DE69828063T2

DE69828063T2 - Menschliche defensin def-x, gen und cdna, deren enthaltende zusammensetzungen und deren diagnostische und therapeutische anwendungen

Info

Publication number: DE69828063T2
Application number: DE69828063T
Authority: DE
Inventors: Lydie Bougueleret; Ilya Chumakov
Original assignee: Genset SA
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: JP2001514264A; CA2299560A1; ES2230714T3; AU759482B2; CA2299560C; US6960441B2; AU9079898A; US7105651B2; US20020115151A1; PT1009767E; US6329340B1; FR2767832B1; FR2767832A1; DE69828063D1; US20020182703A1; WO1999011663A1; EP1009767B1; EP1009767A1; ATE284414T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid-Defensin, das Human-Def-X, ein Homologon von HNP-4, seine genomische DNA und cDNA.
Die Erfindung betrifft außerdem Klonierungs- und Expressionsvektoren und die durch die genannten Vektoren transformierten Zellen. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der genannten Polypeptide als antibiotisches, cytotoxisches, Reparatur- und endokrines Regulations-Agens oder als Pestizid sowie kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von Mikrobeninfektionen, insbesondere Bakterien-, Fungi- und Vireninfektionen, oder Parasiteninfektionen, für die Behandlung von Krebsen, Entzündungen und Immundefizienzen. Die Erfindung betrifft schließlich auch Verfahren und diagnostische Kits für die Bestimmung einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion oder einer Entzündung oder für die Suche nach einer Prädisposition für Immundefizienzen oder Krebserkrankungen.
Bei den antimikrobiellen Substanzen handelt es sich um wesentliche Elemen te der Abwehr von multizellulären Organismen. Unter diesen Substanzen finden sich sowohl einfache anorganische Verbindungen (Wasserstoffperoxid, Unterchlorige Säure, Stickstoffmonoxid) ebenso wie komplexe Peptide und Proteine. Sie liegen vor in den ersten Abwehrreihen an der Oberfläche der Schleimhäute verschiedener Organe, insbesondere in den Epithelzellen des Intestinums und der Lunge, je nach Spezies, sowie in den mikrobiziden Organellen der phagozytären Zellen hämatopoetischen Ursprungs, in denen sie zuerst nachgewiesen wurden. Ihre Neu-Synthese oder ihre Freisetzung aus Vorratslager-Stellen – Organellen vom Lysosom-Typ, Zytoplasma-Granula, welche sie in einer inaktiven oder latenten Form speichern können – können schnell induziert (aktiviert) werden, was sie besonders wichtig macht in den Frühphasen der Bekämpfung von Infektionen (Martin et al., 1995).
Die antimikrobiellen Proteine mit einer Größe von weniger als 100 Aminosäuren werden willkürlich als antimikrobielle Peptide bezeichnet. Es wurden bereits mehrere Familien von antimikrobiellen Peptiden identifiziert, die sich voneinander unterscheiden in Bezug auf die Anwesenheit von Disulfid-Brücken in ihrem Innern, in Bezug auf ihre Aminosäure-Zusammensetzung, in Bezug auf ihre strukturelle Konformation und in Bezug auf ihr Aktivitätsspektrum. Die Antimikroben-Peptide, die sechs konservierte Cysteine umfassen, bilden die Familie der Defensine. Diese Familie besteht aus Antimikroben-Peptiden von etwa 3 bis 4 kDa, die in zahlreichen Spezies in großer Menge vorliegen (Ganz und Lehrer, 1994). Diese Peptide bestehen aus 30 bis 40 Aminosäuren, darunter sechs unveränderte Cysteine, die drei intramolekulare Disulfid-Brücken bilden. Sie haben eine komplexe Konformation, sind amphipathisch, reich an antiparallelen β-Lamellen, jedoch frei von α-Helices (Lehrer und Ganz, 1992). Die antimikrobielle Wirkung der Defensine resultiert aus ihrer Insertion in die Membranen von Target-Zellen, welche die Bildung von spannungsabhängigen Kanälen erlauben. White et al. (1995) beschreiben die möglichen Mechanismen der Membran-Insertion und der Bildung von multimeren Poren durch die Defensine, welche die Permeabilisierung der Membranen der Target-Zellen, beispielsweise der Mikroben- oder Tumor-Zellen, erlauben. Die kristallografische Struktur des Neutrophilen-Human-Defensins HNP-3 (vgl. unten) wurde bestimmt und außerdem wurde ein spezieller Mechanismus der Dimerisierung der Neutrophilen-Human-Defensine vorgeschlagen. Die genauere Kenntnis dieser Familie von Peptiden und der Vergleich zwischen ihren Sequenzen und Aktivitätsspektren wird es in Zukunft erlauben, diese Mechanismen und ihre Spezifitäten, sowie die Aminosäure-Reste, die insbesondere an diesen Phänomenen beteiligt sind, besser zu verstehen.
Die Defensine lassen sich unterteilen in drei Peptid-Familien, die strukturell voneinander verschieden sind: die "klassischen" Defensine, die β-Defensine und die Defensine der Insekten. Diese Familien weisen Unterschiede auf, welche die Position und den Abstand der konservierten Cystein-Reste, sowie anderer konservierter Aminosäuren (Prolin, Glycin) betreffen (Ganz und Lehrer, 1995).
Die Human-Defensine vom klassischen Typ stammen im Wesentlichen aus zwei Quellen. Sie wurden zunächst identifiziert durch Peptid-Reinigung von Extrakten von Neutrophilen (Leukozyten). Dabei wurden vier Defensine isoliert: die "Human-Neutrophilen-Peptide" HNP-1, HNP-2, HNP-3 und HNP-4. Die drei erstgenannten stellen verschiedene Produkte des gleichen Gens dar (Ganz und Lehrer, 1995). Diese drei Peptide repräsentieren 99% des Gehaltes der Neutrophilen (Leukozyten) an Defensinen, während HNP-4 darin ebenfalls vorliegt, jedoch in 100-fach geringeren Konzentrationen. Vor kurzem wurden zwei enterische Human-Defensine, HD-5 und HD-6, im Dünndarm und genauer in den Paneth-Zellen charakterisiert (Bevins et al., 1996). Während bei der Maus 16 Gene für enterische Defensine nachgewiesen wurden, wurden bei Menschen nur diese beiden Homologen identifiziert (Mallow et al., 1996).
