DE60026500T2

DE60026500T2 - Polypeptid aus stratum corneum und seine verwendung

Info

Publication number: DE60026500T2
Application number: DE60026500T
Authority: DE
Inventors: Bruno Mehul; Dominique Bernard; Lucie Simonetti
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1999-07-23
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2020-04-21
Also published as: ES2260010T3; US7098004B2; WO2001007604A1; JP3851818B2; FR2796646A1; FR2796646B1; JP2003505081A; US6800609B1; DE60026500D1; CA2379777A1; EP1204744B1; EP1204744A1; AU4301100A; US20060009380A1

Description

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid aus der Familie der calciumbindenden Proteine, ein Gemisch von Polypeptiden, die aus der Proteolyse des isolierten Polypeptids resultieren, Zusammensetzungen, die diese Polypeptide enthalten, die Verwendung dieses Polypeptids sowie ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung, das zur Behandlung von trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyose und Neoplasien bestimmt ist. Die Erfindung betrifft ferner eine Desoxyribonucleinsäure-Sequenz, die dieses Polypeptid codiert, und die Verwendung dieser Desoxyribonucleinsäure-Sequenz.
Die Schlüsselrolle des Calciumflusses bei den cellulären Funktionen wurde bereits seit mehr als 20 Jahren in breitem Umfang beschrieben. Danach ist das Calcium ein intracellulärer Botenstoff von größter Bedeutung. Zahlreiche Hormone und extracelluläre Botenstoffe üben ihre Wirkung durch eine Erhöhung des intracellulären Calciumgehalts aus. Es wurde rasch gezeigt, dass die Mehrzahl der Wirkungen des Calciums durch eine große, relativ homogene Familie von calciumbindenden Proteinen bestimmt werden. Von dieser Familie sind die Calmoduline am weitesten verbreitet. Die Rolle des Calmodulins besteht darin, Änderungen der Konzentration an Calciumionen im Cytosol zu erkennen und die Information auf intracelluläre Proteine zu übertragen.
Die Übertragung des Signals erfolgt, wenn das Calmodulin das Calcium bei einer Erhöhung des cellulären Calciumgehalts bindet. Dies führt zu Änderungen der Konformation des Proteins, wodurch seine Affinität für das Zielprotein erheblich erhöht wird.
Hinsichtlich seiner Konfiguration enthält das calciumfreie Calmodulin zwei globuläre Domänen, die durch einen flexiblen Arm miteinander verknüpft sind. Jede Domäne enthält zwei wohldefinierte „Helix-Schlaufe-Helix"-Einheiten, die unter der Bezeichnung „EF-Hands" bekannt sind und für die Bindung mit Calcium verantwortlich sind. Die Bindung mit Calcium induziert eine sehr bedeutende Konformationsänderung. Diese Konformationsänderung zeigt sich in einer Exposition des hydrophoben globulären Teils des Proteins, was eine Erkennung durch das Calmodulin und seine Bindung an bestimmte Proteine mit hoher Affinität erlaubt. Die Bindung des Calmodulins an sein Zielprotein führt dann zur Entstehung eines aktiven Komplexes.
Von Calmodulin ist bekannt, dass es mit zahlreichen Proteinen oder Enzymen sowie mit zahlreichen hydrophoben Arzneistoffen oder auch mit Peptiden natürlichen oder synthetischen Ursprungs wechselwirken kann.
In dieser Hinsicht sind zu nennen

– bestimmte Proteinkinasen, die bei der cellulären Homöostase und bestimmten entscheidenden Zellfunktionen, wie dem Metabolismus, der Motilität, der Gentranskription und der Zellteilung, der Proliferation, beteiligt sind;
– das Calcineurin, das eine Phosphatase ist, die bei der Regulation der Enzyme und Proteine, die bei der Transduktion des Calciumsignals beteiligt sind, eine Rolle spielt;
–die Phosphodiesterase für cyclische Nucleotide, die Guanidylcyclase und die Adenylcyclase, die so in positiver und/oder negativer Weise die Menge der Second Messenger cyclisches AMP und cyclisches GMP beim Wirkungsmechanismus bestimmter Hormone regulieren;
– die drei Isoformen der NO-Synthetase, die bei der Erzeugung von NO und damit bei der vasculären Relaxation, der cytotoxischen Wirkung der Makrophagen und der Freisetzung von Neurotransmittern, Neuropeptiden und/oder Hormonen eine Rolle spielen;
– bestimmte Proteine des Cytoskeletts, die bei der Kontrolle der Form der Zellen, ihrer Festigkeit und ihrer Adhäsion eine vitale Rolle spielen, wie zum Beispiel das Myosin;
– das Caldesmon, die Spectrine, das Adducin und Proteine, die Actin binden;
– das Desmocalmin, ein Protein des Desmosoms, das mit den Keratinen wechselwirkt;
– die Ca²⁺-ATPasen der Plasmamembranen, die bei der Aufrechterhaltung der intracellulären Ionenkonzentration eine Rolle spielen;
– die Ornithindecarboxylase, bestimmte Phospholipasen A2 und bestimmte Transglutaminasen, die als calmodulinabhängig angegeben wurden.

