JP3851818B2 - 角質層の単離ポリペプチドとその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、カルシウム固定タンパク質ファミリーの単離ポリペプチド、単離ポリペプチドのタンパク分解に由来するポリペプチド混合物、これらを含有する組成物、該ポリペプチドの使用及び乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、新生組織形成を処理するための美容処理方法を対象とするものである。本発明は、また、前記ポリペプチドをコード化するデオキシリボ核酸配列及び該デオキシリボ核酸配列の使用を対象とするものである。
【０００２】
細胞の機能におけるカルシウム・フラックスの役割は、２０年以上前から広範な記述がある。カルシウムは、最も重要な細胞間メッセンジャーでもある。数多くのホルモン及び細胞間メッセンジャーが、カルシウムの細胞内比率の増大を通じて、その効果を発揮する。最近は、カルシウムの効果の大部分がカルシウムと結合したタンパク質の比較的同質の大きなファミリーによって決定されることが示されている。こうしたファミリーの中で、カルモジュリンが最も遍在的である。カルモジュリンの役割は、細胞質ゾルのカルシウムイオン濃度の変化を検知し、情報を細胞内タンパク質に伝達することである。
シグナル伝達は、その細胞比率が増大してカルモジュリンがカルシウムに結合したときに行われる。それは、タンパク質の構造の変化を引き起こし、対象タンパク質の親和性を著しく高める。
【０００３】
構造については、カルシウムのないカルモジュリンは、フレキシブル・アームで結合された２つの球状領域を含んでいる。各領域は、「ＥＦ−ハンド」という名称で知られ、明瞭に定義された２つの「螺旋−環−螺旋」モチーフを含んでおり、カルシウムとの結合を行う。カルシウムとの結合によって、非常に重要な構造の変化が誘発される。この構造変化は、タンパク質球体の疎水性部分の露出によって現れ、それにより、カルモジュリンは高親和性の一定のタンパク質を認識して、それに結合することができる。カルモジュリンが対象タンパク質と結合することによって、活性複合体が生成される。
カルモジュリンは、数多くのタンパク質又は酵素、並びに数多くの疎水性薬剤、あるいはまた天然ペプチド又は合成ペプチドと相互作用することが知られている。
【０００４】
上記に関連して、以下を指摘することができる：
−あるタンパク質キナーゼは、細胞ホメオシタシス及び代謝、運動性、遺伝子の転写及び細胞分裂、増殖という重要な細胞機能に関係している；
−酵素とタンパク質の調節の役割を果たすホスファターゼであるカルシニュリンは、カルシウムの形質導入に係わる；
−サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ、グアニジュルシクラーゼ及びアデニリルシクラーゼは、二次メッセンジャーサイクリックＡＭＰとサイクリックＧＭＰの比率を、ある種のホルモンのメカニズムによってプラス及び／又はマイナスに調整する；
−ＮＯ−シンターゼの３つの同種形は、ＮＯの生産、及び血管の弛緩、マクロファージの細胞毒性作用、神経刺激伝達物質、ニューロペプチド及び／又はホルモンの塩析に介入する；
−細胞骨格のある種のタンパク質、例えば、ミオシンなどは、細胞形態、その堅さ、付着の制御に不可欠である；
−カルデスモン、スペクトリン、アデュシン、タンパク質は、アクチンを結合する；
−デスモカルミン、デスモゾームのタンパク質は、ケラチンと相互作用する；
−原形質膜Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼは、細胞間イオン濃度の維持に介入する；
−オルニチン・デカーボキシラーゼ、ある種のホスフォリパーゼＡ２、及びある種のトランスグルタミナーゼは、カルモジュリン依存性であると言われている。
【０００５】
他方、ある研究では、カルモジュリンは、デオキシリボ核酸の修復現象で役割を果たし、潜在的に皮膚の老化に係わることが示唆されている。
カルモジュリンは良く解明されたタンパク質であるが、実際、カルモジュリンは、そのすべてがまだ説明し尽くされていない大きなタンパク質ファミリーのプロトタイプであることが知られている。
【０００６】
本出願人は、長期にわたって鋭意研究を行った結果、表皮タンパク質の内、角化上皮において発現するポリペプチドを、生化学的技術によって単離し、精製した。特に本明細書で“ＣＬＳＰ”（カルモジュリンに類似した皮膚タンパク質：カルモジュリン類似皮膚タンパク質）とも呼ばれるこのポリペプチドは、上皮に発現する。角化上皮では、発現するタンパク質の大部分がケラチンで構成されていることが知られている。したがって、本出願人は、特にケラチンを除去する抽出過程を入念に実施することによって、はじめてＣＬＳＰを分離・精製することが可能であった。
【０００７】
本出願人は、アミノ酸の一次配列を決定した。
従って、本発明は、次のような配列番号：０１：

のアミノ酸列を有することを特徴とするカルシウム固定タンパク質（ＣａＢＰ：カルシウム固定タンパク質）ファミリーに属する単離され精製されたポリペプチドを対象とする。
【０００８】
本発明のポリペプチドは、天然由来あるいは合成由来であってよい。合成とは、ここでは、化学的に、あるいは生産に必要な成分（エレメント）を生体に導入した後にその生体によって生産されるすべてのポリペプチドを意味する。
本発明のポリペプチドは、任意の可能な起源、すなわち、動物、特に哺乳類、さらにはヒト由来、又は植物由来、又は微生物（とりわけ、ウイルス、ファージ、バクテリア）由来、あるいは、真菌由来のものであってよく、由来する生物体中に天然に存在しているか否かに関わらない。
