ES2262231T3 - Polipeptido expresado en la capa cornea de la epidermis y su utilizacion. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una composición cosmética o farmacéutica, que comprende, en un medio fisiológica ente aceptable, al menos un polipéptido purificado natural o sintético, específico para la epidermis, que toma parte en la cohexión celular de la capa callosa. La invención también se refiere a una composición cosmética o farmacéutica que comprende una mezcla de polipéptidos derivados de la proteolisis del polipéptido purificado, a un procedimiento de tratamiento cosmético para reforzar la cohexión celular de la capa callosa y a un tratamiento de tratamiento cosmético para reducir la cohexión celular de la capa callosa, promoviendo de esta forma la exfoliación, el polipéptido se caracteriza que se corresponde con la secuencia de aminoácido SEQ ID NO:1.

Description

Polipéptido expresado en la capa córnea de la epidermis y su utilización.

La invención tiene por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido natural o sintético purificado, específico de la epidermis, que tiene un papel en la cohesión intercorneocitaria. La invención tiene también por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene una mezcla de polipéptidos procedentes de la proteolisis del polipéptido purificado, un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a reforzar la cohesión intercorneocitaria y un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a disminuir la cohesión intercorneocitaria y a favorecer así la descamación.

La piel humana está constituida por dos compartimentos, a saber, un compartimento profundo, la dermis, y un compartimento superficial, la epidermis.

La dermis proporciona a la epidermis un soporte sólido. Es también su elemento nutritivo. Está principalmente constituida por fibroblastos y por una matriz extracelular compuesta a su vez principalmente por colágeno, elastina y una substancia, llamada fundamental, componentes sintetizados por el fibroblasto. También se encuentran leucocitos, mastocitos o también macrófagos tisulares. Está igualmente constituida por vasos sanguíneos y fibras nervio-
sas.

La epidermis humana natural está compuesta principalmente por tres tipos de células, que son los queratinocitos, muy mayoritarios, los melanocitos y las células de Langerhans. Cada uno de estos tipos celulares contribuye por sus funciones propias a la función esencial desempeñada en el organismo por la piel.

La epidermis se divide convencionalmente en una capa basal de queratinocitos que constituye la capa germinativa de la epidermis, una capa llamada espinosa constituida por varias capas de células poliédricas dispuestas sobre las células germinativas, una capa llamada granulosa constituida por células aplanadas que contienen inclusiones citoplásmicas distintas, los gránulos de queratohialina, y finalmente una capa superior llamada capa córnea (o estrato córneo), constituida por queratinocitos en el estado terminal de su diferenciación, llamados corneocitos. Éstos son células momificadas, anucleadas, que derivan de los queratinocitos.

Los corneocitos están principalmente compuestos por una matriz fibrosa que contiene citoqueratinas, rodeada por una estructura muy resistente de 15 nm de espesor, llamada envuelta córnea o cornificada. El apilamiento de estos corneocitos constituye la capa córnea, que es responsable de la función de barrera de la epidermis. En el curso del proceso normal de descamación, los corneocitos más superficiales se desprenden de la superficie de la epider-
mis.

Se han descrito estructuras intercelulares que derivan de los desmosomas, llamadas corneosomas o corneodesmosomas, en la capa córnea. Estudios recientes han mostrado su importancia principal en la cohesión intercorneocitaria, así como en el proceso de descamación. En particular, existe una estrecha correlación entre la disociación celular y la proteolisis de ciertos componentes corneodesmosomales, como la desmogleína I.

Varias proteasas con serina de tipo tripsina o quimotripsina parecen estar implicadas en la proteolisis de los corneodesmosomas, en particular la enzima quimotripsina de la capa córnea (stratum corneum chymotryptic enzy-
me).

Numerosas patologías cutáneas se caracterizan por la producción de una capa córnea espesa y por una descamación anormal, es decir, por una hiperqueratosis. Ésta puede sobrevenir en cualquier territorio anatómico cutáneo y en contextos clínicos muy variados. Su substrato fisiopatológico y su causa son variados.

A modo de ejemplos, se pueden citar:

- la xerosis (o sequedad cutánea),

- las ictiosis,

- la psoriasis,

- ciertas lesiones tumorales benignas o malignas y

- las hiperqueratosis de reacción.

Otras patologías se caracterizan por una transdiferenciación o metaplasia, a nivel de mucosas, malpighianas o no, pero normalmente no cornificadas, que se cornifican, es decir, que se revisten de un epitelio anormal, productor en su superficie de una capa córnea. Aunque las mucosas genitales y las de las vías aereodigestivas superiores sean las más frecuentemente implicadas, estas metaplasias pueden asentar en diversos territorios anatómicos.

A modo de ejemplos, se pueden citar:

- la leucoqueratosis del cuello uterino en el curso del prolapso,

- las leucoqueratosis bucales y

- las lesiones tumorales benignas queratósicas de las mucosas malpighianas.

A la inversa, ciertas manifestaciones patológicas conllevan un adelgazamiento de la epidermis y, en particular, de la capa córnea, que se traduce en una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo. Éste puede asentarse en diversos territorios anatómicos, su causa es variable y puede ser constitucional o adquirido.

A modo de ejemplos, se pueden citar:

- las alteraciones tróficas cutáneas de los miembros inferiores en pacientes portadores de patologías vasculares: varices, arteriopatías (diabetes, arteriosclerosis...),

- las alteraciones tróficas cutáneas en el marco de un síndrome algodistrófico y

- las alteraciones tróficas consecutivas a una cicatrización anormal.

La purificación y el conocimiento de los polipéptidos implicados en la cohesión intercorneocitaria es una de las vías que podrían permitir la elaboración de productos destinados a luchar contra los efectos de un exceso o de un defecto de polipéptidos de este tipo, en particular en la superficie de la piel.

El artículo del Journal Invest. Dermatol. (97, 1991, páginas 1061-1072) describe la electroforesis en gel SDS-PAGE de una mezcla de proteínas extraídas del estrato córneo. Los antígenos son evidenciados por marcaje mediante anticuerpos murinos y se les atribuyen pesos moleculares aparentes de 33,5 a 52 kD, en función de su migración sobre el gel. No se ha realizado ningún aislamiento posterior de estas proteínas.

Lundström y col. (Arch. Dermatol. Res. 286, 1994, páginas 369-375) estudiaron el papel de la corneodesmosina en la cohesión celular y sugieren la existencia de proteínas de peso molecular aparente de 33 a 48 kDa, sin, no obstante, aislarlas.

ZHOU y col. (P.N.A.S., Vol. 90, 1993) se refieren a la identificación en la región HLA de clase I de un gen expresado tardíamente en la diferenciación del queratinocito. Este documento describe los resultados de los experimentos que han conducido a la identificación de la secuencia del gen S.

Uno de los objetos de la invención es proporcionar una composición que contiene un polipéptido implicado en la cohesión intercorneocitaria en forma purificada.

Después de largos y laboriosos trabajos por su pobre representación entre las proteínas de la epidermis, por su gran inestabilidad y por su elevada sensibilidad a las proteasas, la solicitante ha puesto en evidencia, aislado y purificado por técnicas bioquímicas a partir de epidermis humana un polipéptido específico de los epitelios cornificados. Este polipéptido, que se denominará igualmente además en el texto "corneodesmosina", se expresa en la capa córnea de la epidermis y está implicado en la cohesión intercorneocitaria. La solicitante ha determinado su secuencia primaria de aminoácidos.

La invención tiene, pues, por objeto, una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido natural o sintético purificado, cuyo polipéptido se caracteriza por responder a la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1 siguiente:

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El polipéptido de la invención puede ser de origen natural o sintético. Por sintético, se entiende aquí cualquier polipéptido obtenido químicamente o por producción en un organismo tras la introducción en este organismo de los elementos necesarios para esta producción.

