ES2340481T3 - Utilizacion de proteasas en el campo cosmetico y terapeutico. - Google Patents
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Abstract
Composición cosmética o farmacéutica que comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.
Description
Utilización de proteasas aspárticas en el campo
cosmético y terapéutico.
La presente invención tiene por objeto principal
la utilización, en los campos cosmético y terapéutico, de las
formas truncadas o derivadas de una proteasa de ácido aspártico
denominada SASPasa o de una mezcla de polipéptidos procedente de su
proteólisis con vistas a tratar unos trastornos relacionados con una
disfunción de la proliferación y/o de la diferenciación
celular.
La invención tiene asimismo por objeto unas
secuencias de ácido desoxirribonucleico que codifican las formas
denominadas activadas de dicha proteasa de ácido aspártico SASPasa,
las secuencias polipeptídicas correspondientes y las utilizaciones
de dichas secuencias desoxirribonucleicas.
Las proteasas son unas enzimas hidrolíticas
capaces de cortar unas uniones peptídicas. Un cierto número de
ellas son conocidas en la actualidad por desempeñar una función
esencial a nivel del equilibrio y de la fisiología de la
epidermis.
La epidermis está dividida convencionalmente en
una capa basal de queratinocitos que constituye la capa germinativa
de la epidermis, una capa denominada espinosa constituida por varias
capas de células poliédricas dispuestas sobre las capas
germinativas, una a tres capas denominadas granulosas constituidas
por células aplanadas que contienen unas inclusiones citoplásmicas
distintas, los granos de queratohialina y por último, un conjunto
de capas superiores denominadas capas córneas (o stratum
corneum), constituidas por queratinocitos en el estado terminal
de su diferenciación denominados corneocitos.
Los corneocitos son unas células anucleadas
constituidas principalmente por una materia fibrosa que contiene
unas citoqueratinas, rodeada por una envolvente córnea. Existe
permanentemente una producción de nuevos queratinocitos para
compensar la pérdida en continuo de células epidérmicas a nivel de
la capa córnea según un mecanismo denominado descamación. Un
desequilibrio entre la producción de las células a nivel de la capa
basal y el índice de descamación puede conducir en particular a
unas formaciones de escamas en la superficie de la piel.
En este caso, numerosas patologías cutáneas se
caracterizan por la producción de una capa córnea gruesa y por una
descamación anormal, es decir, por una hiperqueratosis. A título de
ejemplo, se pueden citar:
- -
- la xerosis (o sequedad cutánea),
- -
- las ictiosis,
- -
- la psoriasis,
- -
- algunas lesiones tumorales benignas o malignas, y
- -
- las hiperqueratosis reaccionales.
\vskip1.000000\baselineskip
A la inversa, algunas manifestaciones
patológicas conllevan un adelgazamiento de la epidermis y más
particularmente de la capa córnea. Este tipo de manifestaciones se
traduce entonces por una fragilidad excesiva del revestimiento
cutáneo. A título representativo de estos trastornos, se pueden
citar en particular las reacciones de origen inmunitario inducidas
generalmente por la puesta en presencia o el contacto con uno o
varios agentes exógenos.
En consecuencia, el conocimiento de los
polipéptidos implicados en la cohesión intercorneocitaria es una de
las vías que puede permitir la elaboración de productos destinados a
luchar contra los efectos de un exceso o de una falta de
polipéptido(s) de este tipo, en particular en la superficie
de la piel.
Uno de los objetivos de la invención es
precisamente proponer la utilización, con un fin cosmético y/o
terapéutico, de un polipéptido implicado en la regulación del
fenómeno de diferenciación/proliferación epidérmica.
Más precisamente, los inventores han demostrado
en unos queratinocitos humanos, han aislado y han purificado un
polipéptido que contiene en su secuencia peptídica (SEC ID nº 5), la
secuencia FLVDSGAQVSVV (SEC ID nº 1) que corresponde a una firma
PROSITE PS00141 de los sitios activos de las proteasas de la familia
de las proteasas denominadas de ácido aspártico.
Este polipéptido denominado asimismo a
continuación proteína SASPasa, está por otra parte caracterizado por
la presencia en su secuencia peptídica de las secuencias
siguientes:
- -
- AQFLVANASAEEAIIGTDVLQ (SEC ID nº 2) y
- -
- ILGVWDTAV (SEC ID nº 3).
De manera inesperada, los inventores han
demostrado que la proteína representada por la secuencia SEC ID nº
5, denominada asimismo SASPasa, poseía una actividad proteolítica
significativa, y han constatado en particular esta actividad frente
a la caseína y la insulina, tal como lo muestran los ejemplos
siguientes.
Por otro lado, han observado que esta proteína
SASPasa era autocatalítica y generaba a un pH comprendido entre 3 y
7, preferentemente superior o igual a 4,5, una forma truncada
denominada "SASPasa activada", que corresponde a la secuencia
SEC ID nº 6, capaz a su vez de dimerizarse.
Un aspecto de la invención se refiere por lo
tanto a un polipéptido aislado y purificado, que pertenece a la
familia de las proteasas de ácido aspártico, caracterizado porque
posee una secuencia peptídica representada por la secuencia SEC ID
nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.
La SEC ID nº 6 corresponde a una forma activada
de la SEC ID nº 5.
La SEC ID nº 16 corresponde a la secuencia SEC
ID nº 6 delecionada de sus dos primeros aminoácidos.
La secuencia SEC ID nº 25 es otra forma activada
de la SEC ID nº 5. Se obtiene a partir de una forma truncada de la
SASPasa (SEC ID nº 36) delecionada del sitio que codifica para la
secuencia FANS (SEC ID nº 29). Se genera más particularmente a pH
5,00 en tampón acetato.
La secuencia SEC ID nº 27 corresponde a la
secuencia SEC ID nº 25 delecionada de una parte de su fragmento
C-terminal.
De manera general, la invención se extiende a
todas las formas homólogas de los diferentes polipéptidos o
secuencias peptídicas citadas. Habitualmente, se entiende por
homólogo de un polipéptido o de una secuencia peptídica, cualquier
polipéptido o cualquier secuencia peptídica que tiene una homología
de secuencia de por lo menos 85%, en particular de por lo menos 90%
y en particular de por lo menos 95% y que tiene, llegado el caso,
el mismo tipo de actividad biológica que dicho polipéptido o que
dicha secuencia peptídica.
Estas formas homólogas engloban las variantes
definidas a continuación.
La invención se extiende en particular a las
formas homólogas de los polipéptidos citados anteriormente, es
decir, que manifiestan la misma actividad biológica y que poseen por
lo menos 85%, en particular por lo menos 90% y en particular por lo
menos 95% de homología de secuencia con la secuencia SEC ID nº 6,
SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.
La invención se extiende asimismo a las
proteínas que contienen al mismo tiempo el motivo "aspartyl
protease retroviral type" definido con la referencia de motivo
PROSITE: PS50175 así como por lo menos un dominio transmembranario
tal como se ha predicho por los algoritmos reconocidos para dicha
detección entre los cuales se pueden citar:
PRED-TMR2, TMHMM, TMpred y SOSUI.
Las modificaciones, denominadas asimismo
mutaciones o variaciones, según la invención, se pueden derivar, o
bien de la deleción de uno o varios aminoácidos de la secuencia SEC
ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, o de la adición
de uno o varios aminoácidos a la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº
16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27; o bien de la sustitución de uno o
varios aminoácidos en la secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC
ID nº 25 o SEC ID nº 27. Las secuencias correspondientes son
designadas asimismo con el término de variantes en el marco de la
presente invención.
A título ilustrativo de las variantes de
deleción, se pueden citar más particularmente las secuencias
peptídicas siguientes:
La secuencia SEC ID nº 4 que corresponde a la
SEC ID nº 5 truncada de su fragmento N-terminal
\Delta1-84.
La secuencia SEC ID nº 7 que corresponde a la
secuencia de la parte N-terminal de la proteína
SASPasa (SEC ID nº 5). La interacción de este fragmento con un
ligando biológico podría ser una etapa importante para la
activación de la proteína SASPasa y en particular la generación de
su forma activada (SEC ID nº 6).
La secuencia SEC ID nº 8 que corresponde a la
secuencia de la parte denominada transmembranaria de la proteína
SASPasa (SEC ID nº 5).
La secuencia SEC ID nº 9 que corresponde a la
secuencia de un péptido procedente de la parte
C-terminal de la proteína SASPasa (SEC ID nº
5).
Las secuencias SEC ID nº 29 y SEC ID nº 30
corresponden a dos sitios de activación.
Están cubiertas asimismo bajo el término de
variante, las proteínas de fusión de la proteína SASPasa (SEC ID nº
5), de sus formas activadas SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25
o SEC ID nº 27 con otro polipéptido, un agente de apuntado
hidrófilo o hidrófobo o un precursor de bioconversión susceptible en
particular de controlar la activación de dicha proteína.
Se sabe que los polipéptidos pueden sufrir unas
modificaciones post-traduccionales tales como la
formación de enlaces disulfuros, las escisiones proteolíticas
específicas, la adición de glúcidos (glicosilación), la
fosforilación en particular a nivel de las serinas y/o de las
treoninas y/o de las tirosinas, y/o la asociación a unos
lípidos.
