JP5939528B2 - カルモジュリン様皮膚タンパク質を有効成分として含む医薬組成物 - Google Patents
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Description
[態様1]式(I):
TGKNLSEAGLRKLI(S又はG)EVDSDGD(アミノ酸一文字表記)(I)
からなるアミノ酸配列を有する、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するペプチド。
[態様2]態様1記載のペプチド、又は、式(I):
TGKNLSEAGLRKLI(S又はG)EVDSDGD(アミノ酸一文字表記)(I)
からなるアミノ酸配列を含み、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
[態様3]以下のアミノ酸配列:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列における式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分において、60%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(4)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列;
(5)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;又は
(6)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。
[態様4]神経細胞の機能障害又は細胞死がアルツハイマー病に関連する、態様2又は3記載の医薬組成物。
[態様5]記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、態様2〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[態様6]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、(a)該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
[態様7]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドによる細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を検出する方法であって、(a)被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞の機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
[態様8]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死の抑制を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、(a)被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞死を検出する工程、(c)神経細胞の機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
[態様9]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドに結合する化合物のスクリーニング方法であって、(a)該ペプチド又はポリペプチドに被検試料を接触させる工程、(b)該ペプチド又はポリペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、(c)該ペプチド又はポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
[態様10]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法。
[態様11]態様1記載のペプチド、又は、態様2若しくは3に記載のポリペプチドを、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
[態様12]
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、態様11記載の方法。
TGKNLSEAGLRKLI(S又はG)EVDSDGD(アミノ酸一文字表記)(I)
からなるアミノ酸配列を有する本発明のペプチド、及び、該ペプチドを含むポリペプチド(タンパク質)、例えば、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドは、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。更に、配列番号3及び配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるマウス由来のポリペプチドも神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有する。
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個(例えば、3個〜5個)のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列における式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分において、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(4)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列;