El polipéptido de la invención puede proceder de cualquier origen posible, a saber, animal, en particular de mamíferos y aún más particularmente humano, o vegetal, o de microorganismos (virus, fagos y bacterias, entre otros), o también de hongos, sin prejuzgar el hecho de que esté presente de forma natural o no en dicho organismo de origen.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención es de origen natural, purificado a partir de tejidos de mamíferos, particularmente a partir de piel de mamíferos.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención es purificado a partir de piel humana y aún más preferiblemente a partir de epidermis humana.

Como se ha indicado anteriormente, la cohesión intercorneocitaria se debe aparentemente, entre otros, a la existencia en la capa córnea de polipéptidos específicos de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria.

Así, el polipéptido de la invención es específico de la capa córnea y de la capa granulosa y, preferiblemente, el polipéptido según la invención es especifico de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria, particularmente de los corneodesmosomas.

Se sabe que, en general, los polipéptidos maduros que se encuentran en las células proceden de la maduración de precursores que contienen en su secuencia la secuencia del polipéptido maduro.

Así, la invención se relaciona también con una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, cualquier polipéptido cuya secuencia esté en parte constituida por la secuencia del polipéptido según la invención.

También se sabe que los polipéptidos pueden sufrir modificaciones post-traducción, como la formación de uniones disulfuro, las escisiones proteolíticas específicas, la adición de glúcidos (glicosilación), la fosforilación, en particular a nivel de las serinas y/o de las treoninas y/o de las tirosinas, y/o la asociación a lípidos.

La invención se relaciona, pues, con una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido de la invención que ha sufrido o no modificaciones post-traducción.

El polipéptido de la invención puede haber sufrido una o varias modificaciones post-traducción.

Preferiblemente, el polipéptido según la invención está glicosilado y/o fosforilado.

Se pueden clasificar los polipéptidos en función de su punto isoeléctrico. Preferiblemente, el polipéptido de la invención es básico.

Se entiende que la secuencia primaria de aminoácidos, así como las diversas modificaciones post-traducción sufridas por el polipéptido hacen que dicho polipéptido pueda caracterizarse por su peso molecular, expresado en kilodaltons.

El polipéptido de la invención tiene un peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE-SDS) comprendido entre 50 y 60 kilodaltons, preferiblemente entre 52 y 56 kilodaltons.

Muy preferiblemente, el polipéptido de la invención es un polipéptido glicosilado, fosforilado y básico de un peso molecular aparente comprendido entre 50 y 60, preferiblemente entre 52 y 56 kilodaltons.

Así, preferiblemente, la invención tiene por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido de la invención, siendo dicho polipéptido glicosilado, básico y fosforilado y teniendo un peso molecular aparente comprendido entre 50 y 60 kilodaltons, preferiblemente entre 52 y 56 kilodaltons.

Se sabe además que la secuencia primaria de aminoácidos de un polipéptido determina sitios específicamente reconocidos por proteasa, las cuales, una vez reconocidos estos sitios efectivos, van a inducir, con o sin fijación a dicho polipéptido, su escisión por proteolisis.

Así, la invención se relaciona también con una composición cosmética o farmacéuticas que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos una mezcla de polipéptidos procedentes de la proteolisis del polepéptido de la invención.

Como se ha descrito anteriormente, ciertas patologías pueden ser debidas a un exceso de descamación, que se puede suponer debido a un defecto en polipéptidos implicados en la cohesión intercorneocitaria.

Ciertas manifestaciones patológicas conllevan un adelgazamiento de la epidermis, y en particular de la capa córnea, que se traduce por una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo, que puede tener asiento en cualquier territorio anatómico cutáneo y ser de causa variada constitucional o adquirida.

Así, la composición según la invención está destinada a tratar el adelgazamiento de la epidermis, y en particular de la capa córnea, y/o a tratar una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo y/o a reforzar la cohesión intercorneocitaria y/o inducir el espesamiento de la capa córnea.

Igualmente, la composición según la invención está destinada a tratar el adelgazamiento de la epidermis, y en particular de la capa córnea, y/o a tratar una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo y/o a reforzar la cohesión intercorneocitaria y/o inducir el espesamiento de la capa córnea.

De igual manera, la composición de la invención puede ser utilizada para provocar un espesamiento localizado de la capa córnea a nivel de territorios cutáneos que deben sufrir microtraumatismos repetidos.

A modo de ejemplo, se puede citar el tratamiento preventivo de las bullas subepidérmicas ("ampollas") en los deportistas.

La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a tratar el adelgazamiento de la epidermis, y en particular de la capa córnea, y/o a tratar una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo y/o a reforzar la cohesión intercorneocitaria y/o inducir el espesamiento de la capa córnea, caracterizado por aplicar sobre la piel del sujeto que se ha de tratar una composición cosmética según la invención.

La invención tiene igualmente por objeto un procedimiento de tratamiento cosmético destinado a tratar las alteraciones tróficas cutáneas, por ejemplo de los pacientes portadores de patologías vasculares, tales como varices o arteriopatías (diabetes, arteriosclerosis...), las alteraciones tróficas cutáneas de los pacientes portadores de síndromes algodistróficos o las consecutivas a alteraciones de la cicatrización.

El análisis de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína según la invención muestra que presenta sitios de reconocimiento y de fijación para proteasas conocidas o sitios específicos de escisión por agentes químicos. Se pueden citar, como ejemplo, los sitios para la Quimotripsina, la Catepsina, la proteinasa K, la Subtilisina, la proteasa V8, la Termolisina, la Trombina, la Tripsina, la Papaína, la Pepsina, la Prolina-Endopeptidasa, la Endoproteinasa GluC, la Endoproteinasa LysC, la Endoproteinasa AspN, la Endoproteinasa ArgC (Clostripaína), la Myxobacter AL117, la Elastasa, la enzima quimotripsina de la capa córnea, el bromuro de cianógeno, la N-clorosuccinimida o también los sitios específicos de la hidrólisis ácida (70% de ácido fórmico, 7 M Guanidina-HCl, 40ºC,
24 h).

La cohesión intercorneocitaria es aparentemente debida a la existencia, en la capa córnea, de polipéptidos específicos de las estructuras implicadas en la unión intercorneocitaria, como, en particular, el polipéptido de la invención. Se ha visto que determinadas patologías hiperqueratósicas podrían estar ligadas a un exceso de cohesión intercorneocitaria, debido, en particular, al polipéptido de la invención.

Estas proteasas pueden ser aisladas a partir de plantas, de animales, de bacterias, de virus o de hongos.

El polipéptido de la invención puede ser glicosilado. Así, la composición tal como se ha definido anteriormente puede contener además una glicosidasa, que puede ser seleccionada entre las aisladas de plantas, de animales, de hongos o también de microorganismos, en particular de bacterias. Se citarán a modo de ejemplo las neuraminidasas, las manosidasas, las galactosidasas, las glucosidasas, las N-acetilglucosaminidasas y las N-acetilgalactosaminidasas.

Como se ha visto anteriormente, ciertas patologías se caracterizan por la producción de una capa córnea epidérmica espesa y por una descamación anormal, es decir, por una hiperqueratosis que puede sobrevenir en cualquier territorio anatómico, en diversos contextos clínicos, y cuyo substrato fisiopatológico y cuya causa pueden ser variados.

Se sabe que una proteína se sintetiza en las células a partir de una matriz de ácidos desoxirribonucleicos codificantes de dicha proteína. Se sabe igualmente que el código genético está degenerado. Así, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención puede proceder de diferentes secuencias de ácidos desoxirribonucleicos, naturales o sintéticos. Por secuencia de ácidos desoxirribonucleicos sintética, se entiende aquí cualquier secuencia obtenida químicamente o por manipulación genética.

Dichas secuencias de ácidos desoxirribonucleicos pueden proceder de cualquier origen posible, a saber, animal, en particular de mamíferos y aún más particularmente humano, vegetal, de microorganismos (virus, fagos y bacterias, entre otros) o también de hongos, sin prejuzgar que estén presentes de manera natural o no en dicho organismo de origen.

