DE60015112T2

DE60015112T2 - Peptidextrakt aus lupinen und pharmazeutische oder kosmetische oder pharmaco-nahrungsmittel zusammensetzung, die so ein extrakt enthalten

Info

Publication number: DE60015112T2
Application number: DE60015112T
Authority: DE
Inventors: Philippe Msika; Antoine Piccirilli; François Paul
Original assignee: Laboratoires Expanscience SA
Current assignee: Laboratoires Expanscience SA
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2006-02-02
Also published as: ES2228500T3; ATE279934T1; EP1171143B9; JP2002542199A; KR20020030263A; PT1171143E; KR100818010B1; US20050148498A1; FR2792202A1; DE60015112T8; US20040101580A1; DE60015112D1; JP5329731B2; WO2000062789A1; EP1171143B1; EP1171143A1; US7638149B2; US7029713B2; FR2792202B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen peptidischen Extrakt, welcher eine Anti-Metalloprotease-Aktivität, insbesondere Anti-Collagenase- und Anti-Gelatinase-Aktivität, aufweist. Sie bezieht sich gleichfalls auf die pharmazeutischen, kosmetischen oder nutrazeutischen Zusammensetzungen, die einen solchen Extrakt umfassen, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung, die dazu bestimmt ist, Entzündungskrankheiten, wie Arthrose, Parodontose oder Geschwüre, zu behandeln, oder die kosmetischen Zusammensetzungen, die dazu bestimmt sind, die durch Strahlung bewirkte oder nicht durch Strahlung bewirkte oder durch äußere Angriffe (Tabak, Verschmutzung, ...) beschleunigte Alterung zu bekämpfen.
Die pharmazeutische oder kosmetische oder nutrazeutische Zusammensetzung ist gleichfalls dazu bestimmt, die pathologische oder unästhetische Neoangiogenese (Proliferation von Gefäßen) (Schuppenflechte, Tumore, Erythrose, Kupferausschlag, Rosazea, lokale Behandlung mit reizenden Substanzen, wie Retinsäure), Narbenbildungsdefekte, Verbrennungen oder den Angriff des Zahnschmelzes zu behandeln (Ch. M. Lapiere, Cours de biologie de la peau – COBIP INSERM U 346, Lyon 1999).
Die Metalloproteasen sind eine Familie von Zink- und Calciumabhängigen Endopeptidasen, die die gemeinsame Eigenschaft aufweisen, die verschiedenen Bestandteile der Matrices des Bindegewebes abzubauen (Dissertation von S. Charvat – Metalloproteinases et épiderme, Seiten 101–113, Nr. 248–98, 1998, Lyon I).
Sie werden je nach der Natur von ihrem Substrat eingestuft. Die Collagenase (fibrilläres Collagen: Bsp. MMP 1, 13, 8); die Gelatinase (denaturiertes Collagen, Gelatine: Bsp. MMP2, MMP9); die Stromelysine (Fibronectin, Proteoglycan: Bsp. MMP3, MMP10). Sie sind an der physiologischen (schwache Expression) oder pathologischen (starke Induktion) Umgestaltung der extrazellulären Matrix beteiligt.
Die Metalloproteasen sind insbesondere an dem Narbenbildungsprozess beteiligt, indem sie die geschädigten Gewebe beseitigen.
Die MMP können auf anarchische Weise tätig werden und zu bedeutenden Läsionen führen, wenn ihre Aktivität nicht kontrolliert wird.
Außerdem ist bekannt, dass die Metalloproteasen an bestimmten biologischen Störungen oder Erkrankungen, wie Entzündungskrankheiten, insbesondere Arthrose, Parodontose (H. BIRKEDRL-HANSEN et al., Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 4(2): 197–250 (1993)), oder an den Alterungsprozessen, die insbesondere mit der Wirkung der Sonnenstrahlung verbunden sind (MARTIN RIEGER; Allured's Cosmetics & Toiletries^®, Band 114, Nr. 1/Januar 1999, oder G.J. FISHER et al., The New England Journal of Medicine, Band 337, Nr. 20, S. 1419–1428, „Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light" und G.J. FISHER et al., The Society for Investigative Dermatology, Inc., 1998, S. 61-68 „Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce A-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo"), oder an akuten und chronischen Entzündungen (XIE et al.; J. Biol. Chem. 273: S. 11576–11582; 1998) und bullösen Erkrankungen (toxische epitheliale Nekrolyse), Pathologien mit zellulärer Hyperproliferation während Entzündung oder Bestrahlung, Dekubitalgeschwüren, Verbrennungen und Geschwüren beteiligt sind.
Das gleiche gilt für die Proliferation der Endothelzellen im Rahmen der Neoangiogenese, die in ihrer proliferativen Phase während Entzündungsprozessen oder pathologischen Prozessen (Schuppenflechte, Tumore) MMP benötigen, um das Bindegewebe zu zerstören, um in Richtung anderer Gebiete wandern und sich als Mikrotubuli und Kapillaren konstituieren zu können (Controlling the vasculature: angiogenesis, antiangiogenesis and vascular targeting of gene therapy – T.P. D. FAN, R. JAGGAR und R. BICKNELL; TiPS – Februar 1995, Band 16; Natural Products as angiogenesis inhibitors, D.H. PRPER, Planta Medical 64 (1998), S. 686–695; Membrane-type matrix metalloproteinases in human dermal microvascular endothelial cells: expression and morphogenetic correlation – V.T. CHAN und Koll., J.I.D. 111, S. 1153–1159, 1998; Matrix metalloproteinases in blood vessel development in human fetal skin and in cutaneous tumors – T.V. KARELINA und Koll..J.I.D.; 105, 411–417, 1995; Vascular proliferation and angiogenic factors in psoriasis, J.D.
CREAMER und J.N.W.N. BARKER, Clinical and Experimental Dermatology, 1995, 20, S. 6–9).
Es ist gleichfalls die Rolle der Inhibitoren von Metalloproteasen, insbesondere der Collagenasen, der Gelatinasen und der Stromelysine, bei bestimmten der Behandlungen der vorerwähnten Krankheiten bekannt.
Der Gegenstand der Erfindung besteht darin, einen neuen Breitspektrum-Inhibitor der Metalloproteasen vom Typ Collagenase oder Gelatinase vorzuschlagen, welcher die Behandlung von Menschen oder Säugetieren erlaubt, die unter einem Zustand oder einer Krankheit, der bzw. die mit einem übermäßigen oder pathologischen Abbau von Collagen oder eines anderen extrazellulären Makroproteins verbunden ist, oder einer jeglichen anderen Krankheit, die mit einem Überschuss der Expression dieser proteolytischen Enzyme verbunden ist, leiden.
Die Erfindung hat einen peptidischen Extrakt von Lupine (Lupinus) zum Gegenstand, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Metalloproteasen, insbesondere die Collagenasen oder die Gelatinasen inhibierende Aktivität aufweist. Als Lupinen-Sorte kann man insbesondere die Gattung der weißen süßen Lupine (Lupinus albus), wie die Sorte Ares mit geringem Gehalt an Alkaloiden, aufführen.
Gemäß einer Variante ist dieser peptidische Extrakt von Lupine an Lipiden verarmt.
Er umfasst vorteilhafterweise wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80% Peptid.
Diese Peptide werden durch Hydrolyse des Protein-Anteils von Lupine erhalten.
Die Hydrolyse kann durch ein jegliches geeignetes Mittel oder eine jegliche geeignete Maßnahme, insbesondere eine enzymatische Hydrolyse ausgeführt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines solchen peptidischen Extrakts von Lupine umfasst die folgenden Schritte:

– Herstellung eines Presskuchens von den Lipiden befreiter und zerkleinerter Lupine oder eines (lipidhaltigen) mikronisierten Lupinenmehls,
– Extraktion der löslichen Protein- und Ose-Fraktionen oder Ausfällung bei saurem pH (4 oder 5) gemäß dem isoelektrischen Punkt,
– gegebenenfalls Abtrennung der Proteinfraktion,
– Hydrolyse der Proteinfraktion und Rückgewinnung, gegebenenfalls nach Filtration, des Proteinextrakts.

Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf den Proteinextrakt, der durch das vorerwähnte Verfahren erhalten werden kann.
Die Erfindung umfasst allgemein die lipidhaltigen Lupinenmehle, die peptidischen Extrakte, die noch die Zucker enthalten.
Der Proteinextrakt weist vorzugsweise die folgende Zusammensetzung an Aminosäuren auf (Gewichtsprozentsatz bezogen auf das Gesamtgewicht der Aminosäuren).
Die Erfindung hat gleichfalls eine pharmazeutische oder kosmetische oder nutrazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die einen peptidischen Extrakt, wie zuvor beschrieben, und gegebenenfalls einen inerten geeigneten Träger, welcher physiologisch annehmbar ist, umfasst.
Eine solche pharmazeutische oder hautkosmetische oder nutrazeutische Zusammensetzung ist insbesondere für die Behandlung von Menschen oder Säugetieren bestimmt, die unter einem Zustand oder einer Erkrankung leiden, der bzw. die mit einer übermäßigen Zerstörung von Collagen und/oder einer übermäßigen Zerstörung der Stütz-Gewebe verbunden ist. Eine solche Zusammensetzung kann präventiv oder kurativ eingesetzt werden.
Unter diesen Zuständen oder Erkrankungen kann man beispielsweise die Arthrose, die parodontalen Erkrankungen, die Krankheiten, die mit Schädigungen der Haut verbunden sind, die Entzündungskrankheiten, die tumorale oder pathologische Neoangiogenese (Erythrose, Kupferausschlag, Telangiektasie, Rosazea, Schuppenflechte ...), die fehlerhafte Narbenbildung, die Geschwüre, die Verbrennungen, die bulbösen Erkrankungen und den Angriff des Zahnschmelzes aufführen.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die kosmetischen Zusammensetzungen für die Behandlung von Schädigungen der Haut, die auf die Alterung zurückzuführen sind, wie die Schädigungen, die durch die Wirkung der Sonnenstrahlung (im Englischen „photoaging"), die schädlichen intrinsischen Wirkungen der Haut, die schädlichen Wirkungen des Tabaks hervorgerufen werden.
Die pharmazeutischen, hautkosmetischen oder kosmetischen Zusammensetzungen liegen gemäß einer Variante in Form einer Formulierung für eine topische Anwendung vor. Die Erfindung hat folglich ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung zum Gegenstand, welches das Auftragen einer solchen Zusammensetzung auf die Hautoberfläche eines Individuums umfasst.
Der peptidische Extrakt gemäß der Erfindung kann gleichfalls in einen polymeren Träger oder ein Abgabesystem für eine topische oder örtliche Verwendung inkorporiert oder in einem solchen formuliert werden, wie in dem Falle der Behandlung einer parodontalen Erkrankung, um direkt in die parodontale Tasche abgegeben zu werden.
Gemäß einer anderen Variante liegen die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form einer Formulierung für eine orale Verabreichung vor.
Diese Zusammensetzungen können im allgemeinen in Form von Tabletten, Kapseln, Pomade formuliert werden.
In dem Falle der nutrazeutischen Zusammensetzungen oder Nahrungsmittelzusammensetzungen können die üblicherweise eingesetzten Formen eingesetzt werden.
Die Erfindung wird jetzt durch die nachfolgend zur Veranschaulichung beschriebenen Ausführungsbeispiele veranschaulicht.
I – Herstellung der peptidischen Extrakte von Lupine
I.1. – Extrakt A
– Extraktion und Reinigung der Proteine von Lupine
Dieser Schritt umfasst eine wässrige Solubilisierung der löslichen Fraktion bei alkalischem pH, gefolgt von einer Abtrennung der unlöslichen Anteile:
Ausgehend von dem Presskuchen von den Lipiden befreiter und zerkleinerter Lupine erfolgt die Extraktion der Proteine bei pH 9,0 (pH durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt) mit einem Mehl/Wasser-Verhältnis von 1/10 (Gew./Gew.). Die Lösung wird unter Bewegung bei Umgebungstemperatur 1 h inkubiert. Der unlösliche Anteil des Presskuchens wird dann von dem löslichen Anteil durch Schleudern abgetrennt. Der erhaltene Kuchen wird gewaschen. Die lösliche Fraktion, die die Proteine und die löslichen Zucker enthält, wird auf einem Ultrafiltrationsmodul mit einem Ausschlussschwellenwert von 10000 Dalton diafiltriert, um die Proteine (Retentat) von den löslichen Zuckern (Ultrafiltrat) abzutrennen.
– Herstellung und Reinigung von Peptiden durch enzymatische Hydrolyse:
Das Retentat aus der Ultrafiltration, welches die Proteine enthält, wird auf eine Konzentration von 100 g/l eingestellt, dann bei pH 8,0 in Gegenwart von Alcalase^® (NOVO NORDISK) bei 55°C ungefähr 3 h hydrolysiert. Nach der Hydrolyse wird das Enzym durch Hydrolyse während 15 min bei 85°C denaturiert. Sobald die Lösung abgekühlt ist, wird sie durch Zugabe von Salzsäure neutralisiert. Die erhaltenen Peptide werden durch Diafiltration auf einem Ultrafiltrationsmodul mit einem Ausschlussschwellenwert von 10000 Dalton gereinigt. Die erhaltene Lösung wird dann nanofiltriert, um sie zu entsalzen (Entfernung von Natriumchlorid) und um die Peptidfraktion aufzukonzentrieren. Die Lösung von Peptiden wird schließlich mit Hilfe von 3% Aktivkohle (1 h bei 50°C) entfärbt, wobei die Kohle durch Filtration entfernt wird.
– Sterilisation und Konditionierung der Fraktion von Peptiden:
Vor der Konditionierung wird die Lösung steril mikrofiltriert (0,2 μm), dann in sterile Behälter zu einer Konzentration von 10% in Gegenwart von Konservierungsmitteln verteilt.
I.2 – Extrakt B
Der peptidische Extrakt B wird gemäß dem beschriebenen Verfahren, das eingesetzt wurde, um den Extrakt A zu erhalten, erhalten mit dem Unterschied, dass der Entfärbungsschritt ausgelassen wird.
I.3 – Extrakt C
Der peptidische Extrakt von Lupine C wird gemäß dem beschriebenen Verfahren, das ausgeführt wurde, um den Extrakt A zu erhalten, erhalten mit dem Unterschied, dass die Schritte der Ultrafiltrationsreinigung und der Entfärbung ausgelassen werden.
II – Analyse des peptidischen Extrakts A
Der trockene Extrakt wird dann analysiert.
Präsentation:

– Aussehen: homogenes, nicht hygroskopisches Pulver
– Farbe: gebrochen weiß
– Menge: 5 g

– Gehalt an gesamten Zuckern (Anthron-Bestimmung):	<1%
– Gehalt an Chloriden (Kit SIGMA Ref.: 955–30):	6%
– Gehalt an Wasser (100°C, 4 h):	8% maximal
– Gehalt an Peptiden:	85%

– pH (Lösung mit einer Konzentration von 20 g/l):	7,06
– Löslichkeit (durch Osmose gereinigtes Wasser):	>100 g/l

Tabelle 1 – Aminosäurezusammensetzung des Hydrolysats
III – Anti-Collagenase-Aktivität und anti-gelatinolytische Aktivität der Peptide von Lupine – Extrakt A – in vitro
Die Anti-Collagenase-Aktivität wurde in vitro in einem biochemischen Modell vom Screening-Typ, welches auf der Verwendung einer gereinigten Collagenase und des Substrats von dieser Letzteren, Gelatine, welche mit Fluorescein konjugiert ist (Kit EnzChek^TM Gelatinase/Collagenase, MOLECULAR PROBES), beruht, gemessen. Die ausgehend von Clostridium histolyticum gereinigte Collagenase wurde mit dem Kit EnzChek^TM Gelati nase/Collagenase (MOLECULAR PROBES) geliefert. Dieses Enzym hat eine doppelte Funktionalität gegenüber Collagen IV (Epidermis/Dermis-Basalmembran) und Gelatine.
Die aus Schweinehaut gereinigte und mit Fluorescein konjugierte DQ-Gelatine wurde mit dem Kit EnzChek^TM Gelatinase/Collagenase (MOLECULAR PROBES) geliefert.
Der Puffer der Reaktion, welcher aus 0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl₂, 0,2 mM Natriumazid (pH 7,6) gebildet wird, wurde mit dem Kit EnzChek^TM Gelatinase/Collagenase (MOLECULAR PROBES) geliefert.
Der peptidische Extrakt wurde in dem Puffer der Reaktion solubilisiert. Er wurde in einer Konzentration von 0,004, 0,02, 0,04, 0,2 und 0,4% (Gew./Vol.) getestet.
Die Verdünnungen der zu testenden Extrakte wurden mit DQ-Gelatine in einer Konzentration von 1 mg/ml und Collagenase in einer Konzentration von 0,2 IE/ml 1 h, 2 h und 24 h bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Eine Vergleichsprobe, die der Mischung „Collagenase + DQ-Gelatine" entspricht, wurde parallel dazu inkubiert.
Für jede Versuchsbedingung wurden Proben, welche in der Folge als „Proben ohne Enzym" bezeichnet werden, in Gegenwart von DQ-Gelatine und in Abwesenheit von Collagenase inkubiert.
Jede Versuchsbedingung wurde dreifach getestet.
Nach 1 h, 2 h und 24 h wurde das dem Abbau der DQ-Gelatine entsprechende Signal fluorometrisch gemessen (Anregung: 485 nm und Emission: 595 nm). Für jede Probe wurde der für die „Proben ohne Enzym" erhaltene Wert abgezogen.
Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenzeinheiten pro Probe und als Prozentsatz der Abweichung bezogen auf die Vergleichsgruppe ausgedrückt.
Die Gruppen von Daten (Vergleichsgruppe und behandelte Gruppen) wurden durch eine Varianzanalyse mit einem Faktor (ANOVA 1, p<0,05) verglichen, gefolgt von einem Dunnett-Test. Die Wirkung der Extrakte wurde so mit jener, die in der Vergleichsgruppe erhalten worden war, verglichen.
Der in einer Konzentration von 0,004 bis 0,2% (Gew./Vol.) getestete peptidische Extrakt wies eine dosisabhängige Anti-Collagenase- und anti-gelatinolytische Aktivität auf. Die Wirkung war zum Zeitpunkt 24 h maximal, wie in der nachfolgenden Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 Inkubationszeit = 1 h
Inkubationszeit = 2 h
Inkubationszeit = 24 h
Die Ergebnisse sind als Fluoreszenzeinheit/Probe ausgedrückt. Fettgedruckt: Mittelwert und Standardabweichung * von der Vergleichsgruppe signifikant unterschiedlicher Mittelwert (p<0,05).
Als Schlussfolgerung wies unter den eingehaltenen Versuchsbedingungen der zwischen 0,004 und 0,4% (Gew./Vol.) getestete Proteinextrakt eine dosisabhängige Anti-Gelatinase/Collagenase-Aktivität auf. Man stellt insbesondere ein hervorragendes Wirkung/Dosis/Zeit-Verhältnis der Peptide von Lupine bezogen auf die unspezifische Collagenase fest: nach 24 h beispielsweise hemmt 0,04 93% der gelatinolytischen Aktivität der Collagenase von Clostridium, nach 2 h: 52%.
Andere Versuche mit dem gleichen peptidischen Extrakt wurden bei Konzentrationen von 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 und 1% (Gew./Vol.) ausgeführt und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 wie auch in der beigefügten 1 angegeben. Diese Figur repräsentiert die Inhibitionskinetik der unspezifischen Collagenase – Einfluss der Konzentration an peptidischem Extrakt. Ordinate: gelatinolytische Aktivität (%), Abszisse: Inkubationszeit (h).
Tabelle 3
Unter den eingehaltenen Versuchsbedingungen weist der in Konzentrationen zwischen 0,01 und 0,5% (Gew./Vol.) getestete peptidische Extrakt eine dosisabhängige und zeitabhängige Anti-Gelatinase- und -Collagenase-Aktivität auf
In allen Versuchen wurde 1,10-Phenanthrolin, ein unspezifischer Inhibitor, als anti-MMP-Referenzprodukt eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse stimmten mit jenen, die erwartet worden waren, überein und validierten die Versuche.
IV – Anti-spezifische Collagenase-Aktivität der Peptide von Lupine – Extrakt A – in einem humanen organotypischen Modell
Die kutane Alterung ist unter anderen durch eine Modifikation der mechanischen kutanen Eigenschaften der Haut, welche aus einem Abbau der collagenartigen Fasern der Dermis und anderer Makroproteine resultiert, definiert. An diesem Abbau sind endogene Collagenasen beteiligt (Grymes, R.A., Kronberger, A., und Bauer, E.A. – Collagenases in disease – In: „Connective Tissue Diseases of the skin", Hrsg. Lapiere, C.M., und Krieg, T., 1993, 69–85). G. Fischer und J. Voorhees „Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light" und „Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce A-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo").
Um die Zeichen der Alterung der Haut zu bekämpfen, können Produkte, die eine Anti-Collagenase-Aktivität aufweisen, in Betracht gezogen werden.
Die Anti-Collagenase-Aktivität eines zu testenden Produkts kann in vitro in einem organotypischen Modell der menschlichen Haut untersucht werden. Das Prinzip des Tests ist das folgende: ein Auftragen von gereiniger Collagenase auf einen Schnitt wird von einem Abbau der endogenen Collagen-Fasern begleitet. Die Collagen-Fasern werden dann durch das Masson-Trickrom-Reagens gefärbt. Der Verdau der endogenen Collagen-Fasern durch die gereinigte Collagenase wird qualitativ durch morphologische Beobachtung und quantitativ durch Analyse von Bildern ausgewertet. Ein Produkt, das eine Anti-Collagenase-Aktivität aufweist, wird die Unversehrtheit der in Gegenwart des Enzyms gebrachten Collagen-Fasern partiell oder vollständig bewahren.
Die zu testenden Produkte wurden bei +4°C bis zu dem Zeitpunkt ihrer Verwendung aufbewahrt.
Es wurden drei Verdünnungen getestet: 0,01, 0,1 und 1% (Vol./Vol.).
Phosphoramidon, das als Referenzprodukt eingesetzt wird, stammte von SIGMA.
Die gereinigte Collagenase (Typ III, Fraktion A) stammte von SIGMA.
Das Inkubationsmedium der Schnitte von menschlicher Haut, welches im Folgenden als „Vehikel" bezeichnet wird, war der Puffer Tris-HCl, 0,15 M, pH 7,5, welcher 0,01 M Calciumchlorid enthielt.
Die Reagenzien von Analysenqualität stammten von CARLO ERBA, GIBCO oder SIGMA, sofern nicht anders angegeben.
Die Haut-Schnitte wurden ausgehend von einem Operationsüberbleibsel, welches nach einer kosmetischen Abdominaloperation erhalten wurde, hergestellt. Der Patient war eine Frau von 30 Jahren. Es wurden Haut-Explantate von 4 cm Durchmesser hergestellt. Sie wurden auf einen Korkträger gelegt und bei –80°C eingefroren. Mit einem Kryomikrotom wurden quer verlaufende Schnitte von 6 μm Dicke hergestellt. Sie wurden auf Glasscheiben fixiert und während des Assays mit dem Vehikel hydratisiert gehalten.
Die zu testenden Proben wurden allesamt in Ethanol aufgenommen, bevor sie in dem Versuchspuffer verdünnt wurden.