El polipéptido de la invención puede haber
sufrido una o varias modificaciones
post-traduccionales. En particular, los
polipéptidos según la invención pueden estar
N-glicosilados, fosforilados, miristoilados,
amidados y/o citruli-
nados.
nados.
De esta manera, la invención se refiere asimismo
a los polipéptidos reivindicados que han sufrido o no unas
modificaciones post-traduccionales.
La invención se extiende asimismo a las formas
multiméricas y preferentemente a la forma dimérica de la secuencia
peptídica SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27. La
forma dimérica de la secuencia peptídica SC ID nº 6 está
caracterizada en particular en el ejemplo V siguiente. Se puede
obtener en particular mediante la asociación molecular de la forma
monomérica o mediante la expresión de su ADNc que codifica para el
dímero activo, incorporando a título de agente de unión entre las
dos entidades monoméricas, un motivo compuesto por 2 a 6
aminoácidos.
Los polipéptidos reivindicados pueden ser de
origen natural o sintético. Por el término "sintético" se
entiende en la presente memoria cualquier polipéptido obtenido
químicamente o mediante la producción en un organismo después de la
introducción en este organismo de los elementos necesarios para esta
producción.
Pueden proceder de cualquier origen posible, a
saber, o bien animal, en particular de mamíferos y también más
particularmente humano, o bien vegetal, o bien de microorganismos
(por ejemplo virus, fagos, bacterias, levaduras, entre otros) o
también de hongos, o proceder de una sobreexpresión en un sistema
eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, sin prejuzgar el
hecho de que estén presentes de manera natural o no en dicho
organismo de origen.
En particular, los polipéptidos de acuerdo con
la invención son de origen natural, y están purificados a partir de
tejidos de mamíferos, más particularmente a partir de piel de
mamíferos.
En particular, se purifican a partir de piel
humana y también más particularmente a partir de epidermis
humana.
Se sabe que en un polipéptido, uno o varios
residuos de aminoácido pueden ser sustituidos por unos residuos de
aminoácidos que tienen un índice hidropático similar sin modificar
por ello las propiedades biológicas del polipéptido.
El índice hidropático es un índice atribuido a
los aminoácidos en función de su hidrofobicidad y de su carga (Kyte
et al. (1982), J. Mol. Biol., 157: 105).
De esta manera, la invención tiene asimismo por
objeto un polipéptido tal como se ha descrito anteriormente en el
que por lo menos un residuo de aminoácido ha sido sustituido por un
residuo de aminoácido que tiene un índice hidropático similar.
Se pueden clasificar asimismo los polipéptidos
en función de su punto isoeléctrico.
El punto isoeléctrico teórico de un polipéptido
puede ser deducido de su cadena en aminoácidos. Los polipéptidos de
la invención son teóricamente unos polipéptidos ácidos.
De esta manera, los polipéptidos de secuencia
SEC ID nº 5, SEC ID nº 6 o SEC ID nº 16 poseen un punto isoeléctrico
comprendido entre 3 y 9, más particularmente entre 4 y 6, y en
particular de aproximadamente 5,8.
Se sabe además que la secuencia primaria en
aminoácidos así como las diversas modificaciones
post-traduccionales sufridas por un polipéptido
hacen que dicho polipéptido pueda caracterizarse por su masa
molecular aparente expresada en kilodaltons.
Se entiende mediante la expresión "masa
molecular aparente" la masa molecular obtenida para el
polipéptido mediante la comparación de la movilidad electroforética
de éste con las de las proteínas estándares de pesos moleculares
conocidos sobre gel de poliacrilamida/dodecilsulfato de sodio, o
también mediante la comparación del volumen de elución del
polipéptido con el de proteínas estándares de pesos moleculares
conocidos en cromatografía de exclusión (según las técnicas
descritas en "Protein Purification" J-C. Janson
y L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989). (El método considerado
en el marco de la invención es el que se basa en la movilidad
electroforética).
El conocimiento de la cadena en aminoácidos del
polipéptido de la invención permite determinar su peso molecular
teórico.
\newpage
La invención se refiere por lo tanto a un
polipéptido de secuencia SEC ID nº 6 que tiene una masa molecular
aparente comprendida entre 5 y 30 kilodaltons (kD), en particular
entre 9 y 15 kD, y más particularmente entre 11 y 14 kD. En
particular, este polipéptido de la invención tiene una masa
molecular aparente del orden de 12 kD.
Tal como se desprende de los ejemplos
presentados a continuación, los inventores han caracterizado la
expresión del polipéptido cuya secuencia está representada por la
secuencia SEC ID nº 5 en un gran número de tejidos biológicos
humanos, tal como el hígado fetal, la placenta, el músculo, el
pulmón, el intestino delgado y sobre todo a nivel del cerebro y del
corazón, y más particularmente a nivel de la epidermis en la que la
expresión es particularmente ele-
vada.
vada.
Por otro lado, se ha constatado que la SASPasa
de secuencia SEC ID nº 5 degradaba la corneodesmosina, que es un
marcador de la descamación.
Por último, en la secuencia polipeptídica de la
SASPasa (SEC ID nº 5) de un sitio autocatalítico que corresponde a
un sitio descrito para la proteasa de tipo matrilisina capaz de
activar los MMP de tipo 1, 2 y 9, demuestra una actividad potencial
de la SASPasa, así como de sus formas activadas (SEC ID nº 6, SEC ID
nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27) o de sus fragmentos, sobre unos
sustratos endógenos y por lo tanto de aplicaciones potenciales en
cicatrización, re-epitelialización, envejecimiento,
angiogénesis y cancerización (proceso de invasión) para dicha
proteína y sus diferentes formas activadas o fragmentos.
El conjunto de estas informaciones valida por lo
tanto la implicación del polipéptido de acuerdo con la invención en
el proceso de proliferación y/o diferenciación celular, y lo
identifica como nueva diana dermato/cosmetológica y
terapéutica.
En consecuencia, un segundo aspecto de la
invención se refiere a una composición cosmética o farmacéutica que
comprende, en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un
polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica
está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº
6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que
poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas
secuencias y la misma actividad biológica.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición cosmética o farmacéutica que comprende por lo menos un
polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica
tal como se ha definido anteriormente está presente en forma
multimérica y preferentemente dimérica.
En el sentido de la invención, y salvo
indicación contraria, se entiende designar con el término
"polipéptido" en las composiciones reivindicadas, los
polipéptidos naturales o sintéticos, ya sean obtenidos mediante
proteólisis o mediante síntesis, las diferentes formas
post-traduccionales de éstos y en particular las
descritas anteriormente o también cualquier polipéptido natural o
sintético cuya secuencia está total o parcialmente constituida por
las secuencias citadas anteriormente como, por ejemplo, las
variantes descritas anteriormente.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición cosmética o farmacéutica en la que dicho polipéptido se
presenta en forma de un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID
nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, fusionado con otro polipéptido,
un agente de apuntado hidrófilo o hidrófobo o un precursor de
bioconversión.
La cantidad de polipéptido contenida en las
composiciones de la invención depende, evidentemente, del efecto
buscado, y puede por lo tanto variar en una amplia medida.
Para dar un orden de magnitud, la composición
puede contener un polipéptido de acuerdo con la invención en una
cantidad que representa de 0,00001% a 50% del peso total de la
composición y preferentemente en una cantidad que representa de
0,001% a 10% del peso total de la composición y todavía más
preferentemente en una cantidad que representa de 0,1% a 1% del
peso total de la composición.
Tal como se ha descrito anteriormente, un cierto
número de desórdenes están asociados a unos trastornos de
diferenciación y/o de proliferación celular. En la medida en la que
los polipéptidos de acuerdo con la invención están implicados a
nivel de la regulación de estos dos fenómenos, constituyen
ventajosamente unas dianas potenciales para tratar cualquier
desorden que resulta de una disfunción de la proliferación o de la
diferenciación celulares, en particular epidérmicas. En
consecuencia, además del hecho de que los polipéptidos según la
invención se pueden utilizar directamente a título de materia
activa en una composición cosmética o farmacéutica, éstos pueden
asimismo servir a su vez de diana en un tratamiento cosmético o
farmacéutico o ser utilizados a título de herramientas de
diagnóstico.
Por otro lado, los inventores han caracterizado
la presencia de sitios de corte en la secuencia peptídica SEC ID nº
5, en parte localizados en su parte N-terminal y
presentes asimismo en las formas activas SEC ID nº 6 y SEC ID nº
16, y en parte presentes en su parte C-terminal, y
presentes asimismo en las formas activas SEC ID nº 25 y SEC ID nº
27. Más precisamente, los sitios de corte deducidos de la
autoactivación de la SASPasa en sí son F/A, N/S, E/L, A/L, R/F,
H/S, F/E, E/A. Evidentemente, estos sitios de corte pueden ser
determinantes a nivel de la activación de la proteína, o bien para
bloquearla, o bien al contrario para activar su hidrólisis.
\newpage
Los sitios pertinentes localizados más
precisamente en la región N-terminal son F/A y N/S y
figuran en la secuencia FANS denominada SEC ID nº 29. Parecen estar
implicados en particular en la generación de la forma activada
representada por la SEC ID nº 25.
