JP5329731B2

JP5329731B2 - ルピンのペプチド抽出物およびそれを含有する医薬組成物、化粧品組成物または栄養組成物

Info

Publication number: JP5329731B2
Application number: JP2000611925A
Authority: JP
Inventors: ムジカ、フィリップ; ピッキリーリ、アントワーヌ; ポール、フランソワ
Original assignee: ラボラトワールエクスパンシアンス
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2000-04-18
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2020-04-18
Also published as: KR100818010B1; US7029713B2; US20040101580A1; EP1171143B1; ATE279934T1; JP2002542199A; DE60015112T8; DE60015112D1; US7638149B2; WO2000062789A1; PT1171143E; EP1171143A1; KR20020030263A; ES2228500T3; DE60015112T2; US20050148498A1; FR2792202B1; FR2792202A1; EP1171143B9

Description

本発明は、抗メタロプロテアーゼ活性、詳細には抗コラゲナーゼ活性および抗ゼラチナーゼ活性を有する新規なペプチド抽出物に関する。本発明はまた、このような抽出物を含有する医薬組成物、化粧品組成物または栄養補給組成物（nutraceutical composition）に関し、より詳細には、関節症、歯周炎もしくは潰瘍などの炎症性疾患を治療することを意図した医薬組成物、あるいは光線性の老化であっても、そうでなくともよい老化または外部からの攻撃（タバコ、汚染など）によって加速される老化と闘うことを意図した化粧品組成物に関する。

該医薬組成物、化粧品組成物または栄養補給組成物はまた、病理学的もしくは見苦しい、血管新生（脈管増殖）（乾癬、腫瘍、全身紅色症（erythosis）、紅斑性挫瘡、しゅさ、レタノイン酸（retanoic acid）などの刺激原による局所処理）、瘢痕化欠損（cicatrization deficiency）、火傷、または歯のエナメル質の攻撃を治療することを意図している（Ch.M.Lapiere, Cours de biologie de la peau（Skin biology course）-COBIP INSERM U
346, Lyon 1999）。

メタロプロテアーゼは亜鉛およびカルシウム依存性エンドペプチダーゼのファミリーであり、これらは、結合組織マトリックスの多様な成分を分解するといった一体としての特性を有する（S.Charvatの論文、Metalloproteinases et epiderme（Metalloproteinases and epidermis）, 101-113頁 No.248-98, 1998, LyonI）。

メタロプロテアーゼはその基質の種類によって分類される：コラゲナーゼ（繊維状コラーゲン：例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−８）；ゼラチナーゼ（変性コラーゲン、ゼラチン：例えばＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）；ストロメリシン類（stromelysins）（フィブロネクチン、プロテオグリシン（proteoglycin）：例えばＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０）。メタロプロテアーゼは細胞外マトリックスの生理学的なリモデリング（低発現）または病理学的なリモデリング（強誘導）に用いられる。

メタロプロテアーゼは特に瘢痕化過程に関与し、ダメージを受けた組織を除去する。

ＭＭＰは無秩序に働き、その活性が制御されなければ、顕著な傷害を引起す。

更に、メタロプロテアーゼは、炎症性疾患（特に、関節炎および歯周炎）などの特定の生物学的障害（H.BIRKEDAL-HANSEN ら、Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 4(2)：197:250(1993)）、老化過程、特に、太陽放射の作用に関連した老化過程（MARTIN RIEGER; Allured's Cosmetics & Toiletries (登録商標), Vol.114, No.1/January 1999 またはG.J.FISHER ら、The New England Journal of Medicine, Vol.337, No.20 pp.1419-1428, “Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light”およびG.J.FISHER ら、the Society for Investigative Dermatology, Inc. 1988, pp.61-68 “Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that in duce A-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo”）、または急性および慢性の炎症（XIE ら; J.Biol.Chem. 273:pp.11576-11582;1998）ならびに水疱形成疾患（中毒性表皮壊死症）、炎症もしくは刺激の間の細胞過剰増殖と関連する病理、床ずれ、火傷および潰瘍に関与することが知られている。

同じことが、血管新生の内皮細胞の増殖にも当てはまり、その炎症過程または病理過程（乾癬、腫瘍）の増殖フェーズにおいて、該内皮細胞は、他の領域に移動するために、および微小管や毛細血管を形成するために、結合組織を破壊するＭＰＰを必要とする（Controlling the vasculature: angiogenesis, anti-angiogenesis and vascular targeting of gene therapy-T.P.D.FAN, R.JAGGAR および R.BICKNELL, TiPS-February 1995, Vol.16； Natural Products as angiogenesis inhibitors, D.H.PAPER, Planta Medical 64(1998) pp.686-695； Membrane-type matrix metalloproteinases in human dermal microvascular endothelial cells:expression and morphogenetic correlation-V.T.CHAN ら、J.I.D.111, pp.1153-1159,1998； Matrix metalloproteinases in blood vessel development in human fetal skin and in cutaneous tumors-T.V.KARELINA ら、J.I.D.;105,411-417,1995； Vascular profiferation and angiogenic factors in psoriasis, J.D.CREAMER および J.N.W.N.BARKER, Clinical and Experimental Dermatology, 1995, 20,pp.6-9）。

上記疾患のある種の治療において、メタロプロテアーゼ、特に、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、およびストロメリシンの阻害剤の役割も知られている。

本発明の目的は、コラゲナーゼまたはゼラチナーゼタイプのメタロプロテアーゼの新規な広域範囲のスペクトルをもつ阻害剤を提供することであり、該阻害剤は、コラーゲンまたは他の細胞外支持巨大タンパク質の過剰な分解もしくは病理学的な分解に関連した状態または疾患、あるいはこれらのタンパク質分解酵素の過剰発現に関連した他の任意の疾患に罹患したヒトまたは哺乳動物の治療を可能とする。