(5)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個(例えば、3個〜5個)のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;又は
(6)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
から成り、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を有するポリペプチドは医薬組成物の有効成分として有用である。
ヒューマニンに対する抗体PO4(Tajimaら,2003)を用いることにより、ヒトNT2神経芽細胞腫細胞溶解物から20kDのタンパク質を免疫沈降させた(図1A)。質量分析によって、このタンパク質はCLSP(カルモジュリン様皮膚タンパク質;calmodulin−like skin protein)と同定された。ヒトCLSP(hCLSP)は146個のアミノ酸から成るタンパク質であって、主として皮膚ケラチノサイトで発現されCa2+結合モチーフであるEFハンドを有するカルモジュリン関連タンパク質である(Mehulら,2000;Hwangら,2003)。細胞内のシグナル伝達におけるその関与は、未だ特徴が明らかにされていない。かかるヒトCLSPのアミノ酸配列を配列番号1として示す。
hCLSP(C末端にMycHisタグを付している)及びヒューマニン(C末端にFLAGタグを付している)を、ヒトSHSY−5Y神経芽細胞腫細胞中で発現させた。Hisタグに吸着するTALON Metal Resinビーズを用いたhCLSP−MycHisの精製、並びに、FLAG抗体をコンジュゲートさせたビーズを用いたヒューマニン−FLAGの精製の結果、回収した調整培地及び細胞溶解物中にhCLSP−MycHis及びヒューマニン−FLAGの存在が認められた(図2A)。小胞体−ゴルジ体輸送の阻害物質であるブレフェンディンAによる処理によって、調整培地中に分泌されるGhCLSP及びヒューマニンの量が少なくなった(図2A)。これらの結果は、CLSP(典型的な分泌リーダー配列は欠けている)が、通常の細胞内分泌メカニズムを介して分泌されることを示唆している。ヒューマニンの分泌については、初期の研究においてすでに示されている(Hashimotoら,2001a)。
hCLSPの欠失変異体hCLSP−DC1及びhCLSP−DC2(これらは、それぞれ、C末端領域(アミノ酸79〜146)及び(アミノ酸62〜146)を欠失している)をコードする発現ベクターを、細胞死アッセイのために構築した(図3A)。各変異体の同時発現は、V642I−APPによって誘発される細胞死を抑制した(図3B及び3C)。イムノブロット分析によって、これらの変異体が調整培地中に分泌されることが示された(図3D)。これらの結果から、N末端の1〜61領域はhCLSPによって誘導される細胞死の抑制にとって十分であることが示された。
EHDがhCLSPによって誘導される抑制のためのhCLSPのコア領域であることを確かめるために、EHDペプチドを化学的に合成し、それがhCLSPを模倣するか否かを調べた。ヒューマニン変異体S14G−ヒューマニンは野生型ヒューマニンと比べて1000倍以上強力であることから(Terashitaら,2003)、比較のためにEHD−Gも合成した(この場合、54番目のセリン(ヒューマニンにおける14番目のセリンと類似)がグリシンに置換されている)。10μMの濃度のヒューマニン又はEHDと一緒にインキュベートするとV642I−APPによって誘発される細胞死は抑制されたのに対して、10nMの濃度のヒューマニン又はEHDでは細胞死は抑制しなかった(図5A及び5B)。S54G置換は、ヒューマニン活性を増強しなかった(図5A及び5B)。これらの結果は、EHDが神経細胞の死を抑制する活性を有することを裏付けるばかりでなく、分泌されたhCLSPが細胞の外側から該活性を示すという考えをも支持するものである。これらのペプチドと一緒にインキュベートすることは、V642I−APPの発現に影響を与えなかった(図5C)。
Talon Metalビーズを用いて、hCLSP−MycHisを過剰発現するF11細胞の調整培地から、hCLSP−MycHisをアフィニティー精製した。模擬精製は骨格ベクターを用いてトランスフェクトしたF11細胞の調整培地を用いて行った。hCLSP−MycHisの濃度は、クーマシーブルー染色によって推定した(図6A)。CLSP−MycHisを過剰発現するCOS7細胞の調整培地から部分精製した各種濃度の組み換えhCLSP−MycHisを用いることにより、V642I−APPによって誘発される細胞死の抑制のためのhCLSPの有効濃度を推定した。図6B及び6Cに示されるように、hCLSP−MycHisは、用量に依存して神経細胞死を抑制した。推定されるEC50は10〜100pMである。この結果は、CLSPがヒューマニン(EC50=1〜10μM)よりも105−6倍強力であることを示した。一方で、EHDペプチドのEC50は、10nMよりも高いことから(図5)、hCLSPのEHD及び/又は調整培地中でCLSPと複合体を形成するその他のタンパク質と比較して、その他の領域が、未だ特徴が明らかにされていない方法を介してEHDのヒューマニン活性を増強する可能性が高い。