En lo que se refiere a la segunda región
potencial de activación o de desactivación de la proteína SASPasa
SEC ID nº 5, ésta corresponde más particularmente a la secuencia
DLELIE denominada SEC ID nº 30 y que comprende en particular el
sitio de corte E/L.
A partir de estos sitios de corte, se puede
prever efectuar la síntesis de diferentes tipos de péptidos o bien
modificados, o bien que contienen un fluoróforo atenuado y que
servirán de sustrato o de inhibidores.
El mínimo de secuencia que se puede utilizar es
evidentemente el dipéptido (aminoácidos en ambas partes del sitio
de corte) pero en general se utilizan unos péptidos de 8 a 12
aminoácidos en los que el sitio de corte está en posición central.
Por ejemplo, se sabe que la SASPasa corta la insulina en posición
E/A. Se puede imaginar por lo tanto desarrollar un sustrato de tipo
peptídico que incorpora este sitio de corte modificándolo
químicamente en cada uno de sus extremos por un grupo fluoróforo
atenuado de tipo: Abz(NO_{2})Tyr (extremo N: ácido
aminobenzoico; extremo C: nitrotirosina (amida)). La hidrólisis de
este péptido por la proteasa separará el fluoróforo y el atenuador
y estará por lo tanto seguida por un aumento de la
fluorescencia.
Se puede utilizar otro par químico tal como
Dabcyl/EDANS para crear otro tipo de sustrato atenuado.
Se puede prever asimismo un sustrato cromogénico
acoplando el péptido con el grupo paranitroanilida.
De la misma manera, se puede prever desarrollar
un inhibidor específico de la SASPasa sustituyendo uno de los
aminoácidos de dicho péptido, modificando la unión peptídica o
añadiendo un grupo químico con el fin de que la unión se vuelva no
hidrolizable por la enzima pero que el péptido presente todavía una
afinidad para el sitio activo. Por ejemplo, se añade un aminoácido
no natural, se reduce la unión peptídica o se añaden unos grupos
químicos de tipo aldehído, clorometil-cetona o
diazometil-cetona.
Los inventores han mostrado en particular que
unas modificaciones puntuales aportadas a nivel del sustrato
peptídico figurado mediante la SEC ID nº 30 podría tener un efecto
significativo a nivel de su afinidad para la enzima.
Más precisamente, las secuencias
correspondientes modificadas resultan susceptibles de constituir
unos inhibidores o activadores potenciales de la SASPasa.
A título ilustrativo de estos moduladores
potenciales, se puede proponer más particularmente unos sustratos
peptídicos que presentan por lo menos las secuencias siguientes:
- EFDLELIEED
- SEC ID nº 31
- EFDLDLIEED
- SEC ID nº 32
- EFDLDLIEWD
- SEC ID nº 33
- EFDLDLIHWD
- SEC ID nº 34
- EPNLDLIEED
- SEC ID nº 35
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Se ha constatado en particular un efecto
activador de los sustratos representados por las secuencias SEC ID
nº 31 y SEC ID nº 32.
La presente invención tiene asimismo por objeto
la utilización de un polipéptido cuya secuencia está representada
por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 31, SEC ID nº 32,
SEC ID nº 33, SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35, para preparar una
composición destinada a modular la actividad de la proteasa de ácido
aspártico de secuencia SEC ID nº 5.
Las composiciones farmacéuticas o cosméticas
reivindicadas y consideradas según la invención pueden ser unas
composiciones utilizadas en los campos cosmético, dermatológico,
dermato-cosmético y farmacológico.
Un medio fisiológicamente aceptable es, según la
invención, un medio cosmética o farmacéuticamente aceptable,
compatible con la piel, las mucosas, las uñas y/o el cabello.
Las composiciones según la invención se pueden
aplicar sobre las uñas, el cabello y más particularmente sobre la
piel y las mucosas.
Son ventajosas en particular para actuar sobre
uno o varios mecanismos epidérmicos tales como la degradación de
proteína(s), la activación de enzima(s), y/o la
regulación del fenómeno de diferenciación/proliferación
epidérmica.
En este caso, las composiciones según la
invención son particularmente útiles para suplir un desequilibrio
de la diferenciación/proliferación epidérmica. Más particularmente,
pueden ser útiles para regular los fenómenos de hidratación, de
inflamación, de melanogénesis y/o de descamación, el fenómeno de
envejecimiento, los mecanismos de defensa, para la regulación de la
diferenciación/proliferación sobre ciertos tipos celulares y
cutáneos: queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans,
sebocitos, adipocitos, así como la regulación de los fenómenos de
secreción y de proceso de invasión.
De manera más precisa, las composiciones
reivindicadas resultan interesantes en los campos siguientes:
- -
- para tratar las afecciones dermatológicas relacionadas con un desorden de la queratinización que se refiere a la diferenciación y a la proliferación en particular para tratar los acnés vulgares, comedonianos, polimorfos, rosáceas, los acnés noduloquísticos, conglobata, los acnés seniles, los acnés secundarios tales como el acné solar, medicamentoso o profesional,
- -
- para tratar otros tipos de trastornos de la queratinización, en particular las ictiosis, los estados ictiosiformes, la enfermedad de Darrier, las queratodermias palmoplantarias, las leucoplasias y los estados leucoplasiformes, el liquen cutáneo o mucoso (bucal),
- -
- para tratar otras afecciones dermatológicas relacionadas con un trastorno de la queratinización con una componente inflamatoria y/o inmuno-alérgica y en particular todas las formas de psoriasis, ya sea cutánea, mucosa o ungueal, e incluso el reumatismo psoriático, o también la atopía cutánea tal como el eczema, o la urticaria o también la hipertrofia gingival; los compuestos pueden ser utilizados asimismo en ciertas afecciones inflamatorias que no presentan ningún trastorno de la queratinización,
- -
- para tratar las proliferaciones dérmicas o epidérmicas, ya sean benignas o malignas, ya sean o no de origen viral tales como las verrugas vulgares, las verrugas planas y la epidermodisplasia verruciforme, las papilomatosis orales o floridas y las proliferaciones que pueden ser inducidas por los ultravioletas en particular en el caso de los epiteliomas baso- y espino-celulares,
- -
- para tratar otros desórdenes dermatológicos tales como las dermatosis bullosas y las enfermedades del colágeno,
- -
- para reparar o luchar contra el envejecimiento de la piel, ya sea fotoinducido o cronológico o para reducir las pigmentaciones y las queratosis actínicas,
- o cualquier patología asociada al envejecimiento cronológico o actínico,
- -
- para prevenir o curar los estigmas de la atrofia epidérmica y/o dérmica inducida por los corticosteroides locales o sistemáticos, o cualquier otra forma de atrofia cutánea,
- -
- para prevenir o tratar los trastornos de la cicatrización o para prevenir o para reparar las ronchas, y
- -
- para luchar contra los trastornos de la función sebácea tales como la hiperseborrea del acné o la seborrea simple.
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En el caso de una aplicación en el campo
cosmético, en particular para la higiene corporal y capilar, las
composiciones según la invención son útiles en particular para el
tratamiento de las pieles con tendencia acneica, para el
crecimiento del cabello, la anticaída, para luchar contra el aspecto
graso de la piel o del cabello, en la protección contra los
aspectos nefastos del Sol o en el tratamiento de las pieles
fisiológicamente secas, para prevenir y/o para luchar contra el
envejecimiento fotoinducido o cronológico. Pueden ser útiles
asimismo para mejorar las pieles reconstruidas. Se puede utilizar
asimismo directamente en el medio de cultivo el polipéptido y/o sus
derivados y/o unos moduladores de su actividad o de su
activación.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de tratamiento cosmético destinado a luchar contra los trastornos
cutáneos relacionados con una disfunción de la proliferación y/o de
la diferenciación celular tal como, en particular, las pieles
secas, la hiperqueratosis, la paraqueratosis, los trastornos de
sebogénesis y/o las señales de envejecimiento cutáneo,
caracterizado porque se aplica sobre la piel, las mucosas y/o las
fibras queratínicas una composición cosmética que comprende por lo
menos un polipéptido cuya secuencia peptídica es una secuencia
seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC
ID nº 27, y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología
de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad
biológica.
El procedimiento de tratamiento de la invención
es un procedimiento cosmético destinado a mejorar el aspecto
estético del individuo que sufre unos trastornos de la proliferación
y/o de la diferenciación epidérmica.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un polipéptido cuya secuencia peptídica es una
secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID
nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que poseen por lo menos 85%
de homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad
biológica para la preparación de una composición farmacéutica
destinada al tratamiento de las afecciones dermatológicas y en
particular las citadas anteriormente.
En particular, la invención se refiere a la
utilización de un polipéptido o de una mezcla tal como se ha
descrito anteriormente para la preparación de una composición
farmacéutica destinada a tratar la ictiosis, la psoriasis o
cualquier patología que implica una hiperqueratosis, una
paraqueratosis o que tiene una componente inflamatoria. Puede
tratarse asimismo de composiciones anti-dolor, de
composiciones para tratar ciertas enfermedades de la piel tal como
el eczema, la rosácea, la psoriasis, los líquenes, y los pruritos
severos.
