JP5946447B2 - 環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、その製造方法、及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、およびその製造方法に関する。また、本発明は、かかる環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の用途に関する。詳細には、本発明は、不全角化を起因とする皮膚状態を予防、治療または改善するうえで有用な環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、並びにその用途に関する。

ヒトの表皮は、下層から順に、基底層と有棘層と顆粒層と角質層とからなる。ヒトの正常な皮膚では、前記角質層は、バリア機能を発現し、物理的刺激や化学的刺激から皮膚を保護している。

正常な皮膚は、通常、２８日間の周期でターンオーバーする。正常な皮膚のターンオーバーでは、ケラチノサイトが顆粒層から角質層へと押し上げられる。このとき、ケラチノサイトの分化により脱核が生じて有核細胞が消失し、成熟した角質層が形成される。しかしながら、炎症や皮脂中に含まれる不飽和脂肪酸などによって表皮における細胞の増殖速度が著しく大きくなり、角化の速度が異常に促進された場合、最終分化段階（表皮細胞内がケラチンで満たされ脱落に向かう段階）のケラチノサイトにおいて、脱核が起こらないことがある。これを「不全角化」という。

不全角化を伴う皮膚は、上記するように皮膚の角化プロセスに不備が生じ正常な角質細胞が形成されないため、角質層のバリア機能が著しく低下していることから、物理的刺激や化学的刺激を十分に防ぐことができない状態になっている。そのため、不全角化を伴う皮膚では、ニキビ、肌荒れなどの皮膚トラブルが生じやすい。

前記バリア機能を補うために、不全角化を伴う皮膚に対して、保湿剤などを含む皮膚外用剤が適用されている。しかしながら、一般に、前記保湿剤による表皮における保湿効果は、一時的に発揮されるにすぎないことから、当該保湿剤などを含む皮膚外用剤には、本質的な皮膚の状態の改善を期待することができないという欠点がある。そこで、不全角化を抑制し、当該不全角化を起因とする皮膚状態を予防または改善することができる有用な皮膚外用組成物が求められている。

一方、エピモルフィンは、上皮組織の形態形成の制御に関与している因子の１つであると考えられている。また、前記エピモルフィンのノックアウトにより、マウスにおける癌化誘導が減少することが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。

前記上皮組織の形態形成を制御するために、エピモルフィンにより奏される上皮組織の形態形成促進作用を阻害するオリゴペプチドが提案されている（例えば、特許文献１および２を参照）。

しかしながら、上皮組織の形態形成促進作用に対する前記オリゴペプチドの阻害作用は、上皮組織の形態形成を制御するには不十分であるため、エピモルフィンによって引き起こされる皮膚などの上皮細胞の形態・分化異常の発生などをより高い効率で抑制することができるさらに有用な化合物が求められている。

一方、エピモルフィンのファミリータンパク質の中には、シンタキシン４（syntaxin 4）と称されるタンパク質がある（非特許文献２）。エピモルフィンと同様に皮膚細胞にて発現して存在するタンパク質であるが、エピモルフィンが真皮に存在するのに対して、シンタキシン４は表皮に大量に存在する（後述する実験例１〜２参照）。

特開平１０−７６９８号公報 特許第３９２２３４５号公報

アニサ・シェーカー（Ａｎｉｓａ Ｓｈａｋｅｒ）ら、「エピモルフィン欠損は、炎症誘導性結腸癌発生からマウスを守るとともに、幹細胞ニッチ筋線維芽細胞分泌を変える（Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）」、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０１０年５月１０日、第１２０巻、ｐ．２０８１−２０９３ セル（Ｃｅｌｌ）１９９３年９月１０日、７４（５）ｐ．８６３−８７３

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、不全角化を伴う皮膚の異常な状態を抑制することができる、新規な環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を提供することを目的とする。また、本発明は、当該環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、上記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の用途、具体的には、シンタキシン４のアンタゴニストとしての使用、並びにシンタキシン４のアンタゴニストとしての作用に基づいて、不全角化を伴う皮膚の異常な状態を抑制し、当該状態を予防、治療または改善するために有効な皮膚外用組成物、並びにその他の医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決することを目的に鋭意検討を重ねていたところ、後述する式（Ｉ）で示される特定のアミノ酸配列を有する環状ペプチド化合物が、皮膚の表皮に大量に発現し存在するシンタキシン４のアンタゴニストとして作用すること（実験例７）、そして当該アンタゴニスト作用に基づいて、シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の分化異常（不全角化）を抑制するとともに（実験例６）、シンタキシン４による皮膚の代謝亢進を抑制することで（実験例４〜５）、皮膚の不全角化やその悪化に伴って生じる皮膚の異常な状態を予防、治療または改善することができることを確認した。

本発明はかかる知見に基づいて完成したものであって、下記の実施形態を包含するものである。

（Ｉ）環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩
（I-1）式（Ｉ）（配列番号１）：

〔式中、Ｘａａ^１は置換基を有していてもよいアラニル基またはグリシル基、Ｘａａ^２は置換基を有していてもよいイソロイシル基またはロイシル基、Ｘａａ^３は置換基を有していてもよいグルタミル基またはアスパルチル基、Ｘａａ^４は置換基を有していてもよいプロリル基またはグリシル基、Ｘａａ^５は置換基を有していてもよいグルタミニル基またはアスパラギニル基、及びＸａａ^６は置換基を有していてもよいリシル基またはアルギニル基を示し；
Ｒ^１は式（II）：

（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
Ｒ^２はカルボキシル基がアミド化されていてもよいシスチン残基、及びｌは０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０になることはない。〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-2）式（Ｉ）において、lが１である（I-1）に記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-3）式（Ｉ）において、ｍが１である（I-1）または（I-2）に記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-4）式（Ｉ）中、ｍが１であって、Ｒ^１が、式(II)中、ｎが１〜３の整数である基である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-5）式（Ｉ）中、ｍが１であって、Ｒ^１が、式(II)中、ｎが１若しくは３である基である、（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-6）式（Ｉ）中、ｍが０であり、ｌが１である、（I-１）または（I-2）に記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

（I-7）式（Ｉ）中、Ｘａａ^１はアラニル基、Ｘａａ^２はイソロイシル基、Ｘａａ^３はグルタミル基、Ｘａａ^４はプロリル基、Ｘａａ^５はグルタミニル基、及びＸａａ^６はリシル基である、（I-1）乃至（I-6）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。

なお、以下、上記式（Ｉ）で示される環状ペプチド化合物を「環状ペプチド化合物（Ｉ）」ともいう。

（II）環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法
（II-1）式（Ｉ）（配列番号１）：

〔式中、Ｘａａ^１は置換基を有していてもよいアラニル基またはグリシル基、Ｘａａ^２は置換基を有していてもよいイソロイシル基またはロイシル基、Ｘａａ^３は置換基を有していてもよいグルタミル基またはアスパルチル基、Ｘａａ^４は置換基を有していてもよいプロリル基またはグリシル基、Ｘａａ^５は置換基を有していてもよいグルタミニル基またはアスパラギニル基、及びＸａａ^６は置換基を有していてもよいリシル基またはアルギニル基を示し；
Ｒ^１は式（II）：

（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
Ｒ^２はカルボキシル基がアミド化されていてもよいシスチン残基、及びｌは０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。〕
で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法であって、式（III）（配列番号２）：

〔式中、Ｘａａ^１は置換基を有していてもよいアラニル基またはグリシル基、Ｘａａ^２は置換基を有していてもよいイソロイシル基またはロイシル基、Ｘａａ^３は置換基を有していてもよいグルタミル基またはアスパルチル基、Ｘａａ^４は置換基を有していてもよいプロリル基またはグリシル基、Ｘａａ^５は置換基を有していてもよいグルタミニル基またはアスパラギニル基、及びＸａａ^６は置換基を有していてもよいリシル基またはアルギニル基を示し、
上記Ｒ^１は式（IV）：

（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びにｌは同時に０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。なお、ｌが１であるとき、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基はフリーでも、またアミド化されていてもよい。〕
で表される化合物を環化させることを特徴とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法。

（II-2）式（Ｉ）中、ｌが１である、（II-1）に記載する製造方法。

（II-3）式（Ｉ）中、ｍが１であって、Ｒ^１が、式(II)中、ｎが１〜３の整数である基である（II-1）又は（II-2）に記載する製造方法。

（II-4）式（Ｉ）中、ｍが１であって、Ｒ^１が、式(II)中、ｎが１若しくは３である基である（II-1）又は（II-2）に記載する製造方法。

（II-5）式（Ｉ）中、ｍが０であり、ｌが１である、（II-1）または（II-2）に記載する製造方法。

（II-6）式（Ｉ）中、Ｘａａ^１はアラニル基、Ｘａａ^２はイソロイシル基、Ｘａａ^３はグルタミル基、Ｘａａ^４はプロリル基、Ｘａａ^５はグルタミニル基、及びＸａａ^６はリシル基である、（II-1）乃至（II-5）のいずれかに記載する製造方法。

（III）環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の用途
（III-1）（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩からなる、シンタキシン４のアンタゴニスト。

（III-2）（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を有効成分とする外用組成物。

（III-3）外用組成物が、外用医薬品、外用医薬部外品、または化粧品である、（III-2）に記載する外用組成物。

（III-4）（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。

（III-5）シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の異常な状態を予防、治療または改善するための組成物である、（III-2）または(III-3)に記載する外用組成物。

（III-6）シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の異常な状態が、皮膚の不全角化、不全角化を起因とする皮膚の異常状態（肌荒れ、ニキビ、吹き出物、タコ、イボ、乾癬）、または皮膚の異常状態における代謝亢進である（III-5）に記載する外用組成物。

（III-7）エピモルフィンによって引き起こされるか、エピモルフィンの過剰発現によって発症若しくは増悪する疾患または病態を予防、治療または改善するための組成物である、（III-4）に記載する医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。

（III-8）上記疾患または病態が、臓器の損傷、慢性閉塞性動脈硬化症、またはバージャー病である、（III-7）に記載する医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。

