DE69823935T2

DE69823935T2 - Aus dem Epidermis isolierte Polypeptide und Verwendung davon

Info

Publication number: DE69823935T2
Application number: DE69823935T
Authority: DE
Inventors: Dominique Bernard; Michel Kermici; Marie-Alix Bernard-Bourboulon
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2018-08-12
Also published as: DE69823935D1; DK0899330T3; JP3819603B2; US20020006654A1; US6737055B2; CA2243633C; FR2767833B1; US6274364B1; FR2767833A1; EP0899330A1; CA2243633A1; EP0899330B1; ATE267249T1; ES2221133T3; JPH11139933A

Description

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, ein Gemisch von Polypeptiden, das bei der Proteolyse des isolierten Polypeptids entsteht, Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung, das dafür vorgesehen ist, die interkorneocytäre Kohäsion zu verringern und so die Abschuppung zu fördern.
Die Haut bildet eine physikalische Barriere zwischen dem Ďrganismus und seiner Umgebung. Sie besteht aus zwei Geweben: der Epidermis und der Dermis.
Die Dermis bildet für die Epidermis einen festen Träger. Sie ist für die Epidermis auch der Bestandteil, der für die Versorgung mit Nährstoffen sorgt. Sie besteht hauptsächlich aus Fibroblasten und einer extrazellulären Matrix, die wiederum im wesentlichen aus Kollagen, Elastin und einer Substanz, die als Grundsubstanz bezeichnet wird, besteht, wobei diese Bestandteile von den Fibroblasten synthetisiert werden. Man findet hier auch Leukozyten, Mastozyten oder auch Gewebsmakrophagen. Sie besteht auch aus Blutgefäßen und Nervenfasern.
Die Epidermis ist ein abschuppendes mehrschichtiges Epithel mit einer mittleren Dicke von 100 μm, und sie ist herkömmlicher Weise in die folgenden Schichten unterteilt: eine Basalschicht von Keratinocyten, die die Keimschicht der Epidermis bildet, eine als Stachelzellschicht bezeichnete Schicht, die aus mehreren Schichten polyedrischer Zellen besteht, die auf der Keimschicht angeordnet sind, eine als Körnerschicht (Stratum granulosum) bezeichnete Schicht, die aus abgeflachten Zellen besteht, die deutlich begrenzte cytoplasmatische Einschlüsse enthalten, die Keratohyalinkörper, und schließlich eine oberste Schicht, die als Hornschicht (oder Stratum corneum) bezeichnet wird, die aus Keratinocyten im Endstadium ihrer Differen zierung besteht, die als Korneocyten (Hornzellen) bezeichnet werden. Hierbei handelt es sich um abgestorbene, kernlose Zellen, die von den Keratinocyten abstammen.
Die Korneocyten bestehen hauptsächlich aus einer faserigen Matrix, die Cytokeratine enthält, die von einer sehr widerstandsfähigen, 15 nm dicken Struktur umgeben ist, die als Hornhülle oder verhornte Hülle bezeichnet wird. Die Stapelung dieser Korneocyten bildet die Hornschicht, die für die Barrierefunktion der Epidermis verantwortlich ist.
Das Stratum corneum verfügt über eine selektive Permeabilität, die dadurch, dass sie den Wasserverlust kontrolliert, eine physiologische Hydratisierung der Haut gewährleistet. Es bildet außerdem eine Barriere gegen schädliche Einflüsse aus der Umwelt unabhängig davon, ob diese chemischer oder physikalischer Natur sind.
Das Stratum corneum besteht aus zwei Teilen:

– dem Stratum corneum compactum, dessen Zellorganisation einer säulenförmigen Stapelung von Korneocyten oberhalb der Körnerzellen entspricht, aus denen sie hervorgehen. Jeder Korneocyt weist eine maximale Bedeckung mit darüber und darunter liegenden Korneocyten auf;
– dem Stratum disjunctum, das aus den letzten fest miteinander verbundenen Korneocyten der Hornschicht besteht, die eine geringere Kohäsion aufweisen als die obigen Korneocyten, und das der Ďrt der Abschuppung der Korneocyten ist.

Im Stratum corneum ist der interkorneocytäre Zwischenraum mit Lipidblättchen ausgefüllt, die von Lamellarkörpern stammen.
Die Differenzierung der Epidermis stellt einen kontinuierlichen und gerichteten Reifungsprozeß dar, der ausgehend von den Keratinocyten der Basalschicht zur Bildung von Korneocyten führt, bei denen es sich um vollständig keratinisierte tote Zellen handelt. Diese Differen zierung ist das Ergebnis perfekt koordinierter Prozesse, die zur Beibehaltung einer konstanten Dicke der Epidermis führen und so die Homöostase der Epidermis gewährleisten. Diese wird durch eine Regulierung der Zahl der Zellen, die in den Differenzierungsprozeß eintreten, und der Zahl der Zellen, die abgeschuppt werden, erreicht. Im Laufe der normalen Abschuppung werden nur die der Ďberfläche am nächsten liegenden Korneocyten von der Ďberfläche der Epidermis abgeschilfert.
Von der Basalschicht bis zur Körnerschicht wird die Kohäsion durch das transzelluläre Netzwerk gewährleistet, das aus den Desmosomen und den intermediären Cytokeratinfilamenten gebildet wird. Dieses Netzwerk ist durch Hemidesmosomen auf der Basalmembran verankert.
In der Hornschicht wird die Kohäsion durch interzelluläre Strukturen gewährleistet, die von Desmosomen abstammen, die als Korneosomen oder Korneodesmosomen bezeichnet werden, die die Hornhüllen der Korneocyten verfestigen. In der Epidermis (nicht der palmoplantaren Epidermis) sind die Korneodesmosomen im unteren Teil der Hornschicht auf der gesamten Korneocytenoberfläche vorhanden, aber nur die peripheren Korneodesmosomen bleiben im oberen Teil erhalten.
Vor kurzem durchgeführte Untersuchungen haben die große Bedeutung der Korneodesmosomen für die interkorneocytäre Kohäsion (d. h. für den Zusammenhalt) sowie für die Abschuppung gezeigt. Es gibt insbesondere einen engen Zusammenhang zwischen dem Ablösen der Zellen voneinander und der Proteolyse bestimmter Bestandteile der Korneodesmosomen, wie von Desmoglein-1.
Durch die Untersuchung der Abschuppung kann die Existenz einer komplexen biochemischen Regulierung bis in die als "tote" Schichten bezeichneten Schichten der Epidermis nachgewiesen werden. Es sind Enzyme, die in den tieferen lebenden Schichten erzeugt werden, die nacheinander und ergänzend wirken und dadurch zur endgültigen Abschilferung der Korneocyten von der Hautoberfläche führen.
Die wesentlichen Enzyme, von denen angenommen wird, dass sie an der Abschuppung beteiligt sind, werden seit kurzem beschrieben. Sie gehören zu zwei Familien von Enzymen: den Glykosidasen und den Proteasen. Die Proteasen können nicht alleine wirken, und eine vorherige Einwirkung von Glykosidasen, bei der Proteolysestellen demaskiert werden, scheint erforderlich zu sein.
Die Proteasen stellen den Typ von Enzymen dar, der wahrscheinlich bei der Abschuppung die größte Bedeutung hat. Sie werden in vier Familien unterteilt:

– die Aspartat-Proteasen, die in ihrem aktiven Zentrum einen Asparaginsäure-Rest enthalten,
– die Serin-Proteasen, die in ihrem aktiven Zentrum einen Serin-Rest enthalten,
– die Cystein-Proteasen, die in ihrem aktiven Zentrum einen Cystein-Rest enthalten,
– die Metalloproteasen, die in ihrem aktiven Zentrum meistens ein Zinkatom oder manchmal ein Calciumatom enthalten.