本発明の主題は、メタロプロテアーゼ、特に、コラゲナーゼまたはゼラチナーゼを阻害する活性を有することを特徴とするルピン（ルピナス（lupinus））のペプチド抽出物である。ルピンの種類として、特に、アルカロイド含量の少ないアレース（Ares）品種などの甘白（sweet white）ルピン属のもの（lupinus albus）が挙げられる。

本発明の主題は特に、ＤＱ−ゼラチンに対して精製Clostridium histolycumコラゲナーゼを阻害する活性を有することを特徴とするルピン（ルピナス）の新規ペプチド抽出物であり、該活性は、特に、濃度０．１％（ｗ／ｖ）以上で、２４時間で５０％超である。

一つの態様では、ルピンのこのペプチド抽出物は脂質が除去されている。

有利には、該ペプチド抽出物はペプチドを少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％含む。

これらのペプチドはルピンのタンパク質分画の加水分解によって得られる。

加水分解は、任意の適切な手段、特に酵素的加水分解によって行うことができる。

このようなルピンのペプチド抽出物の製造方法は以下の工程を含む：
−脂質を含まないルピン粗挽き粉（groung lupin meal）、またはルピン微粉（micronized lupin flour）（脂質を含む）を調製する工程、
−可溶性のタンパク質およびサッカリド分画を抽出する工程、または等電点に依り酸ｐＨ（４または５）で沈殿させる工程、
−必要に応じてタンパク質分画を分離する工程、
−タンパク質分画を加水分解する工程、および、必要に応じて濾過後、タンパク質抽出物を回収する工程。

本発明はまた、上記方法を用いて得ることができるタンパク質抽出物に関する。

概して、本発明は、脂質含有ルピン細粉、および糖類をも含有するペプチド抽出物を含む。

好ましくは、タンパク質抽出物は以下のアミノ酸組成を有する（アミノ酸全重量に対する重量％）。

本発明の主題はまた、上記ペプチド抽出物と、必要に応じて適切な生理学的に許容され得る不活性賦形剤とを含有する医薬組成物、化粧品組成物または栄養補給組成物である。

このような医薬組成物または皮膚化粧品組成物および栄養補給組成物は、コラーゲンの過剰な破壊および／または支持組織の過剰な破壊に関連した状態または疾患に罹患したヒトまたは哺乳動物を治療することを特に意図している。このような組成物は予防剤または治療剤として使用できる。

これらの状態または疾患のうちで、例えば、関節症、歯周疾患、皮膚傷害に関連した疾患、炎症性疾患、腫瘍関連もしくは病理学的な血管新生（全身紅色症、紅斑性挫瘡、毛細管拡張症、しゅさ、乾癬など）、瘢痕化欠損、潰瘍、火傷、水疱形成疾患、および歯のエナメル質の攻撃が挙げられる。

本発明はまた、老化による皮膚傷害、例えば、太陽放射の作用によって引起される傷害（光老化（photoaging））あるいは皮膚の内因性の有害効果またはタバコの有害効果によって引き起こされる傷害を処置するための化粧品組成物に関する。

該医薬組成物、皮膚化粧品組成物または化粧品組成物は、一態様では、局所塗布用製剤の形態である。それ故、本発明の主題は、個体の皮膚表面にこのような組成物を塗布することを含む化粧的処置のための方法である。

本発明によるペプチド抽出物はまた、局所または局部使用のために、例えば、歯周疾患を治療する場合、歯周ポケットに直接送達されるように、ポリマー賦形剤またはデリバリーシステム中に包含または処方されてもよい。

別の態様では、該医薬組成物は経口投与用製剤の形態である。

これらの組成物は、概して、錠剤、カプセルまたは軟膏の形態に処方され得る。

栄養補給組成物または食品組成物の場合には、従来使用され得る形態が利用できる。

本発明は、例示として本明細書中、以下に記載の実施例を用いて説明される。

Ｉ−ルピンのペプチド抽出物の製造
Ｉ．１−抽出物Ａ
−ルピンタンパク質の抽出と精製
本工程は、アルカリ性ｐＨで可溶な分画の水性可溶化、次いで不溶性成分からの分離を含む：
脂質を含まないルピン粗挽き粉を用い、１／１０（ｗ／ｗ）相当の粉／水の比でタンパク質をｐＨ９．０（水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを調整）で抽出する。溶液を室温で１時間攪拌しながらインキュベートする。次いで、粉の不溶部をスピン−乾燥によって可溶部から分離する。得られた固形残渣を洗浄する。可溶性の糖類およびタンパク質を含む可溶性分画を１００００ダルトンのカットオフ閾値を有する限外濾過モジュールで濾過し、可溶性糖類（限外濾過液）からタンパク質（保持物）を分離する。

−酵素的加水分解によるペプチドの製造と精製：
タンパク質を含む限外濾過の保持物を濃度１００ｇ／ｌに調整し、次いでAlcalase（登録商標）（NOVO NORDISK）の存在下、ｐＨ８．０、５５℃で約３時間加水分解する。加水分解後、酵素を８５℃で１５分間の加水分解によって変性させる。溶液が冷却するとすぐに、これに塩酸を加えて溶液を中和する。得られたペプチドをカットオフ閾値１００００ダルトンの限外濾過モジュールでの濾過に（diafiltration）よって精製する。次いで、得られる溶液をナノ濾過して、ペプチド分画を脱塩（塩化ナトリウムを除去する）し、ペプチド分画を濃縮する。最後に、３％活性炭を用いてペプチド溶液を脱色（５０℃、１時間）し、活性炭を濾過で除去する。