La solicitante ha aislado, purificado y secuenciado por técnicas de biología molecular, en particular el cribado de bancos de expresión de ácidos desoxirribonucleicos complementarios preparados a partir de epidermis humana, un fragmento de ácidos desoxirribonucleicos codificantes del polipéptido de la invención.

La invención tiene, pues, por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, cualquier secuencia de ácido desoxirribonucleico natural o sintético del que todo o una parte codifica para la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido de la invención.

En el curso de estos trabajos, la solicitante pudo aislar y purificar una secuencia de ácidos desoxirribonucleicos codificantes para la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido de la invención a partir de piel humana.

Particularmente, la invención tiene por objeto una composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, un fragmento aislado de ácido desoxirribonucleico que lleva al menos la secuencia nucleotídica codificante de la SEC ID Nº: 2 siguiente:

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Sea cual sea su naturaleza, las composiciones de la invención pueden ser ingeridas, inyectadas o aplicadas sobre la piel (sobre cualquier zona cutánea del cuerpo) o las mucosas (bucal, yugal, gingival, genital, conjuntival, ...).

Preferiblemente, las composiciones de la invención son aplicadas sobre la piel o las mucosas.

Según el modo de administración, las composiciones según la invención pueden presentarse en todas las formas galénicas normalmente utilizadas.

Para una aplicación tópica sobre la piel, la composición puede tener la forma especialmente de solución acuosa u oleosa o de dispersión de tipo loción o suero, de emulsiones de consistencia líquida o semilíquida de tipo leche, obtenidas por dispersión de una fase grasa en una fase acuosa (Ac/Ag) o a la inversa (Ag/Ac), o de suspensiones o emulsiones de consistencia blanda de tipo crema o gel acuosos o anhidros, o también de microcápsulas o micropartículas, o de dispersiones vesiculares de tipo iónico y/o no iónico, o de espumas o también en forma de composiciones para aerosol o de espumas o también en forma de composiciones para aerosol que contienen también un agente propulsor bajo presión. Estas composiciones son preparadas según los métodos habituales.

Para la inyección, la composición puede presentarse en forma de loción acuosa, oleosa o en forma de suero. Para los ojos, puede presentarse en forma de gotas y, para la ingestión, puede presentarse en forma de cápsulas, de granulados, de jarabes o de comprimidos.

Las cantidades de los diferentes constituyentes de las composiciones según la invención son las clásicamente utilizadas en los campos considerados.

Estas composiciones constituyen especialmente cremas de limpieza, protección, tratamiento o cuidado para la cara, para las manos, los pies, los grandes pliegues anatómicos o el cuerpo (por ejemplo, cremas de día, cremas de noche, cremas desmaquilladoras, cremas de fondo de color, cremas anti-solares), fondos de color fluidos, leches de desmaquillaje, leches corporales de protección o de cuidado, leches anti-solares, lociones, geles o espumas para el cuidado de la piel, como lociones de limpieza, lociones anti-solares, lociones de bronceado artificial, composiciones para el baño, composiciones desodorantes que contienen un agente bactericida, geles o lociones para después del afeitado, cremas depilatorias, composiciones contra las picaduras de insectos, composiciones anti-dolor, composiciones para tratar ciertas enfermedades de la piel, como el eczema, la rosácea, la psoriasis, los líquenes y los pruritos
graves.

Las composiciones según la invención pueden también consistir en preparaciones sólidas constituyentes de jabones o de penes de limpieza.

Las composiciones pueden también estar acondicionadas en forma de composición para aerosol que contiene igualmente un agente propulsor bajo presión.

La composición según la invención puede ser una composición para los cuidados del cuero cabelludo, y especialmente un champú, una loción para ondulación, una loción de tratamiento, una crema o un gel para el peinado, una composición de tinciones (especialmente tinciones de oxidación) eventualmente en forma de champúes colorantes, lociones reestructurantes para el cabello, una composición de permanente (especialmente una composición para el primer tiempo de una permanente), una loción o un gel anti-caída, un champú antiparasitario, etc.

La composición puede también ser para uso bucodental, por ejemplo una pasta dentífrica. En este caso, la composición puede contener adyuvantes y aditivos habituales para las composiciones de uso bucal, y especialmente agentes tensoactivos, agentes espesantes, agentes humectantes, agentes de pulido, tales como la sílice, diversos ingredientes activos, como los fluoruros, en particular el fluoruro de sodio, y eventualmente agentes edulcorantes, como el sacarinato de sodio.

Cuando la composición es una emulsión, la proporción de la fase grasa puede ir del 5% al 80% en peso y preferiblemente del 5% al 50% en peso con respecto al peso total de la composición. Los aceites, las ceras, los emulsores y los coemulsores usados en la composición en forma de emulsión son elegidos entre los clásicamente usados en el campo cosmético. El emulsor y el coemulsor están presentes, en la composición, en una proporción que va del 0,3% al 30% en peso y preferiblemente del 0,5 al 20% en peso con respecto al peso total de la composición. La emulsión puede además contener vesículas lipídicas.

Cuando la composición es una solución o un gel oleoso, la fase grasa puede representar más de un 90% del peso total de la composición.

De forma conocida, la composición cosmética puede contener también los adyuvantes habituales en el campo cosmético, tales como gelificantes hidrófilos o lipófilos, aditivos hidrófilos o lipófilos, conservantes, antioxidantes, solventes, perfumes, cargas, filtros, absorbentes de olor y materias colorantes. Las cantidades de estos diferentes adyuvantes son las clásicamente utilizadas en el campo cosmético, y por ejemplo del 0,01% al 10% del peso total de la composición. Estos adyuvantes, según su naturaleza, pueden ser introducidos en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las esférulas lipídicas.

Como aceites o ceras utilizables en la invención, se pueden citar los aceites minerales (aceite de vaselina), los aceites vegetales (fracción líquida de la manteca de karité, aceite de girasol), los aceites animales (perhidroescualeno), los aceites de síntesis (aceite de Purcellin), los aceites o ceras siliconados (ciclometicona) y los aceites fluorados (perfluoropoliéteres) y las ceras de abeja, de carnauba o de parafina. Se pueden añadir a estos aceites alcoholes grasos y ácidos grasos (ácido esteárico).

Como emulsores utilizables en la invención, se pueden citar, por ejemplo, el estearato de glicerol, el polisorbato 60 y la mezcla de PEG-6/PEG-32/Estearato de glicol vendida bajo la denominación Tefose® 63 por la sociedad Gattefosse.

Como solventes utilizables en la invención, se pueden citar los alcoholes inferiores, especialmente el etanol y el isopropanol, y el propilenglicol.

Como gelificantes hidrófilos utilizables en la invención, se pueden citar los polímeros carboxivinílicos (carbómero), los copolímeros acrílicos, tales como los copolímeros de acrilatos/alquilacrilatos, las poli-acrilamidas, los polisacáridos tales como la hidroxipropilcelulosa, las gomas naturales y las arcillas, y, como gelificantes lipófilos, se pueden citar las arcillas modificadas, como las bentonas, las sales metálicas de ácidos grasos, como los estearatos de aluminio, y la sílice hidrofóbica, la etilcelulosa y el polietileno.

La composición puede contener otros agentes activos hidrófilos, como proteínas o hidrolizados de proteínas, aminoácidos, polioles, urea, alantoína, azúcares y derivados de azúcar, vitaminas hidrosolubles, extractos vegetales e hidroxiácidos.

Como agentes activos lipófilos, se pueden utilizar el retinol (vitamina A) y sus derivados, el tocoferol (vitamina E) y sus derivados, los ácidos grasos esenciales, las caramidas, los aceites esenciales, el ácido salicílico y sus derivados.

