoffe zu identifizieren, die zur Induktion der Expression von β-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind, ohne die Entzündungsreaktion auszulösen, beispielsweise ohne Überstimulierung der Sekretion von Molekülen, die gewöhnlich in Entzündungsreaktionen exprimiert werden.
Bisher haben alle Moleküle, die beschriebenermaßen die Fähigkeit zur Stimulierung von Defensinen beim Menschen haben (TNFα, IL1, LPS, Bakterien IFNγ ...) auch proinflammatorische Eigenschaften. Sie stimulieren die Entzündungscytokine wie IL1, IL8 oder MIP3α.
Das Ziel der Erfindung ist es daher, das neue technische Problem der Bereitstellung eines Wirkstoffs zu lösen, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist ohne Auslösung von Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen.
Das Ziel der Erfindung ist es, das neue technische Problem der Bereitstellung eines Wirkstoffs zu lösen, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder 3 fähig ist, ohne direkt oder indirekt die Synthese von proinflammatorischen Molekülen zu stimulieren oder nennenswert zu stimulieren, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Das Ziel der Erfindung ist es daher, das neue technische Problem der Bereitstellung einer Zusammensetzung zu lösen, die mindestens einen wie oben definierten Wirkstoff enthält.
Das Ziel der Erfindung ist es, das technische Problem der Bereitstellung eines Screeningverfahrens für die oben definierten Wirkstoffe bereitzustellen.
Das Ziel der Erfindung ist es, das neue technische Problem der Bereitstellung einer Zusammensetzung zu lösen, die den wie oben definierten Wirkstoff zur Verwendung im Gebiet der Kosmetik und der Pharmazie enthält.
Diese Verwendung wird im wesentlichen ausgeführt, um eine bakterizide und/oder fungizide Aktivität vorzugsweise durch topische Anwendung auf Geweben auszulösen, beispielsweise Haut, Mukosa, Haaren und Nägeln oder Kopfhaut.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung verwendet den Ausdruck ”Wirkstoff”, um potentielle zu screenende Wirkstoffe zu bezeichnen, und den Ausdruck ”Defensine”, um auf β-Defensive vom Typ 2 und/oder 3 Bezug zu nehmen, wenn der Ausdruck zur Bezeichnung von Defensinen verwendet wird, die durch die erfindungsgemäßen Wirkstoffe stimuliert werden.
Gemäß Anspruch 1 betrifft die Erfindung ein Screeningverfahren für einen Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, der keine Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursacht.
Der Ausdruck ”der keine Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursacht” wird verwendet, um auszudrücken, daß die Verwendung der Wirkstoffe keine schädlichen Nebenwirkungen für den Anwender des Wirkstoffs hervorruft. Der Ausdruck ”schädlich” meint Reaktionen, wie Hautausschläge, Jucken, Reizung, erhöhte Hautempfindlichkeit usw.
Vorteilhafterweise stimuliert der Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 (hBD 2) und/oder humanen beta-Defensinen vom Typ 3 (hBD3) fähig ist, nicht oder nicht nennenswert die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Der Ausdruck ”die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht nennenswert zu stimulieren, die im Verlauf der Entzündungsprozesse gewöhnlich co-exprimiert werden” bezieht sich auf die Tatsache, daß der Wirkstoff proinflammatorische Moleküle oder Moleküle nicht stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündunsgprozessen co-exprimiert werden oder sie nur in einem Ausmaß stimuliert, das geringer ist als das von TNFalpha (TNFα) oder gamma-Interferon (IFNγ), vorzugsweise eine Stimulierung unter 75% der maximalen Stimulierung, die durch TNFalpha oder gamma-Interferon induziert wird bei identischen Temperatur-, Kontaktzeit- und Ausführungsbedingungen.
Vorteilhafterweise ist das proinflammatorische Molekül oder das Molekül, das gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen exprimiert wird, speziell MIP3alpha oder IL8 oder IL1 oder ein anderes Interleukin oder Histamin, Tryptase, Substanz P, Leukotriene oder Prostaglandine.
Vorteilhafterweise stimuliert der Wirkstoff die direkte oder indirekte Bildung von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht nennenswert, die im Verlauf von Entzündungsprozessen in Kulturen von humanen Epithelzellen, insbesondere Keratinocyten und/oder Corneocyten in Kultur oder von humanen Hautbiopsien, die am Überleben gehalten werden, oder in Modellen von rekonstruierter Epidermis oder in Modellen von rekonstruierter Haut oder in konstruierten oder nicht konstruierten Zellmatrizes oder von deepidermisierten Dermen. Solche Epithelzellen werden vorzugsweise als ”normal” bezeichnet.
Der Ausdruck ”normal” wird verwendet, um Epithelzellen zu bezeichnen, die nicht von immortalisierten Zelllinien stammen, die aber Zellen sein können, die von pathologischen Geweben oder genetisch veränderten Zellen stammen.
Vorteilhafterweise wird der Wirkstoff ausgewählt aus Wermutwurzel, Kanadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, Johanniskraut, Roßkastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.
Vorteilhafterweise erhält man diese von Pflanzen stammenden Wirkstoffe durch Extraktion, vorzugsweise durch eine wässrige Extraktion, aber auch durch andere Extraktionsverfahren, wie beispielsweise in einem Wasser/Butylenglycolgemisch (von 1/99 bis 99/1 G/G). Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder eines der Peptide, aus denen alpha-MSH besteht, oder eine chemische Struktur, die diese Peptide nachahmt, Isoleucinester und Calcium oder irgendwelche organischen oder mineralischen Calciumsalze werden, wie sie sind, in Wasser oder Ethanol oder anderen Lösemitteln verdünnt verwendet, die mit dem beschriebenen Modell kompatibel sind.
Unter Einbeziehung des erfindungsgemäßen Screeningverfahrens kann eine Zusammensetzung hergestellt werden, die zumindest einen wie oben definierten Wirkstoff umfaßt.
Vorteilhafterweise enthält die verfahrensgemäß hergestellte Zusammensetzung diesen Wirkstoff in einer Konzentration im Bereich von 0,001% bis 20%, vorzugsweise 0,01% bis 10%. Diese Konzentrationen werden als Gewichtsprozent ausgedrückt, insbesondere wenn der Prozentsatz nicht klar als Gewichtsprozent erwähnt ist.
Die Konzentration wird so optimiert, daß der Wirkstoff zur Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, während er keine Reizung oder Entzündung induziert, insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht stimuliert oder nicht nennenswert stimuliert, die im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Eine verfahrensgemäß hergestellte Zusammensetzung verwendet zumindest einen Wirkstoff, wie oben definiert, zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff in einer Konzentration vorliegt, die zur Stimulierung der Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, wobei sie keine Reizung oder Entzündung induziert, insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht stimuliert oder nicht nennenswert stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, wobei der Wirkstoff möglicherweise mit einem kosmetisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt wird.
Eine verfahrensgemäß hergestellte Zusammensetzung verwendet zumindest einen wie oben definierten Wirkstoff zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei der Wirkstoff in einer Konzentration vorhanden ist, um die Expression der beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 zu stimulieren und keine Reizung oder Entzündung hervorzurufen und insbesondere die direkte oder indirekte Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül nicht oder nicht merklich zu stimulieren, das gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, wobei der Wirkstoff möglicherweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff gemischt wird.
Vorteilhafterweise umfaßt die verfahrensgemäß hergestellte Zusammensetzung zumindest ein mikrobiozides und/oder mikrobiostatisches Mittel. Der Ausdruck ”mikrobiozides Mittel” wird verwendet, um auf die Gruppe an Mitteln mit einer zerstörenden Wirkung auf Bakterien Bezug zu nehmen und der Ausdruck ”mikrobiostatisches Mittel”, um die Gruppe an Mitteln mit einem limitierenden Effekt auf die bakterielle Proliferation zu bezeichnen.
Gemäß Anspruch 1 betrifft die Erfindung ein Screeningverfahren für Wirkstoffe, die zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind und keine Reizung oder Entzündung hervorrufen und insbesondere nicht zur Stimulierung oder merklichen Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül fähig sind, das im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich co-exprimiert wird (diese Wirkstoffe werden in der Erfindung als ”potentielle zu screenende Wirkstoffe” beschrieben), das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:

a) Kultivierung eines Zell- oder Gewebemodells in Gegenwart von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die unter geeigneten Kulturbedingungen gescreent werden können, wobei das Zell- oder Gewebemodell Epithel-Zellen oder Hautbiopsien, die am Leben gehalten werden, oder Modelle einer rekonstruierten Epidermis oder Modelle einer rekonstruierten Haut enthält, die Epithel-Zellen enthalten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen geeignet sind (das Verfahren kann auf mindestens einen potentiellen Wirkstoff angewendet werden, es ist aber vorteilhafter, eine große Anzahl an Wirkstoffen (”oder Wirksubstanzen”) gleichzeitig zu testen),
b) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung der Expression der humanen beta Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 vorhanden ist, und
c) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung von proinflammatorischen Molekülen oder von Molekülen vorhanden ist, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, ausgenommen der direkten oder indirekten Identifizierung von GM-SCF.

Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren einen zusätzlichen Schritt d), worin zumindest ein auf diese Weise getesteter Wirkstoff ausgewählt wird, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanem β-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist und gleichzeitig die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Dem Leser ist bewußt, daß die Erfindung nicht durch die bestimmten Analyseverfahren beschränkt wird, die nur ein Mittel sind, um das Screeningprinzip der Erfindung auszuführen.
Tatsächlich können in der Zukunft andere Analyseverfahren die derzeit verwendeten Verfahren ersetzen, wie Verfahren mittels Antikörper, die hBD2 und 3 erkennen (EIISA-Verfahren, Immunblots, Immunhistologie usw.).
Das Screeningverfahren in Schritt a) umfaßt ein Zell- oder Gewebemodell, das Epithelzellen oder humane Hautbiopsien, die am Leben gehalten werden oder Modelle rekonstruierter Epidermis oder Modelle rekonstruierter Haut enthält, die Epithelzellen enthalten, beispielsweise Keratinozyten und/oder Corneozyten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen geeignet sind, die insbesondere einen Calciumgehalt im Bereich von 0 bis 100 mmol/l, vorzugsweise 1,7 mmol/l umfassen.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt a) das Vorkommen von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die mit dem Zell- oder Gewebemodell für einen Zeitraum von 6 bis 48 h, vorzugsweise etwa 16 h (Kontaktzeit) gescreent werden.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt b) eine Extraktion der Gesamt-RNA und eine RT-PCR-Analyse der Expression von mRNA, die für die oben zitierten humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt b) eine RT-PCR auf Actin (schwach stimuliertes Reportergen), so daß Erhöhungen der für hBD2 und hBD3 kodierenden mRNA auf die für Actin kodierende mRNA bezogen werden.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt b) die Auftragung der amplifizierten mRNA auf ein Agarosegel, das eine Nukleinsäureinsertion enthält, die unter UV sichtbar ist (wie Ethidiumbromid).
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt b) nach der Wanderung der Produkte auf einem Agarosegel einen Vergleich der Intensitätsverhältnisse von hBD2/Actin- und hBD3/Actin-Banden unter UV-Licht.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt c) einen ELISA Test für proinflammatorische Moleküle oder Moleküle, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren in Schritt d) die Selektion von zumindest einem Wirkstoff, der zur Stimulierung der Expression von mRNA fähig ist, die für die humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert ohne Stimulierung oder merkliche Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen coexprimiert werden.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren die Selektion von Wirkstoffen, die die Expression der oben erwähnten humanen beta-Defensine stimulieren und nicht ein proinflammatorisches Molekül oder nicht ein Molekül stimulieren oder nennenswert stimulieren, das im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich coexprimiert wird, wie IL1, IL8 und MIP3α.
Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren die folgenden Schritte:

– Zusammenbringen der potentiellen, zu screenenden Wirkstoffe mit normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in einem spezifischen Medium ohne Serum und mit Calcium angereichert, beispielsweise durch Einbeziehung einer unbehandelten Kontrolle und zwei parallelen Positivkontrollen (TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3),
– Extraktion und anschließender Test der Gesamt RNA mit einem Spektrophotometer, vorzugsweise bei einer Wellenlänge im Bereich von 260 bis 280 nm, wobei die RNA möglicherweise verdünnt wird,
– Ausführung einer RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 mit der anfänglichen RNA,
– Retrotranskription der Gesamt-RNA und anschließende Amplifikation des retrotranskribierten Produkts (cDNA), die beispielsweise in einem Thermocycler gemäß einem Amplifikationsprogramm ausgeführt wird, das eventuell für Actin, hBD2 und hBD3 gleich ist,
– Mischen der hBD2-, hBD3- und Actinamplifizierungsprodukte, gefolgt von einer Zugabe eines Gemisches aus Beladungspuffer und Wasser (2/3), wobei die schließliche Lösung dann auf ein vorgegossenes Agarosegel aufgetragen wird, das Ethidiumbromid enthält. Die Proben wandern und die durch diese Technik erhaltenen Banden können unter UV sichtbar gemacht werden, vorzugsweise in einer Dunkelkammer, und digital photographiert werden. Die Banden werden an dieser Stelle analysiert, um ihre Intensität zu quantifizieren. Da der Grundlevel der Defensinexpression (nicht behandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die aus der Positivkontrolle erhalten wurden (mit TNFα für hBD2 und INFγ für hBD3 behandelt), und zeigen eine Stimulierung der Expression des in Frage kommenden β-Defensins.