Unter diesen Proteasen stellen die Cystein-Proteasen lysosomaler Herkunft (Kathepsin B, H und L) zweifelsfrei die aktivsten Proteasen im menschlichen Körper dar. Diese Enzyme sind an der täglichen Erneuerung der Proteine eines Menschen beteiligt (200 bis 300 g für einen Menschen, der 70 kg wiegt).
In diesem Zusammenhang werden in dem Patent Nr. WĎ 95/07686 zwei Cystein-Proteasen mit einem apparenten Molekulargewicht von 34 und 35 Kilodalton beschrieben.
Zahlreiche Hautkrankheiten sind durch die Erzeugung einer verdickten Hornschicht und durch eine anomale Abschuppung, d. h. eine Hyperkeratose, gekennzeichnet. Diese kann in allen anatomischen Bereichen der Haut und in sehr unterschiedlichen klinischen Zusammenhängen auftreten. Ihre physiopathologische Grundlage und ihre Ursache sind verschiedenartig.
Beispielhaft können angegeben werden:

– die Xerose (oder Hauttrockenheit),
– die Ichthyosen,
– die Psoriasis,
– bestimmte gutartige oder bösartige Tumorläsionen,
– die als Reaktion auftretenden Hyperkeratosen.

Andere Krankheiten sind durch eine Transdifferenzierung oder Metaplasie im Bereich der Schleimhäute, die gegebenenfalls Schleimhäute vom Malpighi-Typ sind, die normalerweise aber nicht verhornt sind, dann aber verhornen, d. h. sich mit einem anomalen Epithel überziehen, das an seiner Ďberfläche eine Hornschicht bildet, gekennzeichnet. Ďbwohl die Schleimhäute im Genitalbereich und die Schleimhäute der oberen Luft- und Speisewege am häufigsten betroffen sind, können diese Metaplasien auch an verschiedenen anderen anatomischen Stellen vorkommen.
Beispielhaft können angegeben werden:

– die Leukokeratose des Gebärmutterhalses im Laufe des Gebärmuttervorfalls,
– die buccalen Leukokeratosen,
– die gutartigen Keratotumorläsionen der Malpighi-Schleimhäute.