好ましくは、本発明のポリペプチドは天然由来のもので、哺乳類の組織、特に哺乳類の皮膚から単離される。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトの皮膚、更に好ましくは、ヒトの表皮から単離される。
【０００９】
ポリペプチドに関しては、ポリペプチドの生物学的性質を変更させないで、一又は複数のアミノ酸基を、類似のハイドロパシー指標を持つアミノ酸残基と置換することができることが知られている。ハイドロパシー指標は、アミノ酸の疎水性と電荷に関する指標である（Ｋｙｔｅ等（１９８２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５）。
また、本発明は、少なくとも一つのアミノ酸残基が類似のハイドロパシー指標を有するアミノ酸残基と置換された上述のポリペプチドを対象とするものである。
一般的に、成熟ポリペプチドは、その配列に成熟ポリペプチドの配列を含む前駆体の成熟により得られた細胞内に存在することが知られている。
また、本発明は、配列の一部が本発明のポリペプチドの配列で構成されたすべての天然あるいは合成ポリペプチドにも関する。
ポリペプチドは、翻訳後に、例えばジスルフィド結合の形成、特定のタンパク分解による切断、糖の付加（グルコシル化）、特にセリン及び／又はスレオニン及び／又はチロシンのレベルでのリン酸化及び／又は脂質との結合のような修飾を受けてもよいことが知られている。
本発明のポリペプチドは、翻訳後に一又は複数の修飾を受けていてもよい。
また、本発明は、翻訳後に修飾されたか、あるいは翻訳後に修飾されていない、本発明のポリペプチドに関するものである。
【００１０】
等電点に基づいてポリペプチドを分類することが知られている。本発明のポリペプチドの理論的等電点は、そのアミノ酸の連鎖から推定することができる。本発明のポリペプチドは、理論的には酸性のポリペプチドである。
また、本発明は、その理論的等電点が１〜６、特に３〜５の範囲であるポリペプチドを対象とするものである。本発明のポリペプチドは、４．０７５の理論的等電点を有する。
アミノ酸の一次配列並びに前記ポリペプチドについて翻訳後に行われた様々な修飾は、キロダルトンで表現された見かけの分子量によって特徴づけられることが知られている。
見かけの分子量とは、ポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウムゲル上において、既知の分子量の標準タンパク質と電気泳動移動度を比較することによって、あるいは、排除クロマトグラフィーにおいて既知の分子量の標準タンパク質とポリペプチド溶出容量を比較することによって、ポリペプチドについて得られる分子量を意味する（「タンパク質の精製」，Ｊ-Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ及びＬ．Ｒｙｄｅｎ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，１９８９に記述された方法に従う）。
本発明のポリペプチドのアミノ酸の連鎖の知識に基づいて、理論的分子量を決定することができる。
【００１１】
従って、本発明は、１３〜１７キロダルトン（ｋＤ）、特に１４〜１６キロダルトン（ｋＤ）に含まれる理論的分子量を有するポリペプチドに関するものである。
特に、本発明のポリペプチドは、１５．９キロダルトン（ｋＤ）の理論的分子量を有する。
ポリペプチドの一次アミノ酸配列がプロテアーゼにより特異的に認識される部位を決定し、ひとたびこれらの部位が認識されると、プロテアーゼが該ポリペプチドに付着あるいは付着しないで、タンパク分解によるその切断を誘発することが知られている。
また、本発明は、本発明のポリペプチドのタンパク分解に由来する少なくとも一つのポリペプチド混合物に関するものである。
従って、明細書にそれ以外の説明を記載しない限り、ポリペプチドとは、タンパク分解により得られるか、合成により得られるかに関わらず、本発明の天然又は合成ポリペプチド、あるいはその断片の少なくとも一つ、あるいは、その配列が完全にあるいは部分的に前記のポリペプチドの配列によって構成されるすべての天然ポリペプチドあるいは合成ポリペプチドを意味する。
【００１２】
本発明のポリペプチドのアミノ酸の一次配列を分析した結果、カルシウムを固定するポリペプチド中の、パーティシパントとして広く認められた特定部位がカルシウム固定部位になることが示された。本発明のポリペプチドによるカルシウムの固定は、実施例に示した試験結果によって確認された。
本発明のポリペプチドは、カルシウムを固定するポリペプチドである。
明細書には、カルモジュリンのグループのタンパク質が組織内に存在することの重要性が示されている。従って、その効果を変更するために組織にカルモジュリンのグループのタンパク質を供給することの重要性が理解できる。従って、本発明の潜在的な用途には、カルシウム依存性シグナルによるすべての形質導入経路が含まれる。
【００１３】
例えば、化粧品では、老化の治療、特に、皮膚の老化の治療における、紫外線への暴露に関連した皮膚のダメージの治療における、通常、あるいは、病理的な上皮の増殖の機能不全、あるいは、上皮の分化不全（乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、新生組織形成等々）を調整するために、本発明のタンパク質を利用することができる。
また、本発明の別の目的は、生理学的に許容可能な媒体中に、前記のポリペプチドの少なくとも一つを含有する組成物を提供することにある。
本発明において、生理学的に許容可能な媒体とは、皮膚、粘膜、爪、髪と適合性のある化粧品的及び／又は製薬的に許容可能な媒体である。