Se sabe que una proteína se sintetiza en las
células a partir de una matriz de ácido desoxirribonucleico (ADN)
que codifica para dicha proteína. Se sabe asimismo que el código
genético se degenera. Así, la secuencia de aminoácidos del
polipéptido de la invención puede proceder de diferentes secuencias
de ácido desoxirribonucleico, naturales o sintéticas. Mediante la
expresión "secuencia de ácido desoxirribonucleico sintético" se
entiende en la presente memoria cualquier secuencia obtenida
químicamente o mediante manipulación genética.
Dichas secuencias de ácido desoxirribonucleico
pueden proceder de cualquier origen posible, a saber, o bien
animal, en particular de mamíferos y más particularmente aún humana,
o bien vegetal, o bien de microorganismos (virus, fagos, bacterias,
entre otros) o también de hongos, sin prejuzgar el hecho de que
estén presentes de manera natural o no en dicho organismo de
origen.
En este caso, la invención se refiere a los
fragmentos de ácido desoxirribonucleico aislados y purificados que
codifican los polipéptidos reivindicados.
Durante estos estudios, el solicitante ha podido
aislar y purificar los fragmentos de ácido desoxirribonucleico que
codifican las secuencias primarias de aminoácidos de los
polipéptidos de secuencia SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7,
SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, a partir de piel
humana.
La invención tiene por objeto un fragmento de
ácido desoxirribonucleico aislado y purificado cuya secuencia
nucleotídica comprende por lo menos la secuencia nucleotídica
codificante SEC ID nº 24 y en particular está representada por la
secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC
ID nº 26 o SEC ID nº 28.
Las secuencias de ácidos nucleicos según la
invención pueden ser utilizadas en particular para preparar unas
secuencias de ácido ribonucleico correspondientes sentido o
antisentido.
La invención tiene asimismo por objeto cualquier
polinucleótido, ácido ribonucleico o desoxirribonucleico, sentido o
antisentido, en particular "Small interferencial RNA", que
corresponden por lo menos a la secuencia nucleotídica codificante
SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.
Las secuencias de ácidos nucleicos de la
invención pueden asimismo ser utilizadas para realizar unos
cebadores oligonucleotídicos, que se hibridan en unas condiciones
de fuerte astringencia a la secuencia SEC ID nº 17, SEC ID nº 18,
SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº
23, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 28.
Estos cebadores oligonucleotídicos sentido y/o
antisentido pueden ser útiles para unas reacciones de secuenciación
o de amplificación específica según la técnica denominada de PCR
(reacción de polimerización en cadena) o cualquier otra variante de
ésta con el objetivo de clonación, de identificación o de
diagnóstico de un polipéptido representado por SEC ID nº 1, SEC ID
nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, SEC ID nº 8, SEC ID nº
9, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27.
En particular, las sondas o cebadores de la
invención están marcados, previamente a su utilización. Para ello,
varias técnicas están al alcance del experto en la materia como, por
templo, el marcaje fluorescente, radioactivo, quimioluminiscente o
enzimático.
Los métodos de diagnóstico in vitro en
los que se utilizan estas sondas nucleotídicas para la detección de
síntesis de secuencias nucleicas que codifican para un polipéptido
según la invención están incluidos en la presente invención.
El fragmento de ADN que corresponde a la
secuencia SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o
SEC ID nº 28 puede ser introducido asimismo en un vector de
expresión permitiendo así la síntesis de una proteína denominada
recombinante correspondiente.
La invención tiene por lo tanto asimismo por
objeto un vector de expresión recombinante que contiene la totalidad
o parte de la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC
ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.
La invención tiene asimismo por objeto una
composición cosmética o farmacéutica que comprende, en un medio
fisiológicamente aceptable, una secuencia de ácido
desoxirribonucleico, natural o sintética, que codifica para la
secuencia primaria de aminoácidos de un polipéptido según la
invención o una secuencia de ácido ribonucleico sentido o
antisentido, en particular antisentido interferencial, que
corresponden a dicha secuencia SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID
nº 26 o SEC ID nº 28.
De manera general, cualquier composición de la
invención puede ser ingerida, inyectada o aplicada sobre la piel
(sobre cualquier zona cutánea del cuerpo) o sobre las mucosas
(bucal, malar, gingival, genital, conjuntival, etc.).
Preferentemente, una composición de la invención
se aplica sobre la piel o las mucosas.
Según el modo de administración considerado,
ésta puede presentarse en todas las formas galénicas utilizadas
normalmente.
Para una aplicación tópica sobre la piel, la
composición puede tener la forma en particular de disoluciones
acuosas u oleosas o de dispersiones de tipo loción o suero, de
emulsiones de consistencia líquida o semi-líquida
de tipo leche, obtenidas por dispersión de una fase grasa en una
fase acuosa (O/W) o a la inversa (W/O), o de suspensiones o
emulsiones de consistencia blanda de tipo crema o gel acuoso o
anhidras, o también de microcápsulas o micropartículas, o de
dispersiones vesiculares de tipo iónico y/o no iónico o de espumas.
Estas composiciones se preparan según los métodos habituales.
Para la inyección, la composición puede
presentarse en forma de lociones acuosas, oleosas o en forma de
suero. Para los ojos, puede presentarse en forma de gotas y para la
ingestión, puede presentarse en forma de cápsulas, de gránulos, de
jarabes o de comprimidos.
Las cantidades de los diferentes constituyentes
de las composiciones según la invención son las utilizadas
habitualmente en los campos considerados.
En el campo de la cosmética, estas composiciones
constituyen en particular unas cremas de limpieza, de protección,
de tratamiento o de cuidado para el rostro, para las manos, para los
pies, para los grandes pliegues anatómicos o para el cuerpo (por
ejemplo cremas de día, cremas de noche, cremas desmaquilladoras,
cremas de maquillaje de base, cremas anti-solares),
unos maquillajes de base fluidos, unas leches desmaquilladoras, unas
leches corporales de protección o de cuidado, unas leches
anti-solares, unas lociones, geles o espumas para el
cuidado de la piel, tales como unas lociones de limpieza, unas
lociones anti-solares, unas lociones de bronceado
artificial, unas composiciones para el baño, unas composiciones
desodorantes que comprenden un agente bactericida, unos geles o
lociones para después del afeitado, una cremas depilatorias, unas
composiciones contra las picaduras de insectos, unas composiciones
anti-dolor, unas composiciones para tratar ciertas
enfermedades de la piel tales como el eczema, la rosácea, la
psoriasis, los líquenes y los pruritos severos.
Las composiciones según la invención pueden
consistir asimismo en unas preparaciones sólidas que constituyen
unos jabones o unas pastillas de limpieza.
Las composiciones pueden ser acondicionadas
asimismo en forma de composición para aerosol que comprende asimismo
un agente propulsor a presión.
Una composición según la invención puede
asimismo ser una composición para los cuidados del cuero cabelludo,
y en particular un champú, una loción de marcado del pelo, una
loción tratante, una crema o un gel de peinado, una composición de
tintes (en particular tintes de oxidación) eventualmente en forma de
champús colorantes, de lociones restructurantes para el cabello,
una composición de permanente (en particular una composición para
el primer tiempo de una permanente), una loción o un gel anticaída,
un champú antiparasitario, anticaspa, etc.
Una composición puede ser asimismo de uso
buco-dental, por ejemplo una pasta dentífrica. En
este caso, la composición puede contener unos adyuvantes y aditivos
habituales para las composiciones de uso bucal, y en particular
unos agentes tensoactivos, unos agentes espesantes, unos agentes
humectantes, unos agentes de pulido tales como la sílice, diversos
ingredientes activos tales como los fluoruros, en particular el
fluoruro de sodio, y eventualmente unos agentes edulcorantes tal
como el sacarinato de sodio.
Cuando la composición es una emulsión, la
proporción de la fase grasa puede estar comprendida entre
aproximadamente 5% y 80% en peso, y preferentemente entre
aproximadamente 5% y 50% en peso con relación al peso total de la
composición. Los aceites, las ceras, los emulsionantes y los
co-emulsionantes utilizados en la composición en
forma de emulsión se seleccionan de entre los utilizados
habitualmente en el campo cosmético. El emulsionante y el
co-emulsionante están presentes, en la composición,
en una proporción comprendida entre 0,3% y 30% en peso,
preferentemente entre 0,5 y 20% en peso con relación al peso total
de la composición. La emulsión puede, además, contener unas
vesículas lipídicas.
Cuando la composición es una disolución o un
aceite oleoso, la fase grasa puede representar más de 90% del peso
total de la composición.
De manera conocida, la composición cosmética
puede contener asimismo unos adyuvantes habituales en el campo
cosmético, tales como los gelificantes hidrófilos o lipófilos, los
aditivos hidrófilos o lipófilos, los conservantes, los
antioxidantes, los disolventes, los perfumes, las cargas, los
filtros, los absorbentes de olores y las materias colorantes. Las
cantidades de estos diferentes adyuvantes son las utilizadas
habitualmente en el campo cosmético, y por ejemplo están
comprendidas entre aproximadamente 0,01% y 10% del peso total de la
composición. Estos adyuvantes, según su naturaleza, se pueden
introducir en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las esférulas
lipídicas.