Vorteilhafterweise umfaßt das Screeningverfahren den zusätzlichen Schritt

– Selektion von potentiellen zu screenenden Wirkstoffen, die eine Wirkung auf die Expression der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 gezeigt haben. Die den Aktivitäten entsprechenden Überstände werden getestet, um die Mengen der Moleküle zu bestimmen, die gewöhnlich im Verlauf von proinflammatorischen Prozessen co-exprimiert werden, wie MIP3α, IL1 und IL8, die in das Kulturmedium unter der Einwirkung dieser Wirkstoffe sekretiert wurden. Beispielsweise können die Mengen auf die getestete RNA-Konzentration bezogen werden, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.

Vorteilhafterweise ermöglicht das Screeningverfahren die Detektion, daß ein Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression der humanen beta-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen coexprimiert werden, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus Wermutwurzel, Kanadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, Johanniskraut, Roßkastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern.
Durch ein erfindungsgemäßes Screeningverfahren identifizierte Wirkstoffe können zur Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung verwendet werden, die zur Ausübung eines bakteriziden und/oder fungiziden Effekts auf behandelte Gewebe verwendet wird, insbesondere Haut, Mukosa, Haare und Nägel oder Kopfhaut. Im Fall der Kopfhaut kann diese kosmetische Zusammensetzung verwendet werden, um Schuppen zu verhindern oder zu behandeln.
Diese Wirkstoffe können mit anderen kosmetischen Wirkstoffen kombiniert werden, um den Schutz der Haut zu verstärken, die durch den Alterungsprozeß anfällig gemacht wurde, und/oder einem durch die Umgebung und/oder das Klima (Kälte, UV ...) und/oder Reinigungsverfahren, die für das Hautökosystem rauh sind, verursachten Streß ausgesetzt ist. Zusammensetzungen, die aus der Erfindung hervorgehen, können in jeder galenischen Form vorliegen, die für Kosmetika verwendet wird und insbesondere in Form einer wäßrigen Lösung, möglicherweise geliert, einer Dispersion vom Lotionstyp, möglicherweise einer Zweiphasendispersion, einer Wasser/Öl- oder Öl/Wasser-Emulsion, einer Dreifachemulsion oder einer Vesikeldispersion. Die Erscheinungsform dieser Zusammensetzung kann trocken oder mehr oder weniger flüssig sein oder eine weiße oder gefärbte Creme, ein Serum oder ein Schaum sein. Sie kann in Form eines Aerosols oder eines Stifts auf die Haut aufgetragen werden. Sie kann als Schönheits- und/oder Make-up-Produkt für die Haut und/oder als Reinigungsprodukt für die Haut, Mukosa, das Haar und die Nägel und die Kopfhaut angewendet werden. Die aus der Erfindung hervorgehende Zusammensetzung kann auch alle Additive enthalten, die in Kosmetika brauchbar sind, wie Geliermittel, Wirkstoffe, Konservierungsmittel, Öle, Lösemittel, Antioxidantien, Düfte, geladene Stoffe, Pigmente, Filter, Geruchsabsorptionsmittel und Farbstoffe.
Vorteilhafterweise ist die Zusammensetzung, die zumindest ein mikrobiozides und/oder mikrobiostatisches Mittel enthält, insbesondere im Gebiet der Kosmetika und der Pharmazeutika brauchbar, da sie den bakteriziden Effekt von beta-Defensinen der Haut mit der Wirkung dieser Mittel kombiniert, um insbesondere die Hautflora zu kontrollieren.
Durch ein erfindungsgemäßes Screeningverfahren identifizierte Wirkstoffe können zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, um eine bakterizide und/oder fungizide Wirkung auf behandelte Gewebe auszuüben, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention von Akne und Bakterien- oder Pilzdermatose.
Vorteilhafterweise ist die Zusammensetzung, die zumindest ein mikrobiozides und/oder mikrobiostatisches Mittel enthält, insbesondere brauchbar im pharmazeutischen Gebiet, da sie den bakteriziden Effekt der beta-Defensine der Haut mit der Wirkung dieser Mittel kombiniert, nämlich zur Behandlung der Erkrankungen, die mit Mikroben zusammenhängen, wie Schuppen, Akne, Vitiligo, Dermatitis und anderen Erkrankungen der Haut, Mukosa, Kopfhaut, Haare und Nägel, die von Mikroben verursacht werden.
Es werden Analyseverfahren verwendet, die die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen zeigen, die im Verlauf von Entzündungsprozessen gewöhnlich co-exprimiert werden, so daß Entzündungs-, Reiz- und Unverträglichkeitsreaktionen identifiziert werden können.
Die Erfindung kann auf eine unterschiedliche Weise ausgeführt werden, um Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen zu identifizieren, beispielsweise durch die Evaluierung des Juckens und des unangenehmen oder straffenden Gefühls bei der Anwendung auf dem zu behandelnden Gewebe.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Eigenschaft der Erfindung, die für einen dieser Aspekte anwendbar ist, kann ein Wirkstoff ausgewählt werden, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen beta-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist und die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorisehen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht nennenswert stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, beispielsweise einem Cytokin, das gewöhnlich während Entzündungsprozessen coexprimiert wird, wie IL1α, IL8 oder MIP3α.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das in der vorliegenden Erfindung entwickelte Verfahren ermöglicht die Auswahl durch Screening und die anschließende Identifizierung von Wirkstoffen, die zur Erhöhung der Menge an hBD2- und/oder hBD3-mRNA in Epidermiszellen fähig sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Wirkstoffe keine oder keine nennenswerten Entzündungs-, Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen verursachen.
Das Screeningverfahren umfaßt die folgenden Schritte:
Normale humane Epithelzellen, vorzugsweise normale humane Keratinozyten, werden als Monoschicht in einem spezifischen Medium ohne Serum mit einer Calciumkonzentration im Bereich von 0 bis 100 mmol/l vorzugsweise 1,7 mmol/l kultiviert. Bei einem gegebenen Maß an Konfluenz, vorzugsweise zwischen 75% und 95%, vorzugsweise 80%, werden die Zellen mit den potentiellen zu screenenden Wirkstoffen für eine Zeitspanne von 6 bis 48 h, vorzugsweise 16 h zusammengebracht. Es können zumindest eine unbehandelte Kontrolle und zumindest eine Positivkontrolle parallel angesetzt werden, vorzugsweise auf derselben Kulturplatte, um das Screening zu erleichtern. Die Positivkontrollen sind TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3, die den zu screenenden Wirkstoff ersetzen. Vorteilhafterweise liegen ihre Konzentrationen im Bereich von 1 bis 500 ng/ml, vorzugsweise 100 ng/ml. Nach der Kontaktaufnahme auf diese Weise werden die Überstände gewonnen und die Zellen können trocken eingefroren werden, beispielsweise bei –80°C, nachdem sie in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen wurden. Die Gesamt-RNA wird extrahiert und durch Spektrophotometrie getestet, vorzugsweise zwischen 260 und 280 nm und die Gesamt-RNA wird vorzugsweise auf eine Konzentration im Bereich von 2 bis 50 ng/ml, vorzugsweise 5 ng/ml, verdünnt. Die qualitative RT-PCR wird auf Actin, hBD2 und hBD3 ausgeführt. Die verwendeten Primer werden aus der Literatur entnommen (für hBD2: J. Harder et al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997, 387: 861 und für hBD3: J. Harder et al., Isolation and characterization of human β-Defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem 2001, 276: 5707–5713) und sind die folgenden:
Die für die RT-PCR verwendeten Primersequenzen können sich von den angegebenen unterscheiden, solange sie für die untersuchten Gene spezifisch bleiben (Actin, hBD2, hBD3).
Die RT-PCR wird vorzugsweise mit einer Menge an anfänglicher mRNA von 10 bis 100 ng, vorzugsweise 50 ng, in einem Thermocycler, möglicherweise mit einem gemeinsamen Programm, ausgeführt. Dieser Schritt amplifiziert die anfängliche RNA. Die Temperatur und Zeitparameter für die RT-PCR können sich als Funktion der Primer oder des verwendeten Materials verändern (Thermocycler, RT-PCR-Kit-Hersteller ...)
Nach der Amplifizierung werden die Produkte miteinander gemischt, und es wird ein Beladungspuffer und Wasser (2/3) zugegeben. Die schließliche Lösung wird auf ein vorgegossenes Agarosegel aufgetragen, das eine Nukleinsäureinsertion enthält, die unter UV sichtbar ist (wie Ethidiumbromid), beispielsweise mit 2%. Die Proben wandern und die Banden werden unter UV in einer Dunkelkammer sichtbar gemacht und digital photographiert. Die Photos des Gels werden durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Bandenintensitäten quantifiziert. Wenn der Grundlevel der Defensinexpression (unbehandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die für die Positivkontrolle erhalten werden (behandelt mit TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3), und ermöglichen die Detektion jeder Stimulierung der Expression des in Frage kommenden β-Defensins.
Am Ende dieses ersten Schritts werden die Wirkstoffe ausgewählt, die eine Wirkung auf die β-Defensinexpression ausüben.
Die den Wirkstoffen entsprechenden Überstände werden dann mittels eines ELISA-Kits getestet, um ihren Gehalt an MIP3α, IL1 und IL8 zu bestimmen, die unter der Wirkung der Wirkstoffe in das Kulturmedium sekretiert wurden. Die getesteten Konzentrationen werden mit den RNA-Konzentrationen in Bezug gesetzt, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen. Potentielle zu screenende Wirkstoffe, die eine Überstimulierung von MIP3α, IL1 und IL8 induzieren (signifikant höher als 75% der maximalen Stimulierung durch TNFα oder IFNγ) werden aus dem Screening eliminiert.
Die Gele werden dann durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Bandenintensitäten quantifiziert. Die Bandenvisualisierung kann praktisch mit jedem Nukleinsäureelektrophoresesystem ausgeführt werden, da der Insertionstyp und die Menge an Produkten, die aus der RT-PCR resultieren, variieren können, aber unter der Lichtsättigung bleiben.
Eine Validierung der erhaltenen Ergebnisse kann durch das erfindungsgemäße Screeningverfahren ausgeführt werden, das auf eine ”Dosis-Wirkungs-Untersuchung” mit einer quantitativen RT-PCR angewendet wird, wie dies später beschrieben wird, die aber nicht auf das bestimmte Verfahren beschränkt ist, da der Fachmann auch andere Verfahren als geeignet erkennt. Die Echtzeit-RT-PCR-Technik ist derzeit das bevorzugte Verfahren, das quantifizierbare Ergebnisse bezüglich Unterschieden in der mRNA-Expression ergibt.
Es wird eine Cytotoxizitätsstudie für die ausgewählten Wirkstoffe mit steigenden Dosierungen von 0,001% bis 10%, vorzugsweise 0,01% bis 10% ausgeführt. Die Lebensfähigkeit muß eingestellt werden und liegt vorzugsweise über 65% und noch bevorzugter über 75%. Diese Lebensfähigkeit setzt das nicht-cytotoxische Konzentrationslimit.
Die potentiellen zu screenenden Wirkstoffe werden daher mit mehreren Konzentrationen, vorzugsweise von 0,001%, bis zum Limit der nicht-cytotoxischen Konzentration auf normalen Epithelzellen, vorzugsweise normalen humanen Keratinozyten, als Monoschicht in einem spezifischen Medium getestet, das kein Serum aufweist, wie dies später beschrieben ist.
Dann werden die Überstände gewonnen und die Zellen werden dann nach dem Waschen in PBS trocken bei –80°C eingefroren. Die Gesamt-RNA wird extrahiert und auf denselben Konzentrationsbereich wie vorher verdünnt. Die verdünnte RNA wird für die quantitative RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 verwendet.
Diese Technik wird vorzugsweise mit denselben Mengen an anfänglicher RNA ausgeführt, wie dies vorher beschrieben wurde, vorzugsweise unter Verwendung eines Einschrittkits, der SYBR^® Green enthält. Jedoch kann der RT-PCR-Kit auch auf einer anderen Technik als SYBR^®-Green basieren, wie Scorpion^®, Molecular beacons^®, Taqman^®-Sonden usw., vorteilhafterweise in einem Fluoreszenzthermocycler mit denselben Primern wie oben, wobei ein Amplifizierungsprogramm ausgeführt wird, das zum vorher beschriebenen Programm identisch sein kann.
Die Ausführung einer Untersuchung mit Fusionsgraphen ermöglicht es, die Spezifität der amplifizierten Produke zu verifizieren. Der Fluoreszenzgraph ergibt als Funktion der Anzahl an Zyklen den C(T)-Wert, der der Anzahl an Zyklen entspricht, die erforderlich sind, um die Initiation des Fluoreszenzsignals zu erhalten. Je stärker eine mRNA exprimiert wird, desto niedriger ist der C(T). Die Berechnung von S_Gen = (1/2)^C(T) für jede RNA berücksichtigt die exponentielle Zunahme der Anzahl an Kopien während einer Amplifikation. Die S_Gen hBD2/S_Gen Actin- und S_Gen hBD3/S_Gen Actin-Verhältnisse können mit einer unbehandelten Kontrolle verglichen werden, um die hervorgerufene prozentuale Stimulierung zu erhalten.
Unbehandelte Kontrollen können zu denen im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Screeningsverfahrens identisch sein.
Die Überstände der zu screenenden potentiellen Wirkstoffe, deren Fähigkeit zur Induktion der Defensine bestätigt wurde, können mittels eines EIISA-Kits getestet werden, um die Mengen an MIP3α, IL8 und IL1α zu testen.
Vorzugsweise werden die Tests mit dem Überstand ausgeführt. Die Mengen werden mit der getesteten RNA-Konzentration jeder Probe verglichen. Die nicht-entzündliche Art der ausgewählten Wirkstoffe kann so bestätigt werden, und/oder die optimale Dosis für die Defensinstimulierung ohne der Induktion der Sekretion von Entzündungsmolekülen kann so ermittelt werden.