本発明の組成物は、化粧品組成物及び／又は製薬組成物であってもよい。
好ましくは、本発明の組成物は、皮膚及び／又は粘膜に使用することができる。
本発明のポリペプチドは、特に乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、新生組織形成の治療において良性、あるいは、病理学的な皮膚の増殖、あるいは、分化の機能不全を調節する薬剤として利用することができる。本発明のポリペプチドは、また、皮膚、粘膜、及び／又は、ケラチン繊維の手入れ、及び／又は、化粧のための組成物に導入することができる。
【００１４】
本発明の組成物は、また、皮膚の老化の徴候及び／又は紫外線、特にＵＶＡ又はＵＶＢの影響に抗するためのものである。
従って、本発明の別の対象は、皮膚の増殖あるいは分化の機能不全、乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、及び／又は、新生組織形成を治療するための組成物である。
本発明は、また、皮膚の老化の徴候及び／又は紫外線、特にＵＶＡ又はＵＶＢの影響に抗するための少なくとも一つの本発明のポリペプチドを含む組成物に関するものである。
本発明の別の対象は、組成物中における又は組成物の調製における少なくとも一つの本発明のポリペプチドの使用であって、該ポリペプチド又は組成物が、皮膚の増殖又は分化の機能不全、乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、及び／又は、新生組織形成を治療するためのものである使用に関する。
本発明は、また、皮膚の老化の徴候を治療するための、及び／又は紫外線、特にＵＶＡ又はＵＶＢの影響に抗するための薬剤としての少なくとも一つの本発明のポリペプチドの使用に関するものである。
【００１５】
本発明の他の対象は、また、皮膚の増殖、あるいは、分化の機能不全、乾燥肌、角質増殖症、錯角化症、乾癬、魚鱗癬、及び／又は、新生組織形成、皮膚の老化の徴候、及び／又は紫外線、特にＵＶＡ又はＵＶＢの影響と戦うための美容処理方法であり、皮膚、粘膜、及び／又は、ケラチン繊維に少なくとも一つの本発明のポリペプチドを含む美容組成物を塗布することを特徴とする方法に関する。
本発明の処理方法は、皮膚の増殖、及び／又は、分化に関する問題を有する個人の美観を改善するための美容方法である。
【００１６】
本発明の組成物に含まれるポリペプチドの量は、もちろん、必要な効果に依存し、従って、大きく変化することがある。
目安を示すと、組成物は、本発明のポリペプチドを、組成物の全重量に対して０．００００１％〜５０％、好ましくは、組成物の全重量に対して０．００１％〜１０％、更に好ましくは、組成物の全重量に対して０．１％〜１％含むことができる。
同様に、本発明は、特に上述の単離ポリペプチド、あるいは、前記の単離タンパク分解断片、あるいは、前記の合成ペプチドと選択的に結合する、場合によっては皮膚由来の、すべての構造的あるいは機能的分子を調製あるいは精製するための、本発明のポリペプチド、あるいは、タンパク分解断片、配列から派生した合成ペプチドの利用を対象とする。
この点に関して、本出願人は、本発明のポリペプチドが、例えば、トランスグルタミナーゼ、特にトランスグルタミナーゼ３、ガレクチン７、アネキシン、特にアネキシン２、ＭＲＰ１４、あるいは、カルグラニュリンＢ、ヘパラナーゼ、ＨＳＰ２７、ＳＣＣＥ、あるいは、６０Ｓのリボソームタンパク質Ｌ９の中から選択された少なくとも一つの目標タンパク質に結合することができることを実証した。
トランスグルタミナーゼが角質被鞘形成に重要な役割を果たすということが知られていることから、ＣＬＳＰが、トランスグルタミナーゼに固着することによって角質被鞘の形成の調整を行うと推定することができる。
【００１７】
また、本発明は、トランスグルタミナーゼ、特にトランスグルタミナーゼ３の調節、並びに、皮膚の角質層の形成の調節を目的とした、本発明のポリペプチド、あるいは、タンパク分解断片、及び配列に由来するすべての合成ペプチドの利用を対象とするものである。
本発明のポリペプチドがカルモジュリンのグループに属し、知られているように、そのグループのポリペプチドが一般的に目標タンパク質に対する固着によって刺激（細胞間カルシウム比率）に反応する二次メッセンジャーなので、本発明のポリペプチドとそのリガンドとの間の相互作用を変化させる、皮膚由来のものであってもよい、構造的あるいは機能的なすべての分子を調製あるいは精製するために、本発明のポリペプチドを利用することができる。
また、本発明は、場合によっては上皮から、本発明のポリペプチド及びそのリガンド間の相互作用を調整できるすべての構造的あるいは機能的分子を調製、あるいは精製するために、本発明のポリペプチド、タンパク分解断片、及びその配列に由来するすべてのポリペプチドの利用を対象とする。
【００１８】
同様に、本発明は、このタンパク質及びその断片を精製することを目的とした、免疫血清、及び／又は、特定のモノクローナル抗体を調製するための、本発明のポリペプチド、タンパク分解断片、あるいは、その配列に由来するすべての合成ペプチドの利用を対象とするものである。さらに、本発明は、同様に、生産に使用した生物学的なシステムにかかわらず、抗体、あるいは、組換え抗体の断片を生成するための前記の配列の利用をすべて対象とする。
本発明は、また、本発明のポリペプチドを特異的に認識することを特徴とするポリクロナール抗体、あるいは、モノクロナール抗体を対象とする。