Como aceites o ceras que se pueden utilizar en
la invención se pueden citar los aceites minerales (aceite de
vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de la manteca de
karité, el aceite de girasol), los aceites animales
(perhidroescualeno), los aceites sintéticos (aceite de purcelina),
los aceites o ceras siliconados (ciclometicona) y los aceites
fluorados (perfluoropoliéteres), las ceras de abeja, de carnauba o
de parafina. Se pueden añadir a estos aceites unos alcoholes grasos
y unos ácidos grasos (ácido esteárico). Como emulsionantes que se
pueden utilizar en la invención, se pueden citar por ejemplo el
estearato de glicerol, el polisorbato 60 y la mezcla de
PEG-6/PEG-32/estearato glicólico
vendido con la denominación de Tefose® 63 por la compañía
Gattefosse.
Como disolventes que se pueden utilizar en la
invención, se pueden citar los alcoholes inferiores, en particular
el etanol y el isopropanol y el propilenglicol.
Como gelificantes hidrófilos que se pueden
utilizar en la invención, se pueden citar los polímeros
carboxivinílicos (carbomer®), los copolímeros acrílicos tales como
los copolímeros de acrilatos/alquilacrilatos, las poliacrilamidas,
los polisacáridos tales como la hidroxipropilcelulosa, las gomas
naturales y las arcillas y, como gelificantes lipófilos, se pueden
citar las arcillas modificadas tales como las bentonas, las sales
metálicas de ácidos grasos tales como los estearatos de aluminio,
la sílice hidrófoba, la etilcelulosa y el polietileno.
La composición puede contener otros agentes
activos hidrófilos tales como las proteínas o los hidrolizados de
proteínas, los aminoácidos, los polioles, la urea, la alantoína, los
azúcares y los derivados de azúcar, las vitaminas hidrosolubles,
los extractos vegetales y los hidroxiácidos.
Como agentes activos lipófilos, se pueden
utilizar el retinol (vitamina A) y sus derivados, el tocoferol
(vitamina E) y sus derivados, los ácidos grasos esenciales, las
ceramidas, los aceites esenciales, el ácido salicílico y sus
derivados.
Según la invención, la composición puede asociar
por lo menos otro agente activo destinado en particular a la
prevención y/o al tratamiento de las afecciones cutáneas. Entre
estos agentes activos, se pueden citar, a título de ejemplo:
- -
- los agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea tales como el ácido retinoico y sus isómeros, el retinol y sus ésteres, la vitamina D y sus derivados, los estrógenos tales como el estradiol, el ácido kójico o la hidroquinona;
- -
- los antibacterianos tales como el fosfato de clindamicina, la eritromicina o los antibióticos de la clase de las tetraciclinas;
- -
- los antiparasitarios, en particular el metronidazol, el crotamitón o los piretrinoides;
- -
- los antifúngicos, en particular los compuestos que pertenecen a la clase de los imidazoles tales como el econazol, ketoconazol o el miconazol, o sus sales, los compuestos polienos, tales como la amfotericina B, los compuestos de la familia de la alilaminas, tales como la terbinafina, o también el octopirox;
- -
- los agentes antivíricos tales como el aciclovir;
- -
- los agentes antiinflamatorios esteroides, tales como la hidrocortisona, el valerato de betametasona o el propionato de clobetasol, o los agentes antiinflamatorios no esteroides, tales como por ejemplo el ibuprofeno y sus sales, el diclofenaco y sus sales, el ácido acetilsalicílico, el acetaminofeno o el ácido glicirrízico;
- -
- los agentes anestésicos tales como el clorhidrato de lidocaína y sus derivados;
- -
- los agentes antipruriginosos tal como la tenaldina, la trimeprazina o la ciproheptadina;
- -
- los agentes queratolíticos tales como los ácidos \alpha- y \beta-hidroxicarboxílicos o \beta-cetocarboxílicos, sus sales, amidas o ésteres, y más particularmente los hidroxiácidos tales como el ácido glicólico, el ácido láctico, el ácido salicílico, el ácido cítrico, y de manera general los ácidos de frutas, y el ácido n-octanoil-5-salicílico;
- -
- los agentes antirradicales libres, tales como el \alpha-tocoferol o sus ésteres, los superóxidos dismutasas, ciertos quelantes de metales o el ácido ascórbico y sus ésteres;
- -
- los antiseborreicos tales como la progesterona;
- -
- los anticaspa tales como el octopirox o la piritiona de zinc;
- -
- los antiacneicos tales como el ácido retinoico o el peróxido de benzoilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De esta manera, según el modo particular, la
composición según la invención comprende asimismo por lo menos un
agente seleccionado de entre los agentes antibacterianos,
antiparasitarios, antifúngicos, antivíricos, antiinflamatorios,
antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos, antirradicales
libres, anti-seborreicos, anticaspa, antiacneicos
y/o los agentes que disminuyen la diferenciación y/o la
proliferación y/o la pigmentación cutánea.
Los ejemplos siguientes se presentan a título
ilustrativo y no limitativo de la invención.
- figura 1: Fotografía del gel de electroforesis
2D obtenido según el ejemplo I,
- figura 2: Representación de la influencia del
pH sobre la actividad proteolítica de la SASPasa,
- figura 3: Análisis de la actividad de un
cierto número de moduladores convencionales frente a la actividad
proteolítica de la SASPasa,
- figura 4: Representación de las homologías de
estructura entre la SASPasa y unas proteasas,
- figura 5: Representación de la hidrólisis de
los sustratos representados mediante las secuencias SEC ID nº 31,
SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34 y SEC ID nº 35 por la
SASPasa.
Los oligonucleótidos utilizados en los
diferentes experimentos se representan a continuación en la tabla
I.
Tampones:
- I: SDS 0,3%; tris-HCl 28 mM; tris-base 22 mM
- 2D: 8M urea; 2% (p/v) 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano-sulfonato (CHAPS); Ditiotreitol 20 mM; tampón 0,5% (v/v) lmobiline pH gradient (IPG) pH = 3 9-10 de 18 cm comercializado por la compañía Amersham Pharmacia Biotech.
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Se prepararon unos extractos de epidermis
reconstruida humana a partir de 30 barquillas del kit Episkin J13.
Se añaden 15 ml de tampón I a las 30 epidermis reconstruidas y el
conjunto se homogeneiza en el Potter, se lleva a ebullición durante
10 min y después se vuelve a homogeneizar en el Potter. La
disolución se centrifuga entonces a 10.000 rpm durante 10 min. El
sobrenadante se recoge y se filtra sobre una membrana de 0,22
\mum. Se obtienen así 12 ml de sobrenadante Sl. Se añade entonces
al sobrenadante Sl, acetona fría (10 v/2 v). Después de 20 min de
incubación, se centrifuga la mezcla obtenida a 9.400 rpm durante 10
min. El sobrenadante se elimina entonces y el residuo se seca a
temperatura ambiente durante 20 min. El residuo se recoge entonces
en 2 ml de tampón 2D. Se obtiene así el extracto El. La
concentración en proteína final es de 11 mg/ml.
La separación en dos dimensiones de las
proteínas contenidas en el extracto El se lleva a cabo sobre un
aparato de la marca Pharmacia (modelo Multiphor II). La separación
en dos dimensiones de las proteínas se llevó a cabo según las
recomendaciones del proveedor salvo el hecho de que para el
reequilibrio del gel IPG después de la migración en la primera
dirección, se ha omitido la yodoacetamida. La coloración de las
manchas, la recuperación de éstas y la secuenciación de los
polipéptidos que contenían se ha realizado según las técnicas
descritas en Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R:
Identification and cloning of a new calmodulin-like
protein from human epidermis. J Biol Chem 275:
12841-12347, 2000, o también "A practical guide to
protein and peptide purification for microsequencing" (Paul
Mat-sudaira editor, segunda edición 1993). En la
figura 1, se representa el gel de electroforesis
correspondiente.
Las proteínas han sido detectadas mediante una
coloración con amida Black. Las manchas que corresponden a unas
proteínas identificadas mediante secuenciación de Edman se localizan
con el nombre de estas proteínas. La mancha denominada SASPasa
permite localizar una forma epidérmica de la proteína que tiene un
PM aparente de 12 kD y un pl de 5,8.
Los resultados obtenidos han permitido
caracterizar las secuencias SEC ID nº 1, SEC ID nº 2 y SEC ID nº
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ARN totales de queratinocitos que proceden
de epidermis humana reconstruida después de 13 días de cultivo han
sido preparados con la ayuda del kit de preparación de ARN "RNeasy
kit®" y purificados con la ayuda del kit "QiAshredder
column®", comercializado por la compañía QIAGEN según las
instrucciones del proveedor.
Los ADN complementarios (ADNc) de los ARN así
preparados han sido sintetizados con la ayuda del kit "First
Strand cDNA Synthesis®" comercializado por la compañía Amersham
Pharmacia Biotech según las instrucciones del proveedor, utilizando
como cebador el oligonucleótido Not I-(dT)_{18}.