Unter Screeninggesichtspunkten wird eine Kultur von normalen humanen Epithelzellen, vorzugsweise normalen Keratinozyten, bevorzugt, wenn sie in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgeführt wird. Die Expression von hBD2- und hBD3-Defensinen ist im Fall von undifferenzierten, basalen Keratinozyten sehr gering und variiert stark als Funktion des Donors und dem Ort der Probenahme. hBD2 wird insbesondere in 100% der Proben von Gesichtshaut und Vorhaut und nur in 50% der abdominalen oder Brustoperationsproben gefunden (R. S. All et al., Expression of the peptides antibiotics hBD1 und hBD2 in normal human skin. J. Invest. Dermatol 2001, 117: 106–111).
Die Erfindung ermöglicht es, ein reproduzierbares Modell (Verfahren) bereitzustellen, das es erlaubt, eine große Vielzahl an potentiellen Wirkstoffen zu testen und die Expression der hBD2- und hBD3-mRNA zu detektieren.
Die Erfindung verwendet ein System zur Kultivierung von Keratinozyten in einem spezifischen Calciummedium. Die unter diesen Kulturbedingungen induzierte Differenzierung ermöglicht es, den basalen Expressionsspiegel der mRNA von hBD2- und hBD3-Defensiven zu erhöhen und dies erleichtert die Detektion der Stimulierung.
Die Kultivierung von Zellen in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen ist ein Modell, das das Screenen auf den gewünschten Effekt erlaubt und qualitative und quantitative Analysen sind gut an das Format einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen angepaßt.
Die qualitative RT-PCR ermöglicht es, eine große Vielzahl an Wirkstoffen auszuwählen und die Verifizierung dieser durch quantitative RT-PCR ist ein essentieller Schritt in der Validierung der Ergebnisse. Die Positivkontrollen für die Stimulierung (TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3) ergibt einen Induktionswert für Defensine und Entzündungsmoleküle, die als Referenz dienen und die quantitative RT-PCR-Technik validieren.
Der Test in den Überständen auf die Sekretionsmenge der Markermoleküle der Entzündung erlaubt es, nicht-entzündliche Wirkstoffe auszuwählen.
Die obige erwünschte Aktivität wurde durch dieses Screeningverfahren in den folgenden Wirkstoffen gefunden: Wermutwurzel, Kanadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, Johanniskraut, Roßkastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.
In den Beispielen ist jede Eigenschaft, die in Bezug auf den Stand der Technik neu erscheint, ein wesentlicher Bestandteil der Erfindung, und es wird ein Schutz sowohl in Bezug auf die Funktion als auch die allgemeinen Aspekte angemeldet.
Darüberhinaus werden in der Beschreibung und den Ansprüchen alle Prozentsätze als Gewichtsprozente angegeben und die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, falls nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Erster Schritt im Screeningverfahren
Eine Konzentration mit 1% der Wirkstoffe wird auf normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem spezifischen Medium mit Calcium und ohne Serum (Endkonzentration 1,7 mmol/l) getestet.
Bei 80% Konfluenz werden die Zellen mit den Wirkstoffen (1 Wirkstoff pro Vertiefung) für 16 h in Kontakt gebracht. Eine unbehandelte Kontrolle und 2 Positivkontrollen (TNFα 100 ng/ml für hBD2 und IFNγ 100 ng/ml für hBD3) werden parallel auf derselben Kulturplatte angesetzt. Nach 16 h werden die Überstände gewonnen und die Zellen werden bei –80°C nach dem Waschen mit PBS trocken gefroren. Die gesamte RNA wird mittels eines Extraktionskits für Kulturplatten mit 96 Vertiefungen auf Silicasäulen extrahiert und unter Verwendung eines Spektrophotometers für 96 Vertiefungen bei 260 nm und 280 nm getestet. Die RNA wird auf 5 ng/ml verdünnt.
Es wird eine qualitative Einschritt-RT-PCR mit 50 ng anfänglicher RNA in 96 Vertiefungen auf Actin, hBD2 und hBD3 ausgeführt. Die Primer werden in einer Konzentration von 0,5 mmol/l verwendet und werden aus der Literatur entnommen; hBD2 Sense: 5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3', hBD2 Antisense: 5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3' (J. Harder el al., A peptide antibiotic from human skin, Nature 1997, 387; 861), hBD3 Sense: 5'AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3', hBD3 Antisense: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3', Actin Sense: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', Actin Antisense: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGTTTC-3' (J. Harder et al., Isolation and characterization of human β-Defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic, J. Biol. Chem 2001, 276: 5707–5713).
Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und folgen einem gemeinsamen Amplifizierungsprogramm; 50°C, 30 min, 94°C, 2 min (94°C, 30 s, 60°C, 30 s, 68°C, 30 s), 32 Zyklen für die Defensine und 30 Zyklen für Actin, 72°C, 10 min, 14°C unbegrenzt.
Nach der Amplifizierung werden die Produkte in einem Verhältnis von 3 μl Actin-Amplifizierungsprodukte + 6 μl hBD2-Amplifizierungsprodukte + 6 μl hBD3-Amplifizierungsprodukte gemischt.
5 μl eines Gemisches aus Auftragspuffer und Wasser (2/3) werden zugegeben und die schließlichen 20 μl werden auf ein vorgegossenes 2% Agarosegel aufgetragen. Die Proben wandern für 30 Minuten und die Banden werden unter UV in einer Dunkelkammer sichtbargemacht und dann digital photographiert.
Die Photos der Gele werden durch Bildverarbeitungssoftware analysiert, die die Intensität der Banden quantifiziert. Da der Grundlevel der Defensinexpression (unbehandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, können die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden, beispielsweise mit denen, die für die Positivkontrollen erhalten werden (behandelt mit TNFα für hBD2 und mit IFNγ fur hBD3) und zeigen jede Stimulierung der Expression des in Frage kommenden β-Defensins an.
Am Ende des ersten Schritts werden die Wirkstoffe, die einen Effekt auf die β-Defensinexpression ausüben, selektiert und die diesen Wirkstoffen entsprechenden Überstände werden dann mittels eines ELISA-Kits getestet, um die Mengen an MIP3α, IL1 und IL8 zu bestimmen, die unter der Einwirkung der Wirkstoffe in das Kulturmedium sekretiert wurden. Die Mengen werden dann auf die RNA-Konzentration bezogen, die in jeder Vertiefung getestet wurde, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.
Ergebnistabellen für den ersten Schritt:
Da der Grundlevel der Defensinexpression im allgemeinen nicht detektierbar ist, wird die Stimulierung von hBD2 und hBD3 als Prozentsatz der Positivkontrollen (TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3) ausgedrückt.