Ďhne sich auf irgendeine theoretische Grundlage der Erfindung festlegen zu wollen, ist es möglich sich vorzustellen, dass diese Krankheiten mit einem qualitativen oder quantitativen Mangel an Enzymen zusammenhängen, von denen vermutet wird, dass sie an der Abschuppung beteiligt sind, darunter insbesondere die Proteasen.
Die Reinigung neuer Polypeptide und das Wissen über neue Polypeptide, die an der interkorneocytären Kohäsion beteiligt sind, insbesondere von Proteasen, stellt einen der Wege dar, der die Entwicklung neuer Produkte ermöglichen könnte, die dafür vorgesehen sind, die Auswirkungen eines Überschusses oder eines Mangels an Polypeptiden, insbesondere an Proteasen, hauptsächlich auf der Ďberfläche der Haut oder der Schleimhäute zu bekämpfen.
Es ist daher eine der Aufgaben der Erfindung, ein Polypeptid, das an der interkorneocytären Kohäsion beteiligt ist, in isolierter Form bereitzustellen.
Nach langwierigen und schwierigen Arbeiten hat die Anmelderin in der menschlichen Epidermis unter Anwendung von biochemischen Techniken ein Polypeptid nachgewiesen und daraus isoliert und gereinigt, das an der interkorneocytären Kohäsion beteiligt ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein isoliertes Polypeptid, das zur Familie der Cystein-Proteasen vom Kathepsin-L-Typ gehört, das ein apparentes Molekulargewicht von 28 Kilodalton und einen apparenten isoelektrischen Punkt, der im Bereich von 6 bis 9 liegt, aufweist.
Unter apparentem Molekulargewicht wird das Molekulargewicht verstanden, das für das Polypeptid durch Vergleich seiner elektrophoretischen Beweglichkeit mit der elektrophoretischen Beweglichkeit von Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht auf einem Polyacrylamid/Natriumdodecylsulfat-Gel oder durch Vergleich des Elutionsvolumens des Polypeptids mit dem Elutionsvolumen von Standardproteinen mit bekanntem Molekulargewicht bei Durchführung einer Ausschlußchromatographie (nach den Techniken, die in "Protein Purification", J.-C. Janson und L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989) erhalten wird.
Unter apparentem isolektrischem Punkt wird der isoelektrische Punkt verstanden, der für das Polypeptid erhalten wird durch Vergleich mit dem isoelektrischen Punkt, der für Standardproteine mit bekanntem isoelektrischem Punkt in Chromatofokussierungsexperimenten (chromatofocusing) erhalten wird, die in "Protein Purification", J.-C. Janson und L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y. 1989, beschrieben werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann natürlicher oder synthetischer Herkunft sein.
Unter synthetischem Polypeptid wird hier jedes Polypeptid verstanden, das chemisch oder durch Erzeugung in einem Ďrganismus nach Einbringen der für diese Erzeugung erforderlichen Elemente in diesen Ďrganismus erhalten wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann von beliebiger Herkunft sein, nämlich tierischer Herkunft, insbesondere kann es von Säugetieren und noch bevorzugter vom Menschen stammen, oder pflanzlicher Herkunft, oder es kann aus Mikroorganismen (unter anderem aus Viren, Phagen, Bakterien) oder auch von Pilzen stammen, ohne dass damit festgelegt ist, ob es in dem Ďrganismus, aus dem es stammt, natürlich vorkommt oder nicht.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist vorzugsweise natürlicher Herkunft und wird aus Geweben von Säugetieren, insbesondere aus der Haut von Säugetieren, isoliert.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise aus menschlicher Haut und noch bevorzugter aus menschlicher Epidermis isoliert.
Wie weiter oben angegeben wurde, ist die interkorneocytäre Kohäsion offensichtlich unter anderem auf das Vorhandensein spezieller Polypeptide in den Strukturen, die am interkorneocytären Zusammenhalt beteiligt sind, in der Hornschicht zurückzuführen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist in der Hornschicht vorhanden, und es spielt eine Rolle bei der Abnahme der interkorneocytären Kohäsion, indem es die Strukturen abbaut, die am interkorneocytären Zusammenhalt beteiligt sind, insbesondere die Korneodesmosomen.
Es ist im übrigen bekannt, dass die Polypeptide und insbesondere die Enzyme, demnach auch die Proteasen, in einer Form vorliegen können, die als reife Form bezeichnet wird, die einer Primärsequenz von Aminosäuren entspricht, die mit ihrer Aktivität kompatibel ist. Man weiß jedoch, dass diese Polypeptide häufig durch eine Reifung aus größeren Polypeptiden entstehen, nämlich den Vorläuferpolypeptiden, die in ihrer Primärsequenz von Aminosäuren die Primärsequenz des reifen Polypeptids enthalten. Gleiches kann auf das erfindungsgemäße Polypeptid zutreffen.
Gegenstand der Erfindung ist daher auch jedes Polypeptid, das zum Teil aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid besteht.
Es ist ebenfalls bekannt, dass es nach der Translation zu einer Veränderung der Polypeptide kommen kann, wie der Bildung von Disulfid-Bindungen, spezifischen proteolytischen Spaltungen, der Addition von Kohlenhydraten (Glykosylierung), der Phosphorylierung, insbesondere im Bereich der Serin-, und/oder Threonin- und/oder Tyrosin-Reste, und/oder der Kombination mit Lipiden.
Die Erfindung betrifft demnach ganz besonders das erfindungsgemäße Polypeptid, das oder das nicht Veränderungen unterzogen worden ist, die sich nach der Translation ereignen können.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann einer oder mehreren der Veränderungen unterzogen worden sein, die sich nach der Translation ereignen können.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist vorzugsweise glykosyliert und/oder phosphoryliert.
Das erfindungsgemäße Polypeptid weist ein apparentes Molekulargewicht von 28 Kilodalton auf.
Es ist wohlbekannt, dass die Enzyme im Allgemeinen und die Proteasen im besonderen eine maximale Aktivität in Medien mit definiertem pH-Wert aufweisen.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist dadurch gekennzeichnet, dass es bei einem pH-Wert, der im Bereich von 2 bis 9 und vorzugsweise 3, 5 bis 6, 5 liegt, seine maximale Aktivität hat.
Beispielsweise liegt die maximale Aktivität des Polypeptids gegenüber Casein bei einem pH-Wert, der im Bereich von 4,6 bis 5,6 liegt.
Es ist ferner bekannt, dass die Primärsequenz der Aminosäuren eines Polypeptids Stellen festlegt, die spezifisch von Proteasen erkannt werden, die, sobald diese Stellen erkannt worden sind, mit oder ohne Fixierung an dem Polypeptid seine proteolytische Spaltung hervorrufen.
Die Erfindung betrifft demnach auch mindestens ein durch Proteolyse entstandenes Fragment des erfindungsgemäßen Polypeptids.
Hieraus folgt, dass im folgenden Text und solange nichts anderes angegeben ist, unter Polypeptid das erfindungsgemäße natürliche oder synthetische Polypeptid oder mindestens eines seiner Fragmente unabhängig davon, ob dieses durch Proteolyse oder synthetisch erhalten wird, zu verstehen ist.
Die interkorneocytäre Kohäsion ist offensichtlich auf das Vorhandensein spezifischer Polypeptide in Strukturen in der Hornschicht zurückzuführen, die am interkorneocytären Zusammenhalt beteiligt sind. Man hat gesehen, dass bestimmte Hyperkeratose-Erkrankungen mit einer übermäßig starken interkorneocytären Kohäsion zusammenhängen könnten.
Die Anmelderin konnte zeigen, dass das erfindungsgemäße Polypeptid an den Prozessen im Zusammenhang mit der Zerstörung der Strukturen, die für den interkorneocytären Zusammenhalt und demnach die interkorneocytären Kohäsion von Bedeutung sind, beteiligt ist. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann demnach in kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die dafür vorgesehen sind, die interkorneocytäre Kohäsion zu verringern und so die Abschuppung zu fördern.
Gegenstand der Erfindung sind demnach weiterhin kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens ein wie weiter oben definiertes Polypeptid enthalten.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden vorzugsweise auf die Haut oder die Schleimhäute aufgetragen.
Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, die für die Behandlung von Störungen der Abschuppung, wie Hyperkeratosen, zum Beispiel der Xeroxe (oder Hauttrockenheit), der Ichthyosen, der Psoriasis, der Hyperkeratose bestimmter gutartiger oder bösartiger Tumorläsionen, der als Reaktion auftretenden Keratosen, vorgesehen ist.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält, die für die Behandlung von Krankheiten vorgesehen ist, die durch eine Transdifferenzierung oder Metaplasie im Bereich der Schleimhäute, die gegebenenfalls Malpighi-Schleimhäute sind, gekennzeichnet sind, die normalerweise nicht verhornt sind, die aber verhornen, wie z. B. der Leukokeratose des Gebärmutterhalses im Laufe eines Gebärmuttervorfalls, der buccalen Leukokeratosen oder auch der gutartigen oder bösartigen, mit einer Hyperkeratose einhergehenden Tumorläsionen der Malpighi-Schleimhäute.
Die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltene Menge an Polypeptid hängt selbstverständlich von der gewünschten Wirkung ab und kann demnach über einen großen Bereich variiert werden.
Um eine Größenordnung anzugeben, kann die Zusammensetzung das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Menge, die im Bereich von 0,00001 bis 50% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt, und vorzugsweise in einer Menge, die im Bereich von 0,001 bis 10% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt, und noch bevorzugter in einer Menge, die im Bereich von 0,1 bis 1% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt, enthalten.
Im Stand der Technik werden bestimmte Verbindungen als Aktivatoren der Protease beschrieben.
Man kennt beispielsweise die günstige Wirkung von Glycerin auf die Xerosen, eine Wirkung, die durch eine aktivierende Wirkung auf enzymatische Systeme erklärt wird, die auf seine hydratisierende Wirkung zurückzuführen ist, durch die es die Einwirkung der Proteasen, die die Korneodesmosomen abbauen, und dadurch die Abschuppung fördert (Patent Nr. WĎ 95/07687).
Vom Harnstoff und seinen Derivaten weiß man auch seit langer Zeit, dass sie den Ďberflächenzustand von sehr trockener Haut und sogar von Haut, die Ichthyosen aufweist, verbessern (Swanbeck, Acta Dermatologica and Venereologica, 1968, 48, 123–127). Wiederanders et coll. (Biomedical Biochemistry Acta, 1986, 45 (11–12), 1477–1483) haben gezeigt, dass ein Kathepsin, das aus Fisch extrahiert wurde, in Gegenwart von Harnstoff eine größere Aktivität zeigt. Diesen Autoren gelingt es so, Kathepsin L und D spezifisch zu dosieren, deren Aktivität in Gegenwart von Harnstoff um einen Faktor 2, 5 bzw. 6 vergrößert wird.
Reduktionsmittel werden ebenfalls als Aktivatoren von Proteasen beschrieben. Es werden beispielhaft die Sulfide, die Thiole, wie Dithiothreit oder Trithiohexit, Cystein, N-Acetylcystein, die Cystein-reichen Proteine oder Proteinhydrolysate, Mercaptoethanol, Thioglycerin, die Thioalkansäuren und die Mercaptocarbonsäuren und ihren Analoga, wie z. B. Mercaptobernsteinsäure, Thiomilchsäure, Thioglykolsäure und ihre Salze, Coenzym A und auch reduziertes Glutathion (GSH) angegeben.