Según la invención, la composición puede asociar al menos un extracto de al menos una Iridácea a otros agentes activos destinados especialmente a la prevención y/o al tratamiento de las afecciones cutáneas. Entre estos agentes activos, se pueden citar a modo de ejemplo:

- los agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea, tales como el ácido retinoico y sus isómeros, el retinol y sus ésteres, la vitamina D y sus derivados, los estrógenos, tales como el estradiol, el ácido cójico o la hidroquinona;

- los antibacterianos, tales como el fosfato de clindamicina, la eritromicina o los antibióticos de la clase de las tetraciclinas;

- los antiparasitarios, en particular el metronidazol, el crotamitón o los piretrinoides;

- los antifúngicos, en particular los compuestos pertenecientes a la clase de los imidazoles, tales como el econazol, el ketoconazol o el miconazol o sus sales; los compuestos poliénicos, tales como la anfotericina B; los compuestos de la familia de las alilaminas, tales como la terbinafina; o también el octopirox;

- los agentes antivíricos, tales como el aciclovir;

- los agentes antiinflamatorios esteroideos, tales como la hidrocortisona, el valerato de betametasona o el propionato de clobetasol, o los agentes antiinflamatorios no esteroideos, como, por ejemplo, el ibuprofeno y sus sales, el diclofenaco y sus sales, el ácido acetilsalicílico, el acetaminofeno o el ácido glicirrícico;

- los agentes anestésicos, tales como el clorhidrato de lidocaína y sus derivados;

- los agentes antipruriginosos, como la tenaldina, la trimeprazina o la ciproheptadina;

- los agentes queratolíticos, tales como los ácidos \alpha- y \beta-hidroxicarboxílicos o \beta-cetocarboxílicos, sus sales, amidas o ésteres, y más particularmente los hidroxiácidos tales como el ácido glicólico, el ácido láctico, el ácido salicílico, el ácido cítrico y de forma general los ácidos de frutas y el ácido n-octanoil-5-sa-licílico;

- los agentes anti-radicales libres, tales como el \alpha-tocoferol o sus ésteres, las superóxido dismutasas, ciertos quelantes de metales o el ácido ascórbico y sus ésteres;

- los antiseborreicos, tales como la progesterona;

- los anti-película, como el octopirox o la piritiona de zinc, y

- los antiacneicos, como el ácido retinoico o el peróxido de benzoílo.

Así, según un modo particular, la composición según la invención contiene también al menos un agente seleccionado entre agentes antibacterianos, antiparasitarios, antifúngicos, antivíricos, antiinflamatorios, antipruriginosos, anestésicos, queratolíticos, anti-radicales libres, antiseborreicos, anti-película, antiacneicos y/o agentes que disminuyen la diferenciación y/o la proliferación y/o la pigmentación cutánea.

Ejemplos Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales murinos G36-19, F28-27 y B17-21 (IgG1) específicos del polipéptido de la invención, la corneodesmosina, forman parte de una serie de anticuerpos dirigidos contra antígenos de diferenciación epidérmica, producidos tras la inmunización de un ratón con un homogenado de capa córnea plantar humana y caracterizados después. Se utilizó la ascitis del anticuerpo monoclonal MOPC-21 (IgG1) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como control negativo. También se utilizaron el kit de anticuerpos anti-fosfoserina de Biomol Feinchenukalien GmbH (Anticuerpo monoclonal 1C8, 4A3, 4A9 y 4H4) y el anticuerpo monoclonal PSR45 de Sigma.

Aislamiento y caracterización del polipéptido Extracción proteica secuencial

A partir de piel mamaria (procedente de plastias mamarias de reducción), se separó la epidermis de la dermis mecánicamente después de tratar con calor la piel durante 5 minutos a 56ºC en un tampón fosfato y se homogeneizó luego de forma secuencial, a 4ºC, en volúmenes iguales de los tampones siguientes (tres veces en cada tampón): i) tampón TE: Tris-HCl 40 mM pH 7,5; etilendiaminatetraacetato (EDTA) 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,25 mM y 2 \mug/ml de cada uno de los inhibidores siguientes: aprotinina, peptstatina A y leupeptina; ii) tampón TENP40: TE que contiene un detergente, Nonidet P-40, a 0,5%; iii) tampones TEU: TE que contiene diferentes concentraciones de urea (de 2 a 8 M). Después de cada extracción, se centrifugaron los homogenados durante 15 minutos a 15.000 g y se recogieron los sobrenadantes. Se guardó el primer sobrenadante de cada extracción a -30ºC hasta su utilización. Finalmente, se homogeneizó la pella correspondiente a la última extracción en el tampón que contenía urea a 8 M en tampón TUDTT: Tris-HCl 35 mM pH 6,8, urea 8 M, ditiotreitol 50 mM, glicerol al 5%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,25 mM y 2 \mug/ml de cada uno de los mismos inhibidores, se incubó durante 30 minutos a 95ºC y se centrifugó como antes. Se midieron las concentraciones proteicas utilizando el sistema de Pierce (Coomassie Plus protein assay, Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Electroforesis de las proteínas e inmunodetección

Se separaron las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS) en geles de acrilamida al 7,5 ó al 10%, o por electroforesis bidimensional en presencia de urea utilizando el sistema de Pharmacia (PhastSystem™, Pharmacka LKB). Se realizaron una isoelectrofocalización (IEF) o una electroforesis interrumpida antes del equilibrio de pH (NEpHGE: Non-Equilibrium pH Gel Electrophoresis) en primera dimensión y se realizó luego una PAGE-SDS en segunda dimensión con geles de poliacrilamida al 12,5%. Para las electroforesis bidimensionales, se precipitaron las proteínas de los extractos en tampón TENP40 en etanol, se recogieron por centrifugación y se disolvieron en 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 8 M de urea y 0,5% de \beta-mercapto-etanol. Se utilizaron las proteínas marcadoras, así como los patrones de electroforesis bidimensional (2-D SDS-PAGE standards™) de Bio-Rad como marcadores de peso molecular o como referencias de puntos isoeléctricos.

Tras la electroforesis, se tiñeron las proteínas con azul de Coomassie o con ayuda de nitrato de plata (silver stain plus kit Bio-Rad Lab.) o se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa reforzada (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Se tiñeron entonces las membranas con rojo Ponceau o Protogold (British BioCell International, Cardiff, UK) y se inmunodetectaron con los anticuerpos monoclonales como se ha descrito anteriormente. Se revelaron las reactividades con el kit ECL™ de Amersham (ECL™ Wester blotting kit, Amersham International, Aylesbury, UK) según los protocolos del fabricante.

Resultados

Se detectó el polipéptido de 52-56 kDa en los extractos en tampones TE y TEU (a partir de una concentración de urea igual a 6 M), pero no en los extractos secuenciales en tampones TENP40 y TUDTT. Además, si se centrifugaba el extracto en tampón TE durante 30 minutos a 100.000 x g, el polipéptido se encontraba en su totalidad en el sobrenadante. El anticuerpo monoclonal G36-19 reconoció también varios polipéptidos de peso molecular aparente más bajo, que no se extraían más que parcialmente en presencia de urea (incluso a la concentración de 8 M) y se extraían parcialmente en presencia de un agente reductor. Tanto en tampón TE como en presencia de urea, ningún polipéptido era inmunodetectable en el último de los tres extractos realizados. Esto indica que, en cada una de las etapas, la extracción era completa. Los experimentos de control realizados en ausencia de anticuerpo primario o con el anticuerpo MOPC-21 han resultado siempre negativos. Es probable que las formas de polipéptidos de bajo peso molecular inmunodetectables no fueran productos de degradación generados durante las etapas de extracción, puesto que su proporción no variaba de una preparación a otra y puesto que las extracciones fueron siempre realizadas en presencia de inhibidores de proteasas.

La corneodesmosina humana es un componente de las envueltas cornificadas

Con el fin de confirmar a nivel bioquímico que la corneodesmosina está ligada de forma covalente a las envueltas cornificadas, se analizaron fragmentos generados por proteolisis de envueltas altamente purificadas a partir de epidermis plantar humana con el anticuerpo monoclonal G36-19.