– Die Endkonzentration an Ethanol wurde konstant und gleich 0,1% (Vol./Vol.) bei den beiden schwächsten Verdünnungen des peptidischen Extrakts (0,01 und 0,1%, Vol./Vol.) gehalten;
– sie wurde konstant und gleich 1% (Vol./Vol.) bei der höchsten Verdünnung (1%, Vol./Vol.) gehalten.
– Es wurden „Ethanol-Vergleichsproben" mit einer Konzentration von 0,1 und 1% (Vol./Vol.) hergestellt.
– Das Phosphoramidon wurde direkt in dem Vehikel aufgenommen.

Der peptidische Extrakt wurde in Konzentrationen von 0,01, 0,1 und 1% (Gew./Vol.) getestet.
Phosphoramidon wurde in einer Konzentration von 10^–3M getestet.
Man hatte folglich die folgenden Proben:

Extrakt: Puffer; Ethanol (0,1%, Vol./Vol., oder 1%, Vol./Vol.); Enzymextrakt (0,01, 0,1 und 1%, Gew./Vol.);
Enzym-Vergleichsprobe: Puffer; Ethanol (0,1%, Vol./Vol.); Enzym;
Ethanol-Vergleichsprobe (ohne Enzym): Puffer; Ethanol (0,1% oder 1%, Vol./Vol.);
Ref.-Produkt: Puffer; Ethanol; Enzym; 10^–3M Phosphoramidon

Die Verdünnungen der zu testenden Produkte, von Ethanol und des Referenzprodukts wurden auf die Hautschnitte in einer Menge von 100 μl pro Schnitt aufgetragen und zehn Minuten bei 37°C vorinkubiert. Streifen von Filterpapier (0,16 cm² Oberfläche), die in Vehikel allein (Vergleichsprobe ohne Enzym) oder solches, das Collagenase in einer Konzentration von 50 internationalen Einheiten (IE)/ml (Enzym-Vergleichsprobe) enthielt, eingetaucht worden waren, wurden dann auf die Schnitte gelegt. Die Scheiben wurden 3 h in eine feuchte Kammer bei 37°C gelegt.
Nach der Inkubation wurden die Schnitte mit dem Inkubationsmedium gespült und mit dem Masson-Trickrom-Reagens gefärbt. Die Aktivität des Enzyms in Abwesenheit und in Gegenwart von Extrakt, von Ethanol oder des Referenzprodukts wurde durch mikroskopische Beobachtung ausgewertet und gemäß der folgenden Skala aufgezeichnet:

0: keinerlei enzymatischer Verdau
+: schwacher enzymatischer Verdau
++: mittlerer enzymatischer Verdau
+++: starker enzymatischer Verdau.

