ES2221133T3 - Polipeptido aislado a partir de la epidermis y su uso. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN POLIPEPTIDO AISLADO QUE TIENE UNA FUNCION EN LA COHESION INTERCORNEOCITARIA. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNA MEZCLA DE POLIPEPTIDOS OBTENIDOS DE LA PROTEOLISIS DEL POLIPEPTIDO AISLADO, A COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN Y A UN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO COSMETICO DESTINADO A REDUCIR LA COHESION INTERCORNEOCITARIA, Y POR CONSIGUIENTE A FAVORECER LA DESCAMACION.

Description

Polipéptido aislado a partir de la epidermis y su uso.

La invención tiene por objeto un polipéptido aislado, una mezcla de polipéptidos resultantes de la proteolisis del polipéptido aislado, composiciones que los contienen y un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a disminuir la cohesión intercorneocitaria y, por lo tanto, a favorecer la descamación.

La piel constituye una barrera física entre el organismo y su ambiente. Está constituida por dos tejidos: la epidermis y la dermis.

La dermis proporciona a la epidermis un soporte sólido. Es también su elemento nutritivo. Está constituida principalmente por fibroblastos y por una matriz extracelular compuesta principalmente por colágeno, elastina y una substancia llamada substancia fundamental, siendo sintetizados estos componentes por el fibroblasto. También se encuentran en ella leucocitos, mastocitos o también macrófagos tisulares. Está también constituida por vasos sanguíneos y fibras nerviosas.

La epidermis es un epitelio pluriestratificado descamativo de 100 \mum de espesor medio y se divide convencionalmente en una capa basal de queratinocitos que constituye la capa germinativa de la epidermis, una capa llamada espinosa constituida por varias capas de células poliédricas dispuestas sobre las células germinativas, una capa llamada granulosa constituida por células aplastadas que contienen inclusiones citoplásmicas distintas, los granos de queratohialina, y finalmente una capa superior llamada capa córnea (o estrato córneo), constituida por queratinocitos en estado terminal de diferenciación, llamados corneocitos. Éstas son células momificadas, anucleadas, que derivan de los queratinocitos.

Los corneocitos están principalmente compuestos por una matriz fibrosa que contiene citoqueratinas rodeada de una estructura muy resistente de 15 nm de espesor, llamada envuelta córnea o cornificada. El apilamiento de estos corneocitos constituye la capa córnea, que es responsable de la función de barrera de la epidermis.

El estrato córneo posee una permeabilidad selectiva que, controlando la pérdida de agua, asegura una hidratación fisiológica de la piel. Constituye además una barrera contra las agresiones del ambiente, ya sean químicas o físicas.

El estrato córneo se compone de dos partes:

- El estrato córneo compacto, cuya organización celular corresponde a un apilamiento en columna de los corneocitos por encima de las células granulosas de las que proceden. Cada corneocito presenta un recubrimiento máximo con los corneocitos supra- y subyacentes.

- El estrato desunido, constituido por los últimos cimientos de la capa córnea, menos cohesivos que los anteriores y lugar de la descamación de los corneocitos.

En el estrato córneo, el espacio intercorneocitario está rellenado con láminas lipídicas que provienen de los cuerpos lamelares.

La diferenciación epidérmica representa un proceso de maduración continuo y orientado en el que los queratinocitos basales dan lugar a la formación de corneocitos, células muertas totalmente queratinizadas. Esta diferenciación es el resultado de fenómenos perfectamente coordinados que van a dar lugar al mantenimiento de un espesor constante y a asegurar así la homeostasia de la epidermis. Ésta pasa por una regulación del número de células que entran en el proceso de diferenciación y del número de células que se descaman.

En el curso del proceso normal de descamación, sólo los corneocitos más superficiales se desprenden de la superficie de la epidermis.

De la capa basal a la capa granulosa, la cohesión está asegurada por la red transcelular formada por los desmosomas y los filamentos intermedios de citoqueratinas. Esta red está anclada a la membrana basal por los hemidesmosomas.

En la capa córnea, la cohesión queda asegurada por estructuras intercelulares que derivan de los desmosomas, llamadas corneosomas o corneodesmosomas, que solidarizan las envueltas córneas de los corneocitos. En la epidermis (no palmoplantar), los corneodesmosomas están presentes por toda la superficie corneocitaria en la parte inferior de la capa córnea, pero sólo los corneodesmosomas periféricos persisten en la parte superior.

Estudios recientes han mostrado la gran importancia de los corneodesmosomas en la cohesión intercorneocitaria, así como en el proceso de descamación. En particular, existe una correlación estrecha entre la disociación celular y la proteolisis de ciertos compuestos corneodesmosómicos, como la desmogleína I.

El estudio de la descamación permite revelar la existencia de una regulación bioquímica fina incluso en las capas llamadas "muertas" de la epidermis. Se trata de enzimas producidas en las capas vivas más profundas, que van a actuar de forma secuencial y complementaria para dar lugar a la liberación final de los corneocitos a la superficie cutánea.

Las principales enzimas sospechosas de participar en la descamación han sido descritas hace poco. Pertenecen a dos familias de enzimas: las glicosidasas y las proteasas. Las proteasas no pueden actuar solas y parece ser necesaria una acción previa de las glicosidasas para descubrir sitios de proteolisis.

Las proteasas constituyen el tipo de enzimas probablemente más implicado en la descamación. Se subdividen en cuatro familias:

- proteasas con ácido aspártico, que poseen un ácido aspártico en su sitio activo;

- proteasas con serina, que tienen una serina en su sitio activo;

- proteasas con cisteína, que llevan una cisteína en su sitio activo, y

- metaloproteasas, que poseen con la mayor frecuencia un átomo de zinc en su sitio activo o a veces un átomo de calcio.

Entre estas proteasas, las proteasas con cisteína de origen lisosómico (catepsinas B, H y L) son sin duda las proteasas más activas del cuerpo humano. Son ellas las que participan en la renovación cotidiana de las proteínas de un individuo (de 200 a 300 g para un individuo de 70 kg).