（III-9）シンタキシン４によって引き起こされる皮膚異常を有する被験者の当該皮膚に、（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、または（III-2）または(III-3)に記載する組成物を適用する工程を有する、シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の異常を治療または改善する方法。

（III-10）エピモルフィンによって引き起こされるか、エピモルフィンの過剰発現によって発症若しくは増悪する疾患または病態を有する被験者に（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩、または（III-4）に記載する組成物を投与する工程を有する、上記疾患または病態を治療または改善する方法。

なお、上記（III-9）及び（III-10）において、被験者にはヒトを始めとする哺乳動物が含まれる。

（III-11）シンタキシン４によって引き起こされる皮膚異常、またはエピモルフィンによって引き起こされるか、エピモルフィンの過剰発現によって発症若しくは増悪する疾患または病態を予防、治療または改善するための医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物を製造するための、（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の使用。

（III-12）シンタキシン４によって引き起こされる皮膚異常、またはエピモルフィンによって引き起こされる疾患を予防、治療または改善するための医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物を製造するための、（I-1）乃至（I-7）のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の使用。

本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４に対して拮抗的に作用して、その生理活性を制御する。このため、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４に対するアンタゴニストとして用いることができる。具体的には、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩によれば、シンタキシン４に対するアンタゴニスト作用に基づいて、シンタキシン４によってヒトの皮膚に引き起こされる皮膚の不都合な状態（例えば、不全角化を伴う皮膚の異常状態、当該異常状態における皮膚の代謝亢進）の発生や増悪を抑制することができるという効果を奏することができる。本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、当該作用に基づいて、外用組成物として、特に外用医薬品、外用医薬部外品、または化粧料として有用である。

また、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４の機能もしくは特性を解明または検証する実験系において、シンタキシン４の活性を制御するための試薬として用いることができる。さらに、前述するように、シンタキシン４のアンタゴニストとして、シンタキシン４またはシンタキシン４作用剤の活性・作用評価系の試薬や対照薬として用いることができる。

また、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩の製造方法によれば、前記環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩を簡便に製造することができる。

皮膚組織におけるシンタキシン４（stx4）の発現部位を示す図である（実験例１）。これからエピモルフィン（EPM）は真皮層で発現するのに対して、シンタキシン４は表皮層で発現して局在しており、表皮の分化に深く関与している可能性が示唆される。 シンタキシン４は、ヒト皮膚の表皮細胞の外側表面に提示された状態で発現していることを示す図である（実験例２）。 シンタキシン４は、エピモルフィンと同様に、CHX刺激により、正常ヒト表皮細胞の細胞外に提示されるタンパク質であることを示す図である（実験例３）。一方、細胞外に提示されることのないタンパク質であるシンタキシン６（Syntain6）は検出されていない。 本発明の環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の正常ヒト表皮細胞の代謝に及ぼす影響を評価した結果を示す（実験例４）。縦軸は正常ヒト表皮細胞の細胞代謝量を、横軸は添加ペプチド（左からペプチド無添加、ペプチドST41、ペプチドST40、及びペプチドST4gaba）を意味する。 本発明の環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の、正常ヒト表皮細胞及びEP4M強発現表皮細胞の代謝に及ぼす影響を評価した結果を示す（実験例５）。図５において、横軸の左側から１〜４番目の結果は、図４に示した結果を併記したものであり、左からペプチド無添加、環状ペプチドST41添加、環状ペプチドST40添加、及び環状ペプチドST4gaba添加した場合における正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）の代謝量を示す。また横軸中央の結果は、EPΔM発現表皮細胞の細胞代謝量を示す。さらに左から６〜９番目の結果は、左からペプチド無添加、ペプチドST41添加、ペプチドST40添加、及びペプチドST4gaba添加した場合におけるEP4M発現表皮細胞の細胞代謝量を示す。 左端から、正常ヒト表皮細胞の角化率、並びにEPΔM処理表皮細胞、EP4M処理表皮細胞、及び「EP4M＋ST41」処理表皮細胞における角化率をそれぞれ示す（実験例６）。 左端から、正常ヒト表皮細胞、r-stx4処理表皮細胞、及び「r-stx4＋ST41」処理表皮細胞における角化能（コーニファイドエンベロープ形成能：CCE形成能）を示す（実験例７）。なお、角化能（CCE形成能）は、正常ヒト表皮細胞を１とした相対比で示す。 左端から、対照の表皮細胞（正常ヒト表皮細胞に空の発現ベクターを導入した細胞）、EPM強制発現表皮細胞、EPn1処理＋EPM強制発現表皮細胞、stx4強制発現表皮細胞、ST41処理＋stx4強制発現表皮細胞における角化能（コーニファイドエンベロープ形成能：CCE形成能）を示す（実験例８）。なお、角化能（CCE形成能）は、正常ヒト表皮細胞を１とした相対比で示す。**：p<0.01 左端から、ヒト初代培養表皮細胞、ST41処理-ヒト初代培養表皮細胞、EPn0（2CP）処理-ヒト初代培養表皮細胞、及びEPn1処理-ヒト初代培養表皮細胞における角化能（コーニファイドエンベロープ形成能：CCE形成能）を示す（実験例９）。 （Ａ）は、１ウェルあたりに播いた細胞数が1.0×10⁴／wellの場合の接着アッセイの結果、（Ｂ）は、１ウェルあたりに播いた細胞数が2.0×10⁴／wellの場合の接着アッセイの結果を示す（実験例１０）。 実験例１１の結果を示す。（Ａ）各種組換えタンパク質（シンタキシン４(stx4)、エピモルフィン(EPM)、変異エピモルフィン(EP4M)）を各条件（還元条件、非還元条件、native条件）で電気泳動した結果を示す。（Ｂ）電気泳動の結果から推定した各種組換えタンパク質（シンタキシン４(stx4)、エピモルフィン(EPM)、変異エピモルフィン(EP4M)）の立体構造を示す。

１．環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、式（Ｉ）（配列番号１）：

〔式中、Ｘａａ^１は置換基を有していてもよいアラニル基またはグリシル基、Ｘａａ^２は置換基を有していてもよいイソロイシル基またはロイシル基、Ｘａａ^３は置換基を有していてもよいグルタミル基またはアスパルチル基、Ｘａａ^４は置換基を有していてもよいプロリル基またはグリシル基、Ｘａａ^５は置換基を有していてもよいグルタミニル基またはアスパラギニル基、及びＸａａ^６は置換基を有していてもよいリシル基またはアルギニル基を示し；
Ｒ^１は式（II）：

（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
Ｒ^２はカルボキシル基がアミド化されていてもよいシスチン残基、及びｌは０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。〕
で表される構造（配列番号１）を有する。

Ｒ^２で示すシスチン残基とは、例えば下式に示すように、２つのシステイニル基が互いにジスルフィド結合して形成された残基を意味する。当該シスチン残基は、上記するように、カルボキシル基がアミド化されていてもよい。

（式中、＋は、隣接するアミノ酸残基との結合部位を意味する。）
なお、本明細書において、特に言及しない限り、各アミノ酸（Ｘａａ^１〜Ｘａａ^６等）間を連結する結合様式はペプチド結合である。例えば上記式（Ｉ）において、Ｒ^１とＸａａ^１との結合、Ｘａａ^１とＸａａ^２との結合、Ｘａａ^２とＸａａ^３との結合、Ｘａａ^３とＸａａ^４との結合、Ｘａａ^４とＸａａ^５との結合、Ｘａａ^５とＸａａ^６との結合、Ｘａａ^６とＲ^２との結合、及びＲ^１とＲ^２との結合はいずれもペプチド結合である。

本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、式（Ｉ）で表される構造を有することを特徴とし、かかる構造に基づいて、シンタキシン４に対するアンタゴニスト作用、及びシンタキシン４によって引き起こされる皮膚状態の異常を抑制することができる。以下、シンタキシン４によって引き起こされる皮膚状態の異常を抑制する作用を、単に「抑制作用」ともいう。

Ｘａａ¹は、置換基を有してもよいアラニル基、置換基を有してもよいグリシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ¹が置換基を有してもよいアラニル基または置換基を有してもよいグリシル基である場合、かかる置換基としては、例えば、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１−３の低級アルキル基などが挙げられる。前記Ｘａａ¹のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないアラニル基である。

Ｘａａ²は、置換基を有してもよいイソロイシル基、または置換基を有してもよいロイシル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。前記置換基としては、例えば、炭素数１〜３のアルキル基などが挙げられる。前記Ｘａａ²のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないイソロイシル基である。

Ｘａａ³は、置換基を有してもよいグルタミル基、または置換基を有してもよいアスパラチル基である。前記置換基は、本発明の目的を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ³が置換基を有してもよいグルタミル基である場合、前記置換基としては、アミノ基などが挙げられる。Ｘａａ³が置換基を有してもよいアスパラチル基である場合、前記置換基としては、スクシンイミド基、リン酸基などが挙げられる。前記Ｘａａ³のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないグルタミル基である。

Ｘａａ^４は、置換基を有してもよいプロリル基またはグリシル基である。当該置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよく、例えば、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１−３の低級アルキル基などが挙げられる。前記Ｘａａ^４のなかで、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないプロリル基である。

Ｘａａ^５は、置換基を有してもよいグルタミニル基、または置換基を有してもよいアスパラギニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ^５が置換基を有してもよいグルタミニル基である場合、前記置換基としては、カルボキシル基などが挙げられる。またＸａａ^５が置換基を有してもよいアスパラギニル基である場合、前記置換基としては、単糖または多糖から誘導されたチオグリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＯ-グリコシル基、単糖または多糖から誘導されたＮ-グリコシル基などが挙げられる。前記Ｘａａ^５のなかでは、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないグルタミニル基である。