Unos fragmentos de ADNc que codifican para la
SASPasa completa así obtenidos han sido amplificados mediante unas
reacciones de polimerización en cadena (PCR) en un aparato de ciclos
térmicos "Thermocycler®" comercializado por la compañía
Perkin-Elmer utilizando un ADN polimerasa pfu
comercializado por la compañía Promega y como cebadores, el par de
oligonucleótidos SC140 (SEC ID nº 10)/SC131 (SEC ID nº 11) y las
siguientes condiciones: 1 ciclo (95ºC durante 2 min), 35 ciclos
(94ºC durante 30 s, 65ºC durante 30 s, 72ºC durante 2 min) y 1 ciclo
(72ºC durante 7 min).
De manera similar, unos fragmentos de ADNc que
codifican para la forma truncada de la SASPasa (SEC ID nº 4),
desprovista de los 84 residuos de aminoácidos
N-terminales de la SASPasa denominada \Delta
1-84 han sido amplificados mediante PCR utilizando
como cebadores, el par de oligonucleótidos SC131/SC130 (SEC ID nº 11
y SEC ID nº 12).
El ADNc de la SASPasa obtenido anteriormente se
introduce en el vector plasmídico
pGex-4T-3 comercializado por la
compañía Amersham Pharmacia Biotech, mediante corte/unión en los
sitios de restricción BaMH-1/EcoR1. Este plásmido
recombinante que contiene en fase en el marco de lectura la
secuencia codificante de la SASPasa (SEC ID nº 5) y la secuencia
que codifica la glutatión S-transferasa (GST) se
introduce entonces en E. coli cepa BL21 (DE3)
comercializada por la compañía Amersham Pharmacia Biotech. La
proteína de fusión recombinante expresada por las bacterias se
puede cortar mediante la trombina en unas condiciones suaves, siendo
la construcción tal que la proteína de fusión obtenida contiene un
sitio de corte por esta proteasa.
El producto de expresión se purifica mediante
cromatografía de afinidad sobre columna de
glutatión-sefarosa.
El conjunto de estos experimentos se ha llevado
a cabo aplicando estrictamente los diferentes protocolos de los
proveedores.
El análisis mediante electroforesis sobre gel
SDS-PAGE de una fracción alícuota del producto de
expresión obtenido mediante la realización del método descrito
anteriormente muestra que este método permite la obtención en
cantidad satisfactoria de la proteína de fusión recombinante
GST-SASPasa.
De manera similar, se ha obtenido la expresión
en cantidad satisfactoria de la proteína de fusión recombinante
GST-SASPasa truncada \Delta 1-84
(SEC ID nº 4).
\newpage
La proteína de fusión recombinante
GST-SASPasa truncada \Delta 1-84
(SEC ID nº 4) eluida de la columna glutatión sefarosa obtenida en
el ejemplo II, se incuba con trombina en tampón PBS, a pH 8 durante
18 horas a 22ºC. El tampón se intercambia mediante filtración sobre
gel G25® Biorad contra una disolución de 100 mM de acetato, pH 4,5.
La mezcla así obtenida se somete a una cromatografía catiónica
utilizando un gradiente de NaCl (0 a 1 M NaCl). Las fracciones que
contienen la GST y la trombina se eliminan y se recupera la fracción
eluida por la disolución a 750 mM de NaCl. Un análisis mediante
electroforesis sobre gel SDS-PAGE efectuada sobre
la fracción eluida por la disolución de NaCl a 750 mM, que contiene
una actividad caseinolítica (dato no representado) muestra la
presencia de una banda mayoritaria que, mediante comparación con los
marcadores de masas moleculares, presenta una masa molecular
aparente de 12 kD y una banda minoritaria que corresponde a la forma
truncada SASPasa \Delta 1-84 (SEC ID nº 4).
La forma de 12 kD corresponde a la forma
activada de la SASPasa. La secuenciación de Edman indica que el
producto aislado corresponde a la SASPasa activada (SEC ID nº
6).
\vskip1.000000\baselineskip
La deleción del sitio que codifica para la
secuencia FANS en la forma roncada de la SASPasa (SEC ID nº 4) con
la ayuda del kit Quick Change Site-directed
Mutagenesis (Stratagene) y de los cebadores adaptados se lleva a
cabo utilizando como matriz de ADN la construcción plasmídica de la
secuencia de la SASPasa C27 (SEC ID nº 4) en el vector
pGEX-4T3.
Se obtiene una proteína cuya secuencia proteica
está representada mediante SEC ID nº 26.
Después de la incubación a pH 5,00 en tampón
acetato de esta nueva proteína se produce, de manera sorprendente,
una generación de un fragmento de bajo peso molecular
(aproximadamente 21 kDa en electroforesis SDS-PAGE)
que posee como máximo la secuencia SEC ID nº 25 de masa teórica
18.731,44.
La SEC ID nº 27 de masa teórica 16.794,43 se
obtiene a partir de la SEC ID nº 25 asumiendo una activación en
C-terminal idéntica a la forma SEC ID nº 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta actividad ha sido demostrada según el
protocolo siguiente:
La insulina de cadena Beta oxidada (Sigma) se
utiliza como sustrato. La concentración es de 50 \mug en 1,5 ml
de tampón acetato 0,1M pH 5,0. Se añaden 50 \mul de SASPasa 12 kD
purificada (SEC ID nº 6) (aproximadamente 1 mg/ml) por gel de
filtración para iniciar la hidrólisis. Unos controles sin enzima o
sin sustrato se utilizan como referencia. A lo largo del tiempo (1
h a 24 h a 37ºC) se efectúan unos HPLC para seguir la hidrólisis.
Los picos que aparecen rápidamente corresponden a los sitios de
hidrólisis principales y los que aparecen sólo al cabo de 24 h a
los sitios secundarios. Los picos se recogen después de su
fraccionamiento y se secuencian en N-terminal
(secuenciación de EDMAN, Instituto Pasteur).
| FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF | (SEC ID nº 15). |
\vskip1.000000\baselineskip
Sitio principal: E/A (de tipo
pepsin-like)
Sitios secundarios: L/Y y Y/L (de tipo
pepsin-like).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la SASPasa
activada es capaz de degradar la insulina. La desnaturalización
térmica (95ºC - 10 min) de la SASPasa anula su actividad de
degradación de la insulina. Su actividad caseinolítica ha sido por
otro lado demostrada (resultados no representados).
\global\parskip0.930000\baselineskip
En este segundo ensayo, es la proteína
GST-SASPasa (SEC ID nº 4) la que se utiliza a su vez
como sustrato por autocatálisis.
La GST-SASPasa a 3 mg/ml en un
tampón fosfato 0,1M pH 7,0, 50% de glicerol, se acidifica
rápidamente a pH 5,9 mediante tampón acetato 1M pH 4,5. A cada
tiempo de incubación a 37ºC se recoge una alícuota y la reacción se
bloquea mediante la adición de un equivalente en volumen de tampón
Laemmli sin DTT. Al final de la cinética, cada muestra se analiza
mediante electroforesis SDS-PAGE (gel a 15% de
acrilamida) lo que demuestra una aparición progresiva de una banda
mayoritaria que migra a un PM aparente de 12 kD consecutiva a la
desaparición de la proteína de fusión.
Este ensayo muestra que se puede obtener
asimismo directamente la SASPasa activada (SEC ID nº 6) mediante
acidificación a pH 3 a 6, preferentemente 4 a 6 de la proteína de
fusión recombinante GST-rSASPasa \Delta
1-84 o GST-SASPasa obtenidas en el
ejemplo I seguida por una etapa de purificación mediante filtración
sobre gel (G75).
Por otro lado, el análisis de las disoluciones
activadas mediante secuenciación Edman y mediante espectrometría de
masa de tipo QTOF proporciona para la proteasa autoactivada tres
sitios de corte más o menos equivalentes en probabilidades:
- F/A (como ciertas cutáneo metaloproteasas)
- N/S (sitio de corte no clasificado)
- E/L (únicamente descrito para la matrilisina que es capaz de activar la uroquinasa y los MMP 1, 2 y 9).
\vskip1.000000\baselineskip
El kit Quick Change
Site-directed Mutagenesis (Stratagene) se utiliza
para la realización de los mutantes de la SASPasa.
La secuencia de la SASPasa SEC ID nº 5 se
modifica a nivel del ácido aspártico nº 212, es decir, su sitio
activo potencial. Para ello, se sintetizan dos oligonucleótidos de
tal manera que el aminoácido 212 sea sustituido o bien en alanina
(mutante A/D), o bien en ácido glutámico (mutante E/D).
Una amplificación por PCR se lleva a cabo con
cada par de oligonucleótidos mutados, y la construcción plasmídica
de la secuencia de la SASPasa C27 en el vector
pGEX-4T3 se utiliza como matriz de ADN.
Dos bacterias competentes (XL1 blue) se
transforman a continuación con cada producto de PCR. Varios clones
se amplifican y se secuencian con el fin de verificar la presencia
de la mutación deseada y sólo de ésta.
Una producción de las proteínas recombinantes
mutadas se realiza según el mismo protocolo que para la forma
salvaje, SASPasa C27; (SEC ID nº 4).
Cada proteína recombinante producida en forma de
proteína de fusión se incuba a continuación en un tampón acetato
1M, pH 4,5 a 37ºC. Se realizan unas extracciones a lo largo del
tiempo y se analizan mediante SDS-PAGE.