図7Aに示されるように、組み換えhCLSP−MycHis(概算濃度100nM)又は合成ヒューマニン(100μM)との同時インキュベーションは、705番目のチロシンにおけるSTAT3のリン酸化を増大させた。この結果は、CLSPがヒューマニン受容体と結合し、JAK2/STAT3生存促進経路を活性化することにより、神経細胞死を抑制することを示唆する(Hashimotoら,2009)。裏付けとして、gp130に対する中和抗体は、ヒューマニンが介在する神経保護活性についての初期の研究において示されるように(Hashimotoら,2009)、CLSPによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた(図7C〜D)。CNTFR及びWSX−1に対する中和抗体もまた、CLSPによって誘発される神経細胞死の抑制を弱めた(図13A〜F参照)。
ヒトCLSP遺伝子に関しては、元々Scarf1及びScarf2と名付けられた2つのマウスのカウンターパート遺伝子が存在する(Hwangら,2003)。マウスScarf1はアミノ酸レベルでヒトCLSPと50.0%の同一性を示す。マウスのScarf1及びScarf2は、高度に類似しており、それらの遺伝子はマウス染色体15.3に15.3kBの間隔で並んで配置されている(Hwangら,2003)。これら遺伝子をマウスCLSP−1(mCLSP−1)及びマウスCLSP−2(mCLSP−2)と命名する。これらのいずれかとの同時発現によってV642I−APPによって誘発されるF11細胞の細胞死が完全に抑制されたのに対して(図9)、それらは、V642I−APPによって誘発されるヒトSH−SY5Y細胞の細胞死は部分的にのみ抑制した(データは示さず)。一方で、ヒトCLSPは、V642I−APPによって誘発されるSH−SY5Y細胞の死を完全に抑制することができるのに対して、V642I−APPによって誘発されるF11細胞の死は部分的にのみ抑制した(データ示さず)。これらの結果は、CLSPが部分的に種特異的なヒューマニン活性を示すことを示している。尚、マウスScarf1及びマウスScarf2のアミノ酸配列を夫々、配列番号3及び配列番号4で示す。
以前の研究によって、ヒトCLSPは皮膚及びその他の表皮組織において高度に発現することが示されている(Mehulら,2000;Hwangら,2003)。マウスCLSP−1及びCLSP−2は筋肉でも発現した(Hwangら,2003)。本発明者は、mCLSP−1及びmCLSP−2が8週齢及び20月齢のマウスの皮膚組織及び筋肉で高度に発現されていることを免疫組織化学により見出した(図11)。一方中枢神経の海馬における発現レベルは皮膚におけるレベルよりもはるかに低いことが示された(図11)。
更に、健常人の血漿中のCLSPを検出した。100μLのヒト血漿をヒトCLSPに対する抗体を用いて免疫沈降させ、得られた沈降物を同じ抗体を用いてイムノブロットした。免疫沈降効率はほぼ100%であった。図12Aに示されるように、20kDの分子量を有するタンパク質はCLSP抗体によって得られた沈降物中にのみ検出された。このタンパク質は、SDS−PAGE中で組み換え野生型CLSPと完全に同じように移動した。この結果は、ヒト血液中におけるCLSPの存在を示した。血漿中のCLSPの概算濃度は500pM〜1nMであった。
免疫沈降物はTris/Tricine SDS−PAGE上で分離して、PVDF膜上へ転写し、銀染色MSキット(Wako Laboratory Chemical,Japan)を用いて染色した。タンパク質のバンドを切り出して、リシルエンドペプチダーゼを用いて消化し、質量分析法(Applied Biosystems社のPerSeptive Biosystem Voyager-DE/RP)により分析した。
ヒトおよびマウス皮膚組織よりmRNAを調製し、それぞれの遺伝子に対応したプライマーを作成して、RT-PCR方法で、hCLSPならびにmCLSP-1 及びmCLSP-1cDNAをクローニングした。RT-PCR方法でpcDNAベクター中でV642I−APPをコードするcDNAが、これまでに記述されている(Hashimotoら,2001a,b)。細菌中でGSTタグ付CLSPを作製するために、ヒトCLSP cDNAをpGEXベクター中に導入した。C末端にMycHisタグの付いたタンパク質を作製するために、ヒトCLSP(hCLSP)、hCLSP欠失変異体、マウスCLSP−1(mCLSP−1)、及び、マウスCLSP−2(mCLSP−2)をコードするcDNAを、pcDNA3.1/MycHis中に導入した。C末端にFLAGタグの付いたCLSP(CLSP−FLAG)を作製するために、ヒトCLSPcDNAを、pFLAGベクター中に導入した。
抗体は以下の企業から購入した:Myc,Invitrogen(Carlsbad,CA,USA);FLAG(M2),Sigma(St.Louis,MO,USA);APP(22C11),Chemicon(Temecula,CA,USA);phoshoSTAT3(Tyr705),Cell Signaling Technology(Beverly,MA);STAT3(C−20),Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。GST−hCLSPに対するウサギポリクローナル抗体(GST−CLSP抗体と命名)は、N末端にGSTタグが付けられた組み換えヒトCLSPを用いて免疫することにより作製し、細菌中で産生させた。ヒトCLSPに対する別のウサギポリクローナル抗体(CLSP−N抗体と命名)は、キーホールリンペットヘモシアニン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)をコンジュゲートさせたhCLSPのN末端16アミノ酸ペプチドに相当する合成ペプチドを用いて免疫することにより作製した。CLSP−N抗体は、V642I−APPにより誘発される死のCLSPが介在する抑制を阻害する。