Preparación y análisis de las envueltas cornificadas

Se purificaron envueltas cornificadas humanas a partir de la capa córnea plantar y de epidermis mamaria, como se ha descrito anteriormente. Brevemente, las muestras fueron extraídas por ebulliciones repetidas con agitación vigorosa en una solución que contenía un 2% de SDS (p/v) y ditiotreitol a la concentración de 25 mM y luego a 37ºC durante 72 horas en una solución que contenía urea a la concentración de 8 M y ditiotreitol a la concentración de 25 mM. Se sedimentaron las envueltas extraídas en urea y se suspendieron después en una solución que contenía un 0,1% de SDS, glicina a la concentración de 192 mM y Tris a la concentración de 125 mM. Finalmente, se electrodializaron contra este mismo tampón durante 72 horas. Se recogieron las envueltas cornificadas purificadas por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se contaron. Se analizaron morfológicamente y luego por inmunofluorescencia indirecta, como se describe en la técnica anterior. Se realizó una digestión con proteasa V8 y una inmunodetección de los productos de proteolisis como se describe en la técnica anterior.

Resultados

Se incubaron las envueltas durante tiempos crecientes con proteasa V8 y se separaron los fragmentos producidos por SDS-PAGE y se inmunodetectaron. El anticuerpo monoclonal G36-19 marcó fuertemente un gran número de bandas de peso molecular aparente superior a 50 kDa, de los cuales algunos se localizaban en el límite superior del gel. Ello indica que la corneodesmosina se incorpora en el interior de estructuras heteropoliméricas de gran tamaño resultantes de la proteolisis de la envuelta. No se inmunodetectaban varias bandas teñidas por el Protogold, lo que confirma la especificidad de la reacción. Ninguna banda era claramente inmunodetectada con el anticuerpo monoclonal G36-19 en ausencia de proteolisis, lo que prueba la existencia de uniones covalentes entre la corneodesmosina y otros constituyentes de las envueltas cornificadas.

Ninguno de los fragmentos producidos por digestión de envueltas cornificadas purificadas a partir de epidermis mamaria fue inmunodetectado por el anticuerpo monoclonal G36-19. De acuerdo con este resultado, estas envueltas estaban mucho menos marcadas, y sólo en su periferia, cuando fueron analizadas con el anticuerpo monoclonal G36-19 en inmunofluorescencia indirecta.

La corneodesmosina humana de 52-56 kDa es una fosfoproteína básica

Para determinar el punto isoeléctrico de la corneodesmosina, se extrajo epidermis humana directamente en un tampón que contenía un detergente (tampón TENP40) y se separaron las proteínas extraídas por una electroforesis bidimensional (NEpHGE/SDS-PAGE) y se inmunodetectaron con el anticuerpo monoclonal G36-19. La corneodesmosina de 52-56 kDa mostró un punto isoeléctrico básico superior a 8. Este resultado fue confirmado por inmunodetección tras una separación IEF/SDS-PAGE. La proteína inmunodetectada por el anticuerpo monoclonal G36-19 no era visible después de tinción con azul de Coomassie, incluso cuando se cargaban 100 \mug de proteínas del extracto en tampón TENP40 sobre el gel. Esto sugiere, pues, que la corneodesmosina de 52-56 kDa es una proteína cuantitativamente menor, representando menos del 0,1% de las proteínas extraídas. Además, la proteína inmunorreactiva migraba en forma de varias marcas yuxtapuestas, lo que sugiere la presencia de modificaciones post-traducción. Para analizar la eventual fosforilación de la corneodesmosina humana, se purificó ésta por afinidad en una matriz de sefarosa (HiTrap-NHS, Pharmacia) activada por grupos N-hidroxisuccinimida y se copuló después con el anticuerpo monoclonal G36-19. Después, se analizó por inmunotransferencia con anticuerpos específicos de la fosfoserina o de la fosfotirosina. Uno de los cinco anticuerpos monoclonales anti-fosfoserina utilizados inmunodetectó la corneodesmosina de manera específica. Por el contrario, ni el anticuerpo monoclonal PY20 ni un antisuero, dirigidos contra la fosfotirosina, reconocieron la corneodesmosina.

La corneodesmosina humana de 52-56 kDa es una glicoproteína Afinodetección con las lectinas

La corneodesmosina de 52-56 kDa fue parcialmente purificada a partir de un extracto en tampón TENP40 por cromatografía de afinidad. La corneodesmosina fijada fue eluida con un 3% de SDS, depositada sobre gel de electroforesis y transferida a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas en un tampón de bloqueo y luego con lectinas biotiniladas vendidas por Pierce Chemical Co., diluidas a 1 \mug/ml: aglutinina de Pisum sativum (PSA), de germen de trigo (WGA), de Ricinus communis (RCA), de Dolichos bifluorus (DBA) y de Arachis hypogaea (PNA). Después de aclarar, las lectinas fueron detectadas con estreptavidina marcada con peroxidasa (diluida a 1/400.000) y el kit ECL™ de Amersham, como se ha descrito anteriormente.

Experimentos de desglicosilación

Se mantuvo el extracto en tampón TENP40 (10 \mug) en ebullición durante 3 minutos en 20 \mul de tampón fosfato de sodio a pH 7,2 que contenía un 1% (p/v) de SDS. Se añadieron Nonidet P40 y EDTA para alcanzar una concentración final, respectivamente, del 1% y de 20 mM. Se añadieron 2,4 unidades de N-glicosidasa F (EC 3.2.2.18, Boehringer Mannheim) y se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 6 horas. Se incubaron también las proteínas (34 \mug) de un extracto en tampón TENP40 con 5 mU de endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa (EC 3.2.1.97) a 37ºC durante 6 horas en presencia o no de N-glicosidasa F o de neuraminidasa (EC 3.2.1.18) en las condiciones descritas por el fabricante (Oxford GlycoSystems Ltd., Abingdon, UK). Se detuvieron las reacciones por 2 minutos de ebullición en tampón de muestra. Se estudió la desglicosilación de la fetuina, utilizada como control positivo, por PAGE-SDS y con las lectinas biotiniladas.

Las muestras tratadas y no tratadas fueron separadas por electroforesis y analizadas por inmunodetección y afinodetección, como se ha descrito anteriormente.

Cromatografía sobre Concanavalina A-Sefarosa

Se inyectó un extracto en tampón TENP40 directamente, con un caudal de 0,5 ml/minuto, sobre una columna de Concanavalina A sefarosa 4B (ConA Sepharose, Sigma), que había sido equilibrada previamente con tampón de lavado: Tris-HCl 20 mM pH 7,4 que contenía 0,2 M de NaCl. Después del lavado, con un caudal de 1 ml/minuto, con 15 ml de este tampón, se eluyeron las proteínas adsorbidas con un caudal de 0,5 ml/minuto con metil-\alpha-D-manopiranósido (Sigma) diluido a 0,5 M en el tampón de lavado. Se separaron entonces las proteínas por PAGE-SDS y se analizaron como se ha descrito anteriormente.

Resultados

Se trataron las proteínas de un extracto en tampón TENP40, que contenía la corneodesmosina de 52-56 kDa, con diversas glicosidasas y se analizaron en inmunotransferencia con dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido. La coloración de las proteínas totales del extracto no mostró degradación aparente durante la incubación. El tratamiento con N-glicosidasa F indujo una disminución de aproximadamente 5 kDa del peso molecular aparente de la corneodesmosina. Este resultado sugiere muy fuertemente una N-glicosilación. Por el contrario, los tratamientos con la endo-\alpha-N-acetilgalactosaminidasa y/o la neuraminidasa no modificaron la migración de la corneodesmosina. Para confirmar este resultado, se purificó la corneodesmosina humana por afinidad y se analizó con ayuda de lectinas biotiniladas. La aglutinina de germen de trigo (WGA) se unió fuertemente a la proteína purificada, a la inversa de las otras lectinas estudiadas, que no la reconocieron o que lo hicieron muy débilmente. Además, la corneodesmosina se unió a la concanavalina A copulada a una matriz de sefarosa. Se pudo eluir con el metil-\alpha-D-manopiranósido, azúcar específico de esta lectina, a la concentración de 0,5 M, lo que prueba la especificidad de la unión.