Die Defensine haben in vitro eine antimikrobielle Wirkung gegenüber einem großen Spektrum von Mikroorganismen (Martin et al., 1995). Dieses Wirkungsspektrum, das besonders groß ist, umfasst Bakterien, Gram-positive und Gram-negative Bakterien, mehrere Pilzarten, Mycobakterien, Parasiten, darunter die Spirochäten, und mehrere Hüllen-Viren, darunter die Viren HSV und HIV. Sie sind außerdem zytotoxisch für mehrere Kategorien von normalen und malignen Zellen, darunter die Zellen, die gegenüber α-TNF und gegenüber dem zytolytischen Faktor NK resistent sind (Kagan et al., 1994). Die große Menge von Tangents für Defensine und ihr reiches Vorkommen in den Blutzellen, die auf die Immunabwehr spezialisiert sind, sowie die dramatische Zunahme ihrer Konzentration im Verlaufe von schweren Infektion lässt vermuten, dass diese Moleküle eine wichtige Rolle bei der natürlichen Immunität gegenüber Infektionen und gegenüber Krebsen spielen. Insbesondere trägt die Vermehrung der Transkription der Gene der Defensine und die Freisetzung von Zytoplasma-Granula, die vorsynthetisierte Defensine enthalten, als Antwort auf Stimuli, zu der lokalen Antimikroben-Antwort bei, wobei die Defensine an der Entzündungsreaktion, an Reparaturprozessen und an der endokrinen Regulation während der Infektion teilnehmen können. Die hämatopoetischen Defensine können zum Phänomen der Lysis der Krebszellen beitragen, ein Phänomen, das durch die Neutrophilen (Leukozyten) im Verlauf der Antikörper-abhängigen Immun-Antwort vermittelt wird. Die genaue physiologische Rolle der enterischen Defensine ist noch nicht völlig geklärt. Sie können die Proliferation der Intraluminal-Flora eindämmen oder die Translokation von Bakterien durch die Intestinal-Schleimhaut hindurch verhindern (Mallow et al., 1996). Das reiche Vorkommen der Defensin-mRNA in den Paneth-Zellen stützt die Hypothese, dass diese Epithelzellen eine Schlüsselrolle in der Immunabwehr des Intestinums spielen. Es wurde darüber hinaus gezeigt, dass ihr Expressionsschema mit dem Auftreten von Paneth-Zellen im Verlauf der Embryogenese zusammenfällt. Mallow et al. (1996) haben gezeigt, dass geringe Grade der Expression von enterischen Defensinen beim Fötus der Beweis für eine nicht ausgereifte lokale Abwehr sind, sodass die frühgeborenen Säuglinge prädisponiert sind für Infektionen, die auf Intestinal-Mikroorganismen zurückzuführen sind.
Eine Defensin-Konzentration, die 10% des normalen Wertes entspricht, ist festzustellen bei Patienten, die eine "spezifische Granula-Defizienz" aufweisen, eine seltene Erkrankung der Entwicklung der Granulozyten. Die davon befallenen Patienten erleiden häufige Infektionen, die durch gemeine Bakterien hervorgerufen werden (Ganz und Lehrer, 1995).
Biochemisch modifizierte Defensine stellen potentielle prophylaktische und therapeutische Mittel gegen diese Infektionen dar (Ganz und Lehrer, 1995). Die Forschungsarbeiten, die diese Antimikroben-Peptide oder andere Moleküle betreffen, die an der natürlichen Immunität beteiligt sind, erhält eine besondere Bedeutung seit sich Abwehrphänomene der Mikroorganismen gegenüber traditionellen Antibiotika entwickelt haben (Bevins et al., 1996).
Die Primärstruktur von Defensinen, insbesondere der Human-Defensine, ist Gegenstand neuerer Untersuchungen (White et al., 1995; Mallow et al., 1996). Die klassischen Defensine umfassen 29 bis 35 Aminosäuren, die sich jedoch von Vorläufern – Präproproteinen – ableiten, die 90 bis 100 Aminosäuren umfassen. Die proteolytische Reifung der Human-Defensine von Neutrophilen (Leukozyten) zu reifen Peptiden ist gekoppelt mit ihrer Adressierung an die Granulozyten; die Funktion des Propeptids umfasst die Inaktivierung der Vorläuferform des Defensins und einen Träger für die Annahme der aktiven Konformation des reifen Peptids (Martin et al., 1995). Die Peptidhomologien sind maximal im Bereich der Signalpeptide und minimal im Bereich der reifen Peptide, die dennoch sechs vollständig konservierte Cystein-Reste umfassen. Wenn die Konservierung dieser Reste erforderlich scheint für die Annahme von Sekundärstrukturen, die an der Aktivität der Defensine beteiligt sind, scheinen die Sequenz-Differenzen, die im Innern der sehr großen Familie dieser Antimikroben-Peptide, insbesondere an ihrem N-terminalen Ende vorhanden sind, aber auch in anderen nicht konservierten Regionen vorliegen, wichtige Determinanten für ihr Aktivitätsspektrum und für ihre antimikrobielle oder zytotoxische Wirksamkeit zu sein. Die Identifizierung von neuen Vertretern dieser Familie von Peptiden und insbesondere von Human-Defensinen ist daher erforderlich für das Verständnis ihres Wirkungsmechanismus und ihrer Spezifität sowie für ihre Verwendung als Antiinfektions- und/oder zytotoxische Agentien oder für die variierenden Peptid-Muster, die in spezifischen Spektren vorliegen, und/oder für die verminderte oder erhöhte Wirksamkeit.
Sparkes et al. (1989) haben das Gen, das für HNP-1 codiert, auf dem Chromosom 8 in der Region 8p23 lokalisiert. Bevins et al. (1995) und Mallow et al. (1996) haben die beiden für HD-5 und HD-6 codierenden Gene auf dem Chromosom 8, genauer in der Region 8p21-pter, lokalisiert, eine Region, welche die vorhergehende Region einschließt, die identifiziert wurde als eine solche, welche die hämatopoetischen Defensine trägt. Die für die enterischen Human-Defensine HD-5 und HD-6 codierenden Gene enthalten zwei Exone, während diejenigen, die für die hämatopoetischen Defensine codieren, drei Exone enthalten, wobei die beiden letzten Exone für das Präpropeptid sowohl beim Menschen als auch beim Meerschweinchen und beim Kaninchen codieren (Mallow et al., 1996). Der Vergleich zwischen den Genom-Sequenzen der Gene HD-5 und HD-6 hat eine sehr starke Ähnlichkeit der nicht-codierenden flankierenden Sequenzen in 5'-Stellung gezeigt, was vermuten lässt, dass diese die für die Gewebsspezifität der Expression dieser Gene erforderliche Information enthalten; die gleichen Regionen tragen außerdem zahlreiche Andock-Stellen für Transkriptions-Faktoren, darunter zwei Stellen AP2 und sechs Stellen IL6, die Wege zur Regulierung der Expression dieser Gene im Verlaufe der Entzündungsprozesse darstellen. Ganz allgemein hat der sehr hohe Grad von Ähnlichkeit zwischen den Sequenzen und der Genom-Organisation der Defensine HNP-1, 2, 3, 4 und HD-5 und 6 Bevins et al. (1995) veranlasst, ein Evolutionsmodell zu entwickeln, bei dem versucht wird, die Chromosomen-Organisation der Familie und die Homologen-Fraktionen jedes Genpaares zueinander in Beziehung zu setzen.
Es ist auch interessant darauf hinzuweisen, dass die Chromosomen-Region 8p23 an zahlreichen Pathologien, insbesondere Krebsen, beteiligt ist: es sei beispielsweise hingewiesen auf das Leberzellencarcinom (Becker et al., 1996), den kleinzelligen Lungenkrebs (Sundareshan und Augustus, 1996), den Prostatakrebs (Ichikawa et al., 1996), das Colorectal-Carcinom (Yaremko et al., 1994). Obwohl dies niemals dokumentiert worden ist, ist es möglich, dass ein Defizit an dem einen oder anderen der Human-Defensine eine Rolle bei der Prädisposition für solche Pathologien oder bei ihrer Entwicklung spielt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Human-Defensin Def-X, ein Homologon des Defensins HNP-4.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polypeptid, das ausgewählt ist unter den folgenden Polypeptiden:

a) einem Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist;
b) einem Polypeptid, das mindestens zu 80% mit dem Polypeptid identisch ist, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist;
c) einem Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Aminosäure-Sequenz eines biologisch aktiven Fragments von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids, wie es unter (a) oder (b) definiert ist, darstellt;
d) einem Polypeptid, das mindestens ein Polypeptid umfasst, wie es unter (a), (b) oder (c) definiert ist.

In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter einem "Polypeptid" ein Protein oder ein Peptid.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polypeptid dadurch charakterisiert, dass es aus einem Polypeptid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 besteht.
Es können hier auch genannt werden die Polypeptide, die aus mindestens einem der folgenden Fragmente bestehen:

a) einem Signal-Peptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 4 ist, die der Sequenz zwischen der Position 1 und der Position 19 entspricht, welche die Enden der Sequenz der Aminosäuren SEQ ID Nr. 3 umfasst;
b) einer Pro-Region, deren Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 5 ist, die der Sequenz zwischen der Position 20 und der Position 63 einschließlich der Enden der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 3 ist;
c) einem reifen Peptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist, die der Sequenz zwischen der Position 64 und der Position 94 einschließlich der Enden der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht; oder
d) einem homologen Fragment, das variiert oder modifiziert ist mit einem Peptid gemäß (a), (b) oder (c).

Auf bevorzugte Weise entsprechen die Peptide der vorliegenden Erfindung der Primärstruktur des weiter oben definierten reifen Defensins, d. h. der Struktur, die der folgenden Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 6 entspricht
Ile Cys His Cys Arg Val Leu Tyr Cys Ile Phe Gly Glu His Leu Gly Gly Thr Cys Phe Ile Leu Gly Glu Arg Tyr Pro Ile Cys Cys Tyr,
ihren Homologen, die mindestens zu 80% damit identisch sind, sowie ihren biologisch aktiven Fragmenten und den sie enthaltenden Polypeptiden entspricht.
Es ist selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide in einer nicht-natürlichen Form vorliegen, d. h. dass sie nicht aus ihrer natürlichen Umgebung entnommen sind, sondern dass sie erhalten werden können durch Reinigung aus natürlichen Quellen oder auch erhalten werden können durch genetische Rekombination oder durch chemische Synthese, wie weiter unten beschrieben.
Unter einem "homologen Polypeptid" versteht man hier ein Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz Aminosäuren aufweist, die zu mindestens 80%, vorzugsweise zu 90%, identisch sind.
Unter einem "Varianten-Polypeptid" versteht man hier ein mutiertes Polypeptid oder ein Polypeptid, das einem Polymorphismus entspricht, der insbesondere beim Menschen vorliegen kann und eine Verkürzung, eine Substitution, eine Deletion und/oder eine Addition mindestens einer Aminosäure im Vergleich zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid aufweisen kann.
Unter einem "modifizierten Polypeptid" versteht man hier ein Polypeptid, das durch genetische Rekombination oder durch chemische Synthese, wie weiter unten beschrieben, erhalten wurde, das eine Modifikation in Bezug auf die normale Sequenz aufweist. Diese Modifikationen können sich insbesondere erstrecken auf die Prä-, Pro- oder reifen Domänen des erfindungsgemäßen Polypeptids, auf die Ami nosäuren, die Ursprung für ein Spezifitätsspektrum oder ein Wirksamkeits- oder Aktivitätsspektrum oder für die Strukturkonformation, für eine Ladung oder für die Hydrophobizität und für die Fähigkeit zur Multimerisierung und Membran-Insertion des erfindungsgemäßen Polypeptids sind. Auf diese Weise können Polypeptide mit einer gleichen, erhöhten oder verminderten Aktivität, mit einer gleichen, engeren oder breiteren Spezifität erzeugt werden. Die Modifikationen können sich außerdem auf die Sequenzen erstrecken, die an der Reifung, dem Transport und der Adressierung des Polypeptids beteiligt sind.
Unter dem Ausdruck "biologisch aktives Fragment" eines erfindungsgemäßen Polypeptids versteht man hier ein Polypeptid-Fragment, in dem mindestens eine Aktivität des Polypeptids, von dem es abstammt, konserviert ist:

• das in der Lage ist, durch einen spezifischen Antikörper eines erfindungsgemäßen Polypeptids erkannt zu werden; und/oder
• das in der Lage ist, als Antibiotikum zu wirken; und/oder
• das in der Lage ist, als zytotoxisches Agens zu wirken; und/oder
• das in der Lage ist, als Antitumormittel zu wirken; und/oder
• das in der Lage ist, die Gewebs-Reparatur, die endokrine Regulation oder den Entzündungsprozess, insbesondere während einer Infektion, zu modulieren.