−ペプチド分画の滅菌とパッケージング：
パッケージングの前に、溶液を無菌的にマイクロ濾過（０．２μｍ）し、次いで保存剤の存在下、濃度１０％で滅菌容器に分配する。

Ｉ．２−抽出物Ｂ
脱色工程を削除すること以外は、抽出物Ａを得るために実行した記載方法に従い、ペプチド抽出物Ｂを得る。

Ｉ．３−抽出物Ｃ
精製工程、限外濾過工程および脱色工程を削除すること以外は、抽出物Ａを得るために実行した記載方法に従い、ルピンのペプチド抽出物Ｃを得る。

ＩＩ−ペプチド抽出物Ａの分析
次いで、乾燥抽出物を分析する。
提示：
−外観：非吸湿性均一粉末
−色：オフホワイト
−量：５ｇ
・化学組成
−全糖含量（アントロンを用いる試験）：＜１％
−クロライド含量（ＳＩＧＭＡキットｒｅｆ：９５５−３０）：６％
−水含量（１００℃、４時間）：最大８％
−ペプチド含量：８５％
・キャラクタリゼーション
−ｐＨ（溶液、２０ｇ／ｌ）：７．０６
−溶解度（浸透水）：＞１００ｇ／ｌ

ＩＩＩ − インビトロでのルピンペプチド−抽出物Ａの抗コラゲナーゼ活性および抗ゼラチン分解活性
精製コラゲナーゼおよび基質（基質としてフルオレセインと結合したゼラチン）（ＥｎｚＣｈｅｋ^TM ゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）の使用に基づく、スクリーニングタイプの生化学的なモデルにおいて、抗コラゲナーゼ活性をインビトロで測定した。Clostridium histolyticumからの精製コラゲナーゼをＥｎｚＣｈｅｋ^TMゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）で得た。この酵素は、コラーゲンＩＶ（表皮／真皮基底膜）およびゼラチンに二重機能性（double functionality）を有する。

ブタ皮膚から精製し、フルオレセインと結合させたＤＱ−ゼラチンをＥｎｚＣｈｅｋ^TMゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）で得た。

０・０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ₂および０．２ｍＭのアジ化ナトリウムからなる反応緩衝液（ｐＨ７．６）をＥｎｚＣｈｅｋ^TMゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）で得た。

ペプチド抽出物を反応緩衝液中に可溶化した。これを０．００４；０．０２；０．０４；０．２および０．４％（ｗ／ｖ）で試験した。

試験抽出物の希釈溶液を１ｍｇ／ｍｌのＤＱ−ゼラチンおよび０．２Ｒｕ／ｍｌのコラゲナーゼと共に室温で１時間、２時間および２４時間インキュベートした。

「コラゲナーゼ＋ＤＱ−ゼラチン」混合物に対応する対照を並行してインキュベートした。

各実験条件について、サンプル（以下「酵素無しのサンプル」と呼ぶ）をＤＱ−ゼラチンの存在下およびコラゲナーゼの非存在下でインキュベートした。

各実験条件を３連で行った。

１時間、２時間および２４時間後、ＤＱ−ゼラチンの分解に対応するシグナルを蛍光定量法（励起：４８５ｎｍ、発光：５９５ｎｍ）で測定した。各サンプルについて、「酵素無しのサンプル」で得た値を引いた。

結果を蛍光単位／サンプルとして、および対照群に対する変動の％として表した。

データ群（対照群および処理群）を分散の因子解析（ＡＮＯＶＡ１、ｐ＜０．０５）、次いでＤｕｎｎｅｔｔ試験によって比較した。このように、抽出物の効果を対照群で得た効果と比較した。

０．００４〜０．２％（ｗ／ｖ）で試験したペプチド抽出物は、用量依存性の抗コラゲナーゼ活性および抗ゼラチン分解活性を有した。以下の表２に示したように効果は２４時間時点で最大であった。

結論として、選択した実験条件下では、０．００４と０．４％（ｗ／ｖ）との間で試験したタンパク質抽出物は用量依存性の抗ゼラチナーゼ／コラゲナーゼ活性を有していた。非特異的なコラゲナーゼと比較したルピンペプチドの良好な効果／用量／時間の比に特に注目する：例えば、２４時間で、０．０４％は、クロストリジウムコラゲナーゼのゼラチン分解活性を９３％阻害し、２時間では５２％阻害する。

同じペプチド抽出物による他の試験を濃度０．０１、０．０５、０．１、０．５および１％（ｗ／ｖ）で行い、結果を以下の表３および添付の図１にも示す。この図は、非特異的コラゲナーゼの阻害の動態（kinetics）− ペプチド抽出物の濃度の影響を示す。ｙ軸はゼラチン分解活性（％）を表し、ｘ軸はインキュベーション時間（ｈ）を表す。

選択した実験条件下では、０．０１と０．５％（ｗ／ｖ）との間で試験したペプチド抽出物は、用量依存性および時間依存性の抗ゼラチナーゼ／コラゲナーゼ活性を有する。

非特異的阻害剤１，１０−フェナントロリンを全ての試験で参照抗ＭＭＰ製品として使用した。得られた結果は、予期したものと一致し、試験は有効であった。

ＩＶ − ヒト器官型モデル（organotypic model）における、ルピンペプチド−抽出物Ａの特異的抗コラゲナーゼ活性
皮膚老化はとりわけ、真皮のコラーゲン繊維の分解および他の巨大タンパク質の分解に続く皮膚の機械的性質の修飾によって特徴付けられる。この分解には、内因性コラゲナーゼが関与する（Grymes,R.A., Kronberger A. および Bauer E.A. -Collagenases in disease- in “Connective Tissue Diseases of the skin” Lapiere C.M. および Krieg T.編、1993, 69-85 ； G.Fischer および J.Voorhees “Pathiophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light” および “Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce A-1-regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo”）。