En este sentido, la patente Nº WO 95/07686 describe 2 proteasas con cisteína de peso molecular aparente de 34 a 35 kilodaltons.

Numerosas patologías cutáneas se caracterizan por la producción de una capa córnea espesa y por una descamación anormal, es decir, por una hiperqueratosis. Ésta puede aparecer sobre cualquier territorio anatómico cutáneo y en contextos clínicos muy variados. Su substrato fisiopatológico y su causa son variados.

A modo de ejemplo, se pueden citar:

- la xerosis (o sequedad cutánea),

- las ictiosis,

- la psoriasis,

- ciertas lesiones tumorales benignas o malignas y

- las hiperqueratosis reactivas.

Otras patologías se caracterizan por una transdiferenciación o metaplasia a nivel de mucosas, malpighianas o no, pero normalmente no cornificadas, que se cornifican, es decir, que se revisten de un epitelio anormal que produce en su superficie una capa córnea. Aunque las mucosas genitales y las de las vías aereodigestivas superiores sean las más frecuentemente afectadas, estas metaplasias pueden producirse en diversos territorios anatómicos. A modo de ejemplos, se pueden citar:

- la leucoqueratosis del cuello uterino en el curso del prolapso,

- las leucoqueratosis bucales y

- las lesiones tumorales benignas queratósicas de las mucosas malpighianas.

Sin querer inclinarse por una teoría cualquiera de la invención, es posible pensar que estas patologías pueden estar ligadas a un déficit, cualitativo o cuantitativo, en las enzimas sospechosas de participar en la descamación, entre ellas particularmente las proteasas.

La purificación y el conocimiento de polipéptidos nuevos implicados en la cohesión intercorneocitaria, en particular de proteasas, es una de las vías que podría permitir la elaboración de nuevos productos destinados a luchar contra los efectos de un exceso o de un defecto de polipéptidos, en particular de proteasas, principalmente en la superficie de la piel o de las mucosas.

Uno de los objetos de la invención es, pues, proporcionar en forma aislada un polipéptido implicado en la cohesión intercorneocitaria.

Tras largos y laboriosos trabajos, la solicitante ha puesto en evidencia, ha aislado y ha purificado por técnicas bioquímicas, a partir de epidermis humana, un polipéptido implicado en la cohesión intercorneocitaria.

La invención tiene, pues, por objeto un polipéptido aislado perteneciente a la familia de las proteasas con cisteína de tipo catepsinas L, que tiene un peso molecular aparente de 28 kilodaltons y un punto isoeléctrico aparente comprendido entre 6 y 9.

Por peso molecular aparente se entiende el peso molecular obtenido para el polipéptido por comparación de la movilidad electroforética de éste con la de proteínas patrón de pesos moleculares conocidos en gel de poliacrilamida/dodecilsulfato de sodio, o también por comparación del volumen de elución del polipéptido con el de proteínas patrón de pesos moleculares conocidos en cromatografía de exclusión (según las técnicas descritas en "Protein Purification", J-C. Janson y L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989).

Por punto isoeléctrico aparente se entiende el punto isoeléctrico obtenido para el polipéptido por comparación con el obtenido para proteínas patrón de puntos isoeléctricos conocidos en experimentos de cromatofocalización ("chromatofocusing"), tales como las descritas en "Protein Purification", J-C. Janson y L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989.

El polipéptido de la invención puede ser de origen natural o sintético. Por sintético, se entiende aquí cualquier polipéptido obtenido químicamente o por producción en un organismo tras introducción en este organismo de los elementos necesarios para esta producción.

El polipéptido de la invención puede proceder de cualquier origen posible, a saber, animal, en particular de mamíferos y más particularmente aún humano, vegetal, de microorganismos (virus, fagos y bacterias, entre otros) o también de hongos, independientemente de que esté presente de forma natural o no en dicho organismo de origen.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención es de origen natural, aislado a partir de tejidos de mamíferos, particularmente a partir de piel de mamíferos.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención es aislado a partir de piel humana, y aún más preferiblemente a partir de epidermis humana.

Como se ha indicado con anterioridad, la cohesión intercorneocitaria se debe aparentemente, entre otros, a la existencia en la capa córnea de polipéptidos específicos de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria.

Así, el polipéptido de la invención está presente en la capa córnea e interviene en la disminución de la cohesión intercorneocitaria degradando las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria, particularmente los corneodesmosomas.

Se sabe además que los polipéptidos, y en particular las enzimas, entre ellas las proteasas, pueden presentarse en una forma llamada madura, que corresponde a una secuencia primaria de aminoácidos compatible con su actividad. Pero se sabe que frecuentemente estos polipéptidos maduros proceden, por un fenómeno de maduración, de polipéptidos de tamaño superior, precursores, que contienen en su secuencia primaria de aminoácidos la secuencia primaria del polipéptido maduro. Puede ocurrir lo mismo para el polipéptido de la invención.

Así, la invención tiene también por objeto cualquier polipéptido constituido en parte por el polipéptido de la invención.

También se sabe que los polipéptidos pueden sufrir modificaciones después de la traducción, como la formación de uniones disulfuro, escisiones proteolíticas específicas, adición de glúcidos (glicosilación), fosforilación, en particular a nivel de las serinas y/o de las treoninas y/o de las tirosinas, y/o asociación con lípidos.

La invención se relaciona, pues, más particularmente con el polipéptido de la invención que ha sufrido o no modificaciones posteriores a la traducción.

El polipéptido de la invención puede haber sufrido una o varias modificaciones después de la traducción.

Preferiblemente, el polipéptido según la invención está glicosilado y/o fosforilado.

El polipéptido de la invención tiene un peso molecular aparente de 28 kilodaltons.

Es bien sabido que las enzimas en general, y las proteasas en particular, presentan una actividad máxima en medios con pH definido.