Purificación de la corneodesmosina

Tras la escisión dermoepidérmica, se homogeneizó la epidermis en un tampón TEA: Tris-HCl 40 mM pH 7,5, EDTA 10 mM, aprotinina 10 \mug/ml y fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (Interchim, París, Francia) utilizado a 0,8 mM. Se centrifugó el homogenado durante 15 minutos a 15.000 g. Se aclaró el sobrenadante por filtración sobre filtros cuyo diámetro de poro es de 0,45 \mum (Puradisc™ 25 AS, Whatman, Clifton, NJ) y se inyectó con un caudal de 0,3 ml/minuto sobre una columna intercambiadora de aniones (Hi Trap Q, Pharmacia LKB) que había sido equilibrada en el tampón de lavado: Tris-HCl 20 mM pH 7,5. Se inyectaron directamente las proteínas no retenidas (aproximadamente un 5% de las proteínas totales del extracto) con el mismo caudal sobre una columna de afinidad preparada como sigue: se copularon aproximadamente 2 mg del anticuerpo monoclonal F28-27 a 1 ml de matriz de Sefarosa 4B activada por grupos N-hidroxisuccinimida (HiTrap-NHS), como preconizó el fabricante Pharmacia LKB. Se lavó la columna de forma exhaustiva con un caudal de 1 ml/minuto con el tampón de lavado en presencia y luego en ausencia de 1 M de NaCl. Se eluyeron las proteínas inmunoadsorbidas con un caudal de 0,3 ml/minuto con 0,2 M de glicina a pH 2,5; se neutralizó inmediatamente el pH de las fracciones eluidas con Tris base a la concentración de 2 M. Se analizaron las proteínas de las diferentes fracciones en inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal G36-19 o con el anticuerpo monoclonal de control, MOPC-21. Se mezclaron las fracciones que contenían las proteínas así eluidas y se liofilizaron después. Se analizaron las proteínas del liofilizado como se ha descrito antes por electroforesis mono- o bidimensional. Se cortó entonces la corneodesmosina del gel con el fin de ser secuenciada.

Resultados

Se purificó la corneodesmosina de 52-56 kDa por cromatografía de intercambio aniónico seguida de cromatografía de afinidad. La totalidad de la corneodesmosina extraída se unió de manera específica sobre la columna de afinidad, de la que se pudo eluir en presencia de glicina. La tinción con Protogold de las proteínas transferidas muestra el alto grado de purificación obtenido, ya que la corneodesmosina es muy mayoritaria en estas fracciones. Se obtuvieron resultados similares cuando se realizó la cromatografía de afinidad sobre una matriz copulada con el anticuerpo monoclonal F28-27 o con el anticuerpo monoclonal G36-19. Un análisis en gel bidimensional confirmó el punto isoeléctrico básico de la corneodesmosina purificada y mostró que es la única proteína eluida que presenta un peso molecular aparente de 52-56 kDa. La corneodesmosina así purificada fue separada por electroforesis y la banda del gel que contenía esta proteína fue cortada y la proteína fue luego secuenciada.

Inestabilidad del polipéptido purificado

En el curso de sus numerosos ensayos para purificar la corneodesmosina, la solicitante se encontró con dos problemas principales: (1) la baja proporción de esta proteína entre las proteínas epidérmicas y (2) su inestabilidad, debida verosímilmente a su gran sensibilidad a la acción de las proteasas.

Se practicaron diferentes pruebas para intentar estabilizar la corneodesmosina: asociación de zinc (inhibidor de la enzima quimotrípsica de la capa córnea), agentes reductores (\beta-mercaptoetanol o ditiotreitol), agentes desnaturalizantes (SDS), glicerol, inhibidores específicos de las proteasas con serina (PMSF, aprotinina) o un cóctel de inhibidores de diversas proteasas (aprotinina, leupeptina, pepstatina, benzamidina, fenantrolina, PMSF) o supresión de las etapas de congelación/descongelación. Finalmente, la ausencia de las etapas de congelación/descongelación, la presencia de un 2% de SDS o la presencia del cóctel de inhibidores, y preferiblemente una combinación de estas condiciones, se han revelado como las más eficaces para estabilizar la corneodesmosina.

Secuenciación del polipéptido purificado

Para la secuenciación, se cortaron las bandas que corresponden a la corneodesmosina o a fragmentos de corneodesmosina (52-56 kDa, 45 kDa), evidenciados en geles de electroforesis. Se digirieron entonces las proteínas directamente en el gel por la endopeptidasa lys-C (EC 3.4.99.30) y se purificaron los péptidos generados por HPLC utilizando una columna DEAE-C18. Se secuenciaron los péptidos así seleccionados por el método de los ciclos de degradación de Edman en un aparato Procise Sequencer de la sociedad Applied Biosystems, según las instrucciones del proveedor.

Resultados

No fue posible ninguna secuenciación del extremo NH_{2}-terminal, lo que sugiere una protección de la proteína en este extremo.

Las secuenciaciones internas permitieron establecer la secuencia de dos fragmentos, a saber:

A: Lys Ser Tyr Gly Gly Tyr Glu Val Val Gly Gly Ser Ser Asp Ser Gly

B: Lys Ile Tyr Pro Val Gly Tyr Phe Thr Lys

Este resultado confirma el obtenido por las técnicas de biología molecular, que han permitido la deducción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención a partir de la secuencia nucleotídica.

Construcción de un banco de expresión de epidermis humana

No se podía realizar la clonación del ADNc de la corneodesmosina humana a partir de los bancos de expresión preexistentes. En efecto, éstos fueron producidos a partir de epidermis de ratón o a partir de queratinocitos humanos cultivados en monocapa, condiciones que no permiten la expresión de los genes característicos de la diferenciación terminal epidérmica. La solicitante ha construido, pues, un banco de expresión epidérmica humano.

Extracción de ácidos ribonucleicos (ARN) poli(A)^{+} de epidermis humana

Se realizó a partir de muestra de piel mamaria, restos quirúrgicos obtenidos tras cirugía plástica. Se disecó el tejido adiposo subcutáneo y se cortaron después colgajos de piel con ayuda de un dermotomo y se incubaron 2 horas a 37ºC en una solución de tripsina (solución A, Gibco BRL), con la cara epidérmica hacia arriba. Se realizó entonces la escisión dermoepidérmica con pinzas. Se lavaron las hojas epidérmicas obtenidas en un tampón fosfato (PBS, 7,4). La extracción de los ARN poli(A)^{+} fue realizada según el protocolo propuesto en el "mRNA purification kit" comercializado por Dynal (Oslo), tras la homogeneización de las hojas con ayuda de un "Turax", directamente en el tampón proporcionado (Lysis/Binding buffer). El principio de este kit utiliza la afinidad de los ARN mensajeros (ARNm) que llevan un extremo poli(A) por perlas magnéticas recubiertas de oligo(dT)_{25}. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente en el lisado, las perlas fueron aisladas con un imán y sometidas a 3 lavados. Se dosificaron los ARN poli(A)^{+} eluidos por incubación de las perlas a 65ºC durante 2 minutos en una solución de EDTA 2 mM, pH 8, utilizando el equipo colorimétrico "DNA DipStick" comercializado por Invitrogen (San Diego, CA).

Construcción del banco

Se construyó el banco con el equipo "ZAP Express cDNA Gigapack II Gold cloning kit", comercializado por Stratagene (La Jolla, CA), siguiendo el protocolo propuesto por el proveedor. Se sintetizaron los ADN complementarios a partir de 2 \mug de ARN poli(A)^{+}, con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Monoley (MMLV-RT), utilizando cebadores oligo(dT)18 que contienen un sitio de restricción para la enzima XhoI y en presencia de trifosfato de 5-metilcitidina. La síntesis de la segunda hebra fue realizada por la ADN polimerasa I de E. coli y se hizo que los extremos de los ADNc fueran francos con la pfu polimerasa recombinante. Tras la adición de adaptadores EcoR I (ADN ligasa de T4) y la fosforilación de los extremos 5' (polinucleótido kinasa de T4), los ADNc fueron sometidos a una digestión por la enzima Xho I. Se hizo la selección de los ADNc de tamaño superior a 500 pares de bases con una columna de Sephacryl S-500. Se realizó la ligación de los ADNc con los dos brazos del fago ZAP Express con la ligasa del fago T4. La encapsulación del fago recombinante fue realizada con los extractos "Gigapack II Gold Packaging Extract" proporcionados por Stratagene. Se utilizó la cepa XL-1 blue MRF' de E. coli para la titulación y la extensión del banco.