抗体は、そのために利用可能なすべての動物種、特にウサギの免疫処理によって作成された抗体であっても良い。抗体は、本発明のポリペプチドを用いた免疫処理によって生産された、精製したかあるいは精製していない、天然起源あるいは合成起源のものであることができる。
デオキシリボ核酸基質から細胞内でタンパク質が合成されることが知られている。同様に、遺伝コードが縮重されるということが知られている。また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、天然デオキシリボ核酸、あるいは、合成デオキシリボ核酸の異なる配列に由来するものであっても良い。合成デオキシリボ核酸配列は、化学的に、あるいは、遺伝子操作によって得られたすべての配列を含む。
【００１９】
前記のデオキシリボ核酸列は、前記の起源生物の中に自然に存在するかどうか関わらず、知られるすべての起源、例えば、動物、特に哺乳類、更に特には、ヒト、植物、微生物（ウイルス、ファージ、とりわけバクテリア）、あるいは、キノコに由来するものであっても良い。
出願人は、ヒトの皮膚に由来の相補デオキシリボ核酸発現バンクである、本発明のポリペプチドについてコード化しているデオキシリボ核酸の断片に対して分子生物学的技術、特に選別技術を用いて分離、精製と配列読みとりを行った。
従って、同様に、本発明は、そのすべて、あるいは、一部が本発明のポリペプチドのアミノ酸の一次配列についてコード化している生理学的に許容可能な天然、あるいは、合成されたすべてのデオキシリボ核酸列を含む美容組成物、あるいは、薬学的組成物を対象とするものである。
【００２０】
本研究の課程で、本出願人は、ヒトの皮膚からの本発明のポリペプチドのアミノ酸の一次配列についてコード化しているデオキシリボ核酸列を分離、精製することができた。
本発明は、次のような配列番号：２：

をコード化しているヌクレオチド列に対応する分離、精製されたデオキシリボ核酸の断片を対象とするものである。
【００２１】
本発明は、また、配列番号：２の配列をコード化している少なくとも一つのヌクレオチド列を含む単離され、精製されたデオキシリボ核酸のすべての断片を対象とするものである。
同様に、本発明は、少なくとも配列番号：２の配列をコード化しているヌクレオチド配列に対応するすべてのポリヌクレオチド、リボ核酸、あるいは、センス又はアンチセンスのデオキシリボ核酸を対象とするものである。
配列番号：２の配列に対応するＤＮＡの断片を前記のＣＬＳＰに対応する組換えタンパク質の合成を可能にする発現ベクターの中に導入することができる。
組換えタンパク質とは、ここでは、この発現を可能にする生物等、何らかの発現ベクターの中へのＣＬＳＰの相補ＤＮＡのすべて、あるいは一部の導入及び発現後に人工的方法で得られたＣＬＳＰのペプチド配列すべて、あるいは一部に対応するすべてのペプチド要素を意味する。
【００２２】
特に本発明に従って、配列番号：２をコード化しているヌクレオチド配列のすべて、あるいは一部を、例えばベクターｐＧｅｘ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）のような発現ベクターに導入し、大腸菌で発現させて、ＣＬＳＰあるいはＣＬＳＰの一部を生成することができる。
従って、本発明は、同様に配列番号：２をコード化しているヌクレオチド配列のすべて、あるいは、一部を含む組換え発現ベクターを対象とするものである。
また、本発明は、配列番号：１、特に配列番号：２をコード化している配列のすべて、あるいは、一部を含む発現ベクターｐＧｅｘ−２Ｔによって得られたものに対応する組換えタンパク質を対象とするものである。
同様に、本発明は、生理学的に許容可能な媒体中に、配列番号：２をコード化している少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む少なくとも一つの単離、精製されたデオキシリボ核酸の断片を含む化粧品組成物又は製薬組成物を対象とするものである。
同様に、本発明は、生理学的に許容可能な媒体に、前記配列番号：２に対応するセンス又はアンチセンスのリボ核酸列を含む化粧品組成物又は製薬組成物を対象とするものである。
同様に、本発明は、生物、あるいは、微生物による再合成、あるいは、合成環境から、例えば、試験管内合成といった既知のすべての技術によって、本発明のポリペプチド、あるいはリボ核酸を生成するための前記のデオキシリボ核酸配列の利用を対象とするものである。
【００２３】
その性質が何であれ、本発明の組成物は、摂取され、注射され、又は皮膚（体の任意の皮膚領域）もしくは粘膜（頬、頬骨、歯肉、生殖、結膜等）へ塗布することができる。
投与方法に応じて、本発明の組成物は、通常使用される任意のガレノス形態で提供され得る。
皮膚への局所適用用には、組成物は、特に、水性又は油性の溶液、又は漿液型又はローションの分散液、水性相に脂肪相を分散（Ｏ／Ｗ）して、又はその逆（Ｗ／Ｏ）によって得られる、液状又は半液状のコンシステンシーのミルク型のエマルション、又は軟性のコンシステンシーの水性又は無水のクリーム又はゲル型のエマルション又は懸濁液、又はイオン性及び／又は非イオン性の小胞分散液の形態、もしくはムース又は加圧された噴霧剤をさらに含有するエアゾール組成物の形態とすることができる。これらの組成物は通常の方法で調製される。
注射用には、組成物は、水性又は油性のローションの形態又は漿液の形態で提供することができる。眼用には点滴薬の形態、摂取用には、カプセル、顆粒、シロップ又は錠剤の形態で提供することができる。
本発明の組成物の種々の成分の量は、考慮される分野で、従来より使用されている量である。
【００２４】