Erfindungsgemäß weisen die biologisch aktiven Fragmente von erfindungsgemäßen Polypeptiden mindestens 10 Aminosäuren, vorzugsweise 15 Aminosäuren, auf.
Wie weiter oben angegeben, ist unter den biologisch aktiven Fragmenten ein bevorzugtes Fragment das reife Peptid mit der Aminosäure-Sequenz SEQ ID Nr. 6.
Unter den Homologen des reifen Peptids können die Polypeptide genannt werden, in denen bis zu 5 Aminosäuren modifiziert, am N- oder C-terminalen Ende verkürzt oder auch deletiert oder hinzugefügt worden sind, die etwa 80% der Sequenz darstellen.
Die biologisch aktiven Fragmente dieses reifen Peptids umfassen vorzugsweise 10 bis 15 Aminosäuren, deren Vorteil darin bestehen kann, dass sie durch chemische Synthese leicht erhalten werden können.
Wie angegeben, werden mit den Modifikationen des reifen Polypeptids insbesondere die folgenden Ziele verfolgt:

– die Aktivität des Defensins zu modulieren,
– seine Spezifität im Bereich der Mikroorganismen, gegenüber denen es aktiv ist, sowie in Bezug auf seine Gewebslokalisierung zu modifizieren,
– seine biologische Verfügbarkeit zu modifizieren. Die oben genannten Verbindungen können erhalten werden durch Anwendung der kombinatorischen Chemie, bei der es möglich ist, Polypeptid-Abschnitte systematisch zu variieren, bevor sie getestet werden, beispielsweise anhand von Modellen, Zellkulturen oder Mikroorganismen, um die aktivsten Verbindungen oder diejenigen zu selektionieren, welche die gewünschten Eigenschaften haben.

Die chemische Synthese weist außerdem den Vorteil auf, dass in ihr eingesetzt werden können:

– nicht-natürliche Aminosäuren oder
– Nicht-Peptid-Bindungen.

Um die Lebensdauer der Peptide zu erhöhen, kann es vorteilhaft sein, nicht-natürliche Aminosäuren, beispielsweise in der D-Form, oder auch Aminosäure-Analoga, insbesondere beispielsweise sulfurierte Formen, einzusetzen.
Schließlich kann die Struktur des reifen Defensins oder seiner Homologen, die variiert oder modifiziert sind, sogar die entsprechenden Fragmente, in chemische Strukturen vom Polypeptid-Typ oder in andere integriert werden. Es kann auf diese Weise auch vorteilhaft sein, an den N- und C-terminalen Enden Verbindungen vorzusehen, die von den Proteasen nicht erkannt werden.
Die Erfindung betrifft außerdem die isolierten Nucleinsäuren, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren unter den folgenden Nucleinsäuren ausgewählt:

a) eine Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 (genomisch);
b) eine Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 (cDNA);
c) eine Nucleinsäure, die zu mindestens 80% identisch ist mit den Nucleinsäuren gemäß (a) oder (b);
d) ein Fragment mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, das mindestens ein Sequenz-Exon nt 1836 bis 1874, nt 3394 bis 3577 oder nt 4164 bis 4379 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst.