Así, el polipéptido de la invención se caracteriza por el hecho de que su actividad es máxima a un pH de 2 a 9, preferiblemente de 3,5 a 6,5. Por ejemplo, la actividad máxima del polipéptido sobre la caseína se produce a un pH comprendido entre 4,6 y 5,6.

También se sabe que la secuencia primaria de aminoácidos de un polipéptido determina sitios específicamente reconocidos por proteasas que, una vez se ha hecho efectivo el reconocimiento de estos sitios, van a inducir, con o sin fijación a dicho polipéptido, su escisión por proteolisis.

Así, la invención se relaciona también con al menos un fragmento de proteolisis del polipéptido de la invención.

Se deduce por el texto y sin indicación en contrario que, por polipéptido, hay que entender el polipéptido natural o sintético de la invención o al menos uno de sus fragmentos, ya se obtenga por proteolisis o de forma sintética.

La cohesión intercorneocitaria se debe aparentemente a la existencia en la capa córnea de polipéptidos específicos de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria. Se ha visto que determinadas patologías hiperqueratósicas podrían estar ligadas a un exceso de cohesión intercorneocitaria.

La solicitante ha podido mostrar que el polipéptido de la invención interviene en fenómenos de destrucción de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria y, por lo tanto, en la cohesión intercorneocitaria. El polipéptido de la invención puede ser, pues, utilizado en composiciones cosméticas o farmacéuticas destinadas a disminuir la cohesión intercorneocitaria y, por lo tanto, a favorecer la descamación.

Otro objeto de la invención es, pues, proporcionar composiciones cosméticas o farmacéuticas que contienen, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido tal como se ha descrito anteriormente.

Preferiblemente, las composiciones de la invención son aplicadas a la piel o a las mucosas.

La invención se relaciona también con una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido de la invención, destinada a tratar los trastornos de la descamación, como las hiperqueratosis, por ejemplo la xerosis (o sequedad cutánea), las ictiosis, la psoriasis, la hiperqueratosis de ciertas lesiones tumorales benignas o malignas y las queratosis reactivas.

La invención se relaciona también con una composición farmacéutica que contiene al menos un polipéptido de la invención, destinada a tratar las patologías que se caracterizan por una transdiferenciación o metaplasia, a nivel de mucosas, malpighianas o no, pero normalmente no cornificadas, que se cornifican, como, por ejemplo, la leucoqueratosis del cuello uterino en el curso del prolapso, las leucoqueratosis bucales o también las lesiones tumorales hiperqueratósicas benignas o malignas de las mucosas malpighianas.

La cantidad de polipéptido contenida en la composición de la invención, es, bien entendido, función del efecto buscado y puede, por lo tanto, variar en gran medida.

Para dar un orden de magnitud, la composición puede contener el polipéptido de la invención en una cantidad que representa un 0,00001% a un 50% del peso total de la composición, y preferiblemente en una cantidad que representa un 0,001% a un 10% del peso total de la composición, y aún más preferiblemente en una cantidad que representa un 0,1% a un 1% del peso total de la composición.

En la técnica anterior, determinados compuestos son descritos como activadores de proteasas.

Se conoce, por ejemplo, el efecto beneficioso del glicerol sobre las xerosis, efecto que se explica por un efecto activador de los sistemas enzimáticos, debido a su acción hidratante, por la cual favorecería la acción de las proteasas que degradan los corneodesmosomas y por la cual también favorecería la descamación (patente Nº WO 95/07687).

La urea y sus derivados son también conocidos desde hace mucho para mejorar el estado de la superficie de las pieles muy secas e incluso ictiósicas (Swanbeck, Acta Dermatologica and Venereologica, 1968, 48, 123-127). Wiederanders y col. (Biomedical Biochemistry Acta, 1986, 45 (11-12), 1477-1483) mostraron que una catepsina extraída de pescado es más activa en presencia de urea. Estos autores llegan así a dosificar específicamente las catepsinas L y D, cuya actividad se multiplica, respectivamente, por un factor de 2,5 y 6 en presencia de urea.

También se describen agentes reductores como activadores de las proteasas. Se citarán, por ejemplo, los sulfuros, los tioles como ditiotreitol o tritiohexitol, cisteína, N-acetilcisteína, proteínas o hidrolizados de proteínas ricas en cisteína, mercaptoetanol, tioglicerol, ácidos tioalcanoicos y ácidos mercaptocarboxílicos y sus análogos, como, por ejemplo el ácido mercaptosuccínico, el ácido tioláctico, el ácido tioglicólico y sus sales, coenzima A o también glutatión reducido (GSH).

Estos agentes reductores pueden encontrarse en la composición en su forma activa o en forma de su precursor, como, por ejemplo, el carboxilato de oxotiazolidina, que es un precursor de las cisteínas.

El tetraacetato de etilendiamina (EDTA) es conocido por prevenir la inactivación por metales pesados de las proteasas, particularmente de tipo catepsina. En este sentido, el EDTA es considerado como un activador de proteasas.

También se pueden asimilar las transglutaminasas con un activador de proteasas. Estas enzimas pertenecen a la familia de las transpeptidasas. Son calcio-dependientes y catalizan la formación de los puentes isopeptídicos de la \varepsilon(\gamma-glutamil)lisina: reacción del grupo carboxilo (en el carbono \gamma) del residuo de glutamina y del grupo amina de un residuo de lisina o de una poliamina. Las transglutaminasas existen en 2 formas principales en la epidermis: la transglutaminasa E (o epidérmica), citosólica, de PM 50-56 kD, que tiene un precursor de 70 kD, y la transglutaminasa K o de tipo I, de membrana, de PM 92 kD.

Las transglutaminasas E y K están ambas implicadas en la formación de la envuelta córnea por formación de puentes entre ellas de numerosas proteínas, entre las cuales las principales son la involucrina, la loricrina, la elafina, las cistatinas, las pancornulinas (o SPR: Small Proline Rich), citoqueratinas, las desmoplaquinas I y II, desmogleínas y la corneodesmosina.