これらの組成物は、特に、顔、手、足、大きな解剖学上のヒダ又はボディのクレンジング、保護、トリートメント又は手入れ用のクリーム（例えば、デイクリーム、ナイトクリーム、メークアップ除去用クリーム、ファンデーションクリーム、抗日光用クリーム）、液状ファンデーション、メークアップ除去用ミルク、ボディ保護又は手入れ用ミルク、抗日光用ミルク、日焼け後用ミルク、スキンケア用ローション、ゲル又はムース、例えばクレンジングローション、抗日光用ローション、日焼け後用ローション、人工的な日焼け用ローション、入浴用組成物、殺菌剤を含有する脱臭用組成物、アフターシェービングゲル又はローション、脱毛クリーム、昆虫忌避用組成物、鎮痛用組成物又はある種の皮膚病、例えば湿疹、しゅさ、乾癬、苔蘚、激しい痒み及び魚鱗癬の治療用の組成物を構成することができる。
さらに、本発明の組成物は、クレンジングソープ又はケーキを構成する固体状の調製物からなるものであってもよい。
また、組成物は、加圧された噴霧剤をさらに含有するエアゾール組成物の形態に包装されてもよい。
【００２５】
またさらに、本発明の組成物は、頭皮の手入れ用組成物、特にシャンプー、ヘアセット用ローション、トリートメントローション、スタイリングクリーム又はゲル、染毛シャンプーの形態であってもよい染色（特に酸化染色用）組成物、髪の再構成用ローション、パーマネントウエーブ用組成物（特に、パーマネントウエーブ施術の第１工程用の組成物）、抜毛防止用のゲル又はローション、駆虫用シャンプー、抗フケ用組成物等にすることもできる。
また、本発明の組成物は、口腔歯科用、例えば、練り歯磨きに使用することもできる。この場合、組成物は、口腔用組成物に一般的なアジュバントと添加剤、特に、界面活性剤、増粘剤、保湿剤、研磨剤、例えばシリカ、種々の活性成分、例えばフッ化物、特にフッ化ナトリウム、及び任意の甘味料、例えばサッカリンナトリウムを含有してもよい。
本組成物がエマルションである場合、脂肪相の割合は、組成物の全重量に対して５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％である。エマルションの形態の組成物に使用される油、ロウ、乳化剤及び共乳化剤は、化粧品の分野で従来から使用されているものから選択される。乳化剤及び共乳化剤は、組成物中に、組成物の全重量に対して０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％の範囲の割合で存在する。エマルションは、脂質小胞体をさらに含有していてもよい。
組成物が油性ゲル又は溶液である場合、脂肪相は組成物の全重量に対して９０％より多くしてもよい。
【００２６】
また、既知の方法に従って、化粧品組成物は、化粧品の分野で一般的なアジュバント、例えば親水性又は親油性のゲル化剤、親水性又は親油性の添加剤、防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、フィラー、遮蔽剤、臭気吸収剤及び着色物質を含有してもよい。これら種々のアジュバントの量は、化粧品の分野において使用されている典型的な量、例えば、組成物の全重量に対して０．０１％〜１０％である。このようなアジュバントは、その性質により、脂肪相、水性相及び／又は脂質小胞体に導入しうる。
本発明で使用可能な油又はロウとしては、鉱物性油（ペトロラタム）、植物性油（シェアバターの液状留分、ヒマワリ油）、動物性油（ペルヒドロスクワレン）、合成油（プルセリン油：Purcellin oil）、シリコーン油又はロウ（シクロメチコーン）及びフッ化油（ペルフルオロポリエーテル）、ミツロウ、カルナウバ又はパラフィンロウを挙げることができる。脂肪アルコールと脂肪酸（ステアリン酸）をこれらの油に添加してもよい。
本発明で使用可能な乳化剤としては、例えば、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベイト（polysorbate）６０及びガッテフォセ（Gattefosse）社からテフォース（Tefose）（登録商標）６３の名称で販売されているＰＥＧ−６／ＰＥＧ−３２／ステアリン酸グリコールの混合物を挙げることができる。
【００２７】
本発明で使用可能な溶媒としては、低級アルコール、特に、エタノール及びイソプロパノール及びプロピレングリコールを挙げることができる。
本発明で使用可能な親水性のゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー類（カルボマー：carbomer）、アクリルコポリマー類、例えば、アクリレート／アルキルアクリレートのコポリマー類、ポリアクリルアミド類、多糖類、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム類及びクレー類を挙げることができ、また、親油性のゲル化剤としては、変性クレー類、例えば、ベントーン類、脂肪酸の金属塩、例えば、ステアリン酸アルミニウム、疎水性シリカ、エチルセルロース、ポリエチレンを挙げることができる。
組成物は、他の親水性の活性剤、例えば、タンパク質又はタンパク質の加水分解物、アミノ酸、多価アルコール、尿素、アラントイン、糖類及び糖類誘導体、水溶性ビタミン類、植物エキス及びヒドロキシ酸を含有してもよい。
親油性の活性剤としては、レチノール（ビタミンＡ）及びその誘導体、トコフェロール（ビタミンＥ）及びその誘導体、必須脂肪酸、セラミド類、精油、サリチル酸及びその誘導体を使用することができる。
【００２８】
本発明の組成物においては、特に皮膚病の治療及び／又は予防を意図した他の活性剤と、少なくとも１つのアヤメ科の少なくとも１つの抽出物とを組み合わせてもよい。このような活性剤としては、例えば：
−分化及び／又は増殖及び／又は色素沈着を減少させる薬剤、例えば、レチノイン酸及びその異性体、レチノール及びそのエステル類、ビタミンＤ及びその誘導体、エストロゲン類、例えば、エストラジオール、コウジ酸又はヒドロキノン；