Selbstverständlich betrifft die vorliegende Erfindung nicht die genomischen Sequenzen in ihrer natürlichen Chromosomenumgebung; es handelt sich dabei um Sequenzen, die isoliert worden sind, d. h. dass sie direkt oder indirekt entnommen worden sind, wobei ihre Umgebung mindestens teilweise modifiziert worden ist.
Es kann sich somit handeln um genomische DNA, um cDNA oder um RNA, die nicht-natürliche Nucleotide umfasst oder nicht umfasst; es kann sich handeln um isolierte natürliche Nucleinsäuren oder um synthetisierte Nucleinsäuren.
Unter einer äquivalenten Nucleinsäure versteht man hier eine Nucleinsäure, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide codiert, wobei man der Neigung zur Degeneration des genetischen Codes Rechnung trägt, und die entsprechenden cDNA und RNA.
Unter einer homologen Nucleinsäure versteht man hier eine Nucleinsäure, deren Sequenz eine Homologie von mindestens 80%, vorzugsweise von 90%, mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuren aufweist.
Unter einer mutierten Nucleinsäure versteht man hier jede Nucleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Polypeptid-Variante codiert, und jede Nucleinsäure, die beispielsweise gegenüber den Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 mindestens eine Mutation in den Promotor- und/oder Regulator-Sequenzen aufweist, die einen Einfluss auf die Expression des Polypeptids, insbesondere auf seine Expressionsrate und auf die Gewebsspezifität desselben haben können. Die Sequenzen, die einen Polymorphismus aufweisen, wie er beim Menschen vorliegt, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Unter diesen Polymorphismen können bestimmte führen zu Immundifizienzen, zu einer unzureichenden Antwort auf Infektionen, zu Prädispositionen und/oder zur Entwicklung von Krebsen.
Unter einer modifizierten Nucleinsäure versteht man hier jede Nucleinsäure, die für ein modifiziertes Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, oder jede Nucleinsäure, die durch Mutagenese nach dem Fachmann allgemein bekannten Techniken hergestellt worden ist und Modifikationen gegenüber den normalen Sequenzen aufweist, insbesondere Mutationen in den Regulator- und/oder Promotor-Sequenzen, die insbesondere zu einer Modifizierung des Grades und der Gewebsspezifität der Expression des Polypeptids führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Gesamtheit der Initiatoren (Starter) und Sonden, die nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden markiert werden können, die insbesondere nach Methoden, die auf der Hybridisierung oder der Amplifikation basieren, beispielsweise durch PCR, den Nachweis der erfindungsge mäßen Nucleinsäuren und auch die Unterscheidung der normalen Sequenzen von den mutierten Sequenzen erlauben.
Unter den vorteilhaften Fragmenten von Nucleinsäuren können insbesondere genannt werden die Antisense (nicht codierendenden)-Oligonucleotide, d. h. solche, deren Struktur durch Hybridisierung mit der Target-Sequenz eine Hemmung der Expression des entsprechenden Produkts gewährleisten. Es können auch genannt werden die Sense (codierenden)-Oligonucleotide, die durch Wechselwirkung mit Proteinen, die an der Regulierung der Expression des entsprechenden Produkts beteiligt sind, entweder eine Hemmung oder eine Aktivierung dieser Expression induzieren.
Es kann sich dabei handeln um Sequenzen, die auch im Bereich der beschriebenen Exon- oder Intron-Sequenzen sowie auf die flankierenden Sequenzen, insbesondere die Promotoren und/oder Regionen 5' UTR wirksam sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Klonierungs- oder Expressionsvektoren, die eine Nucleotid-Sequenz aufweisen, wie sie vorstehend beschrieben worden ist.
Diese Klonierungs- oder Expressionsvektoren können Elemente, welche die Expression der Sequenz in einer Wirtszelle sicherstellen, insbesondere Promotor-Sequenzen und Regulator-Sequenzen, die in der genannten Zelle wirksam sind, umfassen.
Der genannte Vektor kann ein autonomer Replikationsvektor sein oder auch dazu bestimmt sein, die Integration der Sequenz ins Innere der Chromosomen der Wirtszelle zu gewährleisten.
Im Falle von autonomen Replikationssystemen verwendet man als Funktion der prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle vorzugsweise Systeme vom Plasmid-Typ oder virale Systeme, wobei die Vektorviren insbesondere Adenoviren (Perricaudet et al., 1992), Retroviren, Poxviren oder Herpesviren (Epstein et al., 1992) sein können. Der Fachmann kennt die für jeden dieser Viren anwendbaren Technologien.
Es ist somit bekannt, als Virusvektor Defekt-Viren zu verwenden, deren Kultur in den Komplement-Zellen beeinflusst wird, wodurch eventuelle Risiken einer Vermehrung eines infektiösen Virusvektors vermieden werden.
Wenn man die Integration der Sequenz in die Chromosomen der Wirtszelle wünscht, ist es erforderlich, beiderseits der Nucleotid-Sequenz, die integriert werden soll, eine oder mehrere Sequenzen vorzusehen, die aus der Wirtszelle stammen, um die Rekombination zu gewährleisten. Es handelt sich dabei ebenfalls um Verfahren, die in dem Stand der Technik ausführlich beschrieben sind. Es können beispielsweise Systeme vom Plasmid- oder vom viralen Typ verwendet werden; derartige Viren sind beispielsweise die Retroviren (Temin, 1986) oder die AAV, die Adenovirusassoziierten Viren (Carter, 1993).
Die Erfindung betrifft außerdem Prokaryonten- oder Eukaryonten-Zellen, die durch einen Vektor transformiert worden sind, wie er beispielsweise vorstehend beschrieben worden ist, um die Expression eines natürlichen, normalen oder variierten oder modifizierten Defensins Def-X oder auch beispielsweise eines seiner Fragmente zu gewährleisten.
Wie weiter oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung außerdem Polypeptide, die durch Kultivierung der auf diese Weise transformierten Zellen und durch Gewinnung des exprimierten Proteins erhalten worden sind, wobei die genannte Gewinnung intrazellulär oder extrazellulär in dem Kulturmedium durchgeführt werden kann, wenn der Vektor so konzipiert worden ist, dass er die Sekretion des Proteins unter der Einwirkung beispielsweise einer "Signal"-Sequenz gewährleistet, wobei das Polypeptid in Form eines Prä-Polypeptids oder Präpro-Polypeptids vorliegt. Die Konstruktionen, welche die Sekretion der Polypeptide erlauben, sind bekannt sowohl für Prokaryonten-Systeme als auch für Eukaryonten-Systeme. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können bestimmte der Polypeptide Def-X ihr eigenes Sekretions- oder Membraninsertions-System tragen.
Selbstverständlich können die erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptide in der glycosylierten oder nicht-glycosylierten Form erhalten werden und die natürliche tertiäre Struktur aufweisen oder nicht aufweisen.