Es wurden Photographien von den Schnitten erstellt.
Die Aktivität der Collagenase in Abwesenheit und in Gegenwart der zu testenden Produkte, von Ethanol oder des Referenzprodukts wurden durch Analyse von Bildern ausgewertet. Das Bild der gefärbten Schnitte wurde auf einem Videoschirm digitalisiert; die Bildanalyse-Software (IMAGENIA 2000, BIOCOM^®) hat erlaubt, die durch die intakten Collagen-Fasern eingenommene Oberfläche zu berechnen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz von intakten Collagen-Fasern pro optisches Feld ausgedrückt.
Der Prozentsatz der Inhibition der Collagenase-Aktivität der Extrakte in unterschiedlichen Konzentrationen, von Ethanol und des Referenzprodukts wurde mit Hilfe der folgenden Formeln berechnet:
Für das Referenzprodukt (direkt in dem Vehikel aufgenommen) wird der Prozentsatz der Inhibition durch die folgende Formel berechnet:
Für die in dem 0,1% (Vol./Vol.) Ethanol) enthaltenden Vehikel verdünnten Extrakte wird der Prozentsatz der Inhibition durch die folgende Formel berechnet:
Für die in dem 1% (Vol./Vol.) Ethanol) enthaltenden Vehikel verdünnten Extrakte wird der Prozentsatz der Inhibition durch die folgende Formel berechnet:
Die anti-Collagenase-Aktivität des Extrakts bei verschiedenen Konzentrationen wurde in einem organotypischen Modell der menschlichen Haut untersucht.
In Abwesenheit von Collagenase (Vehikel-Vergleichsprobe) waren die Collagen-Fasern intakt. In Gegenwart von Collagenase (Enzym-Vergleichsprobe) waren die Collagen-Fasern nahezu vollständig abgebaut). Dieses Ergebnis war erwartet und validierte den Versuch.
Phosphoramidon in einer Konzentration von 10^–3 M, welches als Referenzprodukt eingesetzt wurde, inhibierte die Aktivität der Collagenase um 16%. Dieses Ergebnis war erwartet und schloss die Validierung des Versuchs ab.
Ethanol, das als intermediäres Verdünnungsmittel der zu testenden Produkte eingesetzt wurde, wurde in Konzentrationen von 0,1 und 1% (Vol./Vol.) getestet. Es hatte keinerlei Wirkung auf den Abbau der Collagen-Fasern durch die Collagenase.
Der in Konzentrationen von 0,01, 0,1 und 1% (Gew./Vol.) getestete peptidische Extrakt inhibierte die Aktivität der Collagenase um 2, 24 bzw. 65%. Die morphologische Beobachtung führte zu dem gleichen Ergebnis.
Als Schlussfolgerung zeigte der peptidische Extrakt A unter den eingehaltenen Versuchsbedingungen bei geringen Konzentrationen eine bedeutende Anti-Collagenase-Aktivität.
Die Inhibitions-Ergebnisse des peptidischen Extrakts, von Ethanol und von Phosphoramidon auf den Verdau der Collagen-Fasern in der Dermis durch die Collagenase sind in der nachfolgende Tabelle zusammengestellt:
Tabelle 4
V – Anti-Metalloprotease MMP-2- und -MMP-9-Aktivität der Peptide von Lupine – Extrakte A, B und C
Die MMP-2 oder Gelatinase A und die MMP-9 oder Gelatinase B sind Metalloproteasen, die spezielle Bestandteile der extrazellulären Matrix abbauen: die MMP-2 baut Gelatine (= denaturiertes Collagen), die Collagene I, IV, VII und XI, Fibronectin, Laminin und Elastin ab; die MMP-9 baut Gelatine, die Collagene IV, V und XIV und Elastin ab. Sie spielen eine bedeutende Rolle bei dem „photo-aging" und bei der Proliferation der Endothelzellen.
Die anti-MMP-2- und anti-MMP-9-Aktivität der zu testenden Produkte wurde in vitro in einem biochemischen Modell vom Screening-Typ, welches auf der Verwendung einer gereinigten humanen MMP-2 und einer rekombinanten humanen MMP-9 und des Substrats von diesen Letzteren, Gelatine, welche mit Fluorescein konjugiert ist (Kit EnzChek^TM Gelatinase/Collagenase, MOLECULAR PROBES), beruht, gemessen.
Die ausgehend von einem humanen Fibrosarkom gereinigte MMP-2 stammte von BOEHRINGER MANNHEIM.
Die rekombinante humane MMP-9 stammte von R&D SYSTEMS.
Die ausgehend von Schweinehaut gereinigte und mit Fluorescein konjugierte DQ-Gelatine wurde mit dem Kit EnzChek^TM Gelatinase/Collagenase, (MOLECULAR PROBES) geliefert.
Der Reaktionspuffer für die Untersuchung der Aktivität der MMP-2 (TpR1) wurde aus 50 mM Tris-HCl, 0,05 (Gew./Vol.) Triton X100 und 5 mM CaCl₂, pH 7,5, gebildet.
Der Reaktionspuffer für die Untersuchung der Aktivität der MMP-9 (TpR2) wurde aus 50 mM Tris-HCl, 0,05 (Gew./Vol.) Brij 35 und 5 mM CaCl₂, pH 7, 4, gebildet.
Vorbereitung der zu testenden Produkte und des Referenzprodukts
1,10-Phenanthrolin wurde in den Reaktionspuffern TpR1 und TpR2 solubilisiert. Es wurde in Konzentrationen von 8 und 80 μg/ml getestet.
Die peptidischen Extrakte A, B und C wurden in den Reaktionspuffern TpR1 und TpR2 solubilisiert. Sie wurden in Konzentrationen von 0,01, 0,1 und 1% (Gew./Vol.) getestet.
MMP-2
Vor ihrer Verwendung wurde die MMP-2 durch eine dreißigminütige Inkubation bei 37°C in Gegenwart von in dem Puffer TpR1 auf 2,5 mM verdünntem APMA aktiviert.
Die Verdünnungen der zu testenden Produkte oder des Referenzprodukts wurden mit DQ-Gelatine, verdünnt auf 25 μg/ml, und der aktivierten MMP-2, verdünnt auf 1,25 μg/ml, 24 h bei 37°C inkubiert.
Eine Vergleichsprobe, die der Mischung „MMP-2 + DQ-Gelatine" entsprach, wurde parallel dazu inkubiert.
Für jede Versuchsbedingung wurden Proben, die in der Folge als „Proben ohne Enzym" bezeichnet werden, in Gegenwart von DQ-Gelatine und in Abwesenheit von aktivierter MMP-2 inkubiert. Diese Proben erlaubten, die störenden Beeinflussungen der Auswertungsmethode der Wirkungen (Fluorimetrie) durch die zu testenden Produkte zu messen.
Jede Versuchsbedingung wurde dreifach getestet.
MMP-9
Die Verdünnungen der zu testenden Produkte oder des Referenzprodukts wurden mit DQ-Gelatine, verdünnt auf 25 μg/ml, und der MMP-9, verdünnt auf 0,25 μg/ml, 24 h bei 37°C inkubiert.
Eine Vergleichsprobe, die der Mischung „MMP-9 + DQ-Gelatine" entsprach, wurde parallel dazu inkubiert.
Für jede Versuchsbedingung wurden Proben, die in der Folge als „Proben ohne Enzym" bezeichnet werden, in Gegenwart von DQ-Gelatine und in Abwesenheit von MMP-9 inkubiert. Diese Proben erlaubten, die störenden Beeinflussungen der Auswertungsmethode der Wirkungen (Fluorimetrie) durch die zu testenden Produkte zu messen.
Jede Versuchsbedingung wurde dreifach getestet.
Nach 24 h wurde das dem Abbau der DQ-Gelatine entsprechende Signal durch Fluorimetrie (Anregung: 485 nm und Emission: 595 nm) gemessen. Bei jeder Probe wurde der für die „Proben ohne Enzym" erhaltene Wert abgezogen.
Die Ergebnisse sind als Fluoreszenz-Einheiten pro Probe und als Prozentsatz der Abweichung bezogen auf die Vergleichsgruppe ausgedrückt.
Die Gruppen von Daten (Vergleichsgruppe und behandelte Gruppen) wurden durch eine Varianzanalyse mit einem Faktor (ANOVA 1, p<0,05), gefolgt von einem Dunnett-Test, verglichen.
Die Ergebnisse sind nachfolgend angegeben:
V.1 – anti-MMP-2-Aktivität
(1) Aktivität ausgedrückt bezogen auf die Vergleichsgruppe in Abwesenheit von Inhibitor der MMP-2.
Schlussfolgerung

– Die 10 Gew.%-ige Lösung von Lupinen-Extrakt C, der in Konzentrationen von 0,01 und 0,1% (Vol./Vol.) getestet wurde, weist keine anti-MMP-2-Aktivität auf. Getestet in einer Konzentration von 1% (Vol./Vol.), inhibiert er die MMP-2 zu 57%.
– Die 10 Gew.%-ige Lösung von Lupinen-Extrakt A, der in Konzentrationen von 0,01 bis 0,1% (Vol./Vol.) getestet wurde, weist keine anti-MMP-2-Aktivität auf. Getestet in einer Konzentration von 1% (Vol./Vol.), inhibiert er die MMP-2 zu 32%.
– Die 10 Gew.%-ige Lösung von Extrakt B, der in einer Konzentration von 1% getestet wurde, inhibiert die MMP-2 zu 23%.
– Phenanthrolin, getestet in Konzentrationen von 8 und 80 μg/ml, inhibiert die Aktivität der MMP-2 um 32 bzw. 73%. Dieses Ergebnis, das erwartet worden war, validiert den Versuch.