Ｘａａ^６は、置換基を有してもよいリシル基、または置換基を有してもよいアルギニル基である。前記置換基は、本発明の効果を阻害しない官能基であればよい。Ｘａａ^６が置換基を有してもよいリシル基である場合、前記置換基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１−３の低級アルキル基などが挙げられる。またＸａａ^６が置換基を有してもよいアルギニル基である場合、前記置換基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１−３の低級アルキル基などが挙げられる。前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは置換基を有しないリシル基である。

なお、Ｘａａ^１〜Ｘａａ^６、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ、Ｌ−体の官能基であってもよく、Ｄ−体の官能基であってもよい。ヒトの皮膚への適応性の観点から、Ｘａａ^１〜Ｘａａ^６、Ｒ¹およびＲ^２は、好ましくはＬ−体の官能基である。

式（Ｉ）で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩のなかで、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは、式（Ｉ）において、ｌが１である環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩が特に好ましい。さらに、ｍが０であって、ｌが１である化合物；またはｍが１、及びｌが０または１であって、Ｒ^１で示される基が、式（II）において、ｎが１〜１０の整数である化合物である。ｎは、好ましくは８以下の整数、より好ましくは５以下の整数、さらに好ましくは３以下の整数である。特に好ましくは１〜３の整数、なかでも１若しくは３であることが好ましい。なお、ｍが１であるとき、ｌも同時に１であることが好ましい。

前記薬理的に許容される塩としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、有機酸塩などが挙げられる。前記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられる。また、有機酸塩としては、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、無機塩基塩、有機塩基塩などが挙げられる。無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられる。

２．環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法
本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩の製造方法は、式（III）（配列番号２）：

〔式中、Ｘａａ^１、Ｘａａ^２、Ｘａａ^３、Ｘａａ^４、Ｘａａ^５、Ｘａａ^６、ｍ及び１は、式（Ｉ）における各定義と同じ、
Ｒ^１は式（IV）：

（式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表される基を示す。但し、ｍとｌは同時に０にはならない。〕
で表される鎖状ペプチド化合物を合成し、得られた鎖状ペプチド化合物（III）を環化させることによって実施することができる。かかる本発明の製造方法によれば、式（III）で表されるペプチド化合物を環化させることによって、前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を、簡便に、かつ効率よく製造することができる。

なお、上記式（III）中、ｌが１である鎖状ペプチドは、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基がフリーであっても、またアミド化されていてもよい。

式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍが０であり、ｌが１である化合物は、式（III）におけるＣｙｓ、Ｘａａ^１、Ｘａａ^２、Ｘａａ^３、Ｘａａ^４、Ｘａａ^５、Ｘａａ^６およびＣｙｓそれぞれに対応するアミノ酸を用いて、ペプチドの化学合成法を行なうことにより製造することができる。また、式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍとｌがいずれも１である化合物は、式（III）におけるＣｙｓ、Ｘａａ^１、Ｘａａ^２、Ｘａａ^３、Ｘａａ^４、Ｘａａ^５、Ｘａａ^６、Ｃｙｓそれぞれに対応するアミノ酸、及び式（Ｖ）：

〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物を用い、ペプチドの化学合成法などを行なうことにより製造することができる。さらに、式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍが１でｌが０である化合物は、式（III）におけるＸａａ^１、Ｘａａ^２、Ｘａａ^３、Ｘａａ^４、Ｘａａ^５、Ｘａａ^６それぞれに対応するアミノ酸、及び式（Ｖ）：

〔式中、ｎは式（Ｉ）におけるｎと同じである〕
で表される化合物を用い、ペプチドの化学合成法などを行なうことにより製造することができる。

前記化学合成法としては、例えば、固相合成法、段階的伸長法、液相合成法などが挙げられる。前記化学合成法のなかでは、目的とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造が容易であり、しかも、その収率および純度が高いことから、固相合成法が好ましい。前記固相合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などが挙げられる。かかる固相合成法は、市販のペプチド合成機を用いて行なうことができる。

固相合成法を行なう場合、固相として、例えば、ペプチド合成用樹脂などが用いられる。前記ペプチド合成用樹脂としては、例えば、ＰＡＭ樹脂、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。

固相合成法において、前記アミノ酸は、前記保護基によって分子内のアミノ基を予め保護して用いられる。前記保護基としては、例えば、９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、前記アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されているアミノ酸を「保護アミノ酸」という。

式（Ｖ）において、ｎが１である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、グリシンを用いることができる。式（Ｖ）において、ｎが２である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、β−アラニンを用いることができる。また、式（Ｖ）において、ｎが３である場合、式（Ｖ）で表される化合物として、４−アミノ酪酸（γ−アミノ酪酸）を用いることができる。式（Ｖ）において、ｎが４〜１０の整数である場合、式（Ｖ）で表される化合物は、ストレッカー反応ならびにゼリンスキー・スタドニコフの変法を利用した化学合成によって得ることができる。固相合成法において、かかる式（Ｖ）で表される化合物は、前記アミノ酸の場合と同様に、アミノ基および必要に応じて側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いる。なお、本明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されている式（Ｖ）で表される化合物を「保護化合物」という。

式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍが０であり、ｌが１である化合物は、固相合成法を行なう場合、式（III）におけるＣｙｓ、Ｘａａ^６、Ｘａａ^５、Ｘａａ^４、Ｘａａ^３、Ｘａａ^２、Ｘａａ^１、およびＣｙｓに対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（III）で表される化合物に対応する産物を切り出すと同時に保護基を除去する。また、式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍとｌが同時に１である化合物は、固相合成法を行なう場合、式（III）におけるＣｙｓ、Ｘａａ^６、Ｘａａ^５、Ｘａａ^４、Ｘａａ^３、Ｘａａ^２、Ｘａａ^１、Ｒ^１、およびＣｙｓに対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（III）で表される化合物に対応する産物を切り出すと同時に保護基を除去する。さらに、式（III）で表されるペプチド化合物のうち、例えば、ｍが１でｌが０である化合物は、固相合成法を行なう場合、式（III）におけるＸａａ^６、Ｘａａ^５、Ｘａａ^４、Ｘａａ^３、Ｘａａ^２、Ｘａａ^１、及びＲ^１に対応する保護アミノ酸または保護化合物を、この順で、ペプチド合成用樹脂上で逐次的に縮合させ、つぎに、前記ペプチド合成用樹脂から式（III）で表される化合物に対応する産物を切り出すと同時に保護基を除去する。

前記縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。前記縮合の際の反応温度は、ペプチドの合成において一般的な温度であればよい。通常、前記反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。

保護基の除去は、例えば、触媒の存在下での水素気流中での酸処理、アルカリ処理、接触還元などにより行なうことができる。

式（III）で表される化合物の製造後、必要に応じて、得られた生成物の精製を行なってもよい。前記精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行なうことができる。

本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）が、式（Ｉ）中、ｌが１である化合物の場合、式（III）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のシステイニル基のチオール基を酸化架橋させることにより行なうことができる、前記システイニル基同士のジスルフィド化は、例えば、式（III）で表される化合物を、酢酸水溶液などの酸性水溶液中でヨウ素によって酸化させることによって形成させることができる。

本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）が、式（Ｉ）中、ｌが０であり、ｍが１である化合物の場合、式（III）で表される化合物の環化は、かかる化合物の両末端のアミノ酸残基同士（Ｒ^１で示されるアミノ酸残基とＸａａ^６で示されるアミノ酸残基同士）をペプチド結合させることにより行なうことができる、かかるアミノ酸残基同士のペプチド結合は、例えば、式（III）（式中、ｌは０であり、ｍは１である）で表される化合物に通常のペプチド合成に用いられる縮合試薬を作用させることによって行うことができ、斯くして環状構造を形成させることができる。

得られた生成物が式（Ｉ）で表される化合物であることは、例えば、プロテインシークエンサーや質量分析装置などによって確認することができる。

なお、式（Ｉ）で表される化合物が遊離体として得られた場合、式（Ｉ）で表される化合物の薬理的に許容できる塩は、得られた生成物を、必要に応じて、常法にしたがって薬理的に許容できる塩に変換することにより得ることができる。

また、得られた生成物がその分子内に前記保護基を有する場合、常法に従って前記保護基を脱離させることができる。なお、保護基の導入と脱保護に関して、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第４版〔ペーター・Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）およびテオドラ．Ｗ．グリーン（Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２００６年発行〕に記載の方法に従うこともできる。また、必要に応じて、得られた生成物の単離や精製を行なってもよい。前記生成物の単離や精製は、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーなどによって行なうことができる。

本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４に対して拮抗的に働く（アンタゴニスト作用）。このため、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４の生理活性を抑制し、当該シンタキシン４によって引き起こされる皮膚状態の異常を抑制することができる。かかる皮膚状態の異常としては、制限されないが、例えば、ヒトを含む動物の皮膚の不全角化などを例示することができる。従って、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩によれば、皮膚の不全角化を抑制することにより、当該不全角化に起因する皮膚状態の異常を改善することができる。かかる皮膚状態の異常としては、例えば、肌荒れ、ニキビ、吹き出物、タコ、イボ、乾癬などが挙げられる。

これらのことから、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、外用組成物、例えば外用の医薬品、医薬部外品、及び化粧品の有効成分として有用である。また、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４に対するアンタゴニストとして、シンタキシン４またはそのアゴニストの作用等を評価する試薬として有用である。

なお、本発明で対象とするシンタキシン４は、その由来を特に制限されるものではないが、ヒト及びその他の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌなど）の皮膚表皮細胞において発現するタンパク質である。マウス（Mus musculus）のシンタキシン４のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を、配列番号３及び４のそれぞれに示す（NCBI-GeneID：20909、KEGG entry No.: mmu: 20909）。またヒトのシンタキシン４のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を配列番号５及び６のそれぞれに示す（NCBI-GeneID：6810、KEGG entry No.: hsa:6810）。