Die Mengen an IL8 und MIP3α werden als pg/ml/RNA-Konzentration (in ng/μl) angegeben. Effekte der Wirkstoffe auf die hBD2-Expression (Tabelle I)

Wirkstoffe (verwendet mit 1% G/G)	hBD2	MIP3α	IL8
Kontrolle	0%	6,7	30,9
TNFα	100%	33	186
Spirulin	137%	28,8	87
Quinoamehl	85%		-
Wermutwurzel	76%	7,2	30,2
Hollunderbeerrinde	65%	7,5	17,9
Sonnenblume	58%	10,9	68,6
Kanadisches Berufkraut	50%	6,1	29,4
Ananassaft	50%	7,6	39
Bruchkraut	44%	7,8	55
Kakao	39%	4,9	22,5+
Kürbis	35%	5,2	33,1
Pfefferminze	26%	1	4,8
Sarsaparillewurzel	26%	4,7	15,4
Betelnuß	1%	0	25,7
Arnikablüte	0%	3,9	27,8
Pfingstrose	0%	0	2
Johanniskraut	0%	2,81	19,37
Roßkastanie	0%	0,6	36,7
Boldostrauch	0%	1,8	20,1
Walnußblatt	0%	1,4	19,4
Hibiskusblüte	0%	6,5	29,3
Basilikumblatt	0%		-
Schwarzer Chinatee	0%		-
Himbeere	0%		-
L-Isoleucin 10 μg/ml	0%		-
D,L-Isoleucin 100 μg/ml	0%	5,6	30,6
Isoleucinmethylester 100 μg/ml	16%	3,8	7,7
Jasmonsäure 100 μg/ml	7%	6	25,3

Effekte von Wirkstoffen auf die hBD3-Expression (Tabelle II)

Wirkstoffe (verwendet mit 1% G/G)	hBD3	MIP3α	IL8
Kontrolle	0%	6,7	30,9
IFNγ	100%	13,8	97
Arnikablüte	460%	3,9	27,8
Pfingstrose	192%	0	2
Johanniskraut	126%	2,81	19,7
Roßkastanie	103%	0,6	36,7
Boldostrauch	86%	1,8	20,1
Bruchkraut	73%	7,8	55
Hibiskusblüte	50%	6,5	29,3
Betelnuß	45%	0	25,7
Pfefferminze	40%	1	4,8
Walnußblatt	27%	1,4	19,4
Kakao	15%	4,9	22,5
Spirulin	6%	28,8	87
Basilikumblatt	0%		-
Schwarzer Chinatee	0%		-
Himbeere	0%		-
Wermutwurzel	0%	7,2	30,2
Canadisches Beruftkraut	0%	6,1	29,4
Hollunderbeerrinde	0%	7,5	17,9
Ananassaft	0%	7,6	39
Quinoamehl	0%	8	39
Sarsaparillewurzel	0%	4,7	15,4
Sonnenblume	0%	10,9	68,6
Kürbis	0%	5,2	33,1
L-Isoleucin 10 μg/ml	0%		-
D,L-Isoleucin 100 μg/ml	0%	5,6	30,6
Isoleucinmethylester 100 μg/ml	6%	3,8	7,7
Jasmonsäure 100 μg/ml	0%	6	25,3

Unter diesen Wirkstoffen sind die, welche die Kriterien für den ersten Schritt erfüllen, das heißt, die die hBD2 und/oder hBD3 ohne Auslösung der Expression von MIP3- und IL8-Cytokinen stimulieren, die folgenden: Wermutwurzel, Kanadisches Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, Johanniskraut, Roßkastanie oder einer ihrer Extrakte, Jasmonsäure und deren Derivate und Vorläufer und Isoleucinester.
Spirulin stimuliert hBD2 stark, aber löst die IL8- oder MIP3-Sekretion aus und wird daher nicht ausgewählt. Andere Wirkstoffe stimulieren die Defensine nicht. Es wurden L-Isoleucin und mehrere Derivate getestet und es wird keine signifikante Stimulierung der humanen Defensine 2 und 3 durch eine qualitative RT-PCR festgestellt.
Beispiel 2
Zweiter Schritt des Screeningmodells
Die Wirkstoffe, die am besten die Kriterien für den ersten Schritt erfüllen, werden einer Dosis-Wirkungsanalyse unterzogen.
Eine Untersuchung der Cytotoxizität der ausgewählten Wirkstoffe wird durch die Erhöhung der Dosen von –0,01% auf 10% ausgeführt. Die Lebensfähigkeit von 75% wird als Grenze für die nicht-cytotoxische Konzentration angesetzt (% maximale Lebensfähigkeit).
Die Wirkstoffe werden dann in 5 Konzentrationen (von 0,001% bis zur max. Lebensfähigkeit) in vierfachen Ansätzen auf normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen in einem spezifischen Medium getestet, das mit Calcium angereichert und frei von Serum ist (CaCl₂ 1,7 mmol/l) (selbe Bedingungen wie in Beispiel 1).
Nach 16 h werden die Überstände gewonnen und die Zellen werden nach dem Waschen mit PBS bei –80°C trocken eingefroren.
Die gesamte RNA wird mittels eines Extraktionskits mit Silicasäulen für 96 Vertiefungen extrahiert und mittels eines Spektrophotometers für 96 Vertiefungen bei 260 nm und 280 nm getestet. Die RNA wird auf 5 ng/μl verdünnt.
Es wird eine quantitative RT-PCR in 96 Vertiefungen auf Actin, hBD2 und hBD3 anfänglich mit 50 ng RNA mittels eines Einschrittkits, der Sybrgreen enthält, in einem Fluoreszenzthermocycler mit denselben Primern wie vorher (0,5 mmol/l) ausgeführt. Das Amplifizierungsprogramm ist wie folgt: 50°C, 30 min, 94°C, 15 min, (94°C, 15 s, 60°C, 30 s, 72°C, 30 s) × 50 Zyklen, 90°C, 1 min, 30°C, 1 min, 50°C bis 95°C (10 s für jedes °C), 14°C unbegrenzt.
Eine Untersuchung der Fusionsgraphen macht es möglich, die Spezifität der amplifizierten Produkte zu verifizieren. Der Fluoreszenzgraph ergibt als Funktion der Anzahl an Zyklen den C(T)-Wert, der der Anzahl der Zyklen entspricht, die erforderlich ist, um ein Fluoreszenzsignal auszulösen. Je stärker eine mRNA exprimiert wird, desto niedriger ist der C(T)-Wert. Die Berechnung von S_Gen = (1/2)^C(T) für jede RNA berücksichtigt die exponentielle Zunahme der Anzahl an Kopien während einer Amplifizierung. Die S_Gen hBD2/S_Gen Actin- und S_Gen h6D3/S_Gen Actin-Verhältnisse können mit denen der unbehandelten Kontrolle verglichen werden, um den Prozentsatz der gebildeten Stimulierung zu erhalten.
Die Überstände der Wirkstoffe, deren Fähigkeit zur Induktion von Defensinen bestätigt wird, werden mittels eines ELISA-Kits getestet, um die Mengen an MIP3α, IL8 und IL1α zu testen. Diese Tests werden mit demselben Überstand (200 μl) durch die Ausführung einer Verdünnungsreihe durchgeführt (um 1,5, um MIP3α und IL8 zu testen, dann um 2, um IL1 zu testen). Die Mengen werden dann auf die RNA-Konzentration bezogen, die in jedem Test gemessen wird, um die Ergebnisse miteinander zu vergleichen.
Somit ist es möglich, die nicht-entzündliche Art der ausgewählten Wirkstoffe zu bestätigen und/oder die optimale Dosis für die Defensinstimulierung ohne der Auslösung der Sekretion von Entzündungscytokinen zu finden.
Ergebnistabellen für den zweiten Schritt:

Die quantitative RT-PCR macht es möglich, einen basalen Wert für die Defensinexpression für die unbehandelten Kontrollen zu erhalten. Die Ergebnisse werden daher als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Cytokinmengen an IL8, IL1 und MIP3 werden als pg/ml/RNA Konzentration angegeben (in ng/μl). Dosiseffekte der im ersten Schrift ausgewählten Wirkstoffe (Tabelle III)

Wirkstoff	Konzentration	Lebensfähigkeit	hBD2	hBD3	MIP3α.	IL8	IL1α
Kontrolle		100%	100%	100%	5,6	47,4	26,9
TNFα	100 ng/ml	-	1755%	774%	23,6	175	21,8
IFNγ	100 ng/ml	-	472%	4631%	11,6	100,5	40,1
Boldostrauch	0,1%	84%	182%	168%	2,2	33,6	28,2
	0,5%	87%	92%	213%	1,45	27,5	25,3
	1%	76%	72%	703%	0,4	31,7	20,2
Arnika	0,01%	93%	117%	173%	4,6	51,2	30,1
	0,1%	91%	128%	561%	2,5	34,1	38,5
	0,3%	75%	138%	1830	4,1	24,1	37,9
Quinoa	0,1%	83%	143%	102%	6	58,7	23,4
	1%	91%	264%	112%	5,8	50,2	17,7
	5%	90%	401%	237%	12,4	150,2	34,4
	10%	92%	92%	438%	7,6	102,8	40,8
Wermut	0,1%	87%	88%	103%	3,2	36,9	39,5
	1%	75%	117%	116%	2,9	35	34,9
	5%	78%	130%	452%	3,2	61,6	22,3
	10%	83%	104%	3962%	2,3	66,3	25,8
Betelnuß	0,1%	87%	88%	84%	2,8	32,2	28,3
	1%	77%	35%	261%	0,28	23,7	39,5
	2%	70%	98%	2781%	0	7,6	44,8
L-Isoleucin μg/ml	3,125	-	110%	89%	5,2	36,9	21
L-Isoleucin μg/ml	6,25	-	107%	94%	4,9	33,6	22,3
	12,5	-	95%	101%	5,9	42,2	25,3
	25	-	110%	106%	4,5	35,1	22,8
Jasmonsäure μg/ml	100	-	86%	477%	4,6	37,9	31,2
	500	-	134%	26919%	13,6	103,3	97,1

α-MSH ng/ml	1	-	198%	254%	4,5	34,6	24,7
α-MSH ng/ml	100	-	186%	217%	3,9	41,7	26,1

Die quantitative RT-PCR-Technik macht es somit möglich, die stimulierende Wirkung von Boldostrauch, Arnika und Betelnuß auf hBD3 ohne der Induktion von proinflammatorischen Cytokinen zu bestätigen. 10% Wermut stimuliert hBD3 ohne eine signifikante Stimulierung der Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, und Quinoasamenmehl stimuliert hBD2 ab einer Wirkstoffikonzentration von 1%. Bei 5% stimuliert es hBD2 und hBD3.
L-Isoleucin wird mit den 4 Konzentrationen (3,125, 6,25, 12,5 und 25 μg/ml) getestet, von denen beschrieben wurde, daß sie zur Stimulierung von Defensin-3 beim Rind fähig sind (P. Fehlbaum et al., An essential amino acid induces epithelial β-Defensin expression, PNAS 2000, 97: 12723–12728). Es wurde nicht festgestellt, daß diese Aminosäure zur Induktion von hBD2 und hBD3 in normalen humanen Keratinocyten fähig ist.
100 μg/ml Jasmonsäure und α-MSH sind auch zur Induktion der Defensine 2 und/oder 3 fähig.
Unter diesen Wirkstoffen sind die, welche die erfindungsgemäßen Kriterien erfüllen, d. h. diejenigen, welche hBD2 und/oder hBD3 ohne Auslösung der Expression von MIP3, IL8 oder IL1 Cytokinen stimulieren, folgende: Boldostrauch, Arnika, Quinoa, Wermut oder einer der Extrakte hiervon, Jasmonsäure und deren Derivate und Vorläufer, αMSH oder eines der Peptide, aus denen sich αMSH zusammensetzt, oder eine chemische Struktur, die eines dieser Peptide nachahmt.
Beispiel 3:
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 werden Retinolsäure und Retinol auf ihre Fähigkeit getestet, um hBD2 und/oder hBD3 zu stimulieren.
Die Ergebnisse sind die folgenden:

Wirkstoffe Konzentration hBD2 hBD3

Kontrolle 100% 100%

TNFα 100 ng/ml 1755% 774%

IFNγ 100 ng/ml 472% 4631%

Retinolsäure 0,005% 26% 161%

Retinol 0,01% 168% 17562%
Es wird beobachtet, daß Retinolsäure bei 0,005% die hBD3-Synthese schwach stimuliert und daß Retinol (oder Vitamin A) hBD2 schwach und hBD3 stark stimuliert. Um festzustellen, ob diese Produkte Reiz- oder Unverträglichkeitsreaktionen auslösen, werden 3 kosmetische Formulierungen hergestellt:

– Plazebocreme A: Es wird kein Produkt zur Formulierung zugegeben: die ”Produkte der Erfindung” gemäß diesem Beispiel werden nicht zur Formulierung gegeben
– Creme B: Das ”Produkt der Erfindung” gemäß diesem Beispiel ist Retinolsäure und die in der Formulierung verwendete Konzentration ist 0,005%.
– Creme C: Das ”Produkt der Erfindung” gemäß diesem Beispiel ist Retinol und die in der Formulierung verwendete Konzentration ist 0,01%.