抗コラゲナーゼ活性を有する製品は、皮膚老化の兆候と闘うことが想定され得る。

試験製品の抗コラゲナーゼ活性は、ヒト皮膚の器官型モデルにおいてインビトロで研究できる。試験の原理は以下のとおりである：切片への精製コラゲナーゼの塗布には内因性コラーゲン繊維の分解が伴う。次いで、マソントリクローム（Masson trichrome）でコラーゲン繊維を染色する。精製コラゲナーゼによる内因性コラーゲン繊維の消化は、形態学的観察によって定性的に評価され、画像解析によって定量的に評価される。抗コラゲナーゼ活性を有する製品は、配置したコラーゲン繊維の完全性を該酵素の存在下で部分的または全体的に保存するであろう。

試験製品をそれらを使用するまで＋４℃で保存した。

３つの希釈溶液を試験した：０．０１；０．１および１％（ｖ／ｖ）。

参照製品として用いたホスホラミドン（phosphoramidon）は、ＳＩＧＭＡから得た。

精製コラゲナーゼ（ＩＩＩ型、分画Ａ）は、ＳＩＧＭＡから得た。

ヒト皮膚切片をインキュベートするための培地（以下「賦形剤」と呼ぶ）は、、０．０１Ｍの塩化カルシウムを含有する０．１５ＭＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）であった。

試薬は、分析品質のものであり、他に記載していなければ、ＣＡＲＬＯＥＲＢＡ、ＧＩＢＣＯまたはＳＩＧＭＡから得た。

皮膚切片を腹部形成手術後回収した手術の廃棄物から調製した。その個体は３０歳の女性であった。直径４ｃｍの皮膚外植片を調製した。それらをコルク支持体の上に置き、−８０℃で凍結した。クライオミクロトームを用いて厚さ６μｍの横断切片を調製した。それらをガラススライドに固定し、試験の間、賦形剤で水和した状態を維持した。

試験サンプルを全てエタノール中に取り、次いで、試験緩衝液中に希釈した。
・ペプチド抽出物の２つの最も薄い希釈溶液（０．０１および０．１％ｖ／ｖ）において、エタノールの最終濃度を一定かつ０．１％（ｖ／ｖ）に等しく維持した。
・最も濃い希釈溶液（１％、ｖ／ｖ）において、エタノールの最終濃度を一定かつ１％（ｖ／ｖ）に等しく維持した。
・０．１および１％（ｖ／ｖ）の「エタノール対照」を調製した。
・ホスホラミドンを直接賦形剤に取った。
ペプチド抽出物を０．０１；０．１および１％（ｗ／ｖ）で試験した。
ホスホラミドンを１０^-3Ｍで試験した。

それ故、以下のサンプルが存在した：
抽出物：緩衝液；エタノール（０．１％ｖ／ｖまたは１％ｖ／ｖ）；抽出酵素（０．０１；０．１および１％、ｗ／ｖ）、
酵素対照：緩衝液；エタノール（０．１％、ｖ／ｖ）；酵素、
エタノール対照（酵素無し）：緩衝液；エタノール（０．１％または１％、ｖ／ｖ）、
参照製品：緩衝液；エタノール；酵素；１０^-3Ｍホスホラミドン。

試験製品の希釈溶液、エタノールの希釈溶液および参照製品の希釈溶液を１切片当たり１００μ１で皮膚切片に置き、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次いで、賦形剤だけ（酵素無しの対照）または５０国際単位（ＩＵ）／ｍｌのコラゲナーゼを含む賦形剤（酵素対照）をしみこませたろ紙片（表面積０．１６ｃｍ²）を切片の上に置いた。スライドを湿気のあるチャンバーに３７℃で３時間置いた。

インキュベーション後、切片をインキュベーション培地ですすぎ、マソントリクロームで染色した。抽出物、エタノールまたは参照製品の存在および非存在下での酵素の活性を顕微鏡観察により評価し、以下のスキームに基づき点をつけた：
０：ゼロ酵素消化
＋：弱い酵素消化
＋＋：平均的酵素消化
＋＋＋：強い酵素消化。

切片の写真を撮った。

試験製品、エタノールまたは参照製品の存在および非存在下でコラゲナーゼの活性を画像解析で評価した。染色切片の画像解析をビデオスクリーン上にデジタル化した：画像解析ソフトウエア（ＩＭＡＧＥＮＩＡ２０００、ＢＩＯＣＯＭ（登録商標））により、無傷のコラーゲン繊維が占める表面積を計算することが可能となった。結果を視野当たりの無傷コラーゲン繊維の割合として表した。

種々の濃度のエタノールにおける抽出物、および参照製品のコラゲナーゼ活性の阻害割合を以下の式を用いて計算した：

参照製品（直接、賦形剤に取った）の場合、阻害割合を以下の式を用いて計算する：

（％コラーゲン繊維）参照製品−（％コラーゲン繊維）酵素対照 ×１００（％コラーゲン繊維）エタノール対照−（％コラーゲン繊維）酵素対照

０．１％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する賦形剤中に希釈した抽出物の場合、阻害割合を以下の式を用いて計算する：

１％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する賦形剤中に希釈した抽出物の場合、阻害割合を以下の式を用いて計算する：

（％コラーゲン繊維）参照製品−（％コラーゲン繊維）酵素対照 ×１００（％コラーゲン繊維）エタノール対照−（％コラーゲン繊維）酵素対照。

種々の濃度の抽出物の抗コラゲナーゼ活性をヒト皮膚の器官型モデルにおいて研究した。

コラゲナーゼの非存在下（賦形剤対照）では、コラーゲン繊維は無傷であった。コラゲナーゼの存在下（酵素対照）では、コラーゲン繊維はほとんど完全に分解された。この結果は予期したものであり、試験は有効であった。