V.2 – anti-MMP-9-Aktivität
(1) Aktivität ausgedrückt bezogen auf die Vergleichsgruppe in Abwesenheit von Inhibitor der MMP-9.
Schlussfolgerung

– Die 10 Gew.%-ige Lösung von Lupinen-Extrakt A, der in Konzentrationen von 0,01 und 0,1% (Vol./Vol.) getestet wurde, weist keine anti-MMP-9-Aktivität auf. Getestet in einer Konzentration von 1% (Vol./Vol.), inhibiert er die MMP-9 zu 39%.
– Die 10 Gew.%-ige Lösung von Lupinen-Extrakt B, der in Konzentrationen von 0,01 und 0,1% (Vol./Vol.) getestet wurde, weist keine anti-MMP-9-Aktivität auf. Getestet in einer Konzentration von 1% (Vol./Vol.), inhibiert er die MMP-9 zu 73%.

Phenanthrolin, getestet in Konzentrationen von 8 und 80 μg/ml, inhibiert die Aktivität der MMP-9 um 80 bzw. 76%. Dieses Ergebnis, das erwartet worden war, validiert den Versuch.
VI – Auswertung der Wirkung der Lupinen-Peptide auf die Menge von MMP-1, –9 und –3 in mit UVR-Strahlen bestrahlten humanen Fibroblasten
Die Untersuchung wurde an humanen Dermis-Fibroblasten in Monolayer-Kultur ausgeführt. Die Zellen wurden 1 h bei 37°C in Gegenwart der Referenzprodukte und des zu testenden Produkts vorinkubiert. Dann wurden die Zellen mit einer einmaligen Dosis von 10 J/cm² UVA-Strahlen in Gegenwart des zu testenden Produkts und der Referenzprodukte bestrahlt.
Unmittelbar nach der Bestrahlung wurden die Zellen 48 h bei 37°C inkubiert, stets in Gegenwart des zu testenden Produkts und der Referenzprodukte.
Die quantitative Bestimmung der verschiedenen MMPs erfolgt in den Kulturmedien mittels spezifischer ELISA-Kits (Amersham).
Referenzprodukte und zu testendes Produkt
1,10-Phenanthrolin, das in einer Konzentration von 80 μg/ml getestet wurde, ein nicht-spezifischer Inhibitor der MMPs, wurde als Referenzprodukt verwendet.
Die Mischung Retinsäure, 10 μM + EGF, 10 ng/ml, wurde aufgrund ihres Induktionsvermögens der TIMP1 (TIMP1, Tissue Inhibitor of MMP, physiologischer Inhibitor der MMPs) eingesetzt.
Eine Stammlösung, die 10% (Gew./Vol.) Lupinen-Peptide enthielt, wurde in entionisiertem Wasser hergestellt. Ausgehend von dieser Lösung wurden Verdünnungen in dem Kulturmedium der Fibroblasten hergestellt. Der peptidische Extrakt von Lupine wurde in Konzentrationen von 0,5, 1 und 2% (Vol./Vol.) getestet.
Die bestrahlten oder nicht bestrahlten Vergleichskulturen wurden parallel dazu in Abwesenheit der Referenzprodukte und des zu testenden Produkts inkubiert.
Datenverarbeitung
Die Gruppen von Daten (Vergleichsgruppe und behandelte Gruppen) wurden durch eine Varianzanalyse mit einem Faktor (ANOVA 1, p<0,05), gefolgt von einem Dunnett-Test, verglichen. Die Wirkungen der Referenzprodukte und des zu testenden Produkts wurden so mit jenem, das in der Gruppe „bestrahlte Zellen" erhalten worden war, verglichen.
Ergebnisse
Sie sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt und die Ergebnisse sind als % bezogen auf die Gruppe „bestrahlte Zellen" ausgedrückt.
Schlussfolgerungen
1,10-Phenanthrolin, getestet in einer Konzentration von 80 μg/ml, inhibierte die Sekretion von MMP-1 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 99%, die Sekretion von MMP-9 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 92% und die Sekretion von MMP-3 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 97%.
Die Mischung Retinsäure, 10 μM + ETF, 10 ng/ml inhibierte die Sekretion von MMP-1 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 58%, die Sekretion von MMP-9 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 67% und die Sekretion von MMP-3 durch die bestrahlten Fibroblasten zu 44%.
Diese Ergebnisse waren erwartet und validierten die Reaktivität des Versuchssystems.
Die Bestrahlung mit der Dosis von 10 J/cm² erhöhte die jeweiligen Mengen von MMP-1, –9 und –3, die durch die Fibroblasten sekretiert wurden, um einen Faktor von 4,10, 2,42 bzw. 1,13. Diese Ergebnisse waren erwartet und validierten das Versuchssystem, was die Induktion der MMP-1, –9 und –3 durch die UVA-Strahlen angeht.
Der peptidische Extrakt von Lupine, der in Konzentrationen von 0,5, l und 2% (Vol./Vol.) getestet wurde, verringerte die Menge von MMP-1, die durch die Fibroblasten sekretiert wurde, um 96, 97 bzw. 97% (p<0,05).
Der peptidische Extrakt von Lupine, der in Konzentrationen von 0,5, l und 2% getestet wurde, verringerte die Menge von MMP-9, die durch die Fibroblasten sekretiert wurde, um 83, 98 bzw. 100 (p<0,05).
Der peptidische Extrakt von Lupine, der in Konzentrationen von 0,5, l und 2% getestet wurde, verringerte die Menge von MMP-3, die durch die Fibroblasten sekretiert wurde, um 97, 100 bzw. 98% (p<0,05).
So zeigt unter den eingehaltenen Versuchsbedingungen der peptidische Extrakt von Lupine bedeutende inhibitorische Eigenschaften gegenüber der Produktion der MMP-1, –9 und –3 durch die mit UVA-Strahlen bestrahlten humanen Dermis-Fibroblasten.
VII – Formulierungsbeispiele für eine topische Verwendung

Die Prozentsätze sind bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung ausgedrückt. Der peptidische Extrakt von Lupine wird in Form einer 10 Gew.%-igen wässrigen Lösung gemäß der Erfindung oder eines lyophilisierten Pulvers, welches als peptidischer Extrakt in Pulverform bezeichnet wird, eingesetzt. 1. Anti-Rötungs-Creme für normale Haut