Auf der anderen Seite lassen bestimmte Untersuchungen vermuten, dass Calmodulin bei den Phänomenen der Reparatur der Desoxyribonucleinsäure eine Rolle spielt und möglicherweise auch an der Hautalterung beteiligt ist.
Eine Teilsequenz einer mRNS, die aus Brustkrebsgewebe stammt und als EST verwendet wurde, wurde bereits von Strausberg et al. identifiziert ( AI 791495 ). Außerdem ist bekannt, dass aus Epidermis durch Reinigung erhaltenes menschliches Calmodulin die Transglutaminasen aktiviert (Clinical Research 30, Nr. 1 (1982), Seite 159).
Schließlich weiß man, dass Calmodulin, auch wenn es ein gut beschriebenes Protein ist, der Prototyp einer großen Familie von Proteinen ist, von denen sämtliche individuellen Proteine noch nicht beschrieben wurden.
Nach langen und aufwändigen Forschungsarbeiten hat die Anmelderin von den Proteinen der Epidermis ein in den verhornten Epithelien exprimiertes Polypeptid durch biochemische Techniken nachgewiesen, isoliert und gereinigt. Dieses Polypeptid, das in diesem Text auch als „CLSP" (Calmodulin Like Skin Protein, calmodulinartiges Hautprotein) bezeichnet ist, wird in der Epidermis exprimiert. Es ist bekannt, dass in den verhornten Epithelien die große Mehrzahl der exprimierten Proteine aus Keratinen besteht. Dementsprechend konnte die Anmelderin nur durch Ausarbeitung einer speziellen Extraktionsmethode zur Abtrennung der Keratine die CLSP isolieren und anschließend reinigen.
Von der Anmelderin wurde dann die primäre Aminosäuresequenz davon bestimmt.
Die Erfindung betrifft entsprechend ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid, das zur Familie der calciumbindenden Proteine (CaBP: calcium binding protein) gehört und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Aminosäuresequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 1 aufweist:
Das Polypeptid der Erfindung kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Unter einem synthetischen Polypeptid wird hier jedes Polypeptid verstanden, das chemisch oder durch Produktion in einem Organismus nach Einführung der für diese Produktion erforderlichen Elemente in diesen Organismus erhalten wurde.
Das Polypeptid der Erfindung kann aus einer beliebigen möglichen Quelle stammen, das heißt von einem Lebewesen, insbesondere einem Säuger und noch spezieller vom Menschen, oder es kann pflanzlichen Ursprungs sein oder von Mikroorganismen (Viren, Phagen, Bakterien und anderen) oder auch von Pilzen stammen, und zwar unabhängig davon, ob es in dem entsprechenden Herkunftsorganismus natürlicherweise vorkommt oder nicht.
Das Polypeptid der Erfindung ist bevorzugt natürlichen Ursprungs und ausgehend von Säugergewebe und insbesondere ausgehend von der Haut von Säugern durch Reinigung erhalten.
Das Polypeptid der Erfindung wird bevorzugt durch Reinigung ausgehend von menschlicher Haut und noch bevorzugter ausgehend von menschlicher Epidermis erhalten.
Es ist bekannt, dass bei einem Peptid ein oder mehrere Aminosäurereste gegen Aminosäurereste mit einem ähnlichen hydropathischen Index ausgetauscht werden können, ohne dass sich dadurch die biologischen Eigenschaften des Polypeptids ändern. Der hydropathische Index ist ein Index, der Aminosäuren in Abhängigkeit von ihrer Hydrophobizität und ihrer Ladung zugeordnet wird (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157 (1982) 105).
Die Erfindung betrifft entsprechend auch ein Polypeptid wie oben beschrieben, bei dem mindestens ein Aminosäurerest gegen einen Aminosäurerest mit einem ähnlichen hydropathischen Index ausgetauscht ist.
Es ist bekannt, dass allgemein die reifen Polypeptide, die man in den Zellen findet, von der Reifung von Vorläuferverbindungen herrühren, die in ihrer Sequenz die Sequenz des reifen Polypeptids enthalten.
Die Erfindung betrifft dementsprechend auch alle natürlichen oder synthetischen Polypeptide, deren Sequenz zum Teil aus der Sequenz des Polypeptids der Erfindung besteht.
Es ist bekannt, dass die Polypeptide nach der Transduktion Modifizierungen unterliegen können, wie etwa der Ausbildung von Disulfidbindungen, spezifischen proteolytischen Spaltungen, der Hinzufügung von Zuckern (Glycosylierung), der Phosphorylierung, insbesondere bei Serinen und/oder Threoninen und/oder Tyrosinen, und/oder der Kombination mit Lipiden.
Das Polpeptid der Erfindung kann eine oder mehrere posttransduktionale Modifizierungen aufweisen.
Die Erfindung betrifft somit auch das Polypeptid der Erfindung, das gegebenenfalls post-transduktionalen Modifizierungen unterlag.
Die Polypeptide werden bekanntermaßen nach ihrem isoelektrischen Punkt klassifiziert.
Der theoretische isoelektrische Punkt des Polypeptids der Erfindung kann aus der Sequenz seiner Aminosäuren abgeleitet werden. Das Polypeptid der Erfindung ist ein theoretisch saures Polypeptid.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Polypeptid, dessen theoretischer isoelektrischer Punkt im Bereich von 1 bis 6 und insbesondere im Bereich von 3 bis 5 liegt. Das Polypeptid der Erfindung besitzt einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 4,075.
Es ist bekannt, dass die Primärsequenz der Aminosäuren sowie die verschiedenen post-transduktionalen Modifizierungen, denen ein Polypeptid unterlag, es ermöglichen, das Polypeptid durch sein in Kilodalton ausgedrücktes apparentes Molekulargewicht zu charakterisieren.
Unter dem apparenten Molekulargewicht wird das Molekulargewicht verstanden, das für das Polypeptid erhalten wurde durch Vergleich seiner elektrophoretischen Beweglichkeit mit der von Standardproteinen bekannten Molekulargewichts auf Polyacrylamid/Natriumdodecylsulfat-Gel oder durch Vergleich des Elutionsvolumens des Polypeptids mit dem Elutionsvolumen von Standardproteinen bekannten Molekulargewichts durch Ausschlusschromatographie (nach Verfahren, die in „Protein Purification", J.-C. Janson und L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989, beschrieben sind).
Die Kenntnis der Aminosäuresequenz des Polypeptids der Erfindung erlaubt die Bestimmung des theoretischen Molekulargewichts.
Die Erfindung betrifft entsprechend ein Polypeptid mit einem theoretischen Molekulargewicht von 13 bis 17 Kilodalton (kD) und insbesondere von 14 bis 16 Kilodalton (kD).
Das Polypeptid der Erfindung besitzt insbesondere ein theoretisches Molekulargewicht von 15,9 Kilodalton (kD).
Es ist ferner auch bekannt, dass die Primärsequenz der Aminosäuren eines Polypeptids Stellen vorgibt, die von Proteasen spezifisch erkannt werden, die nach dem erfolgten Erkennen dieser Stellen mit oder ohne Bindung an das Polypeptid seine Spaltung durch Proteolyse induzieren.
Die Erfindung betrifft somit auch mindestens ein Gemisch von Polypeptiden, das von der Proteolyse des Polypeptids der Erfindung herrührt.
Es wird damit klar, dass in diesem Text, wenn nichts Gegenteiliges angegeben ist, unter Polypeptid das natürliche oder synthetische Polypeptid der Erfindung, wie es oben beschrieben wurde, oder mindestens eines seiner Fragmente zu verstehen ist, und zwar unabhängig davon, ob es durch Proteolyse oder auf synthetische Weise hergestellt wurde oder ob es sich um ein beliebiges natürliches oder synthetisches Polypeptid handelt, dessen Sequenz vollständig oder teilweise aus der Sequenz des vorstehend beschriebenen Polypeptids besteht.
Die Analyse der Primärsequenz der Aminosäuren des Polypeptids der Erfindung zeigt, dass es spezielle Stellen enthält, von denen bekannt ist, dass sie, bei den calciumbindenden Polypeptiden, zur Ausbildung einer oder mehreren Stellen zur Bindung von Calcium führen. Die Bindung von Calcium durch das Polypeptid der Erfindung wird außerdem durch Versuchsergebnisse bestätigt, die im übrigen in den Beispielen angegeben sind.
Das Polypeptid der Erfindung ist ein Polypeptid, das Calcium bindet.
Aus der Beschreibung wurde ferner die Bedeutung des Vorliegens der Proteine der Familie des Calmodulins im Organismus deutlich. Außerdem wird deutlich, wie wichtig es ist, dem Organismus ein Protein der Familie des Calmodulins zur Verfügung stellen zu können, um dessen Wirkungen modifizieren zu können. Die potentiellen Anwendungen umfassen entsprechend alle Wege der calciumabhängigen Signaltransduktion.
Das Protein der Erfindung kann beispielsweise in der Kosmetik eingesetzt werden zur Regulierung von Dysfunktionen der Proliferation oder der Differentiation der Epidermis unter normalen oder pathologischen Umständen (trockene Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyose, Neoplasien ...), bei der Behandlung der Alterung, insbesondere der Hautalterung, und bei der Behandlung von durch UV-Strahlungsexposition hervorgerufenen Hautschäden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht entsprechend darin, Zusammensetzungen anzugeben, die in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens ein Polypeptid wie oben beschrieben enthalten.
Ein physiologisch akzeptables Medium ist gemäß der Erfindung ein kosmetisch und/oder pharmazeutisch akzeptables Medium, das mit der Haut, den Schleimhäuten, den Nägeln und den Haaren kompatibel ist.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen sein.
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden vorzugsweise auf die Haut oder die Schleimhäute aufgebracht.
Das Polypeptid der Erfindung kann als Mittel zur Regulierung von Dysfunktionen der Proliferation oder der Differentiation der Epidermis unter normalen oder pathologischen Umständen und insbesondere bei der Behandlung von trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyosen und Neoplasien eingesetzt werden. Das Polypeptid der Erfindung kann somit in eine Zusammensetzung eingebracht werden, die zur Pflege und/oder zum Schminken der Haut, der Schleimhäute und/oder von Keratinfasern bestimmt ist.