Las cistatinas son proteínas que poseen una actividad inhibidora de las proteasas con cisteína (Takahashi y col., FEBS Letters, 1990, 2, 261-264).

Así, si se aumenta la actividad de las transglutaminasas, ya sea para obtener activador de transglutaminasa, ya sea para obtener directamente transglutaminasa, se aumenta entonces la cantidad de proteínas constitutivas de la envuelta córnea, que son capturadas en la formación de esta última bajo la influencia de la transglutaminasa. Se priva entonces al estrato córnea de sus proteínas endógenas, en particular las cistatinas. La desaparición de las cistatinas en la epidermis, y particularmente en el estrato córneo, tiene entonces como efecto liberar las proteasas con cisteína, cuya actividad resulta entonces aumentada, lo que tiene como consecuencia la disminución de la cohesión intercorneocitaria y, por lo tanto, el favorecimiento de la descamación.

Así, la invención tiene también por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene al menos un polipéptido según la invención y además al menos un activador de proteasas.

Entre los activadores de proteasas, se pueden citar el glicerol, la urea, el EDTA, la transglutaminasa y los agentes reductores.

Se entiende que la cantidad de activador de proteasas contenida en la composición de la invención es función del efecto buscado y puede, pues, variar en gran medida.

Para dar un orden de magnitud, la composición puede contener el activador de proteasas en una cantidad que representa de un 0,00001% a un 15% del peso total de la composición y preferiblemente en una cantidad que representa de un 0,001% a un 10% del peso total de la composición.

En la composición, los activadores de proteasas pueden estar solos o en mezcla.

Sea cual sea su naturaleza, las composiciones de la invención pueden ser ingeridas, inyectadas o aplicadas a la piel (en cualquier zona cutánea del cuerpo) o las mucosas (bucal, yugal, gingival, genital, conjuntival, ...).

Según el modo de administración, las composiciones de la invención pueden presentarse bajo cualquier forma galénica normalmente utilizada.

Para una aplicación tópica a la piel, la composición puede tener especialmente la forma de solución acuosa u oleosa o de dispersión de tipo loción o suero, de emulsiones de consistencia líquida o semilíquida de tipo leche, obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (Ac/Ag) o a la inversa (Ag/Ac), o de emulsiones de consistencia blanda de tipo crema o gel acuoso o anhidras, o también de microcápsulas o micropartículas, o de dispersiones vesiculares de tipo iónico y/o no iónico, o de espumas, o también en forma de composiciones para aerosol que contienen igualmente un agente propulsor bajo presión. Estas composiciones son preparadas según los métodos habituales.

Para inyección, la composición puede presentarse en forma de loción acuosa u oleosa o en forma de suero. Para los ojos, puede presentarse en forma de gotas y, para ingestión, puede presentarse en forma de cápsulas, de gránulos, de jarabes o de comprimidos.

Las cantidades de los diferentes constituyentes de las composiciones según la invención son las clásicamente utilizadas en los ámbitos considerados.

Estas composiciones constituyen especialmente cremas limpiadoras, protectoras, de tratamiento o de cuidado para la cara, las manos, los pies, los grandes pliegues anatómicos o el cuerpo (por ejemplo, cremas de día, cremas de noche, cremas desmaquilladoras, cremas de fondo de color, cremas antisolares), fondos de color fluidos, leches desmaquilladoras, leches corporales de protección o de cuidados, leches antisolares, leches para después del sol, lociones, geles o espumas para el cuidado de la piel, como lociones limpiadoras, lociones antisolares, lociones para después del sol, lociones de bronceado artificial, composiciones para el baño, composiciones desodorantes que contienen un agente bactericida, geles o lociones para después del afeitado, cremas depilatorias, composiciones contra las picaduras de insectos, composiciones antidolorosas, composiciones para tratar ciertas enfermedades de la piel, como el eczema, la rosácea, la psoriasis, los líquenes, los pruritos graves o la ictiosis.

Las composiciones según la invención pueden también consistir en preparaciones sólidas que constituyen jabones o pastillas de limpieza.

Las composiciones pueden también ser acondicionadas en forma de composición para aerosol que contiene igualmente un agente propulsor bajo presión.

La composición según la invención puede también ser una composición para los cuidados del cuero cabelludo, y especialmente un champú, una loción rizadora, una loción de tratamiento, una crema o un gel para peinado, una composición de tinte (especialmente tintes de oxidación) eventualmente en forma de champúes colorantes, lociones reestructurantes para el cabello, una composición de permanente (especialmente una composición para el primer tiempo de una permanente), una loción o un gel anticaída, un champú antiparasitario, composiciones antipelícula, etc.

La composición puede también ser para uso bucodental, por ejemplo una pasta dentífrica. En este caso, la composición puede contener adyuvantes y aditivos habituales para las composiciones de uso bucal, y especialmente agentes tensoactivos, agentes espesantes, agentes humectantes, agentes pulimentadores tales como la sílice, diversos ingredientes activos, como los fluoruros, en particular el fluoruro de sodio, y eventualmente agentes edulcorantes, como el sacarinato de sodio.

Cuando la composición es una emulsión, la proporción de la fase grasa puede ir del 5% al 80% en peso, y preferiblemente del 5% al 50% en peso, con respecto al peso total de la composición. Los aceites, las ceras, los emulsores y los coemulsores utilizados en la composición en forma de emulsión son seleccionados entre los clásicamente utilizados en el campo cosmético. El emulsor y el coemulsor están presentes en la composición en una proporción que va del 0,3% al 30% en peso, y preferiblemente del 0,5 al 20% en peso, con respecto al peso total de la composición. La emulsión puede además contener vesículas lipídicas.

Cuando la composición es una solución o un gel oleoso, la fase grasa puede representar más de un 90% del peso total de la composición.