−抗菌剤、例えば、リン酸クリンダマイシン、エリスロマイシン又はテトラサイクリンクラスの抗生物質；
−駆虫剤、特に、メトロニダゾール、クロタミトン又はピレスロイド類；
−抗真菌剤、特に、イミダゾール類に属する化合物、例えば、エコナゾール、ケトコナゾール又はミコナゾール、又はそれらの塩類、ポリエン化合物、例えば、アンホテリシンＢ、アリルアミン類の化合物、例えばテルビナフィン、又はオクトピロックス；
−抗ウィルス剤、例えばアシクロビル；
−ステロイド系の抗炎症剤、例えば、ヒドロコルチゾン、吉草酸ベタメタゾン、又はプロピオン酸クロベタゾール、又は非ステロイド系の抗炎症剤、例えば、イブプロフェン及びその塩類、ジクロフェナク及びその塩類、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、又はグルシルリジン酸；
−麻酔剤、例えば、塩酸リドカイン及びその誘導体；
−止痒剤、例えば、テナルジン、トリメプラジン又はシプロヘプタジン；
−角質溶解剤、例えば、α−及びβ−ヒドロキシカルボン酸、又はβ−ケトカルボン酸、及びそれらの塩類、アミド類又はエステル類、特に、ヒドロキシ酸、例えば、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、及び一般には果実の酸類及び５−ｎ−オクタノイルサリチル酸；
−保湿剤、例えばグリセロール及びその誘導体；
−抗フリーラジカル剤、例えば、α−トコフェロール又はそのエステル類、スーパーオキシド−ジスムターゼ、ある種の金属キレート剤又はアスコルビン酸及びそのエステル類；
−抗脂漏剤、例えば、プロゲステロン；
−抗フケ剤、例えば、オクトピロックス又はジンクピリチオン；
−抗挫創剤、例えば、レチノイン酸又は過酸化ベンゾイル；
−植物又は細菌由来のエキス
を挙げることができる。
したがって、特定の実施態様において、本発明の組成物は、抗菌剤、駆虫剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、止痒剤、麻酔剤、角質溶解剤、抗フリーラジカル剤、抗脂漏剤、抗フケ剤及び抗ざ瘡剤、及び／又は皮膚の分化及び／又は増殖及び／又は色素沈着を低減させる薬剤から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含有する。
【００２９】
実施例１
材料と方法：
λｇｔ１１（ＡＲＮｍ＝ヒト成人包皮のケラチノサイト由来）のケラチノサイトのｃＤＮＡライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に由来する。
異なる実験で使用されたオリゴマーを下記に示す。

【００３０】
縮重オリゴマーｓｃ５は、配列番号：１のアミノ酸配列に基づいている。ＣＬＳＰから推論されたすべての別のオリゴマーとその位置は、配列番号：２のヌクレオチド配列から推論された。
Ｎｏｔｌ−（ｄＴ）１８は、Ａの長い連鎖、例えば、ｐｏｌｙＡ＋に固着すると見なされる。逆転写反応で利用され、Ｎｏｔｌ−（ｄＴ）１８は、ｐｏｌｙＡ＋に固着する。
【００３１】
１．ヒトの角質層からの調製
緩衝剤：
ｌ：ＳＤＳ０．３％；トリス−ＨＣｌ２８ｍＭ；トリス塩基２２ｍＭ
２Ｄ：８Ｍ尿素；２％ＣＨＡＰＳ（３-(３-コラミドプロピル)ジメチルアモニオ-１-プロパン-スルホナート）；ジチオスレイトール２０ｍＭ；０．５％イモビリンｐＨ勾配バッファ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＨ＝３；
ＣＬＳＰを精製するために、Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｏｌ．，１９９１，７１：４７１−４７４にＬｕｎｄｓｔｒｏｍ及びＥｇｅｌｒｕｅｄが記述した方法に従って角質層のアセトン抽出物を調製した。
７８ｍｇのアセトン粉末も調製した。
２．５ｍｌの緩衝剤ｌを７８ｍｇのアセトン粉末に加え、すべてをポットに保存し、１０分間沸騰させ、再度ポットに保存した。溶液を１０分間１００００ｇで遠心分離した。上清を回収し、０．２２Ｍで濾過した。そのようにして２ｍｌの上清Ｓｌが得られた。
次に、上清Ｓｌに１０ｍｌの冷アセトンを加えた（１０Ｖ／２Ｖ）。１０分間氷上に放置し（積層氷）、４℃で２０分間９４００ｇで遠心分離した。
上清を除去し、残存物を周囲温度で２０分間乾燥させた。次に、残存物を３００ｌの緩衝剤２Ｄに入れた。そのようにして、抽出物Ｅｌが得られた。
【００３２】
２．二次元ゲル
メーカーの推奨に従って、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の装置（モデルｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）で、抽出物Ｅｌの中に含まれたタンパク質の二次元分離を行う。
「タンパク質のゲル電気泳動（ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ）」あるいは「マイクロシークエンシングのためのタンパク質及びペプチドの精製の実際的手引き（Ｐａｕｌ Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ編、第２版１９９３）」に記載された標準的な方法で、スポット染色、その回復、含まれるポリペプチドのシークエンシングを行った。
【００３３】
３．ｃＤＮＡ ＣＬＳＰのクローニングとシークエンシング