Die Zusammensetzung der Erfindung dient auch zur Bekämpfung von Alterserscheinungen der Haut und/oder zur Bekämpfung von Wirkungen von UV-Strahlung, insbesondere vom Typ A oder B.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht entsprechend in einer Zusammensetzung, die zur Behandlung von Dysfunktionen der Proliferation oder der Differentiation der Epidermis, von trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyosen und/oder Neoplasien bestimmt ist.
Sie betrifft ferner eine Zusammensetzung, die mindestens ein Polypeptid der Erfindung enthält, zur Bekämpfung von Hautalterungserscheinungen und/oder zur Bekämpfung von Wirkungen von UV-Strahlung, insbesondere vom Typ A oder B.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung mindestens eines Polypeptids der Erfindung in einer Zusammensetzung oder zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei das Polypeptid oder die Zusammensetzung zur Behandlung von Dysfunktionen der Proliferation oder der Differentiation der Epidermis, von trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyosen und/oder Neoplasien bestimmt sind.
Sie betrifft ferner auch die Verwendung mindestens eines Polypeptids der Erfindung als Mittel zur Behandlung von Alterungserscheinungen der Haut und/oder zur Bekämpfung von Wirkungen von UV-Strahlung, insbesondere vom Typ A oder B.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung, das zur Bekämpfung von Hautalterungserscheinungen, Dysfunktionen der Proliferation und/oder der Differentiation der Epidermis wie trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyosen und/oder Neoplasien, Alterserscheinungen der Haut und/oder Wirkungen von UV-Strahlung, insbesondere vom Typ A oder B bestimmt und dadurch gekennzeichnet ist, dass eine kosmetische Zusammensetzung, die mindestens ein Polypeptid der Erfindung enthält, auf die Haut, die Schleimhäute und/oder die Keratinfasern aufgebracht wird.
Das Behandlungsverfahren der Erfindung ist ein kosmetisches Verfahren zur Verbesserung des ästhetischen Aussehens des Individuums, bei dem Störungen der Proliferation und/oder der Differenzierung der Epidermis vorliegen.
Die Menge des in der Zusammensetzung der Erfindung enthaltenen Polypeptids hängt selbstverständlich von der angestrebten Wirkung ab und kann entsprechend in weitem Maße variieren.
Als größenordnungsmäßige Angabe kann die Zusammensetzung das Polypeptid der Erfindung in einer Menge enthalten, die 0,00001 bis 50 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung ausmacht, bevorzugt in einer Menge, die 0,001 bis 10 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung ausmacht, und noch bevorzugter in einer Menge, die 0,1 bis 1 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung beträgt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Polypeptids der Erfindung oder eines seiner Proteolysefragmente und aller synthetischen Peptide, die von seiner Sequenz abgeleitet sind, zur Herstellung oder Reinigung, gegebenenfalls ausgehend von Epidermis, beliebiger struktureller oder funktioneller Moleküle, die in der Lage sind, sich spezifisch an das isolierte Polypeptid oder die isolierten Proteolysefragmente oder das synthetische Peptid zu binden.
In dieser Hinsicht wurde von der Anmelderin gezeigt, dass das Polypeptid der Erfindung beispielsweise befähigt ist, sich an mindestens ein Zielprotein zu binden, das ausgewählt ist unter Transglutaminasen, insbesondere Transglutaminase 3, Galectin 7, den Annexinen, insbesondere den Annexinen 2, MRP14 oder Calgranulin B, Heparanasen, HSP 27, SCCE oder auch dem 60 S-Ribosomalprotein L9.
Aufgrund der Erkenntnis, dass die Transglutaminasen eine wichtige Rolle bei der Bildung der verhornten Epidermis spielen, kann angenommen werden, dass CLSP die Rolle eines Regulators bei der Bildung der Hornschichten durch Bindung an die Transglutaminase spielt.
Die Erfindung betrifft entsprechend die Verwendung des Polypeptids der Erfindung oder seiner Proteolysefragmente sowie aller synthetischen Peptide, die von seiner Sequenz abgeleitet sind, zur Regulierung der Transglutaminasen, insbesondere der Transglutaminase 3, um so die Bildung der Hornschicht der Epidermis zu regulieren.
Da das Polypeptid der Erfindung zur Familie der Calmoduline gehört und man weiß, dass die Polypeptide dieser Familie allgemein Second-Messenger sind, die auf einen Stimulus (intracellulärer Calciumgehalt) über eine Bindung an ihr Zielprotein antworten, ist es möglich, das Polypeptid der Erfindung zur Herstellung oder Reinigung, gegebenenfalls ausgehend von Epidermis, aller strukturellen oder funktionellen Moleküle zu verwenden, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid der Erfindung und seinen eventuellen Liganden zu modulieren.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung des Polypeptids der Erfindung oder seiner Proteolysefragmente und aller von seiner Sequenz abgeleiteten synthetischen Peptide zur Herstellung oder Reinigung, gegebenenfalls ausgehend von Epidermis, von sämtlichen strukturellen oder funktionellen Molekülen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid der Erfindung und seinen eventuellen Liganden zu modulieren.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Polypeptids der Erfindung oder seiner Proteolysefragmente sowie sämtlicher von seiner Sequenz abgeleiteter synthetischer Peptide zur Herstellung von Antiseren und/oder spezifischen monoklonalen Antikörpern, wobei insbesondere die Reinigung dieses Proteins und seiner Fragmente im Vordergrund steht. Darüberhinaus betrifft die Erfindung ferner jede Verwendung dieser Sequenz zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern oder Antikörperfragmenten, und zwar unabhängig von dem zur Herstellung der letzteren verwendeten biologischen System.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er das Polypeptid der Erfindung spezifisch erkennt.
Der Antikörper kann ein Antikörper sein, der durch Immunisierung einer beliebigen Tierspecies erzeugt wurde, wobei hierzu insbesondere der Hase verwendbar ist. Der Antikörper kann durch Immunisierung mit Hilfe des Polypeptids der Erfindung hergestellt werden, und zwar unabhängig davon, ob es natürlichen oder synthetischen Ursprungs und gereinigt oder nicht gereinigt ist.
Es ist bekannt, dass ein Protein in den Zellen ausgehend von einer Matrize von Desoxyribonucleinsäuren, die dieses Protein codieren, synthetisiert wird. Es ist ferner bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist. Die Aminosäuresequenz des Polypeptids der Erfindung kann somit von verschiedenen Desoxyribonucleinsäuresequenzen natürlichen oder synthetischen Ursprungs resultieren. Unter einer synthetischen Sequenz von Desoxyribonucleinsäuren wird hier eine beliebige Sequenz verstanden, die chemisch oder durch genetische Manipulation erhalten wurde.
Diese Sequenzen von Desoxyribonucleinsäuren können von allen möglichen Quellen stammen, das heißt von Lebewesen, insbesondere Säugern und noch spezieller vom Menschen, aus pflanzlichen Quellen, Mikroorganismen (Viren, Phagen, Bakterien u.a.) oder auch aus Pilzen, und zwar unabhängig davon, ob sie in dem entsprechenden Herkunftsorganismus natürlicherweise vorliegen oder nicht.
Die Anmelderin hat ein Fragment von Desoxyribonucleinsäuren, welches das Polypeptid der Erfindung codiert, nach molekularbiologischen Techniken, insbesondere durch Durchsuchen von Expressionsbanken von komplementären Desoxyribonucleinsäuren, die aus menschlicher Epidermis hergestellt waren, isoliert, gereinigt und sequenziert.
Die Erfindung betrifft daher auch eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die in einem physiologisch akzeptablen Medium beliebige Sequenzen von Desoxyribonuclein säuren natürlichen oder synthetischen Ursprungs enthält, die ganz oder teilweise die Primärsequenz der Aminosäuren des Polypeptids der Erfindung codieren.
Im Verlauf dieser Untersuchungen gelang es der Anmelderin, eine Sequenz von Desoxyribonucleinsäuren zu isolieren und zu reinigen, welche die Primärsequenz der Aminosäuren des Polypeptids der Erfindung codiert, wobei von menschlicher Haut als Ausgangsmaterial ausgegangen wurde.
Die Erfindung betrifft ein isoliertes und gereinigtes Desoxyribonucleinsäure-Fragment, das der codierenden Nucleotidsequenz des nachstehenden Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 2 entspricht:
Die Erfindung betrifft ferner alle isolierten und gereinigten Desoxyribonucleinsäure-Fragmente, die mindestens die codierende Nucleotidsequenz SEQ ID NO : 2 enthalten.
Die Erfindung betrifft ferner alle Polynucleotide, Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren, und zwar in Sense- oder Antisense-Form, die mindestens der codierenden Nucleotidsequenz SEQ ID NO : 2 entsprechen.
Das DNS-Fragment, das der Sequenz SEQ ID NO : 2 entspricht, kann in einen Expressionsvektor eingeführt werden, der so die Synthese eines Proteins erlaubt, also eines rekombinanten Proteins, das CLSP entspricht.
Unter einem rekombinanten Protein wird hier ein beliebiges Peptidelement verstanden, das insgesamt oder teilweise der Peptidsequenz des CLSP entspricht und künstlich nach Einführung und Expression der gesamten komplementären DNS des CLSP oder eines Teils davon in einen beliebigen Expressionsvektor erhalten wurde, und zwar unabhängig davon, um welchen Organismus es sich handelt, der diese Expression erlaubt.