Resultados

Este banco fue realizado a partir de 2 \mug de ARNm, extraídos de un fragmento de epidermis humana en las horas siguientes a su recogida, por clonación unidireccional en el fago ZAP Express. Está constituido por aproximadamente 2 x 10^{5} clones independientes.

Clonación del ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) codificante de la corneodesmosina Cribado inmunológico

Se hizo el cribado inmunológico, realizado sin etapa de amplificación preliminar, sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) incubadas en una solución de isopropil-1-tio-\beta-D-galactopiranósido (IPTG, Stratagene) a 10 mM durante 10 minutos, secadas e incubadas durante 4 h a 37ºC sobre el banco extendido. Se realizó el procedimiento de cribado inmunológico como se describe en la técnica anterior con un cóctel de tres anticuerpos monoclonales G36-19, F28-27 y B17-21, utilizados a las concentraciones respectivas de 0,2, 0,2 y 2 \mug/ml. Los clones positivos fueron aislados por las técnicas clásicas y estudiados con cada uno de los tres anticuerpos monoclonales por aislado.

Secuenciación

Se sometieron los fagos ZAP Express correspondientes a los clones purificados a una excisión in vivo con ayuda de un fago ExAssist, como indica Stratagene. Se amplificaron los plásmidos obtenidos con el kit Qiagen (Hilden, Alemania) y se secuenciaron luego en los extremos de las inserciones con cebadores T3 y M13 (Stratagene) utilizando un equipo Perkin-Elmer (ABI PRISM Dye Terminator cycle sequencing kit, Perkin Elmer, Foster City, CA). Se realizó la comparación de las secuencias obtenidas con las bases de datos internacionales con el programa Blast.

Resultados

No habiendo sido amplificado el banco previamente, el cribado permitió aislar 5 clones independientes. Se secuenciaron los fragmentos de ADNc humano contenidos en los clones parcialmente a partir de los extremos, lo que permitió mostrar que eran todos solapantes y codificaban todos, por lo tanto, para fragmentos de la misma proteína. También se estudiaron los 5 clones con cada uno de los tres anticuerpos monoclonales por separado. Tres clones (1.1, 4.4 y 5.1) mostraron ser reactivos con los tres anticuerpos monoclonales, el clon 5.5 con dos anticuerpos monoclonales (F28-27 y G36-19) y finalmente el clon 1.2 no fue reconocido más que por el anticuerpo monoclonal F28-27. Estos resultados demuestran de manera formal que los tres anticuerpos monoclonales reconocen la misma proteína, confirmando también lo que había sido fuertemente sugerido por los estudios bioquímicos anteriores. Estos resultados permiten también ordenar sobre la molécula los epitopos reconocidos por cada uno de los anticuerpos monoclonales. En efecto, habiendo sido construidos los clones por transcripción inversa a partir del extremo 3' de los ARNm, que corresponde al extremo COOH de la proteína, es posible concluir que el epitopo reconocido por F28-27 es el más próximo a este extremo, seguido del epitopo de G36-19 y finalmente del de B17-21. El análisis por restricción enzimática del tamaño de estos diferentes fragmentos de ADNc confirmó que los 3 clones reconocidos por los 3 anticuerpos monoclonales presentan las secuencias más largas (de 2 a 1,5 kb), mientras que el que sólo reconoce F28-27 es el más corto (1 kb), teniendo el último, reconocido por 2 anticuerpos monoclonales, un tamaño intermedio de 1,3 kb.

Así, se clonó todo o parte del ADNc codificante de la corneodesmosina humana, proteína caracterizada por los 3 anticuerpos monoclonales B17-21, G36-19 y F28-27, que reconocen epitopos diferentes, ordenados sobre la proteína en el orden indicado, del extremo NH_{2} hacia el extremo COOH.

Las secuencias parciales de cada clon, comparadas con las secuencias incluidas en los bancos de datos internacionales, revelaron una identidad del 99% con la secuencia del gen S, inscrito en el banco de datos GenBank bajo el número L20815. Este análisis mostró igualmente que, entre los 5 clones obtenidos, 4 corresponden a la forma corta del ARNm, correspondiendo uno sólo, el clon 5.1, a la forma larga. Estas formas proceden de una elección alternativa del sitio de poliadenilación a nivel de la parte 3' no codificante del transcrito primario. Este análisis permitió precisar la localización de los epitopos reconocidos por nuestros 3 anticuerpos monoclonales: el epitopo reconocido por B17-21 se localiza en la parte de la proteína correspondiente a los nucleótidos 594 a 762, localizándose respectivamente G36-19 y F28-27 en la zona 762-1044 y 1044-codon de parada. Finalmente, el clon 1.1, que lleva la secuencia codificante más larga, comienza en el nucleótido 348.

Clonación del ADNc completo codificante de la corneodesmosina

Los análisis precedentes mostraron que los clones obtenidos no cubrían la parte del ADN que va del nucleótido 1 al nucleótido 347. La solicitante ha tenido que clonar, pues, esta parte que faltaba.

Se sometieron 80 ng de ARN poli(A)^{+}, extraído de epidermis humana como se ha descrito previamente, a una transcripción inversa a partir de cebadores aleatorios, utilizando el equipo "SuperScript" comercializado por Gibco BRL. Se realizó la amplificación del extremo 5' del ADNc de la corneodesmosina a partir de 1/20 de la reacción de síntesis de la primera hebra, con un oligonucleótido secuencia arriba correspondiente a la secuencia 2-20 (GenBank L20815) y que contiene también un adaptador Spe I y, secuencia abajo, un oligonucleótido complementario de la secuencia 1017-1035. Las condiciones de la reacción de polimerización en cadena (PCR: polymerase chain reaction) eran las siguientes: 3 minutos a 94ºC seguidos de 35 ciclos con 80 segundos a 94ºC, 80 segundos a 57ºC y 2 minutos a 72ºC. Se clonó el fragmento único obtenido, purificado tras electroforesis en gel de agarosa TBE y digerido por Spe I y EcoN I (nucleótidos 2 a 1003), en el plásmido pBK-CMV-1.1 (aislado por cribado del banco) digerido por las mismas enzimas, lo que permitió llegar al plásmido pS11. Se secuenció el ADNc completo contenido en el plásmido pS11 al menos 3 veces hasta el nucleótido 1700. La comparación con la secuencia anteriormente publicada reveló cuatro diferencias puntuales, que fueron analizadas a nivel genómico.

Análisis genómico de la corneodesmosina

Se constataron cuatro diferencias puntuales entre la secuencia del ADNc completo aislado por la solicitante y la del gen S publicado en la técnica anterior (Zhou Y. y Chaplin D.D., P.N.A.S. USA, Vol. 90, pp. 9470-9474, Octubre de 1993). Se analizaron estas cuatro diferencias puntuales por PCR, a nivel genómico, a partir de diez muestras control de ADN extraído de sangre humana según los métodos clásicos.