調製キットＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔを用いて皮膚と等価のケラチノサイト（Ｅｐｉｓｋｉｎ）の全ＲＮＡを調製し、メーカーの指示に従ってＱｉａｇｅｎ製のキットＱｌＡｓｈｒｅｄｄｅｒを用いて精製した。
オリゴマーＮｏｔｌ−ｄ（Ｔ）１８を使用して、メーカーの指示に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製のファースト・ストランドｃＤＮＡ合成キットを用いて、そのようにして調製されたＲＮＡの相補ＤＮＡを合成した。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のポリメラーゼｐｆｕと、オリゴマー対ｓｃ５／Ｎｏｔｌ−ｄ（Ｔ）１８を使用することによって、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（モデルＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）製の熱サイクル装置の中で、そのようにして得られた塩基対７７５ＡＤＮｃをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。この断片の配列によって、ヌクレオチド連鎖を決定することができる。
ＣＬＳＰからｃＤＮＡの完全な配列を得るために、ファージｇｔ１１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中の角質ケラチノサイトの相補ＤＮＡバンクについての標準的実験条件で、次のようなオリゴマー対、ｓｃ１０／ｓｃ７，ｓｃ７／ｓｃ２１，ｓｃ１６／ｓｃ２９を用いて、ＰＣＲ反応を行った。
インターネットサイトＥｘｐａｓｙ Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔに関するプログラムＷＵ−Ｂｌａｓｔによって相同性サーチを行った。プログラムＯｍｉｇａ．１ＰＣ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）によって切断部位の検知を行った。
【００３４】
組換えタンパク質ＣＬＳＰの構造と発現：
制限部位ＢａｍＨ−１／ＥｃｏＲｌでの切断／結合によって、ＣＬＳＰのｃＤＮＡをベクターｐＧｅｘ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に導入する。ＣＬＳＰをコード化している配列がベクターに含まれたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの配列と同位相にある構造が、そこでバクテリアＥ．ＣｏｌｉＢＬ２１に導入される。バクテリアによって発現した組換えタンパク質をトロンビンによって切断することができ、構造は、得られた融合タンパク質がそのプロテアーゼによって切断された部位を支えるようなものになる。この実験のすべては、メーカーの異なる手順を厳密に適用して行った。
【００３５】
ＣＬＳＰによるカルシウムの固定：
カルシウムイオンのキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用するか、あるいは使用せずに、Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ｃｏｌ．（ＢＢＡ，６２３（１９８０），２５７−２７０）の記述した手順に従って、上記のようにして得られた融合タンパク質をタイプＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの上に置く。
【００３６】
親和性クロマトグラフィー：
１ｍｌのビーズを用いて、親和性クロマトグラフィーカラムを作成した。ビーズミリリットル当り１．３ｍｇのポリペプチドを使用して、メーカーの推奨に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈから市販の臭化シアンで活性化されたセファロースビーズの上に本発明のポリペプチドを固定した。
結合効率は、ビーズのミリリットル当り０．９５ｍｇのポリペプチドであった。ヒトの皮膚（ｐｌａｓｔｉｅｓ ｃｈｉｒｕｎｇｉｃａｌｅｓに由来する０．８３ｇの腹部の皮膚及び１００ｇの足裏の角質層）を、それぞれ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、トリトンＸ１００の０．１％（重量／体積）、及びプロテアーゼ抑制体混合物（１Ｍデペプスタチンを添加したＲｏｃｈｅ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＣｏｍｐｌｅｔｅ ＴＭ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）を含む緩衝剤Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ，ｐＨ７．４の１０ｍｌ及び１２０ｍｌ中でポリトロンに均質化した。
懸濁液を４℃で１０分間１００００ｇで遠心分離した。上清を０．２２で濾過し、親和性カラム上で周囲温度に移行する前に２．５ｍＭの塩化カルシウムに対して調整した。次に、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％（重量／体積）のトリトンＸ１００、及びプロテアーゼ抑制剤混合物を含む緩衝剤Ｈｅｐｅｓ１０ｍＭ，ｐＨ７．４の１０体積で、カラムを洗浄する。２ｍＭの塩化カルシウムの代わりに５ｍＭのＥＤＴＡを含む同じ緩衝剤を使用することによって、溶出を行う。