Gemäß der Erfindung können insbesondere das CLSP oder ein Teil des CLSP nach Einführen der gesamten codierenden Nucleotidsequenz SEQ ID NO : 2 oder eines Teils davon in einen Expressionsvektor wie zum Beispiel den Vektor pGex-2T (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) und Expression in E. coli hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft dementsprechend auch einen rekombinanten Expressionsvektor, der die codierende Nucleotidsequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 2 oder einen Teil davon enthält.
Die Erfindung betrifft ferner auch ein rekombinantes Protein, das der Sequenz SEQ ID NO : 1 oder einem Teil davon entspricht, insbesondere das rekombinante Protein, das durch Expression eines Expressionsvektors pGex-2T erhalten ist, der die gesamte codierende Sequenz SEQ ID NO : 2 oder einen Teil davon enthält.
Die Erfindung betrifft ferner auch eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens ein Fragment einer isolierten und gereinigten Desoxyribonucleinsäure enthält, die mindestens die codierende Nucleotidsequenz SEQ ID NO : 2 enthält.
Die Erfindung betrifft ferner auch eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die in einem physiologisch akzeptablen Medium eine Ribonucleinsäuresequenz in Sense- oder Antisense-Form enthält, die der Sequenz SEQ ID NO : 2 entspricht.
Sie betrifft ferner die Verwendung dieser Desoxyribonucleinsäure-Sequenzen zur Herstellung des Polypeptids der Erfindung oder einer entsprechenden Ribonucleinsäure nach beliebigen bekannten Verfahren, beispielsweise durch Synthese in vitro ausgehend von rekonstituierten Medien oder durch Synthese durch Organismen oder Mikroorganismen.
Unabhängig von ihrer Art können die Zusammensetzungen der Erfindung eingenommen, injiziert oder auf die Haut (auf jeden beliebigen Hautbereich des Körpers) oder die Schleimhäute (buccal, jugal, gingival, genital, conjunctival, ...) aufgebracht werden.
Je nach der Verabreichungsweise können die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung in beliebigen, normalerweise verwendeten galenischen Formen vorliegen.
Für eine topische Anwendung auf der Haut kann die Zusammensetzung insbesondere in folgenden Formen vorliegen: als wässerige Lösung oder als Öllösung oder als Dispersion vom Typ einer Lotion oder eines Serums, in Form von Emulsionen mit flüssiger oder halbflüssiger Konsistenz vom Typ einer Milch, die durch Dispergieren einer Fettphase in einer Wasserphase (O/W) oder umgekehrt (W/O) erhalten sind, oder als Suspensionen oder Emulsionen mit weicher Konsistenz vom Typ einer wässerigen oder wasserfreien Creme oder eines wässerigen oder wasserfreien Gels oder auch als Mikrokapseln oder Mikropartikel oder als Vesikeldispersionen vom ionischen und/oder nichtionischen Typ oder als Schäume oder in Form von Aerosol-Zusammensetzungen, die ferner ein unter Druck stehendes Treibmittel enthalten. Diese Zusammensetzungen werden nach üblichen Verfahren hergestellt.
Zur Injektion kann die Zusammensetzung in Form einer wässerigen Lotion, einer öligen Lotion oder in Form eines Serums vorliegen. Für die Augen kann sie in Form von Tropfen oder zur Einnahme in Form von Kapseln, in Form eines Granulats, in Form eines Sirups oder in Form von Tabletten vorliegen.
Die Mengen der verschiedenen Bestandteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind so, wie sie herkömmlicherweise auf den in Betracht kommenden Gebieten angewandt werden.
Diese Zusammensetzungen stellen insbesondere dar: Cremen zur Reinigung, zum Schutz, zur Behandlung oder zur Pflege des Gesichts, der Hände, der Füße, der großen anatomischen Falten oder des Körpers (zum Beispiel Tagescremen, Nachtcremen, Cremen zum Abschminken, Make-up-Cremen, Sonnenschutzcremen), flüssige Make-ups, Milchen zum Abschminken, Körpermilche zum Schutz oder zur Pflege, Sonnenschutzmilche, After-Sun-Milche, Lotionen, Gele oder Schäume zur Pflege der Haut, wie Reinigungslotionen, Sonnenschutzlotionen, After-Sun-Lotionen, Lotionen zur künstlichen Bräunung, Badezusammensetzungen, desodorierende Zusammensetzungen, die ein baktericides Mittel enthalten, After-Shave-Gele oder After-Shave-Lotionen, Enthaarungscremen, Zusammensetzungen gegen Insektenstiche, schmerzstillende Zusammensetzungen, Zusammensetzungen zur Behandlung bestimmter Erkrankungen der Haut wie Ekzeme, Rosacea, Psoriasis, Lichen, gravierende Pruriti und Ichthyosen.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können ferner als feste Präparationen vorliegen, die Seifen oder Reinigungsseifen darstellen.
Die Zusammensetzungen können auch in Form einer Aerosol-Zusammensetzung konfektioniert sein, die ferner ein unter Druck stehendes Treibmittel enthalten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch vorliegen als Zusammensetzung zur Pflege der Kopfhaut, insbesondere als Shampoo, als Lotion zum Legen von Wasserwellen, als Behandlungslotion, als Frisiercreme oder Frisiergel, als Färbezusammensetzung (insbesondere zum Oxidationsfärben), gegebenenfalls in Form von Färbeshampoos, als restrukturierende Lotionen für die Haare, als Dauerwellzusammensetzung (insbesondere als Zusammensetzung für die erste Phase einer Dauerwelle), als Lotion oder Gel gegen Haarausfall, als Shampoo gegen Parasiten, als Zusammensetzung gegen Schuppen, etc.
Die Zusammensetzung kann auch zur buccodentalen Verwendung vorgesehen sein und beispielsweise eine Zahnpasta darstellen. In diesem Fall kann die Zusammensetzung Hilfsstoffe und Zusätze enthalten, die für Zusammensetzungen zur buccalen Verwendung üblich sind, insbesondere grenzflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Befeuchtungsmittel, Poliermittel wie Kieselsäure, verschiedene Wirkstoffe wie Fluoride, insbesondere Natriumfluorid, sowie gegebenenfalls Süßmittel, wie Natriumsaccharinat.
Wenn die Zusammensetzung eine Emulsion ist, kann der Mengenanteil der Fettphase 5 bis 80 Gew.-% und bevorzugt 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, betragen. Die Öle, Wachse, Emulgatoren und Co-Emulgatoren, die in der Zusammensetzung in Form einer Emulsion eingesetzt werden, werden unter den Stoffen ausgewählt, die herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Kosmetik verwendet werden. Der Emulgator und der Co-Emulgator liegen in der Zusammensetzung in einem Mengenanteil von 0,3 bis 30 Gew.-% und bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vor. Die Emulsion kann ferner Lipidvesikel enthalten.
Wenn die Zusammensetzung eine Öllösung oder ein öliges Gel ist, kann die Fettphase mehr als 90 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung darstellen.
Die kosmetische Zusammensetzung kann in bekannter Weise ferner auf dem Gebiet der Kosmetik übliche Hilfsstoffe enthalten, wie etwa hydrophile oder lipophile Gelbildner, hydrophile oder lipophile Zusätze, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Lösungsmittel, Parfums, Füllstoffe, Filter, geruchsabsorbierende Stoffe und Färbemittel. Die Mengen dieser verschiedenen Hilfsstoffe sind so, wie sie herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Kosmetik angewandt werden, und betragen zum Beispiel 0,01 bis 10 % des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Diese Hilfsstoffe können je nach ihrer Art in die Fettphase, in die wässerige Phase und/oder in Lipidkügelchen eingebracht werden.
Als Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare Öle oder Wachse können genannt werden: Mineralöle (Vaselinöl), Pflanzenöle (flüssige Fraktion von Sheabutter, Sonnenblumenöl), tierische Öle (Perhydrosqualen), synthetische Öle (Purcellinöl), Siliconöle oder Siliconwachse (Cyclomethicon) und fluorierte Öle (Perfluorpolyether), Bienenwachs, Carnaubawachs oder Paraffin. Diesen Ölen können Fettalkohole und Fettsäuren (Stearinsäure) zugesetzt werden. Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare Emulgatoren sind etwa Glycerinstearat, Polysorbat 60 sowie das Gemisch PEG-6/PEG-32/Glycol Stearate, das unter der Bezeichnung Tefose^®63 von der Firma Gattefosse im Handel ist.
Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare Lösungsmittel sind etwa niedere Alkohole, insbesondere Ethanol und Isopropanol, und Propylenglycol.
Als Beispiele für im Rahmen der Erfindung verwendbare hydrophile Gelbildner sind zu nennen: Carboxyvinylpolymere (Carbomer), Acrylcopolymere, wie Acrylat/Alkylacrylat-Copolymere, Polyacrylamide, Polysaccharide, wie Hydroxypropylcellulose, natürliche Gummen und Tone; Beispiele für lipohile Gelbildner sind etwa modifizierte Tone, wie Bentone, Metallsalze von Fettsäuren, wie Aluminiumstearate, sowie hydrophobe Kieselsäure, Ethylcellulose und Polyethylen.
Die Zusammensetzung kann auch weitere hydrophile Wirkstoffe enthalten, wie zum Beispiel Proteine oder Proteinhydrolysate, Aminosäuren, Polyole, Harnstoff, Allantoin, Zucker und Zuckerderivate, wasserlösliche Vitamine, Pflanzenextrakte und Hydroxysäuren.
Als Beispiele für lipophile Wirkstoffe sind Retinol (Vitamin A) und seine Derivate, Tocopherol (Vitamin E) und seine Derivate, essentielle Fettsäuren, Ceramide, essentielle Öle sowie Salicylsäure und ihre Derivate zu nennen.
Gemäß der Erfindung kann die Zusammensetzung eine Kombination mindestens eines Extrakts mindestens einer Iridacea mit anderen Wirkstoffen enthalten, die insbesondere zur Vorbeugung und/oder zur Behandlung von Hautaffektionen bestimmt sind. Von diesen Wirkstoffen können folgende als Beispiele genannt werden:

– Mittel, welche die Differentiation und/oder Proliferation und/oder die Pigmentation der Haut verringern, wie zum Beispiel Retinoesäure und ihre Isomeren, Retinol und seine Ester, Vitamin D und seine Derivate, Östrogene, wie Östradiol, Kojisäure oder Hydrochinon;
– Antibakterielle Mittel, wie Clindamycinphosphat, Erythromycin oder Antibiotika aus der Klasse der Tetracycline;
– Mittel gegen Parasiten, insbesondere Metronidazol, Crotamiton oder Pyrethroide;
– Mittel gegen Pilze, insbesondere Verbindungen, die zur Klasse der Imidazole gehören, wie Econazol, Ketoconazol oder Miconazol oder ihre Salze, Polyenverbindungen, wie Amphotericin B, Verbindungen aus der Familie der Allylamine, wie Terbinafin, oder Octopirox;
– Mittel gegen Viren, wie Aciclovir;
– Steroidale entzündungshemmende Mittel, wie Hydrocortison, Betamethason-valerat oder Clobetasol-propionat oder nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel wie zum Beispiel Ibuprofen und seine Salze, Diclofenac und seine Salze, Acetylsalicylsäure, Paracetamol oder Glycyrrhizinsäure;
– Anästhesierende Mittel, wie Lidocain-hydrochlorid und seine Derivate;
– Mittel gegen Pruritus, wie Thenaldin, Trimeprazin oder Cyproheptadin;
– Keratolytische Mittel, wie α- und β-Hydroxycarbonsäuren oder β-Ketocarbonsäuren, ihre Salze, Amide oder Ester und insbesondere Hydroxysäuren, wie Glycolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Citronensäure und allgemein Fruchtsäuren sowie n-Octanoyl-5-salicylsäure;
– Hydratisierende Mittel, wie Glycerin und seine Derivate;
– Mittel gegen freie Radikale, wie α-Tocopherol oder seine Ester, Superoxiddismutasen, bestimmte Metallchelatbildner oder Ascorbinsäure und ihre Ester;
– Antiseborrhoemittel, wie Progesteron;
– Mittel gegen Kopfschuppen, wie Octopirox oder Zink-Pyrithion;
– Antiaknemittel, wie Retinoesäure oder Benzoylperoxid;
– Extrakte pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs.