参照製品として使用した１０^-3Ｍのホスホラミドンはコラゲナーゼ活性を１６％阻害した。この結果は予期したものであり、試験の有効性を完全なものとした。

試験製品の中間の希釈剤として使用するエタノールを０．１および１％（ｖ／ｖ）で試験した。エタノールはコラゲナーゼによるコラーゲン繊維の分解に全く影響しなかった。

０．０１；０．１および１％（ｗ／ｖ）で試験したペプチド抽出物は、コラゲナーゼの活性をそれぞれ、２、２４および６５％阻害した。形態学的観察は同一の結果を与えた。

結論として、選択した実験条件下では、ペプチド抽出物Ａは低濃度でかなりの抗コラゲナーゼ活性を有した。

ペプチド抽出物、エタノールおよびホスホラミドンに関する、コラゲナーゼによる皮膚コラーゲン繊維の消化の阻害の結果を以下の表に示す：

Ｖ − ルピンペプチド−抽出物Ａ、ＢおよびＣの抗メタロプロテアーゼＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９活性
ＭＭＰ−２、即ちゼラチナーゼＡ、およびＭＭＰ−９、即ちゼラチナーゼＢは、細胞外マトリックスの特異的成分を分解するメタロプロテアーゼである：ＭＭＰ−２は、ゼラチン（＝変性コラーゲン）、コラーゲンＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＸＩ、フィブロネクチン、ラミニンならびにエラスチンを分解し；ＭＭＰ−９は、ゼラチン、コラーゲンＩＶ、ＶおよびＸＩＶならびにエラスチンを分解する。それらは、光老化および内皮細胞の増殖に重要な役割を担う。

精製ヒトＭＭＰ−２および組換えヒトＭＭＰ−９および基質（基質としてフルオレセインと結合したゼラチン）（ＥｎｚＣｈｅｋ^TMゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）の使用に基づく、スクリーニングタイプの生化学的モデルにおいて試験製品の抗ＭＭＰ−２活性および抗ＭＭＰ−９活性をインビトロで測定した。

ヒト繊維肉腫から精製したＭＭＰ−９をＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲＭＡＮＮＨＥＩＭから得た。

組換えヒトＭＭＰ−９はＲ＆ＤＳＹＳＴＥＭＳから得た。

ブタ皮膚から精製し、フルオレセインと結合したＤＱ−ゼラチンをＥｎｚＣｈｅｋ^TMゼラチナーゼ／コラゲナーゼキット（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＰＲＯＢＥＳ）から得た。

ＭＭＰ−２の活性を研究するための反応緩衝液（ＲＢｆ１）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ１００および５ｍＭのＣａＣｌ₂（ｐＨ７．５）から成っていた。

ＭＭＰ−９の活性を研究するための反応緩衝液（ＲＢｆ２）は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）のＢｒｉｊ３５および５ｍＭのＣａＣｌ₂（ｐＨ７．４）から成っていた。

試験製品および参照製品の調製
１，１０−フェナントロリンを反応緩衝液ＲＢｆ１およびＲＢｆ２中に可溶化した。これを８および８０μｇ／ｍｌで試験した。

ペプチド抽出物Ａ、ＢおよびＣを反応緩衝液ＲＢｆ１およびＲＢｆ２中に可溶化した。それらを０．０１；０．１および１％（ｗ／ｖ）で試験した。

ＭＭＰ−２
使用する前に、緩衝液ＲＢｆ１中に２．５ｍＭに希釈したＡＰＭＡの存在下での３７℃、３０分間のインキュベーションにより、ＭＭＰ−２を活性化した。

２５μｇ／ｍｌに希釈したＤＱ−ゼラチンおよび１．２５μｇ／ｍｌに希釈した活性化ＭＭＰ−２と共に、試験製品または参照製品の希釈溶液を３７℃で２４時間インキュベートした。

「ＭＭＰ−２＋ＤＱ−ゼラチン」混合物に対応する対照を並行してインキュベートした。

各実験条件について、サンプル（以下「酵素無しのサンプル」と呼ぶ）をＤＱ−ゼラチンの存在下および活性化ＭＭＰ−２の非存在下でインキュベートした。これらのサンプルによって、効果を評価するための方法（蛍光定量法）と試験製品との干渉を測定することが可能となった。

各実験条件を３連で行った。

ＭＭＰ−９
２５μｇ／ｍｌに希釈したＤＱ−ゼラチンおよび０．２５μｇ／ｍｌに希釈したＭＭＰ−９と共に、試験製品または参照製品の希釈溶液を３７℃で２４時間インキュベートした。

「ＭＭＰ−９＋ＤＱ−ゼラチン」混合物に対応する対照を並行してインキュベートした。

各実験条件について、サンプル（以下「酵素無しのサンプル」と呼ぶ）をＤＱ−ゼラチンの存在下およびＭＭＰ−９の非存在下でインキュベートした。これらのサンプルによって、効果を評価するための方法（蛍光定量法）と試験製品との干渉を測定することが可能となった。

各実験条件を３連で行った。

２４時間後、ＤＱ−ゼラチンの分解に対応するシグナルを蛍光定量法（励起：４８５ｎｍ、発光：５９５ｎｍ）によって測定した。各サンプルについて、「酵素無しのサンプル」で得た値を差し引いた。

結果を１サンプル当たりの蛍光単位として、および対照群に対する変動％として表した。

データ群（対照群および処理群）を分散の1因子解析（ＡＮＯＶＡ１、ｐ＜０．０５）、次いでＤｕｎｎｅｔｔ試験によって比較した。

結果を以下に示す：
Ｖ．１ − 抗ＭＭＰ−２活性

結論：
−ルピン抽出物Ｃの１０重量％溶液は、０．０１および０．１％（ｖ／ｖ）で試験され、抗ＭＭＰ−２活性を有しない。１％（ｖ／ｖ）で試験すると、これは、ＭＭＰ−２を５７％阻害する。
−ルピン抽出物Ａの１０重量％溶液は、０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）で試験され、抗ＭＭＰ−２活性を有しない。１％（ｖ／ｖ）で試験すると、これは、ＭＭＰ−２を３２％阻害する。
−抽出物Ｂの１０重量％溶液は、１％で試験され、ＭＭＰ−２を２３％阻害する。
−フェナントロリンは、８および８０μｇ／ｍｌで試験され、ＭＭＰ−２の活性をそれぞれ、３２および７３％阻害する。この結果は、予期したものであり、この試験は有効である。