本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩による前記抑制作用は、例えば、（ａ）シンタキシン４を強発現する表皮細胞を、本発明の環状ペプチド化合物の存在下で培養することにより、シンタキシン４を強発現することによって増加した標記細胞の代謝量が抑制されること、または（ｂ）本発明の環状ペプチド化合物を含む培地中でシンタキシン４を強発現する表皮細胞を培養した後、得られた表皮細胞をカルシウムイオン導入剤を含む培地中で培養することにより、シンタキシン４を強発現することによって増大した皮膚の角化能（不全角化）が抑制されることに基づいて評価することができる。

また（ｃ）本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩のシンタキシン４に対するアンタゴニスト作用（拮抗作用）を評価することによっても、上記抑制作用を評価することができる。

３．環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の用途
（３−１）外用組成物
本発明は、式（Ｉ）で示される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を有効成分とする外用組成物を提供する。本発明が対象とする外用組成物には、前述するように、外用の医薬品（皮膚外用剤）、医薬部外品、及び化粧料が含まれる。

本発明の外用組成物中における前記環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記外用組成物の種類やその形状などによって異なるので、一概には決定することができず、前記外用組成物の種類やその形状などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、本発明の外用組成物中における前記環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０００００００１質量％以上、より好ましくは０．００００００１質量％以上、取り扱い時における容易性を確保するとともに、ヒトへの負荷を抑制する観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０１質量％以下である。なお、液剤や乳液剤の形状を有する外用組成物の場合、当該外用組成物中における前記環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩の含有量は、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下である。

本発明の外用組成物には、本発明の目的が妨げられない範囲で、医薬品、医薬部外品または皮膚化粧料に配合されるその他の成分が配合されていてもよい。前記成分としては、例えば、油性成分、保湿剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、粘度調整剤、キレート化剤、アルコール、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン、アミノ酸、水などが挙げられる。本発明の外用組成物中における前記成分の含有量は、外用組成物の形状や各成分の種類などによって異なるので、一概には決定することができず、外用組成物の形状や各成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。

なお、外用医薬品としては、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ゲル剤、ムース、噴霧剤（スプレー）などが挙げられる。外用の医薬部外品としては、例えば、軟膏、クリーム、ローション、ゲル剤、ムース、噴霧剤（スプレー）などが挙げられる。

また、皮膚化粧料としては、特に限定されないが、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ファンデーションなどが挙げられる。洗顔料としては、特に限定されないが、例えば、石けん、クレンジングフォーム、クレンジングジェル、洗顔パウダー、シェービングフォーム、クレンジングミルク、クレンジングオイル、クレンジングマスクなどが挙げられる。化粧水としては、特に限定されないが、例えば、柔軟化粧水、収れん化粧水などが挙げられる。乳液としては、例えば、エモリエントローション、マッサージローション、クレンジングローション、メーキャップローション、ハンドローション、ボディーローションなどが挙げられる。クリームとしては、特に限定されないが、メーキャップクリーム、ベースクリーム、プレメーキャップクリーム、エモリエントクリーム、クレンジングクリーム、ファンデーションクリーム、マッサージクリーム、デオドラントクリームなどが挙げられる。ファンデーションとしては、パウダーファンデーション、ケーキタイプファンデーション、両用ファンデーションなどが挙げられる。

本発明の外用組成物によれば、当該外用組成物を、不全角化を伴う皮膚と接触させることにより、シンタキシン４と拮抗することでその生理活性を抑制し、当該シンタキシン４により引き起こされる不全角化の状態を改善することができる。したがって、本発明の外用組成物によれば、不全角化を起因とする皮膚の状態を改善することができる。また、シンタキシン４は、ヒトなどの動物の皮膚の表皮最終分化（細胞内がケラチンで満たされ脱落に向かう過程）を抑制するとともに、表皮細胞の代謝を亢進させる作用がある。本発明の外用組成物によれば、シンタキシン４と拮抗することでその生理活性を抑制し、当該シンタキシン４により引き起こされる皮膚の分化異常と代謝亢進による不全角化の悪化を抑制することができる。

本発明の外用組成物の皮膚への使用量は、皮膚の状態や範囲などによって異なるので、一概には決定することができず、皮膚の状態や範囲などに応じて適宜設定することが好ましい。通常、前記外用組成物の使用量は、皮膚の面積１０ｃｍ²あたりの前記環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の量が、前記抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１ｎｇ以上、より好ましくは１０ｎｇ以上となり、取り扱い時における容易性を確保する観点から、好ましくは１０００μｇ以下、より好ましくは１００μｇ以下、さらに好ましくは１０μｇ以下となる程度に調整されることが望ましい。

本発明の外用組成物と皮膚との接触は、当該外用組成物の剤形などに応じた方法によって行なうことができる。

以上のように、本発明の外用組成物によれば、ヒトを含む動物の皮膚の不全角化を抑制することができることから、前記不全角化に起因するヒトの皮膚の異常状態を改善することができる。したがって、本発明の外用組成物は、不全角化に起因するヒトの皮膚の異常状態を予防または改善するために好適に使用することができる。

（３−２）その他の医薬用途
本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、シンタキシン４に対し拮抗的に働き、シンタキシン４の生理活性を抑制し、当該シンタキシン４によって引き起こされるヒトの組織の状態の異常を抑制することができるので、上記で説明したヒトの皮膚の不全角化などの抑制のほか、各種の医薬用途に適用することができる。

例えば、シンタキシン４と同じファミリーであるエピモフィンは、内胚葉細胞に存在するレセプター型チロシンキナーゼを介して臓器の形成などに関与していることが知られている。また、エピモルフィンが過剰に発現した場合、例えば、慢性関節リウマチ、癌（例えば、腎細胞癌、皮膚癌など）、動脈硬化症、膠原病、造血器疾患、腎疾患、筋ジストロフィー、骨粗鬆症、神経線維腫症、Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ症候群、結節性硬化症、神経管閉塞障害、分節異常、脳孔症、水頭症などの疾患が引き起こされる可能性がある。本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩によれば、シンタキシン４の生理活性を抑制することができることから、同様にエピモフィンの生理活性をも抑制できると考えられ、例えば、肺、肝臓、腎臓、胃、腸などの臓器の損傷の治療、血管再生、慢性閉塞性動脈硬化症状、バージャー病などの予防・治療、さらにはエピモルフィンの過剰発現に起因する疾患の予防または治療などの用途に有用である。したがって、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、エピモルフィンの過剰発現に起因する疾患の予防または治療剤、慢性閉塞性動脈硬化症状、バージャー病などの予防または治療剤、損傷臓器の治療剤などの製剤として有用であると考えられる。

前記製剤においては、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩は、器官、局所部位、組織などに導入するに適した薬理的に許容される担体に保持させてもよい。

前記製剤中における本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、治療上有効量であり、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などに応じて適宜設定することができる。通常、前記製剤中における本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の含有量は、０．０００１〜１００質量％である。

また、前記製剤は、前記製剤の用途、投与経路、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、剤形などに応じて、他の助剤をさらに含有していてもよい。前記助剤としては、例えば、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の効果を発現させる対象となる部位に到達するまでの間に、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の分解を抑制する性質を呈する薬理的に許容される助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などが挙げられる。

製剤の剤形は、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類などによって適切な剤形が異なることから一概には決定することができないが、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、注射剤などが挙げられる。

前記製剤の投与経路は、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の投与経路としては、例えば、局所投与、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、経口投与などが挙げられる。

前記製剤の投与量は、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などによって異なることから一概には決定することができないが、前記製剤の用途、適用対象となる疾患または損傷臓器の種類、投与対象となるヒトの年齢または体重などに応じて適宜決定することが好ましい。前記製剤の投与量は、例えば、投与対象となるヒトが成人である場合、１日あたり成人の体重１ｋｇに対して、本発明の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の量が、シンタキシン４の生理活性を十分に抑制する観点から、好ましくは１μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上となり、投与対象のヒトへの負荷を抑制する観点から、好ましくは１０ｍｇ以下、より好ましくは１ｍｇ以下となるように調整されることが望ましい。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、Ｃｙｓはシステイニル基、Ａｌａはアラニル基、Ｇｌｎはグルタミニル基、Ｇｌｕはグルタミル基、Ｉｌｅはイソロイシル基、Ｐｒｏはプロリル基、Ｇｌｙはグリシル基を示す。

実施例１ 環状ペプチドの製造
式（Ｉ）において、Ｘａａ^１がアラニル基、Ｘａａ^２がイソロイシル基、Ｘａａ^３がグルタミル基、Ｘａａ^４がプロリル基、Ｘａａ^５がグルタミニル基、及びＸａａ^６がリシル基であり、ｍ及びｌがいずれも１であり、Ｒ^１基中、ｎが１、Ｒ^２のシスチン残基のカルボキシル基がアミド化されている環状ペプチド（ＳＴ４１）を以下のようにして、合成した。

（１）ＳＴ４１ペプチドの合成（ｍ＝１、ｌ＝１、ｎ＝１）
出発原料として、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｔ（２−Ｃｌ）樹脂〔２-クロロトリチル樹脂１ｇあたりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）の量が０．７０ｍｍｏｌ〕０．２５ｍｍｏｌ相当量を、自動ペプチド合成装置〔アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製、商品名：４３０Ａ〕に入れた。

樹脂上のＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、ペプチド合成装置のプログラムの制御下に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体であるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)１ｍｍｏｌをカップリング剤〔０．５ｍｍｏｌ Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（以下、「ＨＢＴｕ」という）と０．５ｍｍｏｌ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨＯＢｔ」という）とを含むジメチルホルムアミド〕で活性化させ、前記反応槽に入れた。これにより、前記反応槽内において、樹脂上のアミノ酸残基とＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体とのカップリング反応を行ない、Ｆｍｏｃ基保護ペプチド鎖を生成した。

つぎに、樹脂上のＦｍｏｃ基を２０体積％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン溶液で除去し（脱保護）、洗浄した。その後、配列に従ってＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）をこの順で用いて前記と同様の操作を行なうことにより、配列番号７に示されるアミノ酸配列に従って、対応するＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を樹脂上のＦｍｏｃ基保護ペプチド鎖に逐次導入し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得た。なお、カップリング反応の成否は、カイザーテストを行なうことにより適宜確認した。つづいて、樹脂中のＦｍｏｃ基を除去した後、全保護基の除去と樹脂担体からの切り出しを行った。