マウスMLTL−1マウスライディッヒ細胞(ATCC番号CRL-2065)、TM3ライディッヒ細胞(ATCC番号CRL-1714)は、ATCCから取得した。ヒトテラトカルシノーマ細胞株NTERA−2(NT2)はSTRATAGENE社から購入した。F11細胞(胚齢13日目のラット初期培養神経細胞及びマウス神経芽細胞腫N18TG2のハイブリッド))は上記のHashimotoら,2000;2000a及び2003に記載の方法で調製した。SH−SY5Y細胞(ATCC番号CRL-2266)は、10%FBSを含有するDMEM/HamのF12混合液(DMEM/F12)中で増殖させた。SH−SY5Y細胞は、6ウェルプレート中、2x105細胞/ウェルの濃度で、12〜16時間播種し、血清非存在下で、示されたベクターを用いて3時間トランスフェクトして、次に、DMEM/F12−10%中で培養した。トランスフェクションを開始して24時間後に、続いて、培地を、レスキュー因子を含有するDMEM/F12+N2補助物質(Invitrogen)と交換した。トランスフェクションを開始して48時間の時点で、細胞の死亡率及び生存率のアッセイのために細胞を回収した。細胞生存性は、WST−8アッセイ及びカルセイン染色アッセイによって測定した(Hashimotoら,2001a,b,2005a,b)。
イムノブロット分析は、従来文献に記載されるようにして行った(Hashimotoら,2001a,b)。V642I−APP発現ベクターを用いてトランスフェクトした細胞からの溶解物(1レーン当たり20μg)を、SDS−PAGE(又は、Tris/Tricine SDS−PAGE)に供し、次に、ポリ二フッ化ビニリデンシートに電気的にブロッティングした。シートを、22C11抗体に、次に、1:5000の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された抗マウス又は抗ラットIgG抗体(Bio−Rad,Hercules,CA)に浸した。抗原のバンドは、ECL(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)により可視化した。
組み換えヒトCNTFR−ED−Fc−6xHis及びマウスWSX−1−ED−FLAGを作製するために、COS7細胞を、各タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、Ni NTAアガロース(1:1スラリー;Invitrogen)又は抗FLAG抗体M2をコンジュゲートさせたアガロース(1:1スラリー;Sigma−Aldrich)を用いた沈降のために調整培地を回収した。結合しているCNTFR−ED−Fc−6xHisを、10mMのイミダゾール溶液を用いて洗浄し、製造業者の説明書にしたがって、250mMのイミダゾール溶液を用いて溶出した。溶出されたCNTFR−ED−Fc−6xHisを、Zeba脱塩カラム(Pierce,Rockford,IL)により脱塩し、次に、1/10容量の10xPBSを、脱塩したタンパク質溶液に添加した。オリゴマー化を誘導するために、gp130−ED−Fc−6xHis(1mg)及び/又はCNTFR−ED−Fc−6xHis(1μg)を、1%Brij96(Sigma−Aldrich)を含有する100μlのPBS中に含まれる抗FLAGmAb M2をコンジュゲートしたアガロースビーズ上に固定化されたWSX−1−ED−FLAG(推定5μg)と一緒に、ペプチドの存在下、37℃にて6時間インキュベートした。オリゴマー化されたタンパク質は、同じバッファーで十分に洗浄した後、SDS−PAGE分画及びイムノブロット分析により可視化した。
GST−融合タンパク質(GST−CLSP)を、1mM イソプロピル−チオ−b−D−ガラクトピラノシドの存在下、大腸菌BL−21中で、37℃にて4時間発現させ、従来文献に記載されるようにして精製した(Matsuokaら,2000)。
SHSY−5Y細胞を、FBSを含まない条件下、24時間、N2サプリメントを含有するDMEM培地中で培養した。次に、示されたサイトカイン類を用いて、15分間、37℃にて細胞を処理した。ホスホSTAT3(Tyr705)抗体(Cell Signaling)及びSTAT3抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いたイムノブロット分析のために、1%NP−40、20mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM オルトバナジウム酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルComplete(Roche Diagnostics,Alameda,CA)を含有するバッファーを用いて、細胞を回収した。
本研究は、神経科学会の神経科学研究における動物及びヒトの利用に関する方針、並びに、東京医科大学の実験動物のケア及び利用のためのガイドラインにしたがって行われた。全ての実験手順は、東京医科大学の施設内動物実験委員会によって承認された。9週齢のICRマウスを、CLEA Japan(Tokyo,Japan)から購入した。動物は、12時間の明/暗サイクル(7:00A.M.〜7:00P.M.まで明るい)の下、通常の動物用施設において飼育した(23℃、50%湿度)(Tajimaら,2005;Yamadaら,2005;Chibaら,2005)。C57マウス(8週齢)を、Y−maze試験(YM)を行う前に一週間、馴化させた。YM当日、マウスに、YMの30分前に、5μLの生理食塩水、部分精製されたmCLSP−1−MycHis、又は、5μLの生理食塩水中の精製された陰性対照を脳室内に注入した。腹腔内注入のためには、0.21mlの滅菌生理食塩水、又は示された量の部分精製されたmCLSP−1−MycHis、精製された陰性対照、0.21mlの滅菌生理食塩水中のコリベリンを使用した。次に、スコポラミン(1mg/kg)を溶解した滅菌生理食塩水(0.2ml)をYMの30分前にマウスの皮下(s.c.)に注入した。