Se observa una disminución a lo largo del tiempo
de la forma entera GST-SASPasa C27, lo que demuestra
una autoescisión y por consiguiente una autoactivación; aparecen
numerosas bandas de pesos moleculares inferiores. Las formas
mutadas (A/D) y (E/D) por su parte, no se autoactivan.
Este experimento confirma la implicación del
ácido aspártico nº 212 en el sitio activo de la SASPasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis se han llevado a cabo mediante
transferencia de Northern, utilizando unas membranas comerciales
poliA + ARN blot (Ambion®) según el protocolo descrito por el
fabricante, y mediante RT-PCR utilizando una
colección de ADNc de las membranas
"rapid-scan®" humanas comercializadas por la
compañía OriGene Technologies, Inc.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El análisis mediante transferencia de Northern
se ha llevado a cabo utilizando como sonda el ADNc que codifica la
forma (truncada \Delta 1-84) de la SASPasa (SEC ID
nº 4) aislada a partir del plásmido recombinante preparado en el
ejemplo II y con la ayuda de una membrana que contiene diferentes
muestras de ARN.
La PCR se llevó a cabo utilizando la Taq
polimerasa comercializada por la compañía Promega y, como cebadores,
el par de oligonucleótidos SC134 (SEC ID nº 13)/SC135 (SEC ID nº
14) en las condiciones siguientes:
- -
- 1 ciclo de 3 min a 94ºC,
- -
- 25 a 30 ciclos (94ºC durante 30 s, 53ºC durante 30 s, 72ºC durante 60), y
- -
- 1 ciclo a 72ºC durante 5 min.
Los productos de PCR resultantes se visualizan
mediante coloración con bromuro de etidio después de la separación
sobre gel de agarosa al 2% (peso/volumen).
De los resultados, se destaca que la SASPasa se
expresa sustancialmente en casi la totalidad de los tejidos
ensayados a un nivel bajo en el hígado fetal, el cerebro fetal, los
ovarios, la glándula suprarrenal, el tiroides, la placenta, los
testículos, el estómago, el músculo, el pulmón, el hígado, el bazo y
el corazón, y todavía más bajo en la médula ósea, el páncreas, la
saliva, y el intestino delgado. Esta expresión es sin embargo
significativa en el cerebro y particularmente muy elevada en la
piel.
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo utilizado se basa en la técnica
descrita en T.D. Meek et al.; Proc, Natl. Acad. Sci. USA
vol. 86, páginas 1841-1845, marzo de 1989.
Un estudio de la reticulación que utiliza BS3
(Pierce) se efectúa sobre SASPasa activada (SEC ID nº 6), obtenida
mediante acidificación y purificación por cromatografía de exclusión
(gel de filtración) de la proteína de fusión recombinante
GST-SASPasa \Delta 1-84.
A la SASPasa activada (SEC ID nº 6) obtenida en
el ejemplo III, dispuesta en hielo, se añade 1 \mug de BS3 en 60
\mul de tampón fosfato 50 mM, pH 7, que contiene 150 mM de NaCl,
0,1% de TX100, 5 mM de EDTA. Se prepara asimismo una muestra de
control exenta de BS3. Después de 90 min, se introducen en los
medios de reacción 2 \mul de Tris-HCl 1M, pH 8,
para detener la reacción. Se analizan a continuación los productos
obtenidos mediante gel de filtración sobre gel, y mediante
electroforesis SDS-PAGE.
La SASPasa activada incubada con BS3 forma un
complejo multimérico estable que, mediante gel de filtración sobre
gel, se separa en tres picos principales. Se pueden observar
asimismo tres bandas distintas sobre gel después de la
electroforesis SDS-PAGE cuyas masas moleculares
aparentes, determinadas mediante comparación con los marcadores de
las masas moleculares son respectivamente de 12 kD, y están
comprendidas entre 10 y 14 kD, 30 y 45 kD y 60 y 100 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban 10 \mul de proteínas de fusión
GST-SASPasa \Delta 1-84
(aproximadamente 3 mg/ml) obtenidos en el ejemplo II en 200 \mul
de tampón acetato 0,1 M, ajustado a diferentes pH en presencia del
sustrato caseína comercializado con la denominación de Enzchek® por
la compañía Molecular Probes y utilizado a las concentraciones
preconizadas por el proveedor.
Se efectúan tres repeticiones para cada
ensayo.
Después de 20 horas de incubación a 37ºC, se
mide la fluorescencia sobre un lector de placa comercializado con
la denominación de Biolumin® por la compañía Molecular Probes,
utilizando el par de excitación/emisión: 485/535 nm. Los resultados
se representan en la figura 2.
Estos resultados muestran que en las condiciones
experimentales consideradas, la actividad enzimática de la SASPasa
es dependiente del pH y presenta un óptimo a pH 5. Por otro lado,
unos ensayos no representados en tampón fosfato 0,1 M de pH 6 a 7,
muestran sólo una baja actividad residual.
La influencia del pH sobre la autoactivación se
lleva a cabo asimismo y muestra una optimización para unos pH
comprendidos entre 3 y 6,9 y preferentemente entre 4 y 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden 10 \mul de SASPasa activada (SEC ID
nº 6) autoactivados (aproximadamente 3 mg/ml) en 200 \mul de
tampón acetato 0,1 M, pH 5,5, que contiene 20 \mul de DMSO con
unos inhibidores de retropepsinas. Un ensayo de control se efectúa
en las mismas condiciones en ausencia de inhibidor.
Se preincuba la mezcla durante 1 hora a 4ºC, y
después se añade el sustrato, caseína comercializada con la
denominación Enzchzek® por la compañía Molecular Probes en cantidad
suficiente para obtener la concentración preconizada por el
proveedor, habiendo sido las disoluciones previamente recalentadas a
37ºC.
El seguimiento de la hidrólisis de la caseína se
lleva a cabo mediante la medición de la fluorescencia sobre un
lector de placas Biolumin® comercializado por la compañía Molcular
Probes, utilizando el par excitación/emisión:
485/535 nm.
485/535 nm.
Los resultados obtenidos se presentan en la
figura 3. Se constata que las cinéticas de hidrólisis de la caseína,
en presencia de los inhibidores de retropepsinas RP1 y RP2 son más
bajos que el control. La actividad de la SASPasa está por lo tanto
inhibida por estos inhibidores.
- -
- RP1 corresponde a la secuencia Ac-Leu-Val-Phe-aldehído y está comercializado por Bachem con la referencia N 1395.0005,
- -
- RP2 corresponde a la secuencia Ac-Leu-Leu-Met-aldehído y está comercializado por Bachem con la referencia N 1315.0005,
- -
- RP3 corresponde a la secuencia Ac-Leu-Leu-Nle-aldehído y está comercializado por Bachem con la referencia N 1320.0005,
\vskip1.000000\baselineskip
Se constata además que la cinética de hidrólisis
de la caseína, en presencia del inhibidor de retropepsina RP3, es
significativamente más elevada que la obtenida en las condiciones de
control. La actividad de la SASPasa parece por lo tanto ser
estimulada por este inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
La corneodesmosina es un marcador de la
descamación puesto que interviene en la cohesión corneocitaria a
nivel de los corneodesmosomas. Cuanto más degradada está la
proteína, más significativa es la separación de los corneocitos. La
degradación de la corneodesmosina es por lo tanto una etapa clave de
la descamación.
El ensayo utilizado en este estudio consiste por
lo tanto en seguir esta degradación en presencia de la sustancia a
ensayar.
Se preparan unos polvos acetónicos a partir de
stripping vernis (Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA,
Schmidt R: Identification and cloning of a new
calmodulin-like protein from human epidermis. J.
Biol. Chem. 275: 12841-12347, 2000) extraídos en la
parte inferior de las piernas de personas voluntarias con piel
seca. Unas fracciones alícuotas de 2 mg de polvo de stratum
corneum se introducen separadamente en unos tubos Eppendorf, y
después se sumergen en las disoluciones a ensayar a razón de 100
\mul/mg. Las disoluciones se preparan en tampón acetato pH 5. Un
control sin proteasa se prepara en paralelo con el fin de evaluar la
degradación natural de la corneodesmosina. Para cada ensayo, se
preparan tres muestras. Las muestras, los ensayos y el control se
incuban a 30ºC bajo agitación durante 24 horas.
Las proteínas se extraen con tampón Laemmli
completo. Éstas se dosifican mediante el método de Bradford (kit
Bio-Rad®). La concentración de cada muestra se
ajusta para permitir la comparación de las muestras. Los
polipéptidos se separan mediante electroforesis
SDS-PAGE sobre gel de acrilamida 15%, y después se
transfieren sobre una membrana de PVDF. Una inmunodetección
mediante una disolución de anticuerpos
anti-corneodesmosina utilizada al 1/12500 y de
anticuerpos secundarios acoplados con la peroxidasa permite revelar
la corneodesmosina. Las bandas detectadas mediante
quimioluminiscencia se cuantifican con la ayuda del programa
Quantity One® de la compañía Biorad. Las membranas se colorean a
continuación con amido-black, y después se escanean.