溶出したタンパク質は、変性ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられ、移動後に、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の銀染色キットを用いて、メーカーの推奨に従って、銀染色される。
【００３７】
結果：
ＣＬＳＰの精製とキャラクタリゼーション
二次元ゲルから分析したすべてのスポットの中で、スポットから推論された配列が、考慮に入れるに十分重要であるが、分析を継続するには十分異なるカルモジュリンとの配列相同性を示した。
得られたアミノ酸列のエレメントから、また、上述の分子生物学技術によって、配列番号：１の配列を単離、精製することができた。このタンパク質とカルモジュリンとの間の配列相同性により、このタンパク質がカルモジュリンと類似の特性を有するものであると考えられる。
カルシウムとの４カ所の結合部位がこの配列の中に明示される。すなわち、アミノ酸２１〜３２、５７〜６８、９１〜１０２、１２７〜１３８間に含まれる部位である。
電気泳動実験、特に、カルシウムイオンが存在する場合と存在しない場合で行われた組換えタンパク質を用いた電気泳動実験により、タンパク質がカルシウムを固定することが確認された。
従って、この配列はカルシウムを固定し、カルモジュリンではなく、ヒトの皮膚の角質層内に存在する完全なタンパク質に対応する。
【００３８】
ＳＣＴＥからのＤＮＡのクローニング：
上述の技術によって、８５８の塩基対のＤＮＡが単離された。このＤＮＡの断片は、ＣＬＳＰの一体コード配列、位置５５２の停止コドンまでの位置１１４のコドンＡＴＧを含む。
親和性クロマトグラフィー：
本発明のポリペプチドを用いて行われた親和性カラムについて採用したタンパク質の一つの配列によって、トランスグルタミナーゼ、特にトランスグルタミナーゼ３が問題となることが明らかになった。
別の実験によって、ガレクチン７、アネキシン、特にアネキシン２、ＭＲＰ１４、あるいは、カルグラニュリンＢ、ヘパラナーゼ、特にヘパラナーゼＩＩＩ、Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐ ２７、ＳＣＣＥ、あるいは、また、６０Ｓのリボソーム・タンパク質Ｌ９が、同様に本発明のポリペプチドに関連していることが明らかになった。
【配列表】

Claims (22)

1. 配列番号：１：
   

   

   のアミノ酸列であることを特徴とする、精製された天然あるいは合成ポリペプチド。
2. 哺乳類から精製されたことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
3. 哺乳類の皮膚から精製されたことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
4. ヒトの皮膚から精製されたことを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載のポリペプチド。
5. ヒトの表皮から精製されたことを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載のポリペプチド。
6. 配列の一部が、請求項１に記載されたポリペプチドの配列である天然あるいは合成のポリペプチド。
7. １〜６の間の理論的等電点を有することを特徴とする、請求項１ないし６の何れか１項に記載のポリペプチド。
8. ３〜５の間の理論的等電点を有することを特徴とする、請求項７に記載のポリペプチド。
9. １３〜１７キロダルトン（ｋＤ）の範囲の理論的分子量を有することを特徴とする、請求項１ないし８の何れか１項に記載のポリペプチド。
10. １４〜１６キロダルトン（ｋＤ）の範囲の理論的分子量を有することを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 一次配列中に少なくとも一つのカルシウム固定部位を有することを特徴とする、請求項１ないし１０の何れか１項に記載のポリペプチド。
12. カルシウムを固定したことを特徴とする、請求項１ないし１１の何れか１項に記載のポリペプチド。
13. 請求項１ないし１２の何れか１項に記載されたポリペプチドをコードする単離デオキシリボ核酸断片。
14. 以下の配列番号：２：
    

    

    で表されるヌクレオチド配列を含む単離されたデオキシリボ核酸断片。
15. ポリペプチド又はポリペプチド混合物を調製するための、請求項１４に記載されたデオキシリボ核酸の配列の使用。
16. 配列番号：２で表されるヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
17. 配列番号：１の配列に対応する組換え体タンパク質。
18. 配列番号：２で表されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターｐＧｅｘ−２Ｔの発現によって得られる組換え体タンパク質。
19. リボ核酸の調製のための、請求項１４に記載されたデオキシリボ核酸の配列の使用。
20. 精製ポリペプチド又は合成ペプチドに特異的に結合可能な分子の調製又は精製のための、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の少なくとも一つの単離ポリペプチド又は少なくとも一つの合成全ペプチドの使用。
21. 抗血清又は特異的モノクローナル抗体を調製又は精製するための、請求項１ないし１２の何れか１項に記載の少なくとも一つの単離ポリペプチド又は少なくとも一つの合成全ペプチドの使用。
22. 請求項１ないし１２の何れか１項に記載のポリペプチドを特異的に識別することを特徴とするポリクロナール又はモノクロナール抗体。