Dementsprechend enthält die Zusammensetzung gemäß der Erfindung nach einer besonderen Ausführungsform ferner mindestens ein Mittel, das ausgewählt ist unter antibakteriellen Mitteln, Mitteln gegen Parasiten, Mitteln gegen Pilze, Antivirusmitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mitteln gegen Proritus, anästhesierenden Mitteln, keratolytischen Mitteln, Mitteln gegen freie Radikale, Antiseborrhoemitteln, Mitteln gegen Kopfschuppen, Antiaknemitteln und/oder Mitteln, welche die Differentiation und/oder die Proliferation und/oder die Pigmentation der Haut verringern.
Beispiel 1
Stoffe und Methoden:
Die Bibliothek von in λgt1 1 klonierten Desoxyribonucleinsäuren von Keratinocyten (Herkunft der mRNS: Keratinocyten aus adulter menschlicher Vorhaut) stammt von Clontech (Palo Alto, CA, USA). Die in den verschiedenen Versuchen eingesetzten Oligomeren sind nachstehend angegeben.

N

= A, C, G oder T

Y

= C oder T

(+RS)

: der Sequenz hinzugefügte Restriktionsstelle(n) im Oligomer

Das degenerierte Oligomer sc5 beruht auf der Aminosäuresequenz SEQ ID NO : 1. Alle anderen von CLSP abgeleiteten Oligomeren und ihre Position sind von der Nucleotidsequenz SEQ ID NO : 2 abgeleitet.
Not I-(dT)₁₈ ist so konzipiert, dass es sich an lange A-Abfolgen bindet, zum Beispiel polyA+. Wenn es bei Reverstranskriptionsreaktionen eingesetzt wird, bindet Not I-(dT)₁₈ an polyA+.
1. Präparationen aus menschlichem Stratum corneum Puffer:

I: SDS 0,3 %; Tris-HCl 28 mM; Tris-Base 22mM
2D: 8M Harnstoff; 2 % CHAPS (3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfonat); Dithiothreit 20 mM; 0,5 % Imobilin pH gradient Buffer (Amersham Pharmacia Biotech), pH = 3.