Diese drei Formulierungen werden auf zwei verschiedene Arten getestet:

1) Durch wiederholte Anwendung bei Tieren, um den primären Hautreizungsindex der Präparationen zu bestimmen.
2) Durch wiederholte Pflasteranwendung bei humanen Freiwilligen, um das reizende oder sensibilisierende Potential der Formulierungen zu bestimmen.

Mit diesen drei Formulierungen, wie sie in beiden Studien verwendet werden, wird keine Reizung oder Allergie gefunden und Retinolsäure und Retinol (wie auch ihre Vorläufer und Derivate) können daher bei den verwendeten Konzentrationen nicht als Auslöser für eine Entzündungs-, Reiz- oder Intoleranzreaktion betrachtet werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Screening-Verfahren für Wirkstoffe, die zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen β-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig sind und nicht zur Stimulierung oder merklichen Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von zumindest einem proinflammatorischen Molekül oder einem Molekül fähig sind, das im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert wird, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) Kultivierung eines Zell- oder Gewebemodells, in Gegenwart von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen, die unter geeigneten Kulturbedingungen gescreent werden können, wobei das Zell- oder Gewebemodell Epithel-Zellen oder Hautbiopsien, die am Leben gehalten werden, oder Modelle einer rekonstruierten Epidermis oder Modelle einer rekonstruierten Haut enthält, die Epithel-Zellen enthalten, die zur Kultivierung unter geeigneten Kulturbedingungen geeignet sind, b) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung der Expression der humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 vorhanden ist, und c) direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung von proinflammatorischen Molekülen oder von Molekülen vorhanden ist, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, ausgenommen der direkten oder indirekten Identifizierung von GM-CSF, und d) Selektion von zumindest einem auf diese Weise getesteten Wirkstoff, der zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression von humanen β-Defensinen vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist und gleichzeitig die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Screening-Verfahren für Wirkstoffe, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) die direkte oder indirekte Identifizierung, ob eine Stimulierung von proinflammatorischen Molekülen oder von Molekülen vorhanden ist, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, anhand von IL1, IL8 oder MIP3α erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Epithel-Zellen Keratinozyten und/oder Corneozyten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Kultivierung eingesetzten Kulturbedingungen einen Calciumgehalt im Bereich von 0 bis 100 mmol/l aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt a) das Vorkommen von verschiedenen potentiellen Wirkstoffen umfaßt, die mit dem Zell- oder Gewebemodell für einen Zeitraum von 6 bis 48 h (Kontaktzeit) gescreent werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt b) eine Extraktion und einen Test mit der Gesamt-RNA umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt b) einen Test auf mRNA umfaßt, die für die oben erwähnten β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt b) eine RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt b) eine Wanderung der Amplifizierungsprodukte auf einem Agarosegel umfaßt, das eine Nukleinsäureinsertion enthält, die unter UV sichtbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt b) einen Vergleich der Intensitätsverhältnisse von hBD2/Actin- und hBD3/Actin-Banden unter UV-Licht umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt c) einen ELISA-Test zum Testen auf proinflammatorische Moleküle oder Moleküle umfaßt, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es in Schritt d) die Selektion von zumindest einem Wirkstoff umfaßt, der zur Stimulierung der Expression von mRNA fähig ist, die für die humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 kodiert, ohne Stimulierung oder merkliche Stimulierung der direkten oder indirekten Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Selektion von Wirkstoffen umfaßt, die die Expression der oben erwähnten humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 stimulieren und nicht IL1, IL8 und MIP3α stimulieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt – Zusammenbringen der potentiellen, zu screenenden Wirkstoffe mit normalen humanen Keratinozyten als Monoschicht in einem spezifischen Medium ohne Serum und mit Calcium angereichert, durch Einbeziehung einer unbehandelten Kontrolle und zwei parallelen Positivkontrollen mit TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3, – Extraktion und anschließender Test der Gesamt-RNA mit einem Spektrophotometer, – Ausführung einer RT-PCR auf Actin, hBD2 und hBD3 mit der anfänglichen RNA, – Amplifikation der anfänglichen RNA, – Mischen der hBD2-, hBD3- und Actinamplifizierungsprodukte gefolgt von einer Zugabe eines Gemisches aus Beladungspuffer und Wasser (2/3), wobei die schließliche Lösung dann auf ein vorgegossenes Agarosegel aufgetragen wird, die Proben wandern können und die durch diese Technik erhaltenen Banden unter UV sichtbar gemacht werden können und digital photographiert werden, wobei, da der Grundlevel der Defensinexpression (nicht behandelte Kontrolle) nicht detektierbar ist, die Intensitätsverhältnisse der Banden von hBD2/Actin und hBD3/Actin verglichen werden können, mit denen, die aus der Positivkontrolle erhalten wurden, die mit TNFα für hBD2 und IFNγ für hBD3 behandelt wurden, und eine Stimulierung der Expression des in Frage kommenden β-Defensins zeigen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es einen zusätzlichen Schritt umfaßt – Selektion von potentiellen zu screenenden Wirkstoffen, die eine Wirkung auf die Expression der humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 gezeigt haben, wobei die den Aktivitäten entsprechenden Überstände getestet werden, um die MIP3α-, IL1- und IL8-Mengen zu testen, die in das Kulturmedium unter der Einwirkung dieser Wirkstoffe sekretiert wurden.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß IL1 IL1α ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es die Identifizierung erlaubt, daß ein Wirkstoff zur Stimulierung der direkten oder indirekten Expression der humanen β-Defensine vom Typ 2 und/oder Typ 3 fähig ist, wobei er die direkte oder indirekte Synthese von proinflammatorischen Molekülen oder Molekülen nicht oder nicht merklich stimuliert, die gewöhnlich im Verlauf von Entzündungsprozessen co-exprimiert werden, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus Wermutwurzel, Kanadischem Berufkraut, Hollunderbeerrinde, Bruchkraut, Ananassaft, Pfefferminze, Betelnuß, Kakao, Quinoa, Arnika, Boldostrauch, Sarsaparille, Walnußblatt, Hibiskusblüte, Kürbis, Sonnenblume, Pfingstrose, Johanniskraut, Rosskastanie oder einem ihrer Extrakte, Jasmonsäure oder Vitamin A, Derivate und Vorläufer hiervon, alpha-MSH oder einem der Peptide, aus denen sich alpha-MSH zusammensetzt, oder einer chemischen Struktur, die eines der Peptide nachahmt, Isoleucinestern, Calcium oder irgendwelchen organischen oder mineralischen Calciumsalzen.