De forma conocida, la composición cosmética puede contener también adyuvantes habituales en el campo cosmético, tales como gelificantes hidrófilos o lipófilos, aditivos hidrófilos o lipófilos, conservantes, antioxidantes, solventes, perfumes, cargas, filtros, absorbentes de olor y materias colorantes. Las cantidades de estos diferentes adyuvantes son las clásicamente utilizadas en el campo cosmético y, por ejemplo, del 0,01% al 10% del peso total de la composición. Estos adyuvantes, según su naturaleza, pueden ser introducidos en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las esférulas lipídicas.

Como aceites o ceras utilizables en la invención, se pueden citar los aceites minerales (aceite de vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de la manteca de karité, aceite de girasol), los aceites animales (perhidroescualeno), los aceites de síntesis (aceite de Purcellin), los aceites o ceras siliconados (ciclometicona) y los aceites fluorados (perfluoropoliéteres) y las ceras de abeja, de carnauba o de parafina. Se pueden añadir a estos aceites alcoholes grasos y ácidos grasos (ácido esteárico). Como emulsores utilizables en la invención, se pueden citar, por ejemplo, el estearato de glicerol, el polisorbato 60 y la mezcla de PEG-6/PEG-32/estearato de glicol vendida bajo la denominación Tefose® 63 por la sociedad Gattefosse.

Como solventes utilizables en la invención, se pueden citar los alcoholes inferiores, especialmente el etanol y el isopropanol, y el propilenglicol.

Como gelificantes hidrófilos utilizables en la invención, se pueden citar los polímeros carboxivinílicos (carbómeros); los copolímeros acrílicos, tales como los copolímeros de acrilatos/alquilacrilatos; las poli-acrilamidas; los polisacáridos tales como la hidroxipropilcelulosa; las gomas naturales, y las arcillas, y, como gelificantes lipófilos, se pueden citar las arcillas modificadas, como las bentonas, las sales metálicas de ácidos grasos como los estearatos de aluminio y la sílice hidrofóbica, la etilcelulosa y el polietileno.

La composición puede contener otros agentes activos hidrófilos, como proteínas o hidrolizados de proteínas, aminoácidos, polioles, ureas, alantoína, azúcares y derivados de azúcar, vitaminas hidrosolubles, extractos vegetales e hidroxiácidos.

Como agentes activos lipófilos, se pueden utilizar el retinol (vitamina A) y sus derivados, el tocoferol (vitamina E) y sus derivados, los ácidos grasos esenciales, las ceramidas, los aceites esenciales, el ácido salicílico y sus derivados.

Según la invención, la composición puede asociar al menos un extracto de al menos una Iridácea a otros agentes activos destinados especialmente a la prevención y/o al tratamiento de las afecciones cutáneas. Entre estos agentes activos, se pueden citar, a modo de ejemplo:

- los agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea, tales como el ácido retinoico y sus isómeros, el retinol y sus ésteres, la vitamina D y sus derivados, los estrógenos tales como el estradiol, el ácido kójico o la hidroquinona;

- los antibacterianos, tales como el fosfato de clindamicina, la eritromicina o los antibióticos de la clase de las tetraciclinas;

- los antiparasitarios, en particular el metronidazol, el crotamitón o los piretrinoides;

- los antifúngicos, en particular los compuestos pertenecientes a la clase de los imidazoles, tales como el econazol, el ketoconazol o el miconazol o sus sales; los compuestos poliénicos, tales como la anfotericina B; los compuestos de la familia de las alilaminas, tales como la terbinafina; o también el octopirox;

- los agentes antivíricos, tales como el aciclovir;

- los agentes antiinflamatorios esteroideos, tales como la hidrocortisona, el valerato de betametasona o el propionato de clobetasol, o los agentes antiinflamatorios no esteroideos, como, por ejemplo, el ibuprofeno y sus sales, el diclofenaco y sus sales, el ácido acetilsalicílico, el acetaminofeno o el ácido glicirrícico;

- los agentes anestésicos, tales como el clorhidrato de lidocaína y sus derivados;

- los agentes antipruriginosos, como la tenaldina, la trimeprazina o la ciproheptadina;

- los agentes queratolíticos, tales como los ácidos \alpha- y \beta-hidroxicarboxílicos o \beta-cetocarboxílicos, sus sales, amidas o ésteres y más particularmente los hidroxiácidos, tales como el ácido glicólico, el ácido láctico, el ácido salicílico, el ácido cítrico y, de forma general, los ácidos de frutas, y el ácido n-octanoil-5-salicílico;

- los agentes hidratantes, tales como el glicerol y sus derivados;

- los agentes anti-radicales libres, tales como el \alpha-tocoferol o sus ésteres, las superóxido dismutasas, ciertos quelantes de metales o el ácido ascórbico y sus ésteres;

- los antiseborreicos, tales como la progesterona;

- los antipelícula, como el octopirox o la piritiona de zinc;

- los antiacneicos, como el ácido retinoico o el peróxido de benzoílo, y

- los extractos de origen vegetal o bacteriano.

Así, según un modo particular, la composición según la invención contiene también al menos un agente seleccionado entre agentes antibacterianos, antiparasitarios, antifúngicos, antivíricos, antiinflamatorios, antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos, anti-radicales libres, antiseborreicos, antipelícula, antiacneicos y/o agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea.

Otro objeto de la invención es proponer un procedimiento de tratamiento cosmético para luchar contra los excesos de cohesión intercorneocitaria y, por lo tanto, para aumentar la descamación, procedimiento que consiste en aplicar sobre la piel una composición cosmética que contiene al menos un polipéptido de la invención.

La invención tiene también por objeto la utilización del polipéptido de la invención para preparar o purificar, eventualmente a partir de la epidermis, cualquier molécula, estructural o funcional, susceptible de unirse específicamente a dicho polipéptido aislado o a dichos fragmentos de proteolisis aislados o a dicho péptido sintético. Esta molécula puede especialmente corresponder a otras proteínas estructurales específicas de los corneodesmosomas y diversas enzimas de la capa córnea de tipo "proteasas", "glicosidasas" o "fosfatasas".