Unter den für die Herstellung dieser Polypeptide verwendbaren Zellen müssen selbstverständlich genannt werden die Bakterienzellen (Olins und Lee, 1993), aber auch die Hefezellen (Buckholz, 1993), sowie die tierischen Zellen, insbesondere die Kulturen von Säugetierzellen (Edwards und Aruffo, 1993), aber auch die Zellen von Insekten, in denen Verfahren angewendet werden können, bei denen beispielsweise Baculoviren eingesetzt werden (Luckow, 1993).
Die so erhaltenen Zellen können die Herstellung von natürlichen, variierten oder modifizierten Polypeptiden Def-X, aber auch von Fragmenten dieser Polypeptide, insbesondere der Polypeptide, die den biologisch aktiven Fragmenten entsprechen, erlauben.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die gleichen erfindungsgemäßen Polypeptide, die jedoch durch chemische Synthese erhalten wurden und nicht-natürliche oder modifizierte Aminosäuren tragen können.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere das reife Defensin, sowie die Homologen, die davon abgeleitet sind, oder modifizierte reife Polypeptide können erhalten werden durch chemische Synthese und dies unter Anwendung irgendeines beliebigen der zahlreichen bekannten Peptid-Synthese-Verfahren, beispielsweise der Techniken, bei denen feste Phasen angewendet werden, oder Techniken, bei denen teilweise feste Phasen angewendet werden durch Kondensation von Fragmenten oder durch eine klassische Synthese in Lösung.
Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen nach dem Feststoffphasen-Verfahren synthetisiert werden, ist die C-terminate Aminosäure an einem inerten festen Träger fixiert und sie umfasst Schutzgruppen an ihrer α-Aminogruppe (und, falls die erforderlich ist, Schutzgruppen an ihren seitlichen funktionellen Gruppen).
Am Ende dieser Stufe wird die Schutzgruppe für die terminate Aminogruppierung eliminiert und man fixiert die zweite Aminosäure, die ihrerseits ebenfalls die erforderlichen Schutzgruppen aufweist.
Die N-terminalen Schutzgruppen werden eliminiert, nachdem jede Aminosäure fixiert worden ist, dagegen behält man selbstverständlich die Schutzgruppen an den Seitenketten bei.
Wenn die Polypeptidkette vollständig ist, trennt man das Peptid von seinem Träger und eliminiert die seitlichen Schutzgruppen.
Das Verfahren zur Synthese in fester Phase wird insbesondere Stewart et al. (1984) und Bodanszky (1984) beschrieben.
Es werden hier nicht die Details der Synthese beschrieben, es genügt einfach, daran zu erinnern, dass die für die α-Aminogruppierungen bevorzugten Schutzgruppen Schutzgruppen vom Urethan-Typ (BOC oder FMOC) sind. Was die Kupplungs-Reagentien angeht, so sind sie sehr zahlreich, wobei unter ihnen selbstverständlich insbesondere das N,N'-Diisopropylcarbodiimin (DIC) zu nennen ist, das allgemein in dem DMF oder DCM eingesetzt wird.
Wenn man nicht-natürliche Aminosäuren verwenden möchte, kann es erforderlich sein, andere Reagens-Typen und insbesondere andere Typen von Schutzsystemen vorzusehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, die durch Immunreaktion eines menschlichen oder tierischen Organismus mit einem immunogenen Agens erhalten werden, das aus einem erfindungsgemäßen Polypeptid, insbesondere einem Polypeptid besteht, das durch Kultivierung einer der oben genannten Zellen erhalten wird, oder die durch chemische Synthese wie oben angegeben erhalten werden.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder auf eines ihrer Fragmente, Chimären-Antikörper, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid spezifisch erkennen können.
Die Erfindung betrifft außerdem die erfindungsgemäßen Antikörper, die dadurch charakterisiert sind, dass sie markiert sind.
Die markierten Antikörper können beispielsweise immunkonjugiert werden mit Enzymen, wie z. B. Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, oder sie können markiert werden mit Hilfe von fluoreszierenden Verbindungen, von Biotin, oder sie können auch radiomarkiert werden. Die Markierungsmethoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden in der vorliegenden Beschreibung nicht näher angegeben.
Die Erfindung erstreckt sich außerdem auf ein erfindungsgemäßes Polypeptid für die Verwendung als antimikrobielles, insbesondere antibakterielles, Antifungi-, Antiviren- und/oder Antiparasiten-Agens, als zytotoxisches Agens, das insbesondere als Antikrebsmittel und/oder als Mittel zur Modulation der Inflammationsprozesse, der Gewebe-Reparatur und zur endokrinen Regulierung, insbesondere als Corticostaticum, bestimmt ist.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid umfasst, das mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehiculum kombiniert sein kann.
Eine solche Zusammensetzung kann auf systemischem, lokalem oder topischem Wege verabreicht werden.
Ihre Verabreichungsart, ihre Dosierung, ihre optimalen galenischen Formen können nach Kriterien bestimmt werden, wie sie allgemein aufgestellt werden für eine Behandlung, die angepasst ist an einen Patienten, unter Berücksichtigung seines Alters, seines Körpergewichts, der Behandlungstoleranz, der festgestellten Nebeneffekte und dgl.
Die Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthält, der in der Lage ist, in vivo ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren, der mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehiculum kombiniert sein kann.
Es ist auch möglich, die in vivo-Expression von Polypeptiden oder ihren Fragmenten vorzusehen, insbesondere durch Anwendung einer Gentherapie und durch Verwendung der weiter oben beschriebenen Vektoren.
Im Rahmen der Gentherapie ist es auch möglich, die Verwendung von "nackten" Gen-Sequenzen oder cDNA, wie sie vorstehend beschrieben wurden, vorzusehen, wobei diese Technik insbesondere von der Firma Vical entwickelt wurde, die gezeigt hat, dass es unter diesen Bedingungen möglich ist, das Polypeptid in bestimmten Geweben zu exprimieren, ohne auf einen Träger insbesondere eines viralen Vektors zurückgreifen zu müssen.
Im Rahmen der Gentherapie ist es auch möglich, die Verwendung von bestimmten, ex vivo transformierten Zellen vorzusehen, die anschließend als solche oder im Innern von Systemen vom Organoid-Typ reimplantiert werden können, wie dies ebenfalls aus dem Stand der Technik bereits bekannt ist (Danos et al., 1993). Man kann auch die Verwendung von Agentien in Betracht ziehen, welche die Ansteuerung eines bestimmten Zell-Typs, das Eindringen in die Zellen oder den Transport zu dem Kern erleichtern.
Die genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen sind erfindungsgemäß bestimmt für die Prävention und/oder Behandlung von Mikroben-Infektionen, insbesondere von Mikroben-Infektionen bakteriellen Ursprungs, von Gram-positiver oder Gram-negativen Bakterien, Mykobakterien, Fungi und Viren oder Parasiten, insbesondere Spirochäten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung in vorteilhafter Weise die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die viralen Infektionen Infek tionen darstellen, die mit Hüllenviren, insbesondere mit den Viren HSV und HIV, im Zusammenhang stehen.