得られた保護ペプチドを含む樹脂を、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」という）とトリイソプロピルシラン（以下、「ＴＩＳ」という）と水とエタンジチオール（以下、「ＤＴ」という）の混合液〔ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴ（体積比）が９２．５／２．５／２．５／２．５〕中、室温で２時間インキュベーションして脱保護および樹脂からのペプチド鎖の切り出しを行なった。インキュベーション後の混合液から２-クロロトリチル樹脂をろ別し、ろ液を得た。得られたろ液を減圧下に濃縮して当該ろ液からＴＦＡを留去した。得られた残渣に、冷却ジエチルエーテルを添加して、ペプチドの粗生成物の沈殿物約７００ｍｇを回収した。

得られた粗生成物約７００ｍｇを、逆相カラム〔ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた高速液体クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。目的のペプチドを含む画分を回収し、前記画分からアセトニトリルを留去した。つぎに、残渣を凍結乾燥させ、目的のペプチドのトリフルオロ酢酸塩１１０ｍｇを得た。前記ペプチドは、ＨＰＬＣ及び質量分析測定で配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが確認された。

（２）ペプチドの環化
前記（１）で得られたペプチド１１０ｍｇ（０．１３５ｍｍｏｌ）を５０体積％酢酸水溶液１３０ｍＬに添加した。得られた混合物に、０．５Ｍヨウ素水溶液２１０μＬ（０．８当量）を添加し、撹拌しながら室温で３時間混合した。これにより、ペプチド中の２つのシステイニル基のチオール基を酸化して、ジスルフィド結合を形成させた。その後、得られた混合物にアスコルビン酸７０ｍｇを添加した。

つぎに、得られた混合物を、逆相カラム〔ズルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）社製、オクタデシルシリカカラム、カラムの内径：３０ｍｍ、カラムの長さ２５０ｍｍ〕を備えた逆相高速クロマトグラフィー分取装置〔（株）島津製作所製、商品名：モデルＬＣ８Ａ〕に供した。そして、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１体積％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル溶液とを用い、溶離液中のアセトニトリルの濃度勾配が１〜６０体積％となるように溶離液中のアセトニトリルの濃度を調整しながら、流速：１．０ｍＬ／分で２５分間クロマトグラフィーを行なった。これにより、生成物２０ｍｇを得た。

（３）環状ペプチド化合物（ＳＴ４１）の確認
前記（１）で得られたペプチド（配列番号７）および前記（２）で得られた生成物（酸化後のペプチド）それぞれを質量分析装置〔（株）島津製作所製、商品名：ＬＣ−ＭＳ−２０１０〕に供し、前記（１）で得られたペプチドおよび前記（２）で得られた酸化後のペプチドそれぞれのマススペクトルを調べた。

その結果から、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの理論値付近の９４８．１ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。この結果から、前記（１）で得られたペプチドが配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが裏付けられた。なお、配列番号７で示されるペプチドは、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基がアミド化されている。

また、前記（１）で得られたペプチドのマススペクトルでは、９４８．１ｍ／ｚにピークが見られるのに対して、前記（２）で得られた酸化後のペプチドのマススペクトルでは、水素原子２個分少ない９４６．６ｍ／ｚにピークが見られることがわかる。これらの結果から、前記（２）で得られた酸化後のペプチドは、２つのシステイニル基間でジスルフィド結合が形成されることによって、前記（１）で得られたペプチド（配列番号７）が環化されていることが裏付けられた。したがって、前記（２）で得られた酸化後のペプチド（ＳＴ４１）は、式（Ｉ）において、Ｘａａ^１がアラニル基、Ｘａａ^２がイソロイシル基、Ｘａａ^３がグルタミル基、Ｘａａ^４がプロリル基、Ｘａａ^５がグルタミニル基、及びＸａａ^６がリシル基であり、シスチン残基のカルボキシル基はアミド化されており、ｍ及びｌがいずれも１、Ｒ^１基中、ｎが１である環状ペプチド化合物であることがわかる。なお、当該環状ペプチド化合物の純度をＨＰＬＣで調べたところ、９９．６％であることが確認された。

（４）外用組成物の調製
前記（２）で得られた環状ペプチド化合物をその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、外用組成物（皮膚外用剤）を得た。

実施例２：環状ペプチド（ＳＴ４０）の製造（ｍ＝０、ｌ＝１）
実施例１において、ｍが１である化合物の代わりに、ｍが０である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる鎖状ペプチドを合成した後、これを２つのシステイニル基間でジスルフィド結合を形成することで環化させて環状ペプチド化合物（ＳＴ４０）を製造した。なお、配列番号８で示されるペプチドは、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基がアミド化されている。当該環状ペプチド化合物の純度をＨＰＬＣで調べたところ、９８．５％であることが確認された。

ここで得られた環状ペプチド化合物（ＳＴ４０）をその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、外用組成物（皮膚外用剤）を得た。

実施例３：環状ペプチド（ＳＴ４gaba）の製造（ｍ＝１，ｌ＝１，ｎ＝３）
実施例１において、ｍとｌがいずれも１であって、Ｒ^１基中、ｎが１である化合物の代わりに、ｍとｌがいずれも１であって、Ｒ^１基中、ｎが３である化合物を用いたことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる鎖状ペプチドを合成した後、これを２つのシステイニル基間でジスルフィド結合を形成することで環状ペプチド化合物（ＳＴ４gaba）を製造した。なお、配列番号９で示されるペプチドは、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基がアミド化されている。当該環状ペプチド化合物の純度をＨＰＬＣで調べたところ、９３．９％であることが確認された。

ここで得られた環状ペプチド化合物（ＳＴ４gaba）をその濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に添加し、外用組成物（皮膚外用剤）を得た。

実験例１ 表皮におけるシンタキシン４の発現の確認
ヘアレスマウス（日本SLC, HR-1）の皮膚の凍結切片を作成し、これを被験皮膚試料として、上記で調製した抗血清ならびにFITCラベルされた抗ウサギIgG（「Alexa Fluor（登録商標）488ラベル」インビトロジェン社）を用いて、皮膚におけるシンタキシン４の発現部位を調べた。

結果を図１に示す。この結果から、シンタキシン４は、皮膚の表皮において多く発現していることが分かる。このことから、シンタキシン４は表皮の分化に深く関与している可能性が示唆された。

実験例２ シンタキシン４の局在部位の確認
チャンバースライドの培地上に、正常ヒト表皮ケラノサイト細胞株であるHaCaT細胞を播いた。なお、培地として、DMEM/HamF12（シグマ−アルドリッチ社製）に、熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）を最終濃度が10質量％になるように添加し、熱不活性化FCS含有DMEM/HamF12培地（以下、「DH10培地」という）を使用した。

結果を図２に示す。上記で説明するように、この実験ではヒト表皮細胞の細胞膜に穴を開けずに細胞表面のみを蛍光免疫染色している。その結果、図２に示すように、細胞内に存在するタンパク質であるβ-actinは染色されていないのに対して、シンタキシン４は染色されていたこと。このことから、シンタキシン４は、表皮細胞の外側表面に提示された状態で存在していると考えられる。

実験例３ 細胞表面におけるシンタキシン４の検出
マウスのエピモルフィンをコードするcDNA（GeneBank Accession：BAA01278.1、配列番号１０）におけるエピモルフィンのN末端側に対応する部位に、T7タグをコードするDNAを付加し、T7タグ-エピモルフィンをコードするcDNAを調製した。次いで、T7タグ-エピモルフィンをコードするcDNAを、レトロウイルス発現ベクターpQCXIN（クローンテック社製）のEcoRI認識部位に挿入し、T7タグ-エピモルフィン発現用プラスミドを調製した。得られたプラスミドを、遺伝子導入用試薬（商品名：リポフェクタミン（インビトロジェン社製）、商品名：プラス試薬（インビトロジェン社製））を用いてパッケージング細胞（クローンテック社製、PT67細胞）に導入した。つぎに、得られた細胞のうち、500μg/mLのジェネティシン（商品名：G418、ギブコ・ラボラトリー社製）に対して耐性能を示す細胞から培養上清を回収した。回収された培養上清中から、レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスをヒド表皮細胞（HaCaT細胞）に感染させ、500μg/mLのジェネティシンの存在下に、5体積％二酸化炭素雰囲気下にて37℃で8日間培養した。その後、培養後の細胞におけるエピモルフィン発現を調べることにより、N末端側にT7タグを付けたマウスエピモルフィン（配列番号１１）を産生するヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を得た。

同様にして、N末端側にT7タグを付けたマウスのシンタキシン４（配列番号３）を産生するヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を調製した。

次いで、各遺伝子を導入したヒト表皮細胞を培養する培地に、100mMのシクロヘキシミド（CHX）（Bio Vision製）を培地の1／1000量添加し、シクロヘキシミド（CHX）刺激を行った。

CHX刺激した表皮細胞を、DH10培地中で5体積％二酸化炭素雰囲気下、37℃で培養し、3日後に培地を捨てて、PBSで2回優しく洗浄した。洗浄後、5mlのPBSを入れ、次いでSolfo-NHS-ビオチン(ピアス社製：10mg/mL in PBS)を50μL加え15分間室温で反応させた。その後、PBS＋Solfo-NHS-ビオチンを捨て、DH10培地で優しく1回洗浄して、ビオチンラベル化を停止した。

結果を図３に示す。図３に示すように、細胞外に提示されることのないタンパク質であるシンタキシン６は検出されなかったのに対して、CHX刺激により細胞外へより提示されることが分かっているエピモルフィンと同様に、シンタキシン４もCHX刺激により細胞外へより提示されることが分かった。