Zur Reinigung des CLSP wurden Acetonextrakte von Stratum corneum nach dem von Lundstrom und Egelrüd in Acta Derm. Venerol. 71 (1991) 471–474 beschriebenen Verfahren hergestellt. Auf diese Weise wurden 78 mg Pulver aus Acetonextraktion hergestellt. 2,5 ml Puffer I werden zu 78 mg des Pulvers aus Acetonextraktion zugegeben; das Ganze wird gemahlen, 10 Minuten am Sieden gehalten und dann wieder gemahlen. Die Lösung wird dann 10 Minuten bei 10000 g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und durch ein 0,22 μm-Filter filtriert. Man erhält so 2 ml Überstand SI.
Der Überstand SI wird dann mit 10 ml kaltem Aceton (10V/2V) versetzt. Nach 10 Minuten Belassen in der Kälte (gestoßenes Eis) wird 20 Minuten bei 4 °C und 9400 g zentrifugiert.
Der Überstand wird dann abgetrennt, und der Zentrifugierrückstand wird 20 Minuten bei Umgebungstemperatur getrocknet. Der Zentrifugierrückstand wird dann in 300 ml Puffer 2D wieder aufgenommen. Man erhält so den Extrakt EI.
2. Zweidimensionales Gel
Die zweidimensionale Trennung der in Extrakt EI enthaltenen Proteine wird mit einem Apparat der Firma Pharmacia (Modell multiphor) nach den Empfehlungen des Lieferanten durchgeführt. Die Färbung der Flecken, ihre Gewinnung und die Sequenzierung der Polypeptide, die sie enthielten, wurden nach Standardverfahren durchgeführt, die in "Gel Electrophoresis of Proteins" (IRL press) oder auch in "A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing" (Herausgeber Paul Matsudaira, zweite Auflage 1993) beschrieben sind.
3. Klonierung und Sequenzierung der CLSP-cDNS:
Die gesamten RNS von Keratinocyten eines Epidermis-Äquivalents (Episkin) wurden mit einem Präparationskit RNeasy Kit gewonnen und mit einem QIAshredder column-Kit der Marke Qiagen nach den Vorschriften des Lieferanten gereinigt.
Die komplementären DNS der so hergestellten RNS wurden mit einem First strand cDNA Synthesis-Kit der Firma Amersham Pharmacia Biotech nach den Vorschriften des Lieferanten unter Verwendung des Oligomers Not I-(dT)₁₈ synthetisiert.
Eine cDNS von 775 Basenpaaren, die so erhalten worden war, wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in einer Temperaturzyklusvorrichtung der Firma Perkin-Elmer (Modell Thermocycler) unter Verwendung einer Pfu-Polymerase der Firma Stratagene und des Oligomerenpaars sc5/Not I-(dT)₁₈ amplifiziert. Eine Sequenzierung dieses Fragments erlaubte die Bestimmung der Nucleotidsequenz.
Um die vollständige Sequenz der CLSP-cDNS zu erhalten, wurden die PCR-Reaktionen mit den folgenden Oligomerenpaaren sc10/sc7, sc7/sc21, sc16/sc29 unter Standard-Versuchsbedingungen unter Zuhilfenahme einer Bank von im Phagen λgt11 (Stratagene) klonierten komplementären DNS aus Keratinocyten durchgeführt.
Die Untersuchungen zu Homologien wurden mit Hilfe des Programms WU-Blast auf der Internetseite EXpasy Swissprot vorgenommen; die Ermittlung eventueller Spaltungsstellen wurde mit dem Programm Omiga 1.1 PC (Oxford Molecular, Oxford, U.K.) vorgenommen.
Konstruktion und Expression eines rekombinanten CLSP-Proteins:
Die CLSP-cDNS wird durch Schneiden/Ligasierung an den BamH-1/EcoRI-Restriktionsstellen in den Vektor pGex-2T (Pharmacia Biotech Inc.) eingeführt. Das Konstrukt, bei dem die codierende Sequenz des CLSP in Phase mit der Sequenz der im Vektor enthaltenen Glutathion-S-Transferase ist, wird dann in das Bakterium E. Coli BL21 eingeführt. Das durch die Bakterien exprimierte rekombinante Protein kann mit Thrombin gespalten werden, wobei das Konstrukt so ist, dass das erhaltene Fusionsprotein eine Spaltungsstelle für diese Protease aufweist. Die Gesamtheit dieser Versuche wurde unter strenger Anwendung der verschiedenen Protokolle der Lieferanten durchgeführt.
Bindung von Calcium durch CLSP:
Das oben erhaltene Fusionsprotein wird auf ein Gel vom Typ SDS-PAGE, gegebenenfalls in Gegenwart von Ethylendiamintetraacetat (EDTA), eines Chelatbildners für Calciumionen, nach dem von Gurgess et col. beschriebenen Protokoll (BBA, 623 (1980) 257–270) aufgegeben.
Affinitätschromatographie:
Affinitätschromatographiesäulen wurden mit 1 ml Kügelchen hergestellt. Das Polypeptid der Erfindung wurde auf Sepharosekügelchen immobilisiert, die mit Bromcyan von Amersham Pharmacia Biotech aktiviert worden waren, wobei nach den Empfehlungen des Herstellers verfahren wurde und 1,3 mg Polypeptid pro Milliliter Kügelchen eingesetzt wurde.
Die Wirksamkeit der Fixierung betrug 0,95 mg Polypeptid pro Milliliter Kügelchen. Menschliche Epidermis (0,83 g Abdomenhaut, die aus plastischer Chirurgie stammte, und 100 g plantares Stratum corneum) wurden im Polytron in 10 ml bzw. 120 ml 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, homogenisiert, der 125 mM Natriumchlorid, 0,1 % (G/V) Triton X100 und ein Gemisch von Proteaseinhibitoren (CompleteTM EDTA-free von Roche Molecular, versetzt mit 1 M Depepstatin) enthielt.
Die Suspension wird dann 10 Minuten bei 4 °C unter 10000 g zentrifugiert. Der Überstand wird durch ein 0,22 μm-Filter filtriert und vor dem Durchleiten durch die Affinitätssäule bei Umgebungstemperatur auf 2,5 mM Calciumchlorid eingestellt. Die Säulen werden dann mit 10 Volumina 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, gewaschen, der 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % (G/V) Triton X100 und ein Gemisch von Proteaseinhibitoren enthält. Die Elution erfolgt unter Verwendung des gleichen Puffers, der 5 mM EDTA anstelle von 2 mM Calciumchlorid enthält.
Die eluierten Proteine werden einer denaturierenden Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und nach der Migration mit Hilfe des Silber-Färbekits der Firma Amersham Pharmacia Biotech und nach den Empfehlungen des Herstellers mit Silber gefärbt.
ERGEBNISSE:
Reinigung und Charakterisierung des CLSP
Von allen aus dem zweidimensionalen Gel analysierten Flecken ergibt die von einem der Flecken abgeleitete Sequenz eine Sequenzhomologie mit Calmodulin, die ausreichend groß ist, um festgehalten zu werden, jedoch ausreichend verschieden ist, um ihre Analyse fortzusetzen.
Ausgehend von den erhaltenen Elementen der Aminosäuresequenz und mit den oben beschriebenen molekularbiologischen Verfahren war es möglich, die Sequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 1 zu isolieren und zu reinigen.
Die Sequenzhomologien zwischen diesem Protein und Calmodulin lassen vermuten, dass dieses Protein ähnliche Eigenschaften aufweisen muss wie Calmodulin.
Bei dieser Sequenz können vier Bindungsstellen für Calcium nachgewiesen werden, nämlich die Stellen zwischen den Aminosäuren 21 und 32, 57 und 68, 91 und 102 sowie 127 und 138. Die Versuche durch elektrophoretische Migration, insbesondere mit dem rekombinanten Protein, die in Gegenwart oder in Abwesenheit von Calciumionen durchgeführt wurden, bestätigen, dass das Protein Calcium bindet.
Diese Sequenz entspricht daher einem vollständigen Protein, das Calcium bindet, das nicht Calmodulin ist und das im Stratum corneum der menschlichen Epidermis vorliegt.
Klonierung der DNS von SCTE:
Nach den oben beschriebenen Verfahren wurde eine DNS mit 858 Basenpaaren isoliert. Dieses DNS-Fragment weist die vollständige codierende Sequenz von CLSP, vom ATG-Codon in Position 114 bis zum Stop-Codon in Position 552, auf.
Affinitätschromatographie:
Die Sequenzierung eines der Proteine, das auf der Affinitätssäule zurückgehalten wurde, die mit dem Polypeptid der Erfindung erzeugt worden war, ergab, dass es sich um eine Transglutaminase und insbesondere um die Transglutaminase 3 handelt.
Weitere Versuche zeigten, dass auch Galectin 7, die Annexine, insbesondere die Annexine 2, MRP14 oder Calgranulin B, die Heparanasen, insbesondere Heparanase III, Heat Shock P 27, SCCE sowie auch das ribosomale 60 S-Protein L9 am Polypeptid der Erfindung gebunden werden.
Sequenzliste