Diese Reduktionsmittel können in der Zusammensetzung in ihrer aktiven Form oder in Form ihres Vorläufers vorliegen, wie z. B. Ďxothiazolidincarboxylat, bei dem es sich um einen Vorläufer von Cysteinen handelt.
Von Ethylendiamintetraacetat (EDTA) weiß man, dass es die Inaktivierung der Proteasen, insbesondere vom Kathepsin-Typ, durch Schwermetalle verhindert. In dieser Eigenschaft wird EDTA als Aktivator der Protease angesehen.
Ferner kann man die Transglutaminasen den Aktivatoren von Proteasen zurechnen. Diese Enzyme gehören zur Familie der Transpeptidasen. Sie sind Calcium-abhängig und katalysieren die Bildung der isopeptidischen ε-(γ-Glutamyl)-Lysin-Brücken: Reaktion der Carboxygruppe (am γ-Kohlenstoff) des Glutaminrests mit der Aminogruppe eines Lysinrests oder eines Polyamins. Die Transglutaminasen kommen in zwei Hauptformen in der Epidermis vor: als Transglutaminase E (oder epidermale Transglutaminase) im Zytosol mit einer Molmasse von 50–56 kD, zu der es einen Vorläufer mit einer Molmasse von 70 kD gibt, und als Transaminase K oder Typ I in der Membran mit einer Molmasse von 92 kD.
Die Transglutaminasen E und K sind beide an der Bildung der Hornumhüllung durch Brückenbildung zwischen zahlreichen Proteine beteiligt, von denen die wesentlichen das Involucrin, das Loricrin, das Elafin, die Cystatine, die Pancornuline (oder SPR: Small Proline Rich), Cytokeratine, die Desmoplakine I und II, Desmogleine und das Korneodesmosin sind.
Die Cystatine sind Proteine, die eine hemmende Wirkung auf Cystein-Proteasen haben (Takahashi et coll. FEBS Letters, 1990, 2, 261–264) Wenn man also die Aktivität der Transglutaminasen erhöht, entweder durch die Zufuhr eines Aktivators der Transglutaminase oder durch die direkte Zufuhr von Transglutaminase, erhöht man so die Menge an Proteinen, die die Hornhülle ausbilden, die durch die Bildung der Hornhülle unter dem Einfluss der Transglutaminase verbraucht werden. Man entzieht also dem Stratum corneum seine endogenen Proteine, darunter insbesondere die Cystatine. Das Verschwinden der Cystatine aus der Epidermis und insbesondere aus dem Stratum corneum führt also zur Freisetzung der Cystein-Proteasen, deren Aktivität dadurch erhöht wird, was eine Verringerung der interkorneocytären Kohäsion und demnach eine Förderung der Abschuppung zur Folge hat.
Gegenstand der Erfindung ist demnach auch eine kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid und außerdem mindestens einen Aktivator der Protease enthält.
Von den Aktivatoren der Protease können Glycerin, Harnstoff, EDTA, die Transglutaminase, die Reduktionsmittel angegeben werden.
Die Menge an Aktivator der Protease, die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten ist, hängt selbstverständlich von der gewünschten Wirkung ab und kann demnach über einen großen Bereich variieren.
Um eine Größenordnung anzugeben kann die Zusammensetzung den Aktivator der Protease in einer Menge, die im Bereich von 0,00001 bis 15% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt, und vorzugsweise in einer Menge, die im Bereich von 0,001 bis 10% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung liegt, enthalten.
In der Zusammensetzung können die Aktivatoren der Protease einzeln oder im Gemisch enthalten sein.
Wie auch immer ihre Beschaffenheit ist, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eingenommen, injiziert oder auf die Haut (auf alle Hautbereiche des Körpers) oder die Schleimhäute (der Mundhöhle, des Jochbeins, des Zahnfleischs, des Genitalbereich, der Bindehaut, ...) aufgetragen werden.
Je nach der Art der Verabreichung können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in allen normalerweise verwendeten galenischen Formen vorliegen.
Für eine topische Anwendung auf der Haut kann die Zusammensetzung insbesondere in Form einer wässrigen oder öligen Lösung oder in Form einer Dispersion vom Typ der Lotionen oder Sera, in Form von Emulsionen mit flüssiger oder halbflüssiger Konsistenz vom Milchtyp, die durch Verteilen einer Fettphase in einer wässrigen Phase (O/W) oder umgekehrt (W/Ď) hergestellt werden, oder in Form von Suspensionen oder Emulsionen mit weicher Konsistenz vom Typ der Cremes oder der wässrigen oder wasserfreien Gele oder auch in Form von Mikrokapseln oder Mikropartikeln oder in Form von Vesikeldispersionen vom ionischen und/oder nicht-ionischen Typ oder in Form von Schäumen oder auch in Form von Zusammensetzungen für Aerosole, die dann auch ein unter Druck stehendes Treibmittel enthalten, vorliegen. Diese Zusammensetzungen werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt.
Für die Injektion kann die Zusammensetzung in Form einer wäßrigen, öligen Lotion oder in Form eines Serums vorliegen. Für die Augen kann sie in Form von Tropfen vorliegen, und für die Einnahme kann sie in Form von Kapseln, Granulaten, Sirups oder Tabletten vorliegen.
Die Mengen der verschiedenen Bestandteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entsprechen den herkömmlicherweise auf den betreffenden Gebieten verwendeten Mengen.
Die Zusammensetzungen stellen insbesondere dar: Reinigungs-, Schutz-, Behandlungs- oder Pflegecremes für das Gesicht, die Hände, die Füße, die großen anatomischen Hautfalten oder den Körper (z. B. Tagescremes, Nachtcremes, Abschminkcremes, Make-up-Cremes, Sonnenschutzcremes), flüssige Make-ups, Abschminkmilche, schützende oder pflegende Körpermilche, Sonnenschutzmilche, After-sun-Milche, Lotionen, Gele oder Schäume für die Pflege der Haut, wie Reinigungslotionen, Sonnenschutzlotionen, After-sun-Lotionen, Lotionen für die künstliche Bräunung, Zusammensetzungen für das Bad, desodorierende Zusammensetzungen, die ein bakterizides Mittel enthalten, After-shave-Gele oder -Lotionen, Enthaarungscremes, Zusammensetzungen gegen Insektenstiche, schmerzlindernde Zusammensetzungen, Zusammensetzungen für die Behandlung bestimmter Erkrankungen der Haut, wie Exzeme, Rosacea, Psoriasis, Schuppenflechte, heftiger Juckreiz, Ichthyose.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können außerdem aus festen Zubereitungen bestehen, die Seifen oder Reinigungsstücke bilden.
Die Zusammensetzungen können auch in Form einer Zusammensetzung für die Aerosolerzeugung verpackt sein, die außerdem ein unter Druck stehendes Treibmittel enthält.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auch eine Zusammensetzung für die Pflege der Kopfhaut und insbesondere ein Haarwaschmittel, eine Lotion für die Erzeugung einer Wasserwelle, eine Behandlungslotion, eine Frisiercreme oder ein Frisiergel, eine Zusammensetzung für die Haarfärbung (insbesondere die oxidative Färbung), gegebenenfalls in Form von färbenden Haarwaschmitteln, restrukturierenden Lotionen für die Haare, eine Zusammensetzung für die permanente Verformung (insbesondere eine Zusammensetzung für die erstmalige permanente Verformung), eine Lotion oder ein Gel gegen Haarausfall, ein Haarwaschmittel zur Beseitigung von Parasiten, eine Zusammensetzung gegen Schuppen, etc., sein.
Die Zusammensetzung kann außerdem eine Zusammensetzung für die buccal-dentale Verwendung sein, beispielsweise eine Zahnpasta. In diesem Fall kann die Zusammensetzung herkömmliche Hilfsstoffe und Additive für Zusammensetzungen für die buccale Verwendung und insbesondere grenzflächenaktive Stoffe, Verdickungsmittel, Feuchthaltemittel, Poliermittel, wie Kieselsäure, verschiedene Wirkstoffe, wie Fluoride, insbesondere Natriumfluorid, und gegebenenfalls Süßungsmittel, wie Natriumsaccharinat, enthalten.
Wenn die Zusammensetzung eine Emulsion ist, kann der Anteil der Fettphase im Bereich von 5 bis 80 Gew.-% und vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, liegen. Die Öle, die Wachse, die Emulgatoren und die Coemulgatoren, die in der Zusammensetzung in Emulsionsform verwendet werden, werden unter den Substanzen ausgewählt, die herkömmlicherweise auf kosmetischem Gebiet verwendet werden. Der Emulgator und der Coemulgator sind in der Zusammensetzung in einem Anteil enthalten, der im Bereich von 0,3 bis 30 Gew.-% und vorzugsweise 0,5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, liegt. Die Emulsion kann außerdem Lipidvesikel enthalten.
Wenn die Zusammensetzung eine Lösung oder ein öliges Gel ist, kann die Fettphase mehr als 90% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung ausmachen.
Die kosmetische Zusammensetzung kann in bekannter Weise außerdem Zusatzstoffe, die auf dem Gebiet der Kosmetik üblich sind, enthalten, wie hydrophile oder lipophile Gelbildner, hydrophile oder lipophile Additive, Konservierungsmittel, Antioxidantien, Lösemittel, Parfüms, Füllstoffe, Filter, Geruchsabsorber und Farbmittel. Die Mengen dieser verschiedenen Zusatzstoffe entsprechen den herkömmlicherweise auf dem Gebiet der Kosmetik verwendeten Mengen, beispielsweise 0,01 bis 10% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung. Diese Zusatzstoffe können je nach ihrer Beschaffenheit in die Fettphase, die wäßrige Phase und/oder die Lipidkügelchen eingebracht werden.
Als erfindungsgemäß verwendbare Öle oder Wachse können die Mineralöle (Vaselineöl), die pflanzlichen Öle (flüssige Fraktion von Sheabutter, Sonnenblumenöl), die tierischen Öle (Perhydrosqualen), die synthetischen Öle (Purcellinöl), die Siliconöle oder Siliconwachse (Cyclometicon) und die fluorierten Öle (Perfluorpolyether), Bienenwachs, Carnaubawachs oder Paraffinwachs angegeben werden. Zu diesen Ölen können Fettalkohole und Fettsäuren (Stearinsäure) gegeben werden. Als erfindungsgemäß verwendbare Emulgatoren können beispielsweise Glycerinstearat, Polysorbat 60 und das PEG-6/PEG-32/Glykolstearat, das unter der Bezeichnung Tefose^® 63 von der Firma Gattefosse im Handel erhältlich ist, angegeben werden.
Als erfindungsgemäß verwendbare Lösemittel können die niederen Alkohole, insbesondere Ethanol und Isopropanol, Propylenglykol, angegeben werden.
Als erfindungsgemäß verwendbare hydrophile Gelbildner können die Carboxyvinylpolymere (Carbomer), die Acrylcopolymere, wie die Acrylat/Alkylacrylat-Copolymere, die Polyacrylamide, die Polysaccharide, wie Hydroxypropylcellulose, die natürlichen Gummen und die Tone, angegeben werden, und als lipophile Gelbildner können die modifizierten Tone, wie die Bentone, die Metallsalze von Fettsäuren, wie die Aluminiumstearate, und die hydrophobe Kieselsäure, Ethylcellulose, Polyethylen angegeben werden.
Die Zusammensetzung kann andere hydrophile Wirkstoffe enthalten, wie Proteine oder Proteinhydrolysate, Aminosäuren, Polyole, Harnstoff, Allantoin, Zucker und Zuckerderivate, wasserlösliche Vitamine, Pflanzenextrakte und Hydroxysäuren.
Als lipophile Wirkstoffe können Retinol (Vitamin A) und seine Derivate, Tocopherol (Vitamin E) und seine Derivate, die essentiellen Fettsäuren, die Ceramide, die etherischen Öle, Salicylsäure und ihre Derivate verwendet werden.
Erfindungsgemäß kann die Zusammensetzung mindestens einen Extrakt mindestens einer Iridacea mit weiteren Wirkstoffen enthalten, die insbesondere für die Vermeidung und/oder Behandlung von Hauterkrankungen vorgesehen sind. Von diesen Wirkstoffen können beispielhaft angegeben werden:

– die Wirkstoffe, die die Differenzierung und/oder die Proliferation und/oder die Pigmentierung der Haut verringern, wie Retinoesäure und ihre Isomere, Retinol und seine Ester, Vitamin D und seine Derivate, die Östrogene, wie Östradiol, Kojisäure oder Hydrochinon;
– die antibakteriellen Wirkstoffe, wie Clindamycinphosphat, Erythromycin oder die Antibiotika aus der Klasse der Tetracycline;
– die antiparasitären Wirkstoffe, insbesondere Metronidazol, Crotamiton oder die Pyrethrinoide,
– die Antimykotika, insbesondere die Verbindungen, die zur Klasse der Imidazole gehören, wie Econazol, Ketoconazol oder Miconazol und ihre Salze, die Polyenverbindungen, wie Amphotericin B, die Verbindungen aus der Familie der Allylamine, wie Terbinafin, oder auch Ďctopirox;
– die antiviralen Mittel, wie Acyclovir;
– die steroidalen entzündungshemmenden Mittel, wie Hydrocortison, Betamethasonvalerat oder Clobetasolpropionat, oder die nicht-steroidalen entzündungshemmenden Mittel, wie z. B. Ibuprofen und seine Salze, Diclofenac und seine Salze, Acetylsalicylsäure, Acetaminophen oder Glycyrrethinsäure (Glycyrrhizin),
– die Anaesthetika, wie Lidocainhydrochlorid und seine Derivate;
– die Antipruriginosa, wie Thenaldin, Trimeprazin oder Cyproheptadin;
– die Keratolytika, wie α- und β-Hydroxycarbonsäuren oder β-Ketocarbonsäure, ihre Salze, Amide oder Ester und vor allem die Hydroxysäuren, wie Glykolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Citronensäure und ganz allgemein die Fruchtsäuren, und die n-Ďctanoyl-5-salicylsäure;
– die Hydratisierungsmittel, wie Glycerin und seine Derivate;
– die Mittel gegen freie Radikale, wie α-Tocopherol oder seine Ester, die Superoxiddismutasen, bestimmte Metallchelatbildner oder Ascorbinsäure und ihre Ester;
– die Antiseborrhöika, wie Progesteron;
– die Antischuppenmittel, wie Ďctopirox oder Zinkpyrithion;
– die Antiaknemittel, wie Retinoesäure oder Benzoylperoxid;
– die Extrakte pflanzlicher oder bakterieller Herkunft.