Además, las queratinas que son unas proteínas mayoritarias de los
extractos corneocitarios se cuantifican con el fin de verificar el
ajuste a 0,6 mg/ml de todas las muestras.
Un control positivo de degradación (+) se
prepara utilizando 5 mM de EDTA. Un ensayo se lleva a cabo en
presencia de 60 \mug de SASPasa activada. Un control negativo
representa la degradación natural de la corneodesmosina en las
condiciones operativas del ensayo.
Se constata una disminución significativa del
porcentaje de corneodesmosina residual cuando los polvos acetónicos
de stratum corenum son puestos en contacto con la SASPasa
activada (SEC ID nº 6) con relación a los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utiliza el sustrato peptídico considerado
(SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34 o SEC ID nº
35) atenuado con la ayuda del sistema fluorescente
Abz/(NO2)Tyr a razón de 100 \muM en DMSO y después se
añaden 10 \mul de esta disolución madre de sustrato para 100
\mul de tampón acetato 0,1M pH 5,00.
Se añaden 10 \mug de GST-C27
(proteína de fusión a 1 mg/ml en PBS). Se incuba a 37ºC. La lectura
de fluorescencia se lleva a cabo a 340/450 nm en un lector de
placas de tipo Biolumin en diferentes momentos. Los resultados se
representan en la figura 5.
Se observa que el péptido natural (wt) está bien
hidrolizado por la SASPasa pero unas sustituciones de aminoácidos
en la secuencia de este péptido pueden generar unos sustratos para
los cuales la SASPasa posee más afinidad.
Una búsqueda (base MEROPS) sobre las diferentes
proteasas capaces de cortar las uniones peptídicas hidrolizadas o
hidrolizables por la SASPasa (combinaciones de los diferentes
aminoácidos encontrados en la posición P1 con los aminoácidos
encontrados en la posición P2 de las secuencias hidrolizadas por la
SASPasa) hacen aparecer, en paralelo con unas proteasas de tipo
retroviral, unas proteasas que han sido descritas como importantes
para la piel; la SCCE (descamación, conversión de la prolL1B)) los
MMP1, 2 y 9 (cicatrización, etc.), la \mu-calpaína
(maduración de la envolvente córnea, proceso de la filagrina), la
trombina (activación de "Protease Activated Receptors"), las
convertasas 1, 2, 4, 5 y 7 (proceso de la filagrina, regulación de
la diferenciación, etc.).
Estas constataciones refuerzan la idea de un
papel importante de la SASPasa en la fisiología cutánea.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> L'OREAL
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de proteasas aspárticas
en el campo cosmético y terapéutico.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BR75585/CR/PLC/cr
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02 08613
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-07-09
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 259
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 5C140 de amplificación
mediante PCR de fragmentos de ADNc que codifican la SASPasa
completa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggatccat ggggagccca ggggc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SC131 de amplificación
mediante PCR de ADNc que codifica la SASPasa completa o la forma
troncada SASPasa Delta 1-84.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaattctc agtgggatag ctcctgccgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SC130 de amplificación
mediante PCR de ADNc que codifica la SASPasa denominada Delta
1-84.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgataggatcc atggccggga gcggagccag gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SC134 de amplificación
mediante RT-PCR.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccctgggt gtctacaata
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador SC135 de amplificación
mediante RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggccacct ttaccacatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(777)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1029
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1029)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(414)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 516
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(516)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 465
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(465)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211>6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
Claims (27)
1. Composición cosmética o farmacéutica que
comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un
polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica
está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº
6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27, y sus homólogos que
poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas
secuencias y la misma actividad biológica.
2. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho polipéptido se presenta en una
forma multimérica y preferentemente dimérica.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizada porque dicho polipéptido ha sufrido una o
varias modificaciones post-traduccionales.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho
polipéptido se presenta en forma de un polipéptido de secuencia SEC
ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, fusionado con
un agente de apuntado hidrófilo o hidrófobo o un precursor de
bioconversión.
5. Composición cosmética o farmacéutica que
comprende en un medio fisiológicamente aceptable, por lo menos un
polipéptido natural o sintético purificado cuya secuencia peptídica
está representada por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº
6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 y SEC ID nº 27 y sus homólogos que
poseen por lo menos 85% de homología de secuencia con dichas
secuencias y la misma actividad biológica en asociación con por lo
menos otro agente activo destinado a la prevención y/o al
tratamiento de las afecciones cutáneas.
6. Procedimiento de tratamiento cosmético
destinado a luchar contra los trastornos relacionados con una
disfunción de la proliferación y/o de la diferenciación celular,
caracterizado porque se aplica sobre la piel, las mucosas
y/o las fibras queratínicas una composición cosmética que comprende
por lo menos un polipéptido cuya secuencia peptídica es una
secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº
25 o SEC ID nº 27 y sus homólogos que poseen por lo menos 85% de
homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad
biológica.
7. Procedimiento de tratamiento cosmético según
la reivindicación 6, caracterizado porque prevé tratar las
pieles secas, la hiperqueratosis, la paraqueratosis, los trastornos
de la sebogénesis y/o las señales de envejecimiento cutáneo.
8. Utilización de un polipéptido cuya secuencia
peptídica es una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 6, SEC
ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 y sus homólogos que poseen por
lo menos 85% de homología de secuencia con dichas secuencias y la
misma actividad biológica para la preparación de una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de las infecciones
dermatológicas.
9. Utilización según la reivindicación 8,
caracterizada porque la composición farmacéutica está
destinada a tratar la ictiosis, la psoriasis, el eczema, la
rosácea, los líquenes, los pruritos, o cualquier patología que
implica una hiperqueratosis, una paraqueratosis o que tiene una
componente inflamatoria.
10. Utilización de un polipéptido cuya secuencia
peptídica está representada por lo menos por una secuencia
seleccionada de entre SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC
ID nº 34 o SEC ID nº 35, para preparar una composición destinada a
modular la actividad de la proteasa de ácido aspártico de secuencia
SEC ID nº 5.
11. Composición cosmética o farmacéutica,
caracterizada porque comprende en un medio fisiológicamente
aceptable, por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica un
polipéptido tal como el definido según las reivindicaciones 1 a 4,
o una secuencia sentido, antisentido o antisentido interferencial
que corresponde a dicha secuencia nucleotídica.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicha secuencia nucleotídica está
constituida por la secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20,
SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº 28.
13. Polipéptido aislado y purificado que
pertenece a la familia de las proteasas de ácido aspártico,
caracterizado porque presenta una secuencia peptídica
representada por SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID
nº 27.
14. Polipéptido según la reivindicación 13,
caracterizado porque presenta una masa molecular aparente
comprendida entre 5 y 30 kD, más particularmente entre 9 y 15 kD, y
en particular entre 11 y 14 kD.
15. Polipéptido según la reivindicación 13 ó 14,
caracterizado porque se presenta en forma multimérica y
preferentemente dimérica.
16. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque presenta un
punto isoeléctrico teórico comprendido entre 3 y 9.
17. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque es de origen
natural y está purificado a partir de tejidos de mamíferos.
18. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque se purifica a
partir de piel humana y más particularmente a partir de epidermis
humana.
19. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, caracterizado porque ha sufrido una
o varias modificaciones post-traduccionales.
20. Polipéptido según la reivindicación 13 o una
de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque se
presenta en forma de un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID
nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27, fusionado con un agente de
apuntado hidrófilo o hidrófobo o un precursor de bioconversión.
21. Fragmento de ácido desoxirribonucleico
aislado y purificado que codifica un polipéptido tal como el
definido según una de las reivindicaciones 14 a 20.
22. Fragmento de ácido desoxirribonucleico
aislado y purificado constituido por la secuencia nucleotídica
codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº
28.
23. Vector de expresión recombinante que
contiene la totalidad o parte de la secuencia nucleotídica
codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC ID nº 26 o SEC ID nº
28.
24. Utilización de por lo menos una secuencia de
ácido desoxirribonucleico tal como la definida según las
reivindicaciones 21 ó 22 para preparar una secuencia de ácido
ribonucleico sentido, antisentido o antisentido interferencial.
25. Ácido ribonucleico, sentido, antisentido o
antisentido interferencial que corresponde por lo menos a la
secuencia nucleotídica codificante SEC ID nº 20, SEC ID nº 24, SEC
ID nº 26 o SEC ID nº 28.
26. Utilización de por lo menos una secuencia
sentido o antisentido tal como la definida según la reivindicación
25 con fines de clonación o de identificación de un polipéptido de
secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25 o SEC ID nº 27 o
de sus homólogos que poseen por lo menos 85% de homología de
secuencia con dichas secuencias y la misma actividad biológica.
27. Utilización de por lo menos una secuencia
sentido o antisentido tal como la definida en la reivindicación 25
para la preparación de una composición para un método de diagnóstico
in vitro en el que se utiliza dicha secuencia para la
detección de una síntesis de secuencias nucleicas que codifican para
un polipéptido de secuencia SEC ID nº 6, SEC ID nº 16, SEC ID nº 25
o SEC ID nº 27 o de sus homólogos que poseen por lo menos 85% de
homología de secuencia con dichas secuencias y la misma actividad
biológica.
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