La invención tiene igualmente por objeto la utilización del polipéptido de la invención para preparar antisueros y anticuerpos monoclonales específicos, con vistas especialmente a purificar esta proteína y sus fragmentos. Por extensión, la invención tiene también por objeto cualquier utilización de dicho polipéptido para producir anticuerpos o fragmentos de anticuerpos recombinantes, sea cual sea el sistema biológico utilizado para producir estos últimos.

La figura 1 representa los perfiles de actividad de las proteasas contenidas en las muestras de proteínas del estrato córneo en presencia o en ausencia de cisteína.

La figura 2 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en función del pH.

La figura 3 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia del inhibidor E 64 (Proteolytic enzymes: a practical approach, R.J. Beyton y J.S. Bond, IRL Press, Oxford, 1989).

La figura 4 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia de leupeptina.

La figura 5 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia de quimostatina.

La figura 6 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia del inhibidor CA 074 (Inubushi y col., J. of Biochemistry, 116, 282-284, 1994).

La figura 7 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia de pepstatina.

La figura 8 representa los perfiles de actividad de las proteasas del pico G4 en presencia de un substrato peptídico preferencial de las catepsinas L.

\newpage

La figura 9 representa los perfiles obtenidos en experimentos de cromatofocalización para la determinación del punto isoeléctrico aparente.

Ejemplo Aislamiento y caracterización del polipéptido

Se obtienen las proteínas del estrato córneo por el procedimiento llamado de "raspado". Esta técnica no necesita fase de extracción con solvente orgánico y, por lo tanto, es susceptible de una menor destrucción de las actividades enzimáticas. Permite además obtener una buena calidad de material.

Se efectúa el raspado sobre la cara anterior de la pierna. Se lava la zona de extracción con 200 ml de un tampón constituido por 50 mM de tampón fosfato de sodio, pH 7, 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl y un 0,1% de Tritón X100, distribuido por medio de una bomba a un caudal constante de 100 ml/min. Se raspa entonces la zona superficialmente con el borde de un portaobjetos de microscopio.

Se recoge el líquido que contiene las células en un recipiente situado bajo la pierna. Se recicla el tampón así recogido en numerosos pases (15). Las muestras son luego agrupadas o no según el tipo de experimentación.

Se filtra primeramente la solución así obtenida por papel Whatman Nº 4, luego por filtro Millipore de 0,45 \mum y finalmente por filtro Millipore de 0,22 \mum. Se concentra esta solución aclarada hasta 12 ml por ultrafiltración tangencial con un umbral de corte de 10 kD a 4ºC con una contrapresión de 1 bar y un caudal de salida de filtrado de 2 ml/min. por medio del aparato K.BL™ y de las membranas Sartocon™ (SARTORIUS).

Para un individuo de piel sana, la concentración de proteínas extraídas por este método es del orden de 0,15 mg/ml para 12 ml finales con 15 pases para la técnica.

Separación de las proteínas

Se utiliza una columna Superdex G200 HR10/30™ (Pharmacia Biotech) para la separación de las proteínas con un campo de resolución que va de 600 kD a 10 kD. Esta técnica basada en la separación en función del peso molecular permite tener una primera estimación de los pesos moleculares de las proteínas.

El perfil cromatográfico obtenido muestra que los picos proteicos se sitúan mayoritariamente hacia los pesos moleculares bajos (20 a 40 kD).

Se utiliza entonces una columna más resolutiva. Se inyecta la muestra (250 \mul) en una columna de exclusión Superdex G75 HR10/30™ (Pharmacia Biotech) para la cual la separación óptima se sitúa para pesos moleculares de 70 kD a 3 kD.

La salida de la columna es recogida en una placa de 96 pocillos, a 4ºC, a razón de 150 \mul/pocillo, después de un tiempo de espera de 15 minutos tras la inyección (este último corresponde a un poco menos que el volumen muerto de la columna y deja un margen de seguridad para el caso de que el compuesto no sea absolutamente retenido), y un volumen muerto de 0,24 ml. El caudal de la bomba es de 0,5 ml/min., la longitud de onda de detección de 280 nm (Bomba serie 10: Perkin Elmer, Detector SP8450: Spectra Physics, Integrador LCI-100: Perkin Elmer, Colector de fracción modelo 201: Gilson).

Siendo reproducibles los perfiles cromatográficos obtenidos en diferentes inyecciones, se mezclan las fracciones obtenidas "pozo a pozo" con el fin de tener un volumen de trabajo de aproximadamente 800 \mul por fracción.

Se mantienen las diferentes fracciones en frío, en refrigerador o hielo machacado, con el fin de conservar las actividades enzimáticas.

Se determinan los pesos moleculares correspondientes a las diferentes fracciones por electroforesis en gel de poliacrilamida con un gradiente de acrilamida del 8-18%. Se diluyen las muestras a ¼ en un tampón de Laemmli modificado (Tris 0,0625 M, pH 6,8, 2% de SDS y sin DTT) y los depósitos son de 20 \mul. Se revelan las bandas proteicas por tinción con nitrato de plata según el protocolo de Pharmacia Biotech (kit: Silver Staining Plusone™).

Dosificación de las actividades proteásicas

Se efectúa una dosificación de las actividades proteásicas contenidas en las fracciones obtenidas por pase por la columna de exclusión Superdex G75 HR10/30™ por fluorimetría con ayuda del kit Enzcheck™ (Molecular Probes).

Este kit es un procedimiento rápido y simple de medición de las actividades proteásicas, sin fase de precipitación ni de separación, y está, por lo tanto, adaptado para una criba rápida de las actividades proteásicas de las diferentes fracciones. Este protocolo utiliza como substrato la BODIPYfl-Caséine™, que se vuelve fluorescente tras digestión enzimática. La fluorescencia así liberada es directamente proporcional a la actividad proteásica contenida en la muestra. Se mide la fluorescencia en el espectrofluorímetro LS50B, Perkin Elmer, con una longitud de onda de excitación de 485 nm (ranura de 2,5 nm), una longitud de onda de emisión de 535 nm (ranura de 8 nm) y un tiempo de integración de 1 segundo por pocillo.