Nach einer besonderen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung daher zusätzlich mindestens ein Mittel, das unter den antibakteriellen Wirkstoffen, den antiparasitären Wirkstoffen, den Antimykotika, den antiviralen Mitteln, den entzündungshemmenden Mitteln, den Antipruriginosa, den Anaesthetika, den Keratolytika, den Mitteln gegen freie Radikale, den Antiseborrhöika, den Antischuppenmitteln, den Antiaknemitteln und/oder den Wirkstoffen, die die Differenzierung und/oder die Proliferation und/oder die Pigmentierung der Haut verringern, ausgewählt ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein kosmetisches Behandlungsverfahren zur Bekämpfung der Überschüsse der interkorneocytären Kohäsion und demnach zur Verstärkung der Abschuppung anzugeben, wobei das Verfahren darin besteht, auf die Haut eine kosmetische Zusammensetzung aufzutragen, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids für die Herstellung oder Reinigung, gegebenenfalls aus der Epidermis, jedes strukturellen oder funktionellen Moleküls, das imstande ist, sich spezifisch an das oben genannte isolierte Polypeptid oder an die oben genannten isolierten Proteolysefragmente oder an das oben genannte synthetische Peptid zu binden. Dieses Molekül kann insbesondere anderen Strukturproteinen, die spezifisch für Korneodesmosomen und verschiedene Enzyme der Hornschicht sind, vom Typ der "Proteasen", "Glykosidasen" oder "Phosphatasen", entsprechen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids für die Herstellung spezifischer Antiseren und spezifischer monoklonaler Antikörper, mit der insbesondere die Reinigung dieses Proteins und seiner Fragmente angestrebt wird. Im weiteren Sinne hat die Erfindung außerdem jede Verwendung des Polypeptids zum Gegenstand, durch die rekombinante Antikörper oder Fragmente von rekombinanten Antikörpern hergestellt werden unabhängig davon, welches biologische System verwendet wird, um letztere herzustellen.
1 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen, die in den Proteinproben des Stratum corneum enthalten sind, in Gegenwart oder in Abwesenheit von Cystein.
2 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Abhängigkeit vom pH-Wert.
3 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart des Inhibitors E64 (Proteolytic enzymes: a practical approach. R. J. Beyton und J. S. Bond, IRL press, Ďxford, 1989).
4 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart von Leupeptin.
5 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart von Chymostatin.
6 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart des Inhibitors CA 074 (Inubushi et coll., J. of Biochemistry, 116, 282–284, 1994).
7 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart von Pepstatin.
8 zeigt die Aktivitätsprofile der Proteasen des Peaks G4 in Gegenwart eines bevorzugten Peptidsubstrats der Kathepsine L.
9 zeigt die Profile, die bei Chromatofokussierungsexperimenten für die Bestimmung des apparenten isoelektrischen Punktes erhalten werden.
BEISPIEL
Isolierung und Charakterisierung des Polypeptids
Die Proteine des Stratum corneum werden durch ein Verfahren gewonnen, das als "Abkratzen" oder "Abschaben" bezeichnet wird. Bei dieser Technik ist kein Extraktionsschritt mit einem organischen Lösemittel erforderlich, sie wirkt daher wahrscheinlich weniger zerstörend auf die enzymatischen Aktivitäten. Sie ermöglicht außerdem den Erhalt einer brauchbaren Menge des Materials.
Das Abkratzen wird auf der Vorderseite des Beines durchgeführt. Der Bereich, von dem das Material genommen wird, wird mit 200 ml eines Puffers gewaschen, der aus 50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 mM EDTA, 150 mM NaCl und 0,1% Triton X100 besteht, der mit Hilfe einer Pumpe mit einem konstanten Durchsatz von 100 ml/min gepumpt wird.
Der Bereich wird dann oberflächlich mit der Kante eines Mikroskop-Ďbjektträgers abgekratzt.
Die Flüssigkeit, die die Zellen enthält, wird in einem Behälter gesammelt, der unterhalb des Beines angeordnet ist. Der so gesammelte Puffer wird für zahlreiche Durchgänge (15) zurückgeführt. Die Proben werden anschließend gegebenenfalls nach dem Versuchstyp zusammengefaßt.
Die so gewonnene Lösung wird zunächst durch ein Whatman-Papier Nr. 4, dann durch einen Millipore-Filter 0,45 μm und schließlich durch einen Millipore-Filter 0,22 μm filtriert. Diese geklärte Lösung wird dann mit Hilfe einer K.BL^TM-Apparatur und Sartocon^TM-Membranen (SARTĎRIUS) durch Tangential-Ultrafiltration mit einer Ausschlussgrenze von 10 kD bei 4°C bei einem Gegendruck von 1 bar und einem Durchsatz am Auslass an Filtrat von 2 ml/min bis auf 12 ml aufkonzentriert.
Für eine Versuchsperson mit gesunder Haut liegt die Konzentration der durch dieses Verfahren gewonnenen Proteine bei etwa 0,15 mg/ml für 12 ml fertige Lösung bei 15 Durchgängen, in deren Verlauf diese Technik angewendet wurde.
Trennung der Proteine
Eine Superdex^TM-Säule G200 HR10/30 (Pharmacia Biotech) mit einem Auflösungsbereich, der im Bereich von 600 kD bis 10 kD liegt, wird für die Auftrennung der Proteine verwendet. Diese Technik, die auf der Trennung in Abhängigkeit vom Molekulargewicht beruht, ermöglicht eine erste Schätzung der Molekulargewichte der Proteine.
Das erhaltene Chromatographieprofil zeigt, dass sich die Proteinpeaks überwiegend bei den niedrigen Molekulargewichten (20 bis 40 kD) befinden.
Dann wird eine besser auflösende Säule verwendet. Die Probe (250 μl) wird auf eine Superdex^TM-Ausschlusssäule G75 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) injiziert, für die die optimale Trennung bei Molekulargewichten liegt, die im Bereich von 70 kD bis 3 kD liegen.
Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wird bei 4°C auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 150 μl/Vertiefung nach einer Wartezeit von 15 min nach der Injektion (die Wartezeit entspricht etwas weniger als dem Totvolumen der Säule und belässt einen Sicherheitsabstand für den Fall, dass eine Verbindung überhaupt nicht zurückgehalten wird) und einem Totvolumen von 0,24 ml gesammelt. Der Durchsatz der Pumpe beträgt 0,5 ml/min, die Nachweiswellenlänge 280 nm (Pumpe Serie 10: Perkin Elmer, Detektor SP8450: Spectra Physics, Integrator mit LC1-100: Perkin Elmer, Fraktionssammler Gilson Modell 201).
Wenn die für verschiedene Injektionen erhaltenen chromatographischen Profile reproduzierbar sind, werden die in einander entsprechenden Vertiefungen erhaltenen Fraktionen vermischt, um ein Arbeitsvolumen von etwa 800 μl pro Fraktion zu erhalten.
Die verschiedenen Fraktionen werden gekühlt, im Kühlschrank oder in gestoßenem Eis, aufbewahrt, um die enzymatischen Aktivitäten unverändert zu konservieren.
Die den verschiedenen Fraktionen entsprechenden Molekulargewichte werden elektrophoretisch in einem Polyacrylamidgel mit einem Acrylamid-Gradienten von 8–18% ermittelt. Die Proben werden in einem modifizierten Laemmli-Puffer (0,0625 M Tris, pH 6,8, 2% SDS, kein DTT) auf ¼ verdünnt, und die einpipettierte Menge beträgt 20 μl. Die Proteinbanden werden durch Färbung mit Silbernitrat nach dem Protokoll von Pharmacia Biotech sichtbar gemacht (Silver-staining-Kit PlusĎne^TM).
Quantitative Bestimmung der Aktivität der Proteasen: Die quantitative Bestimmung der Aktivität der Proteasen, die in den Fraktionen enthalten sind, die durch Aufbringen auf die Superdex^TM-Ausschlusssäule G75 HR 10/30 erhalten werden, erfolgt fluorimetrisch mit Hilfe des EnzCheck^TM-Kits (Molecular Probes) erhalten. Dieser Kit ermöglicht ein schnelles und einfaches Verfahren zur Messung der Aktivität der Proteasen ohne Fällungsschritt oder Trennschritt und ist demnach an ein schnelles Screening der Aktivität der Proteasen in den verschiedenen Fraktionen angepasst. Nach diesem Protokoll wird Bodipy-FLTM-Casein als Substrat verwendet, das nach dem enzymatischen Abbau fluoreszierend wird. Die so erzeugte Fluoreszenz ist direkt proportional zu der in der Probe enthaltenen Aktivität der Protease. Die Fluoreszenz wird in einem Fluoreszenzspektrometer LS50B, Perkin Elmer, mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm (Spalt 2,5 mm), einer Emissionswellenlänge von 535 nm (Spalt 8 nm) und einer Integrationszeit von 1 Sekunde pro Vertiefung gemessen.