Ｖ．２ − 抗ＭＭＰ−９活性

結論：
−ルピン抽出物Ａの１０重量％溶液は、０．０１および０．１％（ｖ／ｖ）で試験され、抗ＭＭＰ−９活性を有しない。１％（ｖ／ｖ）で試験すると、これは、ＭＭＰ−９を３９％阻害する。
−ルピン抽出物Ｂの１０重量％溶液は、０．０１および０．１％（ｖ／ｖ）で試験され、抗ＭＭＰ−９活性を有しない。１％（ｖ／ｖ）で試験すると、これは、ＭＭＰ−９を７３％阻害する。
フェナントロリンは、８および８０μｇ／ｍｌで試験され、ＭＭＰ−９の活性をそれぞれ、８０および７６％阻害する。この結果は、予期したものであり、この試験は有効である。

ＶＩ − ＵＶＡ線を放射したヒト繊維芽細胞におけるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−３の量へのルピンペプチドの効果の評価
単層培養のヒト皮膚繊維芽細胞に対して研究を行った。参照製品および試験製品の存在下で細胞を３７℃で１時間プレインキュベートした。次いで、試験製品および参照製品の存在下に単回量１０Ｊ／ｃｍ²のＵＶＡを細胞に放射した。

放射後直ちに、依然として試験製品および参照製品の存在下にて該細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。

種々のＭＭＰを特異的ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて培養培地中で試験する。

参照製品および試験製品
ＭＭＰの非特異的阻害剤である１，１０−フェナントロリンを８０μｇ／ｍｌで試験し、参照製品として使用した。

１０μｇ／ｍｌのレチノイン酸（retinoic acid）＋１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ混合物をそのＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰ１、ＭＭＰの組織阻害剤、ＭＭＰの生理学的な阻害剤）を誘導する能力のために用いた。

１０％（ｗ／ｖ）のルピンペプチドを含有するストック溶液を脱イオン水中に調製した。この溶液を使用して希釈溶液を繊維芽細胞培養培地中に調製した。ルピンのペプチド抽出物を０．５；１および２％（ｖ／ｖ）で試験した。

参照製品および試験製品の非存在下に放射および非放射対照培養物を並行してインキュベートした。

データ処理
データ群（対照群および処理群）を分散の１因子解析（ＡＮＯＶＡ１、ｐ＜０．０５）、次いでＤｕｎｎｅｔｔ試験によって比較した。このようにして、参照製品および試験製品の効果を「放射細胞」群で得た効果と比較した。

結果：
結果を下記の表に示す。結果を「放射細胞」群に対する％として表す。

結論：
１，１０−フェナントロリンは、８０μｇ／ｍｌで試験され、放射繊維芽細胞によるＭＭＰ−１の分泌を９９％阻害し、ＭＭＰ−９の分泌を９２％阻害し、ＭＭＰ−３の分泌を９７％阻害した。

１０μＭレチノイン酸＋１０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ混合物は、放射繊維芽細胞によるＭＭＰ−１の分泌を５８％阻害し、ＭＭＰ−９の分泌を６７％阻害し、ＭＭＰ−３の分泌を４４％阻害した。

これらの結果は、予期したものであり、試験システムの反応性は有効であった。

１０Ｊ／ｃｍ²の量の放射は、繊維芽細胞によって分泌されるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−３のそれぞれの量を４．１０倍、２．４２倍および１．１３倍増加した。これらの結果は、予期したものであり、ＵＶＡ放射によるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−３の誘導に関する試験システムは有効であった。

ルピンのペプチド抽出物は、０．５、１および２％（ｖ／ｖ）で試験され、繊維芽細胞によって分泌されるＭＭＰ−１の量をそれぞれ、９６、９７および９７％減少させた（ｐ＜０．０５）。

ルピンのペプチド抽出物は、０．５、１および２％で試験され、繊維芽細胞によって分泌されるＭＭＰ−９の量をそれぞれ、８３、９８および１００％減少させた（ｐ＜０．０５）。

ルピンのペプチド抽出物は、０．５、１および２％で試験され、繊維芽細胞によって分泌されるＭＭＰ−３の量をそれぞれ、９７、１００および９８％減少させた（ｐ＜０．０５）。

このように、選択した実験条件下では、ルピンのペプチド抽出物は、ＵＶＡ−放射ヒト皮膚繊維芽細胞によるＭＭＰ−１、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−３の産生に関してかなりの阻害特性を有する。

ＶＩＩ−局所使用のための処方例
割合を組成物の全重量として表す。ルピンのペプチド抽出物は、本発明による１０重量％水溶液の形態、または粉末形態ペプチド抽出物にちなんだ凍結乾燥粉末の形態で使用される。

１．正常皮膚用の紅い斑点に対し作用するクリーム
水合計１００．０００になるまで必要量
ペンタエリトリチルテトラオクタノエート１５．０〜５．０
グリセリルステアレート１０．０〜２．０
イソデシルネオペンタノエート１０．０〜２．０
プロピレングリコール１．０〜３．０
デキストリン１．０〜３．０
シクロメチコーン１．０〜３．０
ダイズ（ダイズグリシン）抽出物０．１〜１０．０
ルピンのペプチド抽出物（１０％水溶液）０．１〜１０．０
二酸化チタン１．０〜３．０
キャンデリアワックス（Euphorbia Cerifora）１．０〜３．０
コメ澱粉（Oriza Sativa）１．０〜３．０
ケン化できないダイズ０．０１〜１０．０
（ダイズグリシン）油
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド０．５〜５．０
ＰＥＧ−１００ステアレート０．５〜５．０
Sophora Japonica 抽出物０．１〜１０．００
ステアリン酸０．５〜１．０
酢酸トコフェロール０．１〜１．０
フェノキシエタノール０．１〜１．０
ＣＩ７７８９１０．１〜１．０
キサンタンゴム０．１〜０．５
ジメチコノール０．１〜０．５
ポリアクリルアミド０．１〜０．５
マイカ０．１〜０．５
Ｃｅｔｅａｒｅｔｈ−２００．１〜０．５
クロルフェネシン０．１〜０．５
カルボマー０．１〜０．５
オクチルパルミテート０．１〜０．５
トロメタミン０．１〜０．５
蜜蝋０．１〜０．５
Ｃ１３−１４イソパラフィン０．１〜０．５
ＤＥＡセチルホスフェート０．１〜０．５
セチルアルコール０．１〜０．５
グルコース０．１〜０．５
フレグランス０．１〜０．５
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１〜０．５