Wasser	auf 100,000
Pentaerythrityltetraoctanoat	15,0 bis 5,0
Glycerylstearat	10,0 bis 2,0
Isodecylneopentanoat	10,0 bis 2,0
Propylenglycol	1,0 bis 3,0
Dextrin	1,0 bis 3,0
Cyclomethicon	1,0 bis 3,0
Soja-Extrakt („Soja-Glycine")	0,1 bis 10,0
Peptidischer Extrakt von Lupine (10%-ige wässr. Lsg.)	0,1 bis 10,0
Titandioxid	1,0 bis 3,0
Candelilla (Euphorbia cerifora)-Wachs	1,0 bis 3,0
Reisstärke (Oryza sativa)	1,0 bis 3,0
Unverseifbares Sojaöl („Glycine Soja")	0,01 bis 10,0
Capryl-/Caprintriglyceride	0,5 bis 5,0
PEG-100-stearat	0,5 bis 5,0
Extrakt von Sophora Japonica	0,1 bis 10,00
Stearinsäure	0,5 bis 1,0
Tocopherylacetat	0,1 bis 1,0
Phenoxyethanol	0,1 bis 1,0
CI 77891	0,1 bis 1,0
Xanthan-Gummi	0,1 bis 0,5
Dimethiconol	0,1 bis 0,5
Polyacrylamid	0,1 bis 0,5
Glimmer	0,1 bis 0,5
Ceteareth-20	0,1 bis 0,5
Chlorphenesin	0,1 bis 0,5
Carbomer	0,1 bis 0,5
Octylpalmitat	0,1 bis 0,5
Tromethamin	0,1 bis 0,5

Bienenwachs (Beeswax)	0,1 bis 0,5
C13-C14-Isoparaffin	0,1 bis 0,5
DEA-Cetylphosphat	0,1 bis 0,5
Cetylalkohol	0,1 bis 0,5
Glucose	0,1 bis 0,5
Parfum	0,1 bis 0,5
Dinatrium-EDTA	0,1 bis 0,5

2. Anti-Alter-Präventionscreme

Wasser	auf 100,00000
Pentaerythrityltetraoctanoat	3,0 bis 15,0
Isodecylneopentanoat	3,0 bis 15,0
Squalan	1,0 bis 10,0
Dextrin	1,0 bis 10,0
Cyclomethicon	1,0 bis 10,0
Cetearylalkohol	1,0 bis 10,0
Peptidischer Extrakt von Lupine (10%-ige wässr. Lsg.)	0,1 bis 10,0
Ascorbylglucosid	0,1 bis 10,0
Glycerin	1,0 bis 10,0
Laureth-23	1,0 bis 10,0
Myristylmyristat	1,0 bis 10,0
Cyclopentasiloxan	1,0 bis 10,0
Nylon-6	1,0 bis 10,0
Avocado-Furan	0,01 bis 10,0
Phenoxyethanol	0,1 bis 1,0
Cetearylglucosid	0,1 bis 1,0
Parfum	0,1 bis 1,0
Bienenwachs (Beeswax	0,1 bis 1,0
Methylparaben	0,1 bis 0,5
Natriumcitrat	0,1 bis 0,5
Dimethiconol	0,1 bis 0,5
Glycerylstearat	0,1 bis 0,5
Dinatrium-EDTA	0,1 bis 0,5
Propylparaben	0,1 bis 0,5
Natriumhydroxid	0,1 bis 0,5
Acrylate/C10-30-Alkylacrylate-Kreuzpolymere	0,1 bis 0,5
Xanthan-Gummi	0,1 bis 0,5

Glucose

0,1 bis 0,5

3. Anti-Alter-Creme für reife Haut

Wasser	auf 100,0000
Pentaerythrityltetraoctanoat	1,0 bis 10,0
Isodecylneopentanoat	1,0 bis 10,0
Hydrierte Kokosnuss-Glyceride	1,0 bis 10,0
Simmondsia chinensis (Jojoba)-Samenöl	1,0 bis 10,0
Squalan	1,0 bis 10,0
Glycerin	1,0 bis 10,0
Cyclomethicon	1,0 bis 5,0
Cetearylalkohol	1,0 bis 5,0
Myristylmyristat	1,0 bis 5,0
Laureth-23	1,0 bis 5,0
Siliciumdioxid	1,0 bis 5,0
Peptidischer Extrakt von Lupine (10%-ige wässr. Lsg.)	0,1 bis 10,0
Sklerotium-Gummi	0,1 bis 1,0
Rvodaco-Furan	0,01 bis 10,0
Salicylsäure	0,1 bis 10,0
Bienenwachs (Beeswax)	0,1 bis 10,0
Polyacrylamid	0,1 bis 1,0
Phenoxyethanol	0,1 bis 1,0
Glycerylstearat	0,1 bis 1,0
Retinolpalmitat	0,01 bis 5,0
Cetearylglucosid	0,01 bis 5,0
Nylon-6	0,01 bis 5,0
Titandioxid	0,01 bis 5,0
Parfum	0,1 bis 5,0
Tocopherylacetat	0,1 bis 5,0
Kaliumsorbat	0,1 bis 5,0
Methylparaben	0,1 bis 5,0
C13-C14-Isoparaffin	0,1 bis 5,0
CI 77891	0,1 bis 5,0
Dimethiconol	0,1 bis 5,0
Propylparaben	0,1 bis 5,0
Natriumhydroxid	0,1 bis 5,0

Laureth-7	0,1 bis 5,0
Cetearylalkohol	0,1 bis 5,0
Cetylpalmitat	0,1 bis 5,0
Kokosnuss-Glyceride	0,1 bis 5,0
Dinatrium-EDTR	0,1 bis 5,0
CI 77491	0,1 bis 5,0
Citronensäure	0,1 bis 5,0

4. Anti-Rötungs-Creme für trockene bis sehr trockene Haut

Wasser	auf 100,00000
Petrolat	1,0 bis 10,0
Hydrierte Kokosnuss-Glyceride	1,0 bis 10,0
Isodecylneopentaonat	1,0 bis 10,0
Simmondsia chinensis (Jojoba)-Öl	1,0 bis 2,0
Butylenglycol	1,0 bis 5,0
Cetearylalkohol	1,0 bis 5,0
Glycerin	1,0 bis 10,0
Squalan	1,0 bis 10,0
Peptidischer Extrakt von Lupine (10%-ige wässr. Lsg.)	0,1 bis 10,0
Laureth-23	1,0 bis 10,0
Titandioxid	1,0 bis 10,0
Unverseifbares Öl von „Glycine Soja" (Soybean)	0,1 bis 10,0
Capryl-/Caprintriglyceride	1,0 bis 5,0
Phenoxyethanol	0,1 bis 1,0
Cetearylglucosid	0,1 bis 1,0
Sojabohnenextrakt	0,1 bis 10,0
Parfum	0,1 bis 1,0
Sophora japonica	0,1 bis 10,0
Tocopherylacetat	0,1 bis 1,0
Candelilla-Wachs	0,1 bis 1,0
CI 77891	0,1 bis 0,5
Methylparaben	0,1 bis 0,5
Glimmer	0,1 bis 0,5
Propylparaben	0,1 bis 0,5
Ethylhexylpalmitat	0,1 bis 0,5
Chlorphenesin	0,1 bis 0,3
Acrylate/C10-30-Alkylacrylate-Kreuzpolymere	0,1 bis 0,3