El análisis de la inserción eventual de una guanina en posición 1514 fue realizado tras amplificación por PCR de la región genómica comprendida entre los nucleótidos 1446 y 1786 (GenBank, L20815), realizada en las condiciones clásicas. Se sometió el fragmento de ADN obtenido para cada muestra a una digestión por Bsi MI por una parte y por Nci I por otra. Se realizó una electroforesis en gel NuSieve GTG al 3% (FMC, Rockland, ME) en tampón TBE. Se realizó el estudio de la secuencia en posición 66 según el método ASA (allele specific amplification). Se realizaron dos reacciones de PCR en paralelo con un oligonucleótido secuencia abajo complementario de la secuencia 572-91 y un nucleótido secuencia arriba correspondiente a la secuencia 52-65 y que acaba en posición 66 por A o por T. Se realizaron las reacciones de PCR con 0,5 \mug de ADN genómico, 2,5 pmol de cada oligonucleótido y 0,5 U de Taq polimerasa (Appligene). Las condiciones de amplificación son 94ºC, 2 minutos, y luego 30 ciclos con 50 segundos a 94ºC, 1 minuto a 56ºC y 2,5 minutos a 72ºC.

El análisis de las bases en posición 1118 y 1236 fue realizado tras amplificación con un par de oligonucleótidos único: oligonucleótido sentido 908-27, antisentido 1573-93. Las condiciones de PCR son las mismas que antes, con un tiempo de polimerización limitado a 1 minuto. Se sometieron los fragmentos a una digestión por Bsm I o Hin 6 I para el estudio respectivo de las posiciones 1118 y 1236 y se separaron luego por electroforesis en gel NuSieve al 3%.

Resultados

La inserción de una guanina en la posición 1514 conlleva una dislocación del marco de lectura y desplaza el codon de parada de la posición 1523 a la posición 1603. La proteína producida por esta secuencia difiere a nivel de los dos últimos aminoácidos (I y S), que son reemplazados por la secuencia:

Asp Ile Leu Ala Gln Val Lys Pro Leu Gly Pro Gln Leu Ala

Asp Pro Glu Val Phe Leu Pro Gln Gly Glu Leu Leu Asp Ser

Pro

lo que corresponde a una adición de 27 aminoácidos con respecto a la secuencia publicada. Presentando los 5 ADNc previamente aislados todos ellos esta inserción, se amplió el estudio a otros individuos. Se amplificaron diez muestras control de ADN genómico humano, procedentes de diez individuos, en esta región y se analizaron por restricción enzimática. En efecto, la secuencia publicada corresponde a la presencia de un sitio de restricción Bsi MI en posición 1510, que desaparece en la secuencia que contiene una guanina suplementaria, mientras que aparece un sitio Nci I en 1512. Los resultados son los mismos para los 10 individuos, a saber, que sólo el sitio Nci I está presente. Esto significa que, en
estos diez individuos, la corneodesmosina se produce en una forma más larga que la forma publicada del gen S.

Se encontraron otras tres diferencias puntuales, de tipo substitución, entre los clones y la secuencia publicada. El análisis de las diez muestras genómicas control por PCR y restricción enzimática o por ASA mostró que se trata de un polimorfismo del gen. La solicitante ha evidenciado en posición 66 una mutación conservadora T/A (Leu-Met); en posición 1118, un polimorfismo A/G, correspondiente a una mutación silenciosa Ala-Ala, y, finalmente, en 1236 un polimorfismo T/G correspondiente a una mutación no conservadora Ser-Ala.

Producción de corneodesmosina recombinante

Se aisló el ADNc completo codificante de la corneodesmosina, en forma de fragmento Ecl136 I/Not I de 2106 pares de bases, a partir del plásmido pS11. Se realizó la subclonación en el vector pCDNA amp (InVitrogen) previamente digerido por EcoR V y Not I, obteniéndose el plásmido p14-9.

Se efectuó la traducción in vitro de la corneodesmosina con el equipo "TNT T7 Quick coupled transcription/trans- lation system", comercializado por Promega, a partir del plásmido p14-9. Este equipo asocia en una etapa la transcripción por la ARN polimerasa del fago T7 con la traducción por un lisado de reticulocitos de conejo. Estas reacciones fueron realizadas con 0,6 \mug de plásmido en un volumen de 25 \mul según las instrucciones del proveedor.

La corneodesmosina se expresó en células COS-7 tras transfección con el plásmido p14-9. Las células fueron transfectadas según el protocolo clásico con DEAE-dextrano, completado por adición de cloroquina y un choque con DMSO, utilizando 1 \mug de plásmido/3 x 10^{5} células. Después de 48 h de expresión, se lavan las células 2 veces con PBS pH 7,4 y se lisan en un tampón Tris-HCl 40 mM pH 7,5, EDTA 10 mM, NP40 al 0,5%, que contiene un cóctel de inhibidores de proteasas (Pharmigen, Inc.). Tras separación en SDS-PAGE y electrotransferencia, se inmunodetectan las muestras como se ha descrito previamente.

Resultados

La nueva secuencia completa de la proteína predice un peso molecular de 51,45 kDa en ausencia de toda modificación post-traducción. La corneodesmosina sintetizada in vitro, en ausencia de membranas microsomales, migra con un peso molecular aparente de aproximadamente 60 kDa. Esto muestra que esta proteína tiene una migración aberrante en gel SDS-PAGE. La comigración con la forma epidérmica mayoritaria extraída en tampón de débil fuerza iónica demuestra que esta última corresponde a una forma bastante truncada de la proteína, tanto más cuanto que la solicitante ha mostrado que esta forma epidérmica está glicosilada.

La transfección de células COS-7 con el plásmido 14-9 hace aparecer una proteína inmunorreactiva que migra también a las proximidades de los 60 kDa. Se obtuvieron los mismos resultados con la línea de neuroepitelioma humano CHP 126, transfectada por electroporación. El conjunto de estos resultados sugiere fuertemente que, en la epidermis, la corneodesmosina sufre, de manera precoz en el curso de su maduración, una proteolisis específica.

Claims (17)

1. Composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos un polipéptido natural o sintético purificado, caracterizándose dicho polipéptido por tener la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1 siguiente:

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2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por purificar el polipéptido a partir de mamíferos.

3. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por purificar el polipéptido a partir de piel de mamíferos.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por purificar el polipéptido a partir de piel humana.

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por purificar el polipéptido a partir de epidermis humana.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por intervenir el polipéptido en la cohesión intercorneocitaria.

7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por estar constituido el polipéptido en parte por la secuencia del polipéptido descrito en la reivindicación 1.

8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por tener el polipéptido un peso molecular aparente, tal como puede determinarse por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE-SDS), comprendido entre 50 y 60 kilodaltons, preferiblemente entre 52 y 56 kilodaltons.

9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por ser básico el polipéptido.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por estar el polipéptido glicosilado.

11. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por estar el polipéptido fosforilado.

12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por el hecho de que el polipéptido está glicosilado, es básico y está fosforilado y de que el polipéptido tiene un peso molecular aparente, tal como puede determinarse por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE-SDS), comprendido entre 50 y 60 kilodaltons, preferiblemente entre 52 y 56 kilodaltons.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, destinada a tratar el adelgazamiento de la epidermis y en particular de la capa córnea y/o a tratar una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo y/o a reforzar la cohesión intercorneocitaria y/o a inducir el espesamiento de la capa córnea.

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, destinada a tratar las alteraciones tróficas cutáneas o las consecutivas a alteraciones de la cicatrización.

15. Utilización de al menos un polipéptido de secuencia SEC ID Nº: 1 para la preparación de una composición cosmética según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, estando destinada dicha composición al tratamiento cosmético del adelgazamiento de la epidermis, y en particular de la capa córnea, y/o para tratar una fragilidad excesiva del revestimiento cutáneo y/o para reforzar la cohesión intercorneocitaria y/o inducir el espesamiento de la capa córnea, siendo conveniente dicha composición para una aplicación sobre la piel del sujeto que ha de ser
tratado.

16. Utilización de al menos un polipéptido de secuencia SEC ID Nº: 1 para la preparación de una composición cosmética según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, estando destinada dicha composición al tratamiento de las alteraciones tróficas cutáneas o de las consecutivas a alteraciones de la cicatrización y siendo conveniente para una aplicación sobre la piel del sujeto que ha de ser tratado.

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17. Composición cosmética o farmacéutica que contiene, en un medio fisiológicamente aceptable, al menos una secuencia nucleotídica codificante SEC ID Nº: 2 siguiente:

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