実験例４ 本発明の環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の表皮細胞に対する作用
DH10培地入りの96穴プレートに、5,000個/well の割合で正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を播き、それに製造例１〜３で製造した各環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）を10μg/mLずつ添加し、5体積％二酸化炭素雰囲気下で37℃の条件で静置培養した。培養から7日後、各ウエルに細胞増殖試薬（商品名：WST-1、(株)同仁化学研究所製）を添加し、37℃で2時間反応させた後、波長450nmにおける吸光度を測定した（WST-1値の測定）。また、比較対照試験として、上記環状ペプチド化合物を添加しない以外は同様にして、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を播いて７日間培養したウエルに細胞増殖試薬を添加して反応させた後、波長450nmにおける吸光度を測定した（WST-1値の測定）。

次いで、各ウエルをPBSで洗ったのち、0.5MのNaOH 水溶液を50μL/wellの割合で添加し、DNA濃度を超微量分光光度計（nano-drop）を用いて測定した。ヒト表皮細胞１個あたりの代謝量を、下式から算出した。

[数１]
ヒト表皮細胞１個あたりの代謝量 ＝ WST-1の値／DNA量
結果を図４に示す。縦軸は正常ヒト表皮細胞の細胞代謝量を、横軸は添加ペプチドを意味し、左からペプチド無添加、環状ペプチドST41添加、環状ペプチドST40添加、及び環状ペプチドST4gaba添加の系における実験結果を示す。図４に示すように、環状ペプチドを添加していない表皮細胞の代謝量に比べて、環状ペプチド（ST40、ST41、ST4gaba）を添加した標記細胞の代謝量はいずれも低くなった。この結果から、本発明の環状ペプチドは表皮細胞の代謝を抑制する作用を有していると判断された。

実験例５ 環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の表皮細胞に対する作用
上記実験例４では、内在性のエピモルフィン及びシンタキシン４が正常に発現している正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）に対する本発明の環状ペプチド化合物の影響を調べたが、この実験例５では、正常ヒト表皮細胞に代えて、下記の変異エピモルフィンを強制発現させたヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を用いて、実験例４と同様の実験を行い、変異エピモルフィン強制発現表皮細胞に対する本発明の環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の影響を調べた。
（１）変異エピモルフィン強制発現表皮細胞の調製
（1-1）変異エピモルフィン（EPΔM）強制発現表皮細胞
マウスのエピモルフィンのアミノ酸配列（配列番号１１）において、N末端から95〜100の領域（活性中心）のアミノ酸配列（SIEQSC：配列番号１２）を欠損させた変異エピモルフィン（以下、これを単に「EPΔM」という）をコードする遺伝子を、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）に導入して、変異エピモルフィン（EPΔM）強制発現表皮細胞（以下、これを「EPΔM発現表皮細胞」という）を調製した。

（1-2）変異エピモルフィン（EP4M）強制発現表皮細胞
マウスのエピモルフィンのアミノ酸配列（配列番号１１）において、N末端から95〜100の領域（活性中心）のアミノ酸配列（SIEQSC：配列番号１２）を、マウスのシンタキシン４の推定活性中心のアミノ酸配列（AIEPQK：配列番号１３）（N末端から103〜108の領域）で置換した変異エピモルフィン（以下、これを単に「EP4M」という）をコードする遺伝子を、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）に導入して、変異エピモルフィン（EP4M）強制発現表皮細胞（以下、これを「EP4M発現表皮細胞」という）を調製した。

（２）表皮細胞の代謝量の測定
実験例４と同様にして、DH10培地入りの96穴プレートに、5,000個/well の割合で上記で調製したEPΔM発現表皮細胞またはEP4M発現表皮細胞を播き、それに製造例１〜３で製造した各環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）を10μg/mLずつ添加し、5体積％二酸化炭素雰囲気下で37℃の条件で静置培養した。培養から7日後、各ウエルに細胞増殖試薬（商品名：WST-1試薬、(株)同仁化学研究所製）を添加し、37℃で2時間反応させた後、波長450nmにおける吸光度を測定した（WST-1値の測定）。また、比較対照試験として、環状ペプチド化合物を添加しない以外は同様にして、ウエルに細胞増殖試薬を添加して反応させた後、波長450nmにおける吸光度を測定した（WST-1値の測定）。

次いで、各ウエルをPBSで洗ったのち、0.5MのNaOH 水溶液を50μL/wellの割合で添加し、DNA濃度をnano-dropを用いて測定した。ヒト表皮細胞１個あたりの代謝量を算出した。

（３）結果
結果を図５に示す。縦軸はヒト表皮細胞の細胞代謝量を示す。具体的には、図５において、横軸の左側から１〜４番目の結果は、図４に示した結果を併記したものであり、左からペプチド無添加、環状ペプチドST41添加、環状ペプチドST40添加、及び環状ペプチドST4gaba添加した場合における正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）の代謝量を示す。図５において横軸中央の結果は、EPΔM発現表皮細胞の細胞代謝量を示す。さらに図５において左から６〜９番目の結果は、左からペプチド無添加、ペプチドST41添加、ペプチドST40添加、及びペプチドST4gaba添加した場合におけるEP4M発現表皮細胞の代謝量を示す。

この結果からわかるように、エピモルフィンの活性中心部位を欠損させたEPΔMを強制発現させたヒト表皮細胞の代謝量（図５中、中央）は、正常ヒト表皮細胞の代謝量 (図５中、一番左側)と殆ど変わらないのに対して、エピモルフィンの活性中心部位のアミノ酸配列をシンタキシン４の推定活性中心部位のアミノ酸配列で置換したEP4Mを強制発現させたヒト表皮細胞の代謝量（図５中、左から６番目）は正常ヒト表皮細胞の代謝量 (図５中、一番左側)よりも有意に高くなることが分かった。かかるEP4M発現表皮細胞に対して、本発明の環状ペプチド化合物（ST41、ST40、ST4gaba）を添加することにより、その代謝量の増加を中和すること、つまり、EP4M発現表皮細胞における代謝量の増加を抑制することが分かった。

このことから、エピモルフィンの活性中心部位のアミノ酸配列をシンタキシン４の推定活性中心部位のアミノ酸配列で置換したEP4Mを強発現させることで、表皮細胞の代謝量は増加するが、本願発明の環状ペプチド化合物（ST41、ST40、ST4gaba）にはその代謝量の増加を抑制する作用があることが判明した。

なお、エピモルフィンとシンタキシン４とは互いに類似のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、上記で置換した活性中心領域のアミノ酸配列は相違するものの、それ以外の領域のアミノ酸配列は類似している。このため、エピモルフィンの活性中心部位のアミノ酸配列をシンタキシン４の推定活性中心部位のアミノ酸配列で置換したEP4M は、シンタキシン４に極めて類似するものであり、いわばシンタキシン４を模倣したものといえる。このため、上記実験例５の結果から、シンタキシン４（Stx4）を強制発現させたヒト表皮細胞の代謝量は正常ヒト表皮細胞の代謝量よりも高くなることが予想され、またかかるStx4強発現表皮細胞に対して、本発明の環状ペプチド化合物（ST41、ST40、ST4gaba）を添加することによりその代謝量の増加が中和されること、つまり、本発明の環状ペプチド化合物によればStx4強発現表皮細胞における代謝量の増加を抑制できるものが予想される。

実験例６ 環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）の表皮細胞の角化に対する作用
エピモルフィンの活性中心（a.a.95-1000）のアミノ酸配列（配列番号１２）を欠失させたEPΔM、エピモルフィンの活性中心のアミノ酸配列をシンタキシン４の推定活性中心（a.a.103-108）のアミノ酸配列（配列番号１３）で置換したEP4M、および本発明の環状ペプチド化合物（ST41）が、表皮細胞の分化の過程である角化においてどのような影響を示すかを調べた。

（１）実験方法
DH10培地を入れた48穴プレートに、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を播いた（10×10⁴/1well）。5体積％二酸化炭素雰囲気下に37℃で2日間培養した後に、培地を交換し、各ウエルに、EPΔM（50μg/mL）単独、EP4M（50μg/mL）単独、及び「EP4M（50μg/mL）＋ST41（10μg/mL）」をそれぞれ添加した。引き続き、5体積％二酸化炭素雰囲気下、37℃条件下で3日間培養した後に、表皮細胞を回収し、回収した表皮細胞を1.0×10⁵ 細胞／mLになるように、無血清DH培地（DMDM/HamF12：シグマ−アルドリッチ社製）に懸濁した。

斯くして調製した懸濁液（20×10⁴ 細胞/ 250μL）に、カルシウム流入を引き起こすカルシウムイオノフォア（商品名：A23187、シグマ−アルドリッチ社製）を10ng / 250μLとなるように加えて混合し、5体積％二酸化炭素雰囲気下、37℃条件下で5時間培養した。次いで、10,000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去して表皮細胞を回収し、回収した表皮細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄した。洗浄後の細胞を可溶化液（組成：2質量％SDS、20mMジチオスレイトール、残部精製水）中で10分間沸騰処理した後、カルシウムイオノフォアによるカルシウム流入後の角化（コーニファイドエンベロープ形成）に起因する残存不溶化細胞の数を、光学顕微鏡下で計数し、表皮細胞の総数（全細胞数）と残存不溶化細胞の総数から、下式より、表皮細胞の角化率（コーニファイドエンベロープ形成率）を算出した。

[数２]
角化率（％）＝（残存不溶化細胞の総数／全細胞数）×100
結果を図６に示す。図６の左端から、正常ヒト表皮細胞の角化率、並びにEPΔM処理表皮細胞、EP4M処理表皮細胞、及び「EP4M＋ST41」処理表皮細胞における角化率をそれぞれ示す。これからわかるように、EPΔMは表皮細胞の角化にまったく影響しなかったのに対して、EP4Mは表皮細胞の角化を有意に阻害した。また表皮細胞を「EP4M＋ST41」で処理することで、EP4M処理による表皮細胞の角化の阻害が抑制されたことから、本発明の環状ペプチド化合物ST41は、EP4Mの角化阻害作用を中和すること、つまり、EP4Mの角化阻害作用をペプチドST41が抑制することが確認された。