Gegenstand der Erfindung sind auch erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen, die bestimmt sind für die Prävention und/oder für die Behandlung von Krebsen, insbesondere von Melanomen, des Leberkrebses, des Prostatakrebses, des kleinzelligen Lungenkrebes oder des Colorectal-Carcinoms.
Die Erfindung betrifft außerdem erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen, die dazu bestimmt sind, die Immunabwehr zu verbessern, die Immunabwehr im Falle einer erworbenen Immundefizienz zu erhöhen oder einer Immundefizienz vorzubeugen, insbesondere für die Behandlung der Psoriasis oder zum Modulieren der inflammatorischen Prozesse im Falle insbesondere von Erkrankungen mit chronischer Entzündung.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insbesondere verwendbar in einer externen topischen Form, beispielsweise auf der Haut und auf den Schleimhäuten. Diese externen topischen Formen können außerdem auf dem pharmazeutischen, dermatologischen oder kosmetischen Gebiet eingesetzt werden.
Diese Zusammensetzungen können insbesondere als pharmazeutisches antiseptisches Agens oder auch als Antiseptikum in bestimmten Kosmetika verwendet werden, entweder um eine Reinigung der Haut oder der Phaneren zu gewährleisten und/oder als Konservierungsmittel für die Zusammensetzungen.
Die erfindungsgemäßen topischen Zusammensetzungen können insbesondere bei bestimmten Haut-, Augen-, Vaginal- oder Mund-Erkrankungen verwendet werden. Sie können auch verwendet werden als zusätzliches kosmetisches Agens, insbesondere in bestimmten Shampoo-Behandlungsmitteln.
Die Erfindung betrifft ferner den Nachweis des Fehlens oder einer anormalen Menge an Protein oder Nucleinsäure, die dem Defensin X entspricht, als Hinweis auf eine Infektion oder Pathologien, die nachstehend beschrieben werden.
Die Erfindung betrifft ferner den Nachweis einer anormalen Form des Proteins oder der Anwesenheit einer anormalen Nucleinsäure, die einem mutierten Defensin entspricht, das gegebenenfalls vollständig inaktiv sein kann. In diesem Fall kann die Anwesenheit dieser anormalen Form ein Anzeichen für eine Prädisposition für bestimmte Erkrankungen, insbesondere für eine Immundefizienz und/oder Krebse, sein.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer Immundefizienz und/oder einer Prädisposition für bestimmte Krebs-Typen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einer aus einem Patienten entnommenen Probe die Anwesenheit eines anormalen Defensins und/oder einer Sequenz, die für ein anormales Defensin codiert, nachweist.
Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren erlauben insbesondere den Nachweise einer Immundefizienz und/oder einer Prädisposition für einen oder mehrere Krebse, insbesondere diejenigen, wie sie weiter oben genannt sind, insbesondere in Risiko-Familien. Dieser Diagnose-Typ wird im Allgemeinen angewendet zum Nachweis von mutierten Formen des Proteins oder von Nucleinsäure-Sequenzen.
Die Erfindung betrifft aber auch Verfahren zur Diagnose einer Entzündung, einer Immundefizienz, einer Prädisposition für Erkrankungen vom Krebs-Typ und/oder für Infektionen, die auf Mikroorganismen zurückzuführen sind oder mit einer Immundefizienz oder einem Entzündungsphänomen im Zusammenhang stehen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Bestimmung eines Polypeptids oder einer Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in einer biologischen Probe und den Vergleich des bei der Bestimmung erhaltenen Ergebnisses mit der Polypeptid- oder Nucleinsäure-Menge, die normalerweise in einer äquivalenten biologischen Probe enthalten ist, umfasst.
In diesem Fall erlaubt die Peptid-Bestimmung allgemein den Nachweis einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion und/oder einer Entzündung. Die Peptid-Bestimmungen können nach jedem bekannten Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch ELISA oder RIA. Der Nachweis einer anormalen Form von Defensin X kann beispielsweise erfolgen mit Hilfe eines für diese Form spezifischen monoklonalen Antikörpers, insbesondere mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung zweckmäßig auch Verfahren, die dadurch charakterisiert sind, dass in ihnen eine erfindungsgemäße Oligonucleotid-Sonde und/oder -Initiator eingesetzt wird.
Bevorzugt sind im Allgemeinen Verfahren, in denen die gesamte oder ein Teil der Sequenz, die dem Polypeptid Def-X entspricht, vorher durch Bestimmung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure amplifiziert wird, wobei diese Amplifikationsverfahren unter Anwendung so genannter PCR- oder PCR-artiger Methoden durchgeführt werden können. Unter "PCR-artig" versteht man hier alle Verfahren, bei denen direkte oder indirekte Reproduktionen der Nucleinsäure-Sequenzen eingesetzt werden, oder in denen die Markierungssysteme amplifiziert worden sind, wobei diese Methoden selbstverständlich bekannt sind, im Allgemeinen handelt es sich dabei um die Amplifikation der DNA durch eine Polymerase; wenn die ursprüngliche Probe eine RNA ist, ist es zweckmäßig, vorher eine reverse Transkription durchzuführen. Es gibt derzeit sehr zahlreiche Verfahren, welche diese Amplifikation erlauben, wie z. B. die Verfahren, die bekannt sind als NASBA ("Nucleic Acid Sequence Based Amplification")-Verfahren (Compton, 1991), als TAS ("Transcription based Amplification System")-Verfahren (Guatelli et al., 1990), als LCR ("Ligase Chain Reaction")-Verfahren (Landegren et al., 1988), als ERA ("Endo Run Amplification")-Verfahren, als CPR ("Cycling Probe Reaction")-Verfahren und als SDA ("Strand Displacement Amplification")-Verfahren (Walker et al., 1992), die dem Fachmann allgemein bekannt sind.
Die Erfindung betrifft außerdem Diagnose-Kits oder -Geräte zur Bestimmung einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion, einer Entzündung, einer Immundefizienz und/oder einer Prädisposition für Krebserkrankungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen erfindungsgemäßen Antikörper umfassen.
Die Diagnose-Kits oder -Geräte zur Bestimmung einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion, einer Entzündung, einer Immundefizienz und/oder einer Prädisposition für Erkrankungen vom Krebs-Typ, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Sonde und/oder einen Initiator (Starter) gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als Pestizid, insbesondere für Pflanzenkulturen von industriellem Interesse, wie z. B. Nahrungsmittelpflanzen, wie Mais, Getreide, Soja, Reis oder Raps, Futtermittelpflanzen, Obstbäumen, Weinreben oder Zierpflanzen.
Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus den nachfolgenden Beispielen hervor, die durch die Zeichnungen erläutert werden, deren Erläuterungen (Beschriftungen) nachstehend angegeben sind.
Erläuterung der Figuren
1
Genom-Sequenz von hDef-X
Es ist die gesamte genomische DNA-Sequenz von hDef-X angegeben, die eine Homologie aufweist, die signifikant für das Gen ist, das für hDef-4 (HNP-4) codiert.