Se efectúan las dosificaciones en presencia o en ausencia de cisteína a una concentración final 5 mM con el fin de evidenciar eventuales actividades de proteasas con cisteína.

En la figura 1 se muestran los resultados.

El perfil proteásico revela la existencia de un pico (G4) presente cuando el tampón contiene cisteína y ausente cuando el tampón no contiene cisteína. Este pico revela, pues, en las fracciones 34 a 47 la existencia de una proteasa cisteína-dependiente. Esta proteasa tiene un peso molecular del orden de 28 kD.

pH óptimo de actividad de las proteasas

Para caracterizar el pH óptimo de actividad de las proteasas del pico G4, se prepararon dos tampones, tales como los descritos en "Data for Biochemical Research" (Dawson y col., 3ª edición, Oxford Science Publications, 1990) para cubrir una gama de pH de 4,0 a 8,25:

tampón acetato 0,1 M, pH 4,0 a 5,75,

tampón fosfato 0,1 M, pH 5,75 a 8,25.

Todos los tampones contienen 5 mM de EDTA y un 0,1% de Tritón X100. Se miden las actividades cada 0,25 unidades de pH.

Se utiliza la técnica anterior de medición de la actividad proteásica con cada uno de los dos tampones en cada fracción.

En la figura 2 se muestran los resultados.

El pH óptimo de las proteasas extraídas del estrato córneo, que actúan sobre el substrato BODIPYfl-Caséine™, se sitúa en los pH ácidos, de 4,0 a 6,25.

Se obtuvo la actividad más fuerte para pH de entre 5,0 y 5,5 con el tampón acetato. El tampón acetato a pH 5,0 es, pues, el tampón utilizado después en los experimentos.

Caracterización de los picos de proteasas utilizando inhibidores

Con el fin de caracterizar mejor la proteasa cisteína-dependiente aislada anteriormente, se realizan pruebas de inhibición con inhibidores de proteasas conocidos.

Se efectúan las mediciones de forma idéntica a las mediciones anteriores en presencia de cisteína a una concentración final 5 mM y en presencia o ausencia (patrón) del inhibidor considerado.

Inhibidor E 64

E 64 es un inhibidor de las proteasas con cisteína y, en particular, de las catepsinas B, H y L (Proteolytic enzymes: a practical approach, R.J. Beyton y J.S. Bond, IRL Press, Oxford, 1989).

Se realiza la prueba a una concentración de inhibidor E64 1,4 \muM.

En la figura 3 se muestran los resultados.

El E64, a 1,4 \muM, inhibe en aproximadamente un 71% la actividad de la proteasa cisteína-dependiente del pico G4.

En cuanto a la especificidad de este inhibidor, G4 es una catepsina B, H o L.

Leupeptina

La leupeptina, a la dosis utilizada, es específica de las catepsinas B o L y no tiene efecto sobre las catepsinas H (Schwartz y col., 1980).

Se realiza la prueba a una concentración de 1 \muM de leupeptina.

En la figura 4 se muestran los resultados.

La leupeptina, a 1 \muM, en presencia de cisteína, reduce aproximadamente un 41% la actividad proteásica de G4.

G4 no es una catepsina H.

Quimostatina

La quimostatina es específica de las catepsinas L y es inactiva a la concentración utilizada sobre las catepsinas B (Inubushi y col., J. of Biochemistry, 116, 282-284 (1994).

Se realiza la prueba a una concentración de 2,5 \muM de quimostatina.

En la figura 5 se muestran los resultados.

Utilizada a 2,5 \muM, la quimostatina inhibe en más del 50% la proteasa cisteína-dependiente del pico G4.

G4 es una proteasa de tipo catepsina L.

Inhibidor CA 074

El inhibidor CA 074 inhibe específicamente las catepsinas B y no tiene acción sobre las catepsinas L (Inubushi y col., 1994).

Se realiza la prueba a una concentración de 1 \muM de quimostatina.

En la figura 6 se muestran los resultados.

El inhibidor CA 074 no afecta prácticamente al perfil de actividad de la proteasa cisteína-dependiente del pico G4.

G4 no es una proteasa de tipo catepsina B.

Pepstatina

La pepstatina es un inhibidor específico de las proteasas con ácido aspártico (Proteolytic enzymes: a practical approach, R.J. Beyton y J.S. Bond, IRL Press, Oxford, 1989).

Se realiza la prueba a una concentración de 1 \muM de pepstatina.

En la figura 7 se muestran los resultados.

La pepstatina no tiene acción sobre G4.

G4 no es una proteasa con ácido aspártico.

Utilización de un substrato específico de las catepsinas L [Z(Phe-Arg 2R110) (Assfalg-Machleidt y col. 1992)] para confirmar la caracterización de G4

Los resultados de identificación de G4, obtenidos por las diferentes pruebas inhibitorias, han sido verificados utilizando un substrato peptídico preferencial de las catepsinas L marcado con rodamina 110. Este substrato es 850 veces más sensible a la acción de las catepsinas L que a la de las catepsinas B.

En la figura 8, se presentan los resultados del balance de actividad de las proteasas en presencia de cisteína y del control sin cisteína substrato.

Los resultados muestran que la hidrólisis intensa del substrato peptídico específico se superpone perfectamente a la de la caseína, confirmando la naturaleza de catepsina L de G4.

Evaluación del punto isoeléctrico aparente de G4

Esta evaluación fue realizada por la técnica de cromatofocalización ("chromatofocusing"), tal como se describe en "Protein Purification", J-C. Janson y L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989, en las condiciones siguientes:

Columna: Mono PTM HR 5/20 de Pharmacia.

Muestra: extracto de SC humano equilibrado en un tampón Tris 0,075M/acetato, pH 9,3).