Die quantitativen Bestimmungen werden in Gegenwart von Cystein in einer Endkonzentration von 5 mM oder in Abwesenheit von Cystein durchgeführt, um mögliche Aktivitäten von Cystein-Proteasen nachzuweisen.
Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Das Proteaseprofil zeigt die Existenz eines Peaks (G4), der vorhanden ist, wenn der Puffer Cystein enthält, und der fehlt, wenn der Puffer kein Cystein enthält.
Dieser Peak zeigt demnach das Vorhandensein einer Cystein-abhängigen Protease in den Fraktionen 34 bis 47. Diese Protease weist ein Molekulargewicht von etwa 28 kD auf.
Ďptimaler pH-Wert für die Aktivität der Proteasen
Für die Ermittlung des optimalen pH-Wertes für die Aktivität der Proteasen des Peaks G4 wurden zwei Puffer, die in "Data for Biochemical Research (Dawson et coll., 3. Auflage, Ďxford science publications, 1990) beschrieben werden, hergestellt, um einen pH-Bereich von 4,0 bis 8,25 abzudecken:
Acetat-Puffer 0,1 M, pH 4,0 bis 5,75;
Phosphat-Puffer 0,1 M, pH 5,75 bis 8,25.
Alle Puffer enthalten 5 mM EDTA und 0,1% Triton X100. Die Aktivitäten werden in Schritten von 0,25 pH-Wert-Einheiten gemessen.
Die obige Technik zur Messung der Proteaseaktivität wird mit jedem der beiden Puffer auf jede Fraktion angewendet.
Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Der optimale pH-Wert für die aus dem Stratum corneum gewonnenen Proteasen, die auf das Substrat Bodipy-FL^TM-Casein einwirken, liegt im Bereich saurer pH-Werte bei 4,0 bis 6,25.
Die größte Aktivität wurde im pH-Bereich von 5,0 bis 5,5 mit dem Acetat-Puffer erhalten. Der Acetat-Puffer bei pH 5,0 ist daher der Puffer, der für die folgenden Versuche verwendet wird.
Charakterisierung der Peaks der Proteasen durch Verwendung von Inhibitoren
Für die bessere Charakterisierung der oben isolierten Cystein-abhängigen Protease werden Hemmversuche mit bekannten Inhibitoren von Proteasen durchgeführt.
Die Messungen werden in identischer Weise wie die vorherigen Messungen in Gegenwart von Cystein in einer Endkonzentration von 5 mM und in Gegenwart oder in Abwesenheit (Vergleich) des betreffenden Inhibitors durchgeführt.
Inhibitor E 64
E 64 ist ein Inhibitor der Cystein-Proteasen und insbesondere der Kathepsine B, H und L (Proteolitic enzymes: a practical approach, R. J. Beyton und J. S. Bond, IRL press, Ďxford, 1989).
Der Versuch wird mit dem Inhibitor E 64 in einer Konzentration von 1,4 μM durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
E64 in einer Konzentration von 1,4 μM hemmt etwa 71% der Aktivität der Cystein-abhängigen Protease des Peaks G4.
Im Hinblick auf die Spezifität dieses Inhibitors handelt es sich bei G4 um ein Kathepsin B, H oder L.
Leupeptin
Leupeptin ist in der verwendeten Menge spezifisch für die Kathepsine B oder L und ohne Wirkung auf die Kathepsine H (Schwarz et coll. 1980).
Der Versuch wird mit Leupeptin in einer Konzentration von 1 μM durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Leupeptin senkt in einer Konzentration von 1 μM in Gegenwart von Cystein die Proteaseaktivität von G4 um etwa 41%.
G4 ist kein Kathepsin H.
Chymostatin
Chymostatin ist spezifisch für die Kathepsine L und in der verwendeten Konzentration inaktiv gegenüber den Kathepsinen B (Inubushi et coll., J. of Biochemistry, 116, 282–284, 1994).
Der Versuch wird mit Chymostatin in einer Konzentration von 2,5 μM durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Bei Verwendung in einer Konzentration von 2,5 μM hemmt Chymostatin die Aktivität der Cystein-abhängigen Protease des Peaks G4 um mehr als 50%.
G4 ist eine Protease vom Kathepsin-L-Typ.
Inhibitor CA 074
Der Inhibitor CA 074 hemmt spezifisch die Kathepsine B und hat keine Wirkung auf die Kathepsine L (Inubushi et coll. 1994).
Der Versuch wird mit CA 074 in einer Konzentration von 1 μM durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
Der Inhibitor CA 074 hat praktisch keine Auswirkungen auf das Aktivitätsprofil der Cystein-abhängigen Protease des Peaks G4.
G4 ist keine Protease vom Kathepsin-B-Typ.
Pepstatin
Pepstatin ist ein spezifischer Inhibitor der Proteasen mit Asparaginsäure (Proteolytic enzymes: a practical approach, R. J. Beyton und J. S. Bond, IRL press, Ďxford, 1989).
Der Versuch wird mit Pepstatin in einer Konzentration von 1 μM durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
Pepstatin ist ohne Wirkung auf G4.
G4 ist keine Protease mit Asparaginsäure.
Verwendung eines Substrats, das für Kathepsine L spezifisch ist [Z(phe-arg 2R110) (Assfalg-Machleidt et coll. 1992)], für die Bestätigung der Charakterisierung von G4
Die Ergebnisse der Identifizierung von G4, die mit Hilfe der verschiedenen Versuche mit Inhibitoren erhalten wurden, wurden durch die Verwendung eines Peptidsubstrats, das von den Kathepsinen L bevorzugt wird, das mit Rhodamin 110 markiert war, überprüft. Dieses Substrat ist 850 × empfindlicher gegenüber der Wirkung der Kathepsine L als der Kathepsine B.
Die Ergebnisse der Bilanz der Aktivität der Proteasen in Gegenwart von Cystein, unter Abzug des Vergleichs ohne Cystein, sind in 8 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass sich die intensive Hydrolyse des spezifischen Peptidsubstrats perfekt mit der Hydrolyse des Caseins überlagert, was bestätigt, dass G4 einem Kathepsin L entspricht.
Messung des apparenten isoelektrischen Punkts von G4
Die Messung erfolgt durch die als Chromatofokussierung bezeichnete Technik, die in "Protein Purification", J.-C. Janson und L. Ryden, VCH Publisher Inc N.Y., 1989, beschrieben wird, unter den folgenden Bedingungen.
Säule: Mono PTM HR 5/20 Pharmacia.
Probe: gewonnen aus menschlichem Stratum corneum (SC), äquilibriert in einem 0,075 M Tris/Acetat-Puffer, pH 9,3).
Elutionspuffer: 10 ml Polybuffer 96/Acetat, pH 6,0, "Protein Purification", J.-C. Janson und L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989). Durchsatz: 1 ml/min.
Fraktionen: 0,5 ml ab der Injektion bei 48 ml insgesamt.
Detektion: Kathepsin L-Aktivitäten gegenüber Z(phe-Arg)2R110 10 mM in dem Puffer Acetat 0,1 M pH 5,0, 0,1% Triton X100 5 mM ED TA, 5 mM Cystein. Inkubation von 10 μl der Fraktion + 200 μl Substrat bei 37°C während 2 h 30 min. Ablesen des Wertes an Biolumin^TM von Molecular Dynamics, dessen Photomultiplier auf 700 V eingestellt ist, Anregung: 485/10 nm, Emission: 520/10 nm.
Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen einen apparenten isolelektrischen Punkt, der im Bereich von 6 bis 9 liegt.
Nachweis der wahrscheinlichen Bedeutung von G4 für den Abschuppungsvorgang
Das Korneodesmosin ist ein essentielles Protein des Korneodesmosoms, das während der Abschuppung abgebaut wird (Serre G. et coll. J. I. D., 1991, 97 (6), 1061–1072).
Der Versuch wird mit Korneodesmosin durchgeführt, das aus dem Stratum corneum nach der Technik gewonnen wurde, die von Munerot C. (Rapport de DEA., 1996, Universite de Marne la Vallée) entwickelt wurde.
Ein Immunotransfer, der mit Korneodesmosin nach dem Inkubieren auf intaktem Stratum corneum in Gegenwart oder in Abwesenheit der Protease des Peaks G4 durchgeführt wurde, zeigt einen deutlichen Abbau des Korneodesmosins.
Die Protease des Peaks G4, die im Stratum corneum vorhanden ist, baut das Korneodesmosin ab.
Alle Ergebnisse zusammen der durchgeführten Versuche ermöglichen die Schlussfolgerung, dass das aus dem Stratum corneum gewonnene Polypeptid eine Cystein-abhängige Protease vom Kathepsin-L-Typ ist, die ein apparentes Molekulargewicht von 28 kD und einen isoelektrischen Punkt aufweist, der im Bereich von 6 bis 9 liegt.