２．老化予防クリーム
％
水合計１００．０００００になるまで必要量
ペンタエリトリチルテトラオクタノエート３．０〜１５．０
イソデシルネオペンタノエート３．０〜１５．０
スクアレン１．０〜１０．０
デキストリン１．０〜１０．０
シクロメチコーン１．０〜１０．０
セテアリール（cetearyl）アルコール１．０〜１０．０
ルピンのペプチド抽出物（１０％水溶液）０．１〜１０．０
アスコルビルグルコシド０．１〜１０．０
グリセロール１．０〜１０．０
Ｌａｕｒｅｔｈ−２３１．０〜１０．０
ミリスチルミリステート１．０〜１０．０
シクロペンタシロキサン１．０〜１０．０
ナイロン−６１．０〜１０．０
アボカドフラン０．０１〜１０．０
フェノキシエタノール０．１〜１．０
セテアリールグルコシド０．１〜１．０
フレグランス０．１〜１．０
蜜蝋０．１〜１．０
メチルパラベン０．１〜０．５
クエン酸ナトリウム０．１〜０．５
ジメチコノール０．１〜０．５
グリセリルステアレート０．１〜０．５
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１〜０．５
プロピルパラベン０．１〜０．５
水酸化ナトリウム０．１〜０．５
アクリレート／Ｃ１０−３００．１〜０．５
アルキルアクリレートクロスポリマー
キサンタンゴム０．１〜０．５
グルコース０．１〜０．５

３．成熟皮膚用抗老化クリーム
水合計１００．００００になるまで必要量
ペンタエリトリチルテトラオクタノエート１．０〜１０．０
イソデシルネオペンタノエート１．０〜１０．０
水素化ココグリセリド１．０〜１０．０
Simmondsia Chinensis(ホホバ)種子油１．０〜１０．０
スクアレン１．０〜１０．０
グリセロール１．０〜１０．０
シクロメチコーン１．０〜５．０
セテアリールアルコール１．０〜５．０
ミリスチルミリステート１．０〜５．０
Ｌａｕｒｅｔｈ−２３１．０〜５．０
シリカ１．０〜５．０
ルピンのペプチド抽出物（１０％水溶液）０．１〜１０．０
スクレロチウム（Sclerotium）ゴム０．１〜１．０
アボカドフラン０．０１〜１０．０
サリチル酸０．１〜１０．０
蜜蝋０．１〜１０．０
ポリアクリルアミド０．１〜１．０
フェノキシエタノール０．１〜１．０
グリセリルステアレート０．１〜１．０
レチノールパルミテート０．０１〜５．０
セテアリールグルコシド０．０１〜５．０
ナイロン−６０．０１〜５．０
二酸化チタン０．０１〜５．０
フレグランス０．１〜５．０
酢酸トコフェロール０．１〜５．０
ソルビン酸カリウム０．１〜５．０
メチルパラベン０．１〜５．０
Ｃ１３−１４イソパラフィン０．１〜５．０
ＣＩ７７８９１０．１〜５．０
ジメチコノール０．１〜５．０
プロピルパラベン０．１〜５．０
水酸化ナトリウム０．１〜５．０
Ｌａｕｒｅｔｈ−７０．１〜５．０
セテアリールアルコール０．１〜５．０
セチルパルミテート０．１〜５．０
ココグリセリド０．１〜５．０
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１〜０．５
ＣＩ７７４９１０．１〜０．５
クエン酸０．１〜０．５

４．乾燥〜非常に乾燥した皮膚用の紅い斑点に作用するクリーム
水合計１００．０００００になるまで必要量
ワセリン１．０〜１０．０
水素化ココグリセリド１．０〜１０．０
イソデシルネオペンタノエート１．０〜１０．０
Simmondsia Chinensis(ホホバ)油１．０〜２．０
ブチレングリコール１．０〜５．０
セテアリールアルコール１．０〜５．０
グリセロール１．０〜１０．０
スクアレン１．０〜１０．０
ルピンのペプチド抽出物（１０％水溶液）０．１〜１０．０
Ｌａｕｒｅｔｈ−２３１．０〜１０．０
二酸化チタン１．０〜１０．０
ケン化できないダイズグリシン０．１〜１０．０
（ダイズ）油
カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド１．０〜５．０
フェノキシエタノール０．１〜１．０
セテアリールグルコシド０．１〜１．０
ダイズ種子抽出物０．１〜１０．０
フレグランス０．１〜１．０
Sophora Japonica ０．１〜１０．０
酢酸トコフェロール０．１〜１．０
キャンデリアワックス０．１〜１．０
ＣＩ７７８９１０．１〜０．５
メチルパラベン０．１〜０．５
マイカ０．１〜０．５
プロピルパラベン０．１〜０．５
エチルヘキシルパルミテート０．１〜０．５
クロルフェネシン０．１〜０．３
アクリレート／Ｃ１０−３００．１〜０．３
アルキルアクリレートクロスポリマー
キサンタンゴム０．１〜０．３
ＥＤＴＡ二ナトリウム０．１〜０．３
水酸化ナトリウム０．１〜０．３