Xanthan-Gummi	0,1 bis 0,3
Dinatrium-EDTA	0,1 bis 0,3
Natriumhydroxid	0,1 bis 0,3

VII – Beispiele von Mundspülungslösungen

Die Prozentsätze sind bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung ausgedrückt. Der peptidische Extrakt von Lupine wird in Form einer 10 Gew.%-igen wässrigen Lösung gemäß der Erfindung oder eines lyophilisierten Pulvers, welches als peptidischer Extrakt in Pulverform bezeichnet wird, eingesetzt. 1.Peptidischer Extrakt von Lupine, 10%-ige wässrige Lösung + Antiseptikum (Triclosan) + Antiplaque-Mittel (Gantrez S97BR^®)

Peptidischer Extrakt von Lupine	2
Ethylalkohol	10
Glycerin	10
Hydriertes Rizinusöl, ethoxyliert mit 40 Molen EO (Cremophor co410)	0,5
Poly(Methylvinylether/Maleinsäure) (Gantrez S97BF^®)	0,2
Soda	0, 15
Natriumfluorid	0,05
Zimt-Minze-Arome	0,1
Triclosan	0,03
Zinkchlorid	0,01
Natriumsaccharin	0,01
Farbstoff C.I. 16255 (E 124)	0,0025
Gereinigtes Wasser auf	100

2. Peptidischer Extrakt von Lupine, 10%-ige wässrige Lösung + Antiseptikum

Peptidischer Extrakt von Lupine	2
Ethylalkohol	10
Glycerin	10
Hydriertes Rizinusöl, ethoxyliert mit 40 Molen EO (Cremophor co410)	0,3
Natriumfluorid	0,05
Zimt-Minze-Arome	0,1

Triclosan	0,03
Zinkchlorid	0,01
Natriumsaccharin	0,01
Farbstoff C.I. 16255 (E 124)	0,0025
Gereinigtes Wasser	auf 100

3. Peptidischer Extrakt von Lupine in Pulverform + Antiseptikum (Cetylpyridiniumchlorid)

Peptidischer Extrakt von Lupine	1
Ethylalkohol	10
Glycerin	8
Hydriertes Rizinusöl, ethoxyliert mit 40 Molen EO (Cremophor co410)	0,1
Natriumfluorid	0,05
Zimt-Minze-Arome	0,1
Cetylpyridiniumchlorid	0,05
Zinkchlorid	0,01
Natriumsaccharin	0,01
Farbstoff C.I. 16255 (E 124)	0,0025
Gereinigtes Wasser auf	100

IX – Beispiele von Zahnpasten

Die Prozentsätze sind bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung ausgedrückt. Der peptidische Extrakt von Lupine wird in Form einer 10 Gew.%-igen wässrigen Lösung gemäß der Erfindung oder eines lyophilisierten Pulvers, welches als peptidischer Extrakt in Pulverform bezeichnet wird, eingesetzt. 1. Peptidischer Extrakt von Lupine in Pulverform + Fluoride

Peptidischer Extrakt von Lupine	1
Natriummonofluorphosphat	0,75
Natriumfluorid	0,10
70%-iges Sorbitol	35
Synthetisches Siliciumdioxid mit hohem Schleifvermögen	13
Synthetisches Siliciumdioxid mit geringem Schleifvermögen	5
Natriumcarboxymethylcellulose	1,6
Natriumlaurylsulfat	1

Menthol-Aroma	0,85
Titandioxid	0,5
Natronlauge	0,5
Natriumcyclamat	0,3
Menthol	0,15
Natriumsaccharin	0,07
Gereinigtes Wasser	auf 100

2. Peptidischer Extrakt von Lupine, 10%-ige wässrige Lösung, + Fluoride

Peptidischer Extrakt von Lupine	2
Natriummonofluorphosphat	0,75
Natriumfluorid	0,10
70%-iges Sorbitol	35
Synthetisches Siliciumdioxid mit hohem Schleifvermögen	13
Synthetisches Siliciumdioxid mit geringem Schleifvermögen	5
Natriumcarboxymethylcellulose	1,6
Natriumlaurylsulfat	1
Menthol-Aroma	0,85
Titandioxid	0,5
Natronlauge	0,5
Natriumcyclamat	0,3
Menthol	0,15
Natriumsaccharin	0,07
Gereinigtes Wasser	auf 100

Claims

Zusammensetzung, umfassend einen peptidischen Extrakt von Lupine (Lupinus) und gegebenenfalls einen inerten Träger, für deren Verwendung als Arzneimittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 für die Behandlung von Menschen oder von Säugetieren, die unter einer Erkrankung leiden, die mit einer übermäßigen Zerstörung von Kollagen oder mit einer übermäßigen Zerstörung der Stütz-Makroproteine durch Metalloproteasen verbunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 für die Behandlung von Arthrose, von parodontalen Erkrankungen, von Schädigungen der Haut, von Entzündungskrankheiten, von Erkrankungen, die mit einer fehlerhaften Narbenbildung verbunden sind, von Erkrankungen, die mit einem Angriff des Zahnschmelzes verbunden sind, oder von Erkrankungen, die mit einer tumoralen oder pathologischen Angiogenese verbunden sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für eine topische äußerliche Anwendung oder für eine orale Verabreichung.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der peptidische Extrakt von Lupine wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80% Peptide umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide ein Molekulargewicht unter 10000 Dalton haben.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der peptidische Extrakt von Lupine die folgende Aminosäurezusammensetzung aufweist (als Gewichtsprozentsatz bezogen auf das Gesamtgewicht der Aminosäuren):
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der peptidische Extrakt von Lupine erhalten werden kann durch ein Verfahren, welches die folgenden Schritte umfasst: – Herstellung eines Presskuchens von den Lipiden befreiter und zerkleinerter Lupine oder eines (lipidhaltigen) mikronisierten Lupinenmehls; – Extraktion der löslichen Protein- und Ose-Fraktionen oder Ausfällung der Proteine am isoelektrischen Punkt, – gegebenenfalls Abtrennung der Proteinfraktion, – Hydrolyse der Proteinfraktion und gegebenenfalls Rückgewinnung, nach Filtration, des Proteinextrakts.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der peptidische Extrakt von Lupine durch Hydrolyse der Proteinfraktion der Lupine erhalten wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse der Proteinfraktion der Lupine eine enzymatische Hydrolyse ist.
Peptidischer Extrakt von Lupine, dadurch gekennzeichnet, dass er durch Hydrolyse der Proteinfraktion der Lupine erhalten wird.
Extrakt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse der Proteinfraktion der Lupine eine enzymatische Hydrolyse ist.
Pharmazeutische, kosmetische oder nutrazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Extrakt, wie in einem der Ansprüche 11 und 12 definiert.
Verwendung eines peptidischen Extrakts von Lupine für die Herstellung einer pharmazeutischen, kosmetischen oder nutrazeutischen Zusammensetzung, welche für die Behandlung von Menschen oder von Säugetieren, welche unter einer Erkrankung oder einem Zustand leiden, die bzw. der mit einer übermäßigen Zerstörung von Kollagen oder mit einer übermäßigen Zerstörung der Stütz-Makroproteine durch Metalloproteasen verbunden ist, bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 14 für die Behandlung von Schädigungen der Haut, insbesondere von Schädigungen, die auf die intrinsische Alterung der Haut, auf die Alterung unter der Einwirkung der Sonnenstrahlung oder auf die schädlichen Wirkungen des Tabaks, der Verschmutzung oder von Stress zurückzuführen sind.