Claims

Gereinigtes natürliches oder synthetisches Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 1 aufweist:
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Reinigung ausgehend von menschlicher Haut erhalten ist.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Reinigung ausgehend von menschlicher Epidermis erhalten ist.
Natürliches oder synthetisches Polypeptid, dessen Sequenz der Aminosäuresequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 1 nach Anspruch 1 entspricht.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 4,075 besitzt.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein theoretisches Molekulargewicht von 15,9 Kilodalton (kD) aufweist.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in seiner primären Sequenz mindestens eine Bindungsstelle für Calcium aufweist.
Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es Calcium bindet.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens ein Polypeptid enthält, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung handelt.
Verwendung mindestens eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Behandlung von normalen oder pathologischen Dysfunktionen der Proliferation oder der Differenzierung der Epidermis bestimmt ist.
Verwendung mindestens eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Behandlung von trockener Haut, Hyperkeratose, Parakeratose, Psoriasis, Ichthyosen und Neoplasien bestimmt ist.
Verwendung mindestens eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zur kosmetischen oder pharmazeutischen Anwendung bestimmt ist.
Verwendung mindestens eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Regulierung der Transglutaminase 3 vorgesehen ist.
Verwendung mindestens eines Polypeptids wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Regulierung der Bildung der Hornschicht der Epidermis vorgesehen ist.
Verwendung mindestens eines Polypeptids zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine kosmetische Zusammensetzung zur topischen Anwendung ist.
Isoliertes Desoxyribonucleinsäure-Fragment, das ein Polypeptid codiert, das wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Isoliertes Desoxyribonucleinsäure-Fragment, das mindestens die codierende Nucleotidsequenz des nachstehenden Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 2 aufweist:
Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens eine Nucleotidsequenz enthält, wie sie in Anspruch 18 beschrieben ist.
Verwendung mindestens einer Desoxyribonucleinsäure-Sequenz wie in Anspruch 18 beschrieben zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Gemisches von Polypeptiden.
Rekombinanter Expressionsvektor, der die codierende Nucleotidsequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 2 enthält.
Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem physiologisch akzeptablen Medium ein rekombinantes Protein enthält, das der Sequenz des Sequenzprotokolls SEQ ID NO : 1 entspricht.
Verwendung mindestens einer Desoxyribonucleinsäure-Sequenz wie in Anspruch 18 beschrieben zur Herstellung einer Ribonucleinsäure.
Verwendung mindestens eines isolierten Polypeptids oder eines beliebigen synthetischen Peptids wie in den Ansprüchen 1 bis 8 beschrieben zur Herstellung oder Reinigung von Molekülen, die in der Lage sind, eine spezifische Bindung mit dem gereinigten Polypeptid oder dem synthetischen Peptid einzugehen.
Verwendung mindestens eines isolierten Polypeptids oder eines beliebigen synthetischen Peptids wie in den Ansprüchen 1 bis 8 beschrieben zur Herstellung oder Reinigung von Antiseren oder spezifischen monoklonalen Antikörpern.
Polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er das in den Ansprüchen 1 bis 8 beschriebene Polypeptid spezifisch erkennt.