ＶＩＩＩ−洗口液の例
割合を組成物の全重量として表す。ルピンのペプチド抽出物は、本発明による１０重量％水溶液の形態、または粉末形態ペプチド抽出物にちなんだ凍結乾燥粉末の形態で使用される。

１．ルピンの１０％水溶液ペプチド抽出物＋殺菌剤（トリクロサン（Triclosan））＋抗プラーク剤（ＧａｎｔｒｅｚＳ９７ＢＦ（登録商標））
ルピンのペプチド抽出物２
エチルアルコール１０
グリセロール１０
水素化ヒマシ油０．５
（４０モルＥＯでエトキシル化）
（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｃｏ４１０）
ポリ（メチルビニルエーテル／マレイン酸）０．２
（ＧａｎｔｒｅｚＳ９７ＢＦ（登録商標））
水酸化ナトリウム０．１５
フッ化ナトリウム０．０５
シナモン−ミント着香剤０．１
トリクロサン０．０３
塩化亜鉛０．０１
サッカリンナトリウム０．０１
着色剤Ｃ．Ｉ．１６２５５（Ｅ１２４）０．００２５
精製水合計１００になるまで必要量

２．ルピンの１０％水溶液ペプチド抽出物＋殺菌剤
ルピンのペプチド抽出物２
エチルアルコール１０
グリセロール１０
水素化ヒマシ油０．３
（４０モルＥＯでエトキシル化）
（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｃｏ４１０）
フッ化ナトリウム０．０５
シナモン−ミント着香剤０．１
トリクロサン０．０３
塩化亜鉛０．０１
サッカリンナトリウム０．０１
着色剤Ｃ．Ｉ．１６２５５（Ｅ１２４）０．００２５
精製水合計１００になるまで必要量

３．ルピンの粉末形態ペプチド抽出物＋殺菌剤（セチルピリジニウムクロライド）
ルピンのペプチド抽出物１
エチルアルコール１０
グリセロール８
水素化ヒマシ油０．１
（４０モルＥＯでエトキシル化）
（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｃｏ４１０）
フッ化ナトリウム０．０５
シナモン−ミント芳香剤０．１
セチルピリジニウムクロライド０．０５
塩化亜鉛０．０１
サッカリンナトリウム０．０１
着色剤Ｃ．Ｉ．１６２５５（Ｅ１２４）０．００２５
精製水合計１００になるまで必要量

ＩＸ−練歯磨き例
割合を組成物の全重量として表す。ルピンのペプチド抽出物は、本発明による１０重量％水溶液の形態、または粉末形態ペプチド抽出物にちなんだ凍結乾燥粉末の形態で使用される。

１．ルピンの粉末形態ペプチド抽出物＋フッ化物
ルピンのペプチド抽出物１
モノフルオロリン酸ナトリウム０．７５
フッ化ナトリウム０．１０
７０％ソルビトール３５
強研磨力を有する合成シリカ１３
弱研磨力を有する合成シリカ５
カルボキシメチルセルロースナトリウム１．６
ラウリル硫酸ナトリウム１
メントール化着香剤０．８５
酸化チタン０．５
水酸化ナトリウムアルカリ溶液０．５
チクロナトリウム０．３
メントール０．１５
サッカリンナトリウム０．０７
精製水合計１００になるまで必要量

２．ルピンの１０％水溶液ペプチド抽出物＋フッ化物
ルピンのペプチド抽出物２
モノフルオロリン酸ナトリウム０．７５
フッ化ナトリウム０．１０
７０％ソルビトール３５
強研磨力を有する合成シリカ１３
弱研磨力を有する合成シリカ５
カルボキシメチルセルロースナトリウム１．６
ラウリル硫酸ナトリウム１
メントール化着香剤０．８５
酸化チタン０．５
水酸化ナトリウムアルカリ溶液０．５
チクロナトリウム０．３
メントール０．１５
サッカリンナトリウム０．０７
精製水合計１００になるまで必要量

図１は、非特異的コラゲナーゼの阻害の動態 − ペプチド抽出物の濃度の影響を示す。

Claims

ルピナス属植物のペプチド抽出物を含有する、メタロプロテアーゼ阻害剤において、ルピナス属植物のペプチド抽出物が、脂質を含まず、抽出物の乾燥重量あたりのペプチド含有量が５０％以上で、糖質含有量が１％未満であり、ペプチドの分子量が１０，０００ダルトン未満である、メタロプロテアーゼ阻害剤。
メタロプロテアーゼが、コラゲナーゼおよびゼラチナーゼから選択される、請求項１に記載のメタロプロテアーゼ阻害剤。
（ａ）ルピナス属植物からタンパク質分画を抽出する工程、（ｂ）タンパク質分画を酵素的に加水分解する工程、（ｃ）ペプチド抽出物を回収する工程を含むメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法であって、工程（ａ）が、
（ｉ）ルピナス属植物の脂質を含まない荒挽き粉を調製する工程、
（ｉｉ）可溶性のタンパク質およびサッカリド分画を抽出する工程、または等電点により酸で沈殿させる工程を含み、
工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前にタンパク質分画の限外濾過を行う、請求項１または２に記載のメタロプロテアーゼ阻害剤の製造方法。
工程（ｂ）の後、加水分解されたペプチド抽出物の限外濾過を行う、請求項３に記載の製造方法。
請求項１または２に記載のメタロプロテアーゼ阻害剤を含有する、メタロプロテアーゼによるコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンまたはエラスチンの過剰破壊に関連する皮膚傷害を化粧的に処置するための化粧品組成物。
皮膚傷害が、皮膚の内在性老化による皮膚傷害である、請求項５に記載の組成物。
皮膚傷害が、太陽放射の作用での老化による皮膚傷害、ならびにタバコ、汚染およびストレスの有害効果による皮膚傷害である、請求項５に記載の組成物。
外部からの局所塗布用である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。