YMは、従来文献に記載されるようにして行った(Kawasumiら,2004;Yamadaら,2005)。YMのための装置は、それぞれが120°の角度で連結されている3つの灰色のプラスチック製アーム(40cmの長さ、12cmの高さ、底部で3cmの幅、及び頂部で10cmの幅)から作られている。マウスは、アームの端部に個別に置かれ、8分間アームを自由に探索させた。調べられたパラメーターは、(1)全アームエントリー数及び(2)自発的交代パーセンテージ(SA%)であった。SA%は、試験実施時における全選択(初めの2つのエントリーは評価することができなかったので「全エントリー引く2」)に対する、以前の2つの選択と異なるアームの選択(「成功の選択」)の比として定義された。例えば、あるマウスが10エントリーした場合(例えば、1−2−3−2−3−1−2−3−2−1)、8つの全選択(10エントリー引く2)のうち5つの成功の選択であった。その結果、本ケースにおけるSA%は、62.5%であった。
200μlの免疫前血清(Pre)又は抗hCLSP抗血清を、800μlのタンパク質Gセファロース4B(1:1スラリー、GE Health Care)と混合し、4℃にて一晩回転させた。0.2Mの四ホウ酸ナトリウム(pH9.0)で二度洗浄した後、それらを2mlの同じバッファー中に懸濁させた。次に、それらを、200μlの0.2M ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩(Pierce)と混合し、緩やかに振盪させながら室温にて30分間インキュベートした。0.2Mのエタノールアミンを用いて一度洗浄し、遠心分離(1000rpm、5分間、室温)により回収した後、ビーズを、10μlの0.2M エタノールアミンと混合し、緩やかに振盪させながら室温にて2時間インキュベートした。次に、ビーズをPBS中に懸濁させた。抗体のコンジュゲーション効率は、SDS−PAGEゲルの銀染色により確認した(Wako Pure Chemicals)。
細胞培養及びヒト血漿からの調整培地(CM)中のヒトCLSPレベルを定量するために、ELISAシステムを構築した。0.05Mの炭酸バッファー(pH9.6)で(2500倍に)希釈した抗ヒトCLSP抗体を含有するウサギ血清を用いて、96ウェルマイクロプレートを1ウェル当たり50μLの量でコーティングし、4℃にて一晩インキュベートした。各ウェルを吸引し、各洗浄工程時に、200μLのPBS(pH7.4)中0.1%Tween(登録商標)20を用いて3回洗浄した。捕捉抗体に対する非特異的結合は、3%のろ過済みスキムミルク含有PBS(150μL)を添加後37℃において1時間インキュベートし、5回の洗浄により最小にした。組み換えヒトCLSP−MycHisを、7点標準曲線を提供するように希釈した(10pM〜1nM)。100μLのヒト血漿及び基準物質をウェルに添加し(3連)、37℃にて2時間インキュベートした。5回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたアフィニティー精製したウサギ抗ヒトCLSP抗体を含むCan Get Signal(登録商標)溶液(Toyobo,Japan)(0.144μg/ml)を1ウェル当たり50μL添加し、37℃にて1時間インキュベートした。7回洗浄した後、4mg/mLのo−フェヌレンジアミンを含む0.05Mクエン酸ペルオキシドバッファー(100μL)を各ウェルに添加し、37℃にて2時間インキュベートした。次に、反応を停止させるために50μLの2N H2SO4を添加した。CLSP濃度を測定するために、吸光度(450nm)を、蛍光分光光度計(Wallac 1420 ARVOsx Multilabel Counter,PerkinElmer,Wellesley,MA)によって測定した。全てのサンプルは3連でアッセイし、値は、標準曲線に対してプロットした。このELISAの感度は1nM迄の直線範囲で10〜50pMであった。
8週齢、20月齢のオスC57−BL6マウスを、ジエチルエーテルによって麻酔した。4%パラホルムアルデヒドを含有するリン酸バッファー(pH7.4)を用いて固定化した後、脳及び皮膚を、O.C.T.Compound(Sakura,Tokyo,Japan)中に包埋し、10μmの厚さに切断した。海馬の矢状断面を、MASコーティングしたスライドグラス(Matsunami,Osaka,Japan)上に調製した。この断面を、TBS−Tを用いて洗浄し、内因性のペルオキシダーゼ活性を消失させるために30分間、0.3% H2O2を用いて処理し、TBS−Tですすいだ。ブロッキング及び免疫染色は、M.O.M.ベーシックキット(Vector laboratories,Burlingame, CA, USA)を用いて処理した。この断面を、一次抗体として、アフィニティー精製したmCLSP−1及びmCLSP−2抗体を用いて、4℃にて一晩インキュベートした。次に、それらを、TBS−T中ですすぎ、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG(Vector laboratories)を用いて、室温にて30分間インキュベートし、ABCエリートキット(Vector laboratories)を用いてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法で処理した。免疫反応性は、チラミド−FITC(TSAキット;NEN−Perkin−Elmer)を用いて可視化した。蛍光は、レーザー走査共焦点顕微鏡LSM510(Carl Zeiss,Germany)を用いて観察した。