実験例５にて説明したように、EP4M は、シンタキシン４に極めて類似したアミノ酸配列からなるタンパク質であり、いわばシンタキシン４を模倣したものといえる。つまり、上記EP4Mに代えてシンタキシン４を用いても、同様の結果が得られると考えられる。このため、上記実験例６の結果に基づけば、表皮細胞にシンタキシン４（Stx4）を強制発現させるとヒト表皮細胞の角化率は格段に低下して不全角化が生じると予想される。またかかる表皮細胞に対して、本発明の環状ペプチド化合物（ST41、ST40、ST4gaba）を添加することにより表皮細胞の最終分化が抑制され、その結果、不全角化が抑制されると予想される。このことから、本発明の環状ペプチド化合物（ST41、ST40、ST4gaba）は、シンタキシン４の強発現などに起因する不全角化等の皮膚の異常な状態を抑制若しくは改善する作用があると考えられる。

実験例７ 環状ペプチド化合物（ST41）の表皮細胞の角化に対する作用（その２）
シンタキシン４（r-stx4）、および本発明の環状ペプチド化合物（ST41）が、表皮細胞の分化の過程である角化においてどのような影響を示すかを調べた。

（１）組換えシンタキシン４（r-stx4）の調製
Y. Hirai, et al.,（J. Cell Biol. 140 (1998) 159-169）及びY. Oka, et al.,（Exp. Cell Res. 222(1996) 189-198）に記載されている方法と同様の手法を用いて作製したシンタキシン４発現コンストラクト（stx4構築物）を用いて、BL21菌株により調製した。具体的には、stx4の発現構築物は、SNAREとC末端のトランスメンブランドメインを欠失させたマウス・シンタキシン４（NCBI-GeneID:20909）に相当するｃDNAを、5’末端に6つのヒスチニン残基をコードする塩基配列、及び3’末端にTGAの塩基残基を有するDNAとともにPCRにより増幅させ、次いで、Pet3aベクター（Novagen社製）のEcoRI部位に挿入することで、作製した。

（２）実験方法
実験例６と同様に、DH10培地を入れた48穴プレートに、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）を播いた（10×10⁴/1well）。5体積％二酸化炭素雰囲気下に37℃で2日間培養した後に、培地を交換し、各ウエルに、r-stx4（50μg/mL）単独、及び「r-stx4（50μg/mL）＋ST41（10μg/mL）」をそれぞれ添加した。引き続き、5体積％二酸化炭素雰囲気下、37℃条件下で3日間培養した後に、表皮細胞を回収し、回収した表皮細胞を1.0×10⁵ 細胞／mLになるように、無血清DH培地（DMDM/HamF12：シグマ−アルドリッチ社製）に懸濁した。

斯くして調製した懸濁液（20×10⁴ 細胞/ 250μL）に、実験例６と同様に処理して、カルシウムイオノフォアによるカルシウム流入後の角化（コーニファイドエンベロープ形成：CCE形成）に起因する残存不溶化細胞の数を、光学顕微鏡下で計数し、表皮細胞の総数（全細胞数）と残存不溶化細胞の総数から、上記式より、表皮細胞の角化率（コーニファイドエンベロープ形成率）を算出した。

結果を図７に示す。図７の左端から、正常ヒト表皮細胞の角化能、r-stx4処理表皮細胞、及び「r-stx4＋ST41」処理表皮細胞における角化能をそれぞれ示す。なお、図に示すr-stx4処理表皮細胞及び「r-stx4＋ST41」処理表皮細胞における角化能は、正常ヒト表皮細胞の角化能を１とした場合の相対比である。これからわかるように、本発明の環状ペプチド化合物（ST41）は、シンタキシン４が有する正常ヒト表皮細胞の角化促進作用を阻害することが確認された。

前述する実験例５と上記実験例６の結果から、本発明の環状ペプチド化合物（ST41）は、EP4Mの角化阻害活性を阻害するのみならず、シンタキシン４の角化促進活性をも抑制するように機能することが判明した。

実験例８ 環状ペプチド化合物（ST41）の表皮細胞の角化に対する作用（その３）
シンタキシン４（stx4）を強制発現させた表皮細胞に対する本発明の環状ペプチド化合物（ST41）の、角化における影響を調べた。

（１）シンタキシン４（stx4）強制発現表皮細胞の調製
細胞外に発現するようにN末端側にシグナルペプチドを融合させた、T7タグ付きシンタキシン４（stx4）（マウス）のアミノ酸配列（配列番号３）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）に導入して、シンタキシン（stx4）強制発現表皮細胞（以下、これを「stx4強制発現表皮細胞」という）を調製した。

（２）エピモルフィン（EPM）強制発現表皮細胞の調製
細胞外に発現するようにN末端側にシグナルペプチドを融合させた、T7タグ付きエピモルフィン（EPM）（マウス）のアミノ酸配列（配列番号１１）をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、正常ヒト表皮細胞（HaCaT細胞）に導入して、エピモルフィン（EPM）強制発現表皮細胞（以下、これを「EPM強制発現表皮細胞」という）を調製した。

（３）実験方法
実験例６と同様に、DH10培地を入れた48穴プレートに、上記のstx4強制発現表皮細胞またはEPM強制発現表皮細胞を播いた（10×10⁴/1well）。5体積％二酸化炭素雰囲気下に37℃で2日間培養した後に、培地を交換し、stx4強制発現表皮細胞を撒いたウエルにST41（10μg/mL）を、EPM強制発現表皮細胞を撒いたウエルにEPMのアンタゴニストEPn1（配列番号１４）（10μg/mL）を添加した。なお、EPn1は、エピモルフィンの活性中心のアミノ酸配列（配列番号１２）から合成されたエピモルフィンのアンタゴニストであり、下式(VI)で示される環状ペプチドである（特開2012-17290号公報参照）。なお、下記式中、各アミノ酸はＬ体である。

引き続き、5体積％二酸化炭素雰囲気下、37℃条件下で3日間培養した後に、表皮細胞を回収し、回収した表皮細胞を1.0×10⁵ 細胞／mLになるように、無血清DH培地（DMDM/HamF12：シグマ−アルドリッチ社製）に懸濁した。

斯くして調製した懸濁液（20×10⁴ 細胞/ 250μL）に、実験例６と同様に処理して、カルシウムイオノフォアによるカルシウム流入後の角化（コーニファイドエンベロープ形成：CCE形成）に起因する残存不溶化細胞の数を、光学顕微鏡下で計数し、表皮細胞の総数（全細胞数）と残存不溶化細胞の総数から、上記式より、表皮細胞の角化率（コーニファイドエンベロープ形成率）を算出した。

結果を図８に示す。図８の左端から、対照の表皮細胞（正常ヒト表皮細胞に空の発現ベクターを導入した細胞）、EPM強制発現表皮細胞、EPn1処理-EPM強制発現表皮細胞、stx4強制発現表皮細胞、及びST41処理-stx4強制発現表皮細胞における角化能をそれぞれ示す。なお、図に示す各細胞における角化能は、対照細胞の角化能を１とした場合の相対比である。

この結果からわかるように、表皮細胞においてシンタキシン４を強制発現させると表皮細胞の角化能（CCE形成能）が増加するが、この作用は本発明の環状ペプチド（ST41）により抑制される。このことから、本発明の環状ペプチド（ST41）は、シンタキシン４のアンタゴニストとして作用することがわかる。つまり、本発明の環状ペプチド（ST41）は、シンタキシン４のアンタゴニストとして、シンタキシン４の表皮分化促進機能を抑制するように作用する。

一方、表皮細胞においてエピモルフィンを強制発現させると、逆に表皮細胞の角化能（CCE形成能）が低下する。この作用は、エピモルフィンのアンタゴニストにより抑制される。エピモルフィンとシンタキシン４は同じ領域を活性中心とするものの、表皮細胞の分化に対しては逆の作用を示し、それぞれの作用がペプチド性アンタゴニストで中和されることが判明した。このことは、表皮のホメオスタシス維持に両方の因子が違った形で参加し、何らかの形でそのバランスが崩れた場合にもそれぞれのアンタゴニストにより修正が可能であることを示唆する。

実験例９ 環状ペプチド化合物（ST41）の表皮細胞の角化に対する作用（その４）
ヒト初代培養表皮細胞は、シンタキシン４を多く発現している。そこで、細胞としてヒト初代培養表皮細胞（クラボウNHEK cat＃KK-4009 Stain No.01387）を用いて、実験例６と同様の方法により、本発明の環状ペプチド（ST41）の表皮細胞の角化能（コーニファイドエンベロープ形成能：CCE形成能）に対する作用を調べた。なお、対照として、本発明の環状ペプチド（ST41）とは別に、エピモルフィンのアンタゴニストである上記式（VI）に示すEPn1（配列番号１４）、およびコントロールペプチドとして下式（VII）で示す環状ペプチドEPn0（配列番号１５）についても同様に、表皮細胞の角化能に対する作用を調べた。下記式中、各アミノ酸はＬ体である。

結果を図９に示す。

この結果から、ヒト初代培養表皮細胞を用いた場合でも、本発明の環状ペプチド（ST41）は、表皮細胞の角化を有意に抑制することが確認された。

実験例１０ 環状ペプチド（ST40、ST41、ST4gaba）のアンタゴニスト作用
（１）試験方法
（1-1）被験試料の調製
被験試料として、下記のタンパク質含有水溶液を調製した。
・ＧＦＰ
・シントキシン４＋環状ペプチド（ST41, ST40, またはST4gaba）
・ＥＰ４Ｍ＋環状ペプチド（ST41, ST40, またはST4gaba）
（1-2）接着アッセイ
細胞培養用でない未処理の48穴プレート（iwaki）の各ウエルの内壁に、蛋白濃度を1mg/mlに調製した上記の各被験試料を5μLずつ塗布した。これを室温で１時間放置して乾燥させた。次いで、非特異的な細胞の接着を阻止するため7mg/mlのBSAを含有する培養液（DMEM/HamF12：Sigma製）にHaCaT細胞を懸濁し、１ウエルあたり10000個（1.0×10⁴／well）または20000個（2.0×10⁴／well）の割合になるように細胞（400μL）を播いた。室温で１.５時間インキュベートした後、ウエル内でよくピペッティングし、沈んでいる細胞を浮かせた後、素早く培養液を吸い取った。