Claims

Kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die in einem physiologisch akzeptablen Medium mindestens ein isoliertes natürliches oder synthetisches Polypeptid oder mindestens ein Fragment eines isolierten natürlichen oder synthetischen Polypeptids enthält, das zur Familie der Cystein-Proteasen vom Typ der Kathepsine L gehört, das ein apparentes Molekulargewicht von 28 Kilodalton und einen isoelektrischen Punkt aufweist, der im Bereich von 6 bis 9 liegt, wobei das Polypeptid aus der Hornschicht der menschlichen Epidermis isoliert werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid und seine Fragmente an der Verringerung der interkorneocytären Kohäsion beteilt sind, indem sie das Korneodesmosin abbauen.
Zusammensetzung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid bei einem pH-Wert, der im Bereich von 2 bis 9 und vorzugsweise 3, 5 bis 6, 5 liegt, seine maximale Aktivität hat.
Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Polypeptid enthält, das zum Teil aus dem Polypeptid besteht, das wie in den Ansprüchen 1 und 2 beschrieben ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Fragment des Polypeptids enthält, das wie in den Ansprüchen 1 und 2 beschrieben ist, das durch Proteolyse oder auf synthetischem Weg erhalten wird.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid oder das Fragment in einer Menge enthalten ist, die im Bereich von 0,00001 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, liegt.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem mindestens einen Aktivator von Proteasen enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Protease-Aktivator unter Glycerin, Harnstoff und seinen Derivaten, der Transglutaminase, EDTA, Reduktionsmitteln ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen Aktivator von Proteasen enthält, bei dem es sich um ein Reduktionsmittel in aktiver Form oder in Form eines seiner Vorläufer handelt, der unter Sulfiden, Thiolen, wie Dithiothreit oder Trithiohexit, Cystein, N-Acetylcystein, Cystein-reichen Proteinen oder Hydrolysaten von Proteinen, Mercaptoethanol, Thioglycerin, Thioalkansäuren und Mercaptocarbonsäuren und ihren Analoga, der Mercaptobernsteinsäure, der Thiomilchsäure, der Thioglykolsäure und ihren Salzen, Coenzym A, reduziertem Glutathion (GSH) und Ďxothiazolidincarboxylat ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Protease-Aktivator in einer Menge enthalten ist, die im Bereich von 0,00001 bis 15 Gew.-% und vorzugsweise 0,001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthalten ist.
Verwendung eines isolierten natürlichen oder synthetischen Polypeptids oder mindestens eines Fragments eines isolierten natürlichen oder synthetischen Polypeptids, das zur Familie der Cystein-haltigen Proteasen vom Typ der Kathepsine L gehört, das ein apparentes Molekulargewicht von 28 Kilodalton aufweist, für die Herstellung einer kosmetischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung dafür vorgesehen ist, auf die Haut aufgetragen zu werden, um die übermäßige interkorneocytäre Kohäsion zu bekämpfen oder um die Abschuppung zu fördern.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die dafür vorgesehen ist, die Störungen der Abschuppung zu behandeln.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die für die Behandlung der Hyperkeratose vorgesehen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, die für die Behandlung der Xerose, der Ichthyosen, der Psoriasis, der gutartigen oder bösartigen Tumorläsionen oder der reaktiven Keratosen vorgesehen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12, die für die Behandlung der Leukokeratose des Gebärmutterhalses im Laufe des Uterusprolapses, der buccalen Leukokeratosen oder auch der gutartigen Hornhaut-Tumorläsionen der Malpighi-Schleimhäute vorgesehen ist.
Isoliertes natürliches oder synthetisches Polypeptid, das zur Familie der Cystein-Proteasen vom Typ Kathepsin L gehört, das ein apparentes Molekulargewicht von 28 Kilodalton aufweist, das wie in einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche beschrieben ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aus dem menschlichen Stratum corneum isoliert werden kann und dass es einen isoelektrischen Punkt aufweist, der im Bereich von 6 bis 9 liegt.
Verwendung des isolierten Polypeptids oder seiner Fragmente, die wie in den Ansprüchen 1 bis 15 beschrieben sind, zur Herstellung oder Reinigung jedes Moleküls, das imstande ist, spezifisch an das isolierte Polypeptid oder an die isolierten, durch Proteolyse erhaltenen Fragmente oder an das synthetische Peptid zu binden.
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch zur Herstellung oder Reinigung spezifischer Strukturproteine der Korneodesmosomen der Hornhaut.
Verwendung des isolierten Polypeptids, das wie in den Ansprüchen 1 bis 4 oder 15 beschrieben ist, für die Herstellung oder Reinigung von Antiseren oder spezifischen monoklonalen Antikörpern.