全ての細胞死試験、細胞生存試験、結合試験、及び定量リアルタイムPCR試験を行った(n=3)。インビトロ研究における図中の全ての値は、平均±SDである。統計分析は、スチューデントのt検定を用いて行った。インビボ試験に対する統計分析は、一元配置分散分析、続いて、FisherのPLSDを用いて行い、この場合、有意差として、p<0.05が算定された。
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Claims (9)
- 式(I):
TGKNLSEAGLRKLI(S又はG)EVDSDGD(アミノ酸一文字表記)(I)
に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。 - 請求項1記載のペプチド、又は、式(I):
TGKNLSEAGLRKLI(S又はG)EVDSDGD(アミノ酸一文字表記)(I)
に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを有効成分として含み、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害、又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物。 - 以下のアミノ酸配列:
(1)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(2)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分の一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;
(3)配列番号1に示されるアミノ酸配列における式(I)からなるアミノ酸配列以外の部分において、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
(4)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列;
(5)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列において、一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列;又は
(6)配列番号3又は配列番号4に示されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列;
から成るポリペプチドを有効成分として含み、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物。 - アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害がアルツハイマー病に関連する記憶障害である、請求項2または3記載の医薬組成物。
- アルツハイマー病に関連する記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いるための、請求項2ないし4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1記載のペプチド、又は、請求項2若しくは3に記載のポリペプチドによるアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害、又は神経細胞死を抑制する活性を培地中で検出する方法であって、(a)該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の該機能障害又は細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞の該機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
- 請求項1記載のペプチド、又は、請求項2若しくは3に記載のポリペプチドによる神経細胞死を抑制する活性に対する化合物の効果を培地中で検出する方法であって、(a)被検化合物および該ペプチド又はポリペプチドの存在下でアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害、又は神経細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞の該機能障害又は細胞死を検出する工程、を含む方法。
- 請求項1記載のペプチド、又は、請求項2若しくは3に記載のポリペプチドによるアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害、又は神経細胞死の抑制を調節する化合物を培地中でスクリーニングする方法であって、(a)被検試料および該ペプチド又はポリペプチドの存在下で神経細胞の該機能障害又は細胞死を誘導する工程、(b)神経細胞死を検出する工程、(c)神経細胞の該機能障害又は細胞死を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。
- 請求項1記載のペプチド、又は、請求項2若しくは3に記載のポリペプチドを培地中で神経細胞に接触させる工程を含む、該神経細胞のアルツハイマー病に関連する機能障害、又は神経細胞死を抑制する方法。
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