培養液を除去したウエルを数回PBSで洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで10分間処理して固定した後、ヘマトキシリンで１時間染色した。次いで、ウエル内を流水で洗浄し、染色を指標として、細胞数をカウントした。

（２）結果
結果を図１０に示す。図１０（Ａ）は、１ウエルあたりに播いた細胞数が1.0×10⁴／wellの場合の結果、図１０（Ｂ）は、１ウエルあたりに播いた細胞数が2.0×10⁴／wellの場合の結果を示す。図１０に示すように被験試料を塗布しなかったウエルにはHaCaT細胞が全く接着しなかった。また、ネガティブコントロールとして実施したGFPを塗布したウエルにもHaCaT細胞がほとんど接着しなかった。これに対して、シンタキシン４(r-Stx4) を塗布したウエル、および活性中心領域のアミノ酸配列をシンタキシン４(r-Stx4)の活性相当領域のアミノ酸配列で置換したエピモルフィン改変体（r-EP4M）を塗布したウエルにはHaCaT細胞が接着した。さらにシンタキシン４およびエピモルフィン改変体（r-EP4M）にそれぞれ本発明の環状ペプチド化合物（ST40、ST41、ST4gaba）を加えた結果、どの環状ペプチド化合物を加えた場合でも、接着細胞数が減少した。これらの結果から、本発明の環状ペプチド化合物はいずれもシンタキシン４およびエピモルフィン改変体（r-EP4M）のアンタゴニストとして機能していることが確認された。

以上の実験例１〜１０の結果から、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）は、シンタキシン４のアンタゴニストとして作用することが確認された。このため、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩によれば、シンタキシン４によってヒトの皮膚に引き起こされる皮膚の状態の異常、特に不全角化の発生や増悪を抑制することができることがわかる。したがって、本発明の環状ペプチド化合物（Ｉ）またはその薬理的に許容される塩は、不全角化に起因するヒトの皮膚の状態の異常を改善する医薬用途や美容用途などに有用である。

実験例１１ シンタキシン４（stx4）、エピモルフィン（EPM）、及び変異エピモルフィン（EP4M）の立体構造
正常ヒト表皮細胞と各種の組換えタンパク質［シンタキシン４（stx4）、エピモルフィン（EPM）、変異エピモルフィン（EP4M）］をインキュベートし、細胞に結合したタンパク質を還元下（ジメルカプトエタノール存在下：2Me(＋)）または非還元下（ジメルカプトエタノール存在下：2Me(-)）、並びにnative-PAGEにて電気泳動を行った。native-PAGE電気泳動は、インビトロジェンから購入した試薬を用いて推奨のプロトコールに従って実施した。

電気泳動の結果を図１１（Ａ）に示す。この結果から、角化阻害活性を有するエピモルフィン（EPM）や変異エピモルフィン（EP4M）は主として二量体として存在し、角化促進活性を有するシンタキシン４（stx4）は主として単量体として存在することが明らかになった（図１１（Ｂ））。EPM及びEP4Mは、それぞれN末端領域の11番目のシステイニル基がジスルフィド結合することにより二量体を形成し、またstx4は141番目のシステイニル基がジスルフィド結合することにより二量体を形成するものと考えられる。いずれも活性部位（図11(B）の矢印領域)を表面に出した状態で折り畳まれた構造を有している。このことから、本発明の環状ペプチドは、シンタキシン４（stx4）の単量体及び二量体の両方をアンタゴナイズすることが示唆される。

（処方例）
以下、本発明に係る外用組成物の処方例を示す。

（処方例１ エモリエントローション）
実施例１〜３で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００１質量％
エタノール ５．０質量％
ポリイキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油 １．０質量％
グリセリン １５．０質量％
１，３−ブチレングリコール １．５質量％
クエン酸 ０．０５質量％
クエン酸ナトリウム ０．１質量％
メチルパラベン ０．３質量％
香料 適 量
紫外線吸収剤 適 量
精製水 残 部
合計 １００．０質量％

（処方例２ エモリエント乳液）
実施例１〜３で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００３質量％
流動パラフィン １５．０質量％
ミツロウ ２．０質量％
ラノリン １．５質量％
セスキオレイン酸ソルビタン ２．５質量％
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル １．０質量％
１，２−オクタンジオール ０．０５質量％
グリセリン １０．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
キサンタンガム ０．５質量％
香料 適 量
紫外線吸収剤 適 量
精製水 残 部
合計 １００．０質量％

（処方例３ エモリエントクリーム）
実施例１〜３で得られた環状ペプチド化合物 ０．０００５質量％
ステアリルアルコール ５．０質量％
ステアリン酸 ２．０質量％
ワセリン ５．０質量％
スクワラン ５．０質量％
トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０質量％
ホホバ油 １．０質量％
オリーブ油 １．０質量％
１，３−ブチレングリコール ３．０質量％
グリセリン １０．０質量％
プロピレングリコールモノステアリン酸エステル ２．５質量％
ポリオキシエチレンセチルエーテル ３．０質量％
トリエタノールアミン １．０質量％
メチルパラベン ０．１５質量％
プロピルパラベン ０．１質量％
香料 適 量
酸化防止剤 適 量
精製水 残 部
合 計 １００．０質量％

配列番号１は一般式（Ｉ）で示される本発明の環状ペプチド化合物のアミノ酸配列である。配列番号２は本発明の環状ペプチド化合物を合成する中間体としての直鎖状ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号７は、式（Ｉ）中、Ｒ^１が式（II）または（III）で示される基であってｍ＝１、ｎ＝１である本発明の環状ペプチド化合物の製造中間体としての鎖状ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号８は、式（Ｉ）中、Ｒ^１が式（II）または（III）で示される基であってｍ＝０である本発明の環状ペプチド化合物の製造中間体としての鎖状ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号９は、式（Ｉ）中、Ｒ^１が式（II）または（III）で示される基であってｍ＝１、ｎ＝３である本発明の環状ペプチド化合物の製造中間体としての鎖状ペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１２はエピモルフィンの活性中心のアミノ酸配列、配列番号１３はシンタキシン４の推定活性中心のアミノ酸配列である。配列番号１４はエピモルフィンのアンタゴニストである環状ペプチド(EPn1)のアミノ酸配列である。配列番号１５は実験例９においてコントロールペプチドとして使用した環状ペプチド(EPn0)のアミノ酸配列である。

Claims (13)

1. 式（Ｉ）：
   

   

   〔式中、Ｘａａ^１ はアラニル基、Ｘａａ^２ はイソロイシル基、Ｘａａ^３ はグルタミル基、Ｘａａ^４ はプロリル基、Ｘａａ^５ はグルタミニル基、及びＸａａ^６ はリシル基を示し；
   Ｒ^１は式（II）：
   

   

   （式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
   で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
   Ｒ^２はカルボキシル基がアミド化されていてもよいシスチン残基、及びｌは０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。〕
   で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
2. 式（Ｉ）中、ｌが１である、請求項１記載の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
3. 式（Ｉ）において、ｍが１である、請求項１または２記載の環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
4. 式（Ｉ）中、ｍが１であって、Ｒ^１が、式(II)中、ｎが１〜３の整数である基である、請求項１乃至３のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
5. 式（Ｉ）中、ｍが０であり、ｌが１である、請求項１または２に記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩。
6. 式（Ｉ）：
   

   

   〔式中、Ｘａａ^１は置換基をアラニル基、Ｘａａ^２ はイソロイシル基、Ｘａａ^３ はグルタミル基、Ｘａａ^４ はプロリル基、Ｘａａ^５ はグルタミニル基、及びＸａａ^６ はリシル基を示し；
   Ｒ^１は式（II）：
   

   

   （式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
   で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
   Ｒ^２はカルボキシル基がアミド化されていてもよいシスチン残基、及びｌは０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。〕
   で表される環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法であって、式（III）：
   

   

   〔式中、Ｘａａ^１ はアラニル基、Ｘａａ^２ はイソロイシル基、Ｘａａ^３ はグルタミル基、Ｘａａ^４ はプロリル基、Ｘａａ^５ はグルタミニル基、及びＸａａ^６ はリシル基を示し、
   Ｒ^１は式（IV）：
   

   

   （式中、ｎは１〜１０の整数を示す）
   で表される基、及びｍは０または１の整数を示し；並びに
   ｌは同時に０または１の整数を示す。但し、ｍとｌが同時に０となることはない。
   なお、ｌが１であるとき、Ｃ末端のシステイニル基のカルボキシル基はフリーでも、またアミド化されていてもよい。〕
   で表される化合物を環化させることを特徴とする環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩の製造方法。
7. 請求項１乃至５のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩からなる、シンタキシン４のアンタゴニスト。
8. 請求項１乃至５のいずれかに記載する環状ペプチド化合物またはその薬理的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。
9. 外用組成物である、請求項８記載の医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。
10. シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の異常な状態を予防、治療または改善するための組成物である、請求項８または９に記載する医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。
11. シンタキシン４によって引き起こされる皮膚の異常な状態が、皮膚の不全角化、不全角化を起因とする皮膚の異常状態、または皮膚の異常状態における代謝亢進である、請求項１０に記載する外用組成物。
12. エピモルフィンによって引き起こされるか、エピモルフィンの過剰発現によって発症若しくは増悪する疾患または病態を予防、治療または改善するための組成物である、請求項８または９に記載する医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。
13. 疾患または病態が、臓器の損傷、慢性閉塞性動脈硬化症、またはバージャー病である、請求項１２に記載する医薬組成物、医薬部外品組成物、または化粧料組成物。

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