Tampón de elución: 10 ml de politampón 96/acetato, pH 6,0 ("Protein Purification", J-C. Janson y L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989).

Caudal: 1 ml/min.

Fracciones: 0,5 ml a partir de la inyección sobre 48 ml totales.

Detección: Actividades de catepsina L sobre Z(Phe-Arg)2R110 10 mM en tampón acetato 0,1M, pH 5,0, 0,1% de Tritón X100, 5 mM de EDTA, 5 mM de cisteína. Incubación de 10 \mul de fracción + 200 \mul de substrato a 37ºC durante 2 h 30 min. Lectura sobre Biolumin™ de Molecular Dynamics, donde el fotomultiplicador está regulado a 700 V, excitación: 485/10 nm, emisión: 520/10 nm.

En la figura 9 se presentan los resultados.

Estos resultados muestran un punto isoeléctrico aparente comprendido entre 6 y 9.

Evidenciación de la función probable de G4 en el proceso de descamación

La corneodesmosina es una proteína esencial del corneodesmosoma que se degrada con la descamación (Serre G. y col., J.I.D., 1991, 97(6), 1061-1072).

Se practica la prueba con corneodesmosina extraída del estrato córneo según la técnica desarrollada por Munerot C. (Informe de DEA, 1996, Universidad de Marne la Vallée).

Una inmunotransferencia realizada con corneodesmosina después de incubar con estrato córneo entero en presencia o ausencia de la proteasa del pico G4 muestra una degradación pronunciada de ésta.

La proteasa del pico G4 presente en el estrato córneo degrada la corneodesmosina.

El conjunto de los resultados de los ensayos practicados permite concluir que el polipéptido extraído del estrato córneo es una proteasa cisteína-dependiente de tipo catepsina L que tiene un peso molecular aparente de 28 kD y un punto isoeléctrico comprendido entre 6 y 9.

Claims (18)

1. Composición cosmética o farmacéutica que incluye, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido o al menos un fragmento de un polipéptido natural o sintético aislado, perteneciente a la familia de las proteasas con cisteína del tipo de las catepsinas L, que tiene un peso molecular aparente de 28 kilodaltons y un punto isoeléctrico comprendido entre 6 y 9, cuyo polipéptido puede ser aislado a partir de la capa córnea de la epidermis humana, caracterizada por el hecho de que dicho polipéptido y sus fragmentos intervienen en la disminución de la cohesión intercorneocitaria degradando la corneodesmosina.

2. Composición según la reivindicación anterior, caracterizada por el hecho de que la actividad del polipéptido es máxima a un pH comprendido entre 2 y 9, preferiblemente entre 3,5 y 6,5.

3. Composición caracterizada por incluir al menos un polipéptido constituido en parte por el polipéptido descrito en las reivindicaciones 1 a 2.

4. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por contener al menos un fragmento del polipéptido descrito en las reivindicaciones 1 a 2 obtenido por proteolisis o de forma sintética.

5. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por el hecho de que el polipéptido o el fragmento está en una cantidad comprendida entre el 0,00001% y el 50%, preferiblemente comprendida entre el 0,001% y el 10%, en peso con respecto al peso total de la composición.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por contener además al menos un activador de proteasas.

7. Composición según la reivindicación 6, caracterizada por seleccionar el activador de proteasas entre glicerol, urea y sus derivados, transglutaminasa, EDTA y agentes reductores.

8. Composición según la reivindicación 7, caracterizada por contener al menos un activador de proteasas que es un agente reductor en forma activa o en forma de su precursor, seleccionado entre sulfuros, tioles como el ditiotreitol o el tritiohexitol, cisteína, N-acetilcisteína, proteínas o hidrolizados de proteínas ricas en cisteína, mercaptoetanol, tioglicerol, ácidos tioalcanoicos y ácidos mercaptocarboxílicos y sus análogos, ácido mercaptosuccínico, ácido tioláctico, ácido tioglicólico y sus sales, coenzima A, glutatión reducido (GSH) o carboxilato de oxotiazolidina.

9. Composición según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada por el hecho de que el activador de proteasas está en una cantidad del 0,00001% al 15%, preferiblemente del 0,001% al 10%, en peso con respecto al peso total de la composición.

10. Utilización de un polipéptido o de al menos un fragmento de un polipéptido natural o sintético aislado perteneciente a la familia de las proteasas con cisteína del tipo de las catepsinas L, que tiene un peso molecular aparente de 28 kilodaltons, para la preparación de una composición cosmética según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada por destinar la composición a su aplicación a la piel para luchar contra los excesos de la cohesión intercorneocitaria o para favorecer la descamación.

11. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 9, destinada a tratar los trastornos de la descamación.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, destinada a tratar la hiperqueratosis.

13. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, destinada a tratar la xerosis, las ictiosis, la psoriasis, las lesiones tumorales benignas o malignas o las queratosis reactivas.

14. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, destinada a tratar la leucoqueratosis del cuello uterino en el curso del prolapso, las leucoqueratosis bucales o también las lesiones tumorales benignas queratósicas de las mucosas malpighianas.

15. Polipéptido natural o sintético aislado perteneciente a la familia de las proteasas con cisteína del tipo de las catepsinas L, que tiene un peso molecular aparente de 28 kilodaltons, tal como se describe en una composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por ser susceptible de ser aislado del estrato córneo humano y por tener un punto isoeléctrico comprendido entre 6 y 9.

16. Utilización del polipéptido aislado o de sus fragmentos según se describe en las reivindicaciones 1 a 15 para preparar o purificar cualquier molécula susceptible de unirse específicamente a dicho polipéptido aislado o a dichos fragmentos de proteolisis aislados o a dicho péptido sintético.

17. Utilización según la reivindicación anterior para preparar o purificar proteínas estructurales específicas de los corneodesmosomas.

18. Utilización del polipéptido aislado tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 4 ó 15 para preparar o purificar antisueros o anticuerpos monoclonales específicos.