Die Sequenz weist die folgenden Stellen (Sites) auf, deren Anwesenheit durch Homologie mit der Sequenz hDef-4 bestimmt wird:

• CAAT-Box	1711–1714
• TATA-Box	1758–1767
• mRNA-Start	1836
• Exon 1	1836–1874
• Spleißungsstelle 1	GTCAGT
• Insertion Alu	2155–2335
• Insertions-Fragment von L1	2710–2780
• Spleißungsstelle 2	CAG
• Exon 2	3394–3577
• Beginn der codierenden Phase	3406
• Spleißungsstelle 3	GTGAGA
• Spleißungsstelle 4	CAG
• Exon 3	4164–4379
• Ende der codierenden Phase	4276
• Polyadenylierungsstelle	4374–4379.

2
Anordnung der genomischen Sequenzen der Human-Defensine Def-X und Def-4 (HNP-4)
Die Anordnung der Gesamtheit der genomischen DNA-Sequenz des neuen Defensins Def-X zeigt eine Homologie mit der genomischen DNA von hDef-4 (GenBank-Zugangsnummer U18745).
Die Markierungen (Kennzeichnungen) geben die Positionen in der Sequenz von hDef-4 der Signale CAAT-Box, TATA-Box, der Spleißungsstellen, der Enden und Anfänge der Intronen/Exonen, des Transkriptions-Beginns, der Polyadenylierungsstelle an.
3
Anordnung der cDNA-Sequenzen von hDef-4 (HNP-4) und hDef-X
Die Sequenzen weisen eine globale Homologie von 61,4% auf. Die Anordnung zeigt eine Insertion von etwa 75 Basen vor dem STOP-Codon, die auf der Sequenz von hDef-4, jedoch nicht auf derjenigen von hDef-X vorhanden sind; die starke Homologie ist vorhanden über die gesamte Region zwischen dem Ende dieser Insertion und dem Ende der cDNA. Außerhalb dieser Insertions-Region ist der Grad der Homologie zwischen den Nucleinsäure-Sequenzen somit bemerkenswert.
4
Peptid-Sequenz des Proteins hDef-X
Die Position der Spaltungsstellen des Signalpeptids und der Pro-Region wurden abgeleitet von der Anordnung der Peptid-Sequenzen von hDef-4 und hDef-X.
5
Anordnung der Peptid-Seguenzen der bekannten Human-Defensine hDef-1, hDef-4, hDef-5 und hDef-6 mit hDef-X

* der Stern zeigt eine Aminosäure an, die in den fünf Sequenzen konserviert worden ist
• der Punkt zeigt eine Aminosäure an, deren Klasse in den fünf Sequenzen konserviert worden ist (die Aminosäure ist entweder identisch oder Gegenstand einer konservativen Substitution)
^ sechs Pfeilspitzen zeigen die Positionen der sechs konservierten Cysteine innerhalb der Klasse der klassischen Defensive an, die verantwortlich sind für die dreidimensionale Struktur, die für die Aktivität dieser Peptide erforderlich ist.

Beispiele
Beispiel 1: Identifizierung des Gens, das für hDef-X codiert
Isolierung von BAC B0725B12
Um die Region 8p23 des Human-Genoms zu analysieren, insbesondere in der Region, die dafür bekannt ist, dass sie Gene trägt, die für Human-Defensine codieren, wurde ein BAC ("bakterielles künstliches Chromosom"), das der genannten Region entspricht, isoliert. Eine BAC-Bank, die das vollständige Human-Genom umfasst, wurde hergestellt aus der DNA einer Human-Lymphoblasten-Linie, abgeleitet von dem Individuum Nr. 8445 der Familien von CEPH. Diese Linie wurde verwendet als DNA-Quelle mit einem hohen Molekulargewicht. Die DNA wurde partiell digeriert mit dem Restriktionsenzym BamHI, dann an der Stelle BamHI des Plasmids pBe- IoBacII kloniert. Die so erhaltenen Klone wurden "gepoolt" und "gescreent" nach einem dreidimensionalen Analysen-Verfahren, wie es vorstehend beschrieben worden ist für das Screenen (Durchsuchen) der YACs ("Yeast Artificial Chromosome")-Banken (Chumakov et al., 1992 und 1995). Die erhaltenen dreidimensionalen Pools wurden durch PCR mit Hilfe von Startern (Initiatoren) gescreent, die umfassen den Marker SHGC-10793 im Hinblick auf den Neutrophil-Defensin 4-Vorläufer (GeneBank: Zugangs-Nr. U18745); wobei ein Klon von BAC B0725 B12 isoliert wurde.
Nach dem Digerieren mit dem Restriktionsenzym NotI wurde die Größe des von diesem BAC getragenen Inserts auf einem 0,8%igen Agarosegel bestimmt nach dem Laufenlassen durch Elektrophorese in einem Wechselfeld (CHEF) (4 h bei 9 V/cm mit einem Winkel von 100°, bei 11°C in einem 0,5 × TAE-Puffer). Auf diese Weise wurde nachgewiesen, dass das BAC B0725B12 ein Insert von 220 kb trägt mit einer inneren Stelle für das Enzym NotI.
Chromosomem-Lokalisierung von BAC B0725B12 durch fluoreszierende in situ-Hybridisierung (FISH)
Die Chromosomen-Lokalisierung von BAC in der Kandidaten-Region 8p23.1-23.2 wurde bestätigt durch fluoreszierende in situ-Hybridisierung (FISH) auf Metaphasen-Chromosomen nach dem von Cherif et al. (1990) beschriebenen Verfahren.
Sequenzierung des Inserts von BAC B0725B12
Zum Sequenzieren des Inserts von BAC B0725B12 wurden eine Subklon-Bank aus der mit Ultraschall behandelten DNA von BAC hergestellt.
Die aus einem Liter einer Übernacht-Kultur erhaltenen Zellen wurden durch alkalische Lysis nach klassischen Methoden behandelt. Nach dem Zentrifugieren des erhaltenen Produkts in einem Cäsiumchlorid-Gradienten wurden 12 μg DNA von BAC B0725B12 gereinigt. 3 μg DNA wurden mit Ultraschall behandelt, um Fragmente zu erhalten, deren Größen sich gleichmäßig verteilten zwischen 1,2 kb und 1,5 kb. Die erhaltenen Fragmente wurden in einem Volumen von 50 μl mit 2 Einheiten Vent-Polymerase 20 min lang bei 70°C in Gegenwart von 4 Deoxytriphosphaten (100 μM) behandelt. Die an den freien Enden resultierenden Fragmente dieser Stufe wurden durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel mit tiefem Schmelzpunkt (60 Volt innerhalb von 3 h) abgetrennt. Die entsprechend ihrer Größe gruppierten Fragmente wurden ausgeschnitten und die dabei erhaltenen Banden wurden mit Agarose behandelt. Nach der Extraktion mit Chloroform und der Dialyse an Microcon 100-Kolonnen wurde die gelöste DNA auf eine Konzentration von 100 ng/μl eingestellt. Es wurde über Nacht eine Ligation durchgeführt, indem man 100 ng der fragmentierten DNA des BAC B0725B12 mit 20 ng DNA des Vektors BluescriptSK zusammenbrachte, der durch enzymatische Digestion linearisiert worden war, und mit der alkalischen Phosphatase behandelt. Diese Reaktion wurde in einem Endvolumen von 10 μl in Gegenwart von 40 Einheiten/μl T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Die Ligationsprodukte dienten anschließend zur Umwandlung durch Elektroporation entweder eines Stammes XL-Blue (für die Plasmid-Multikopien) oder eines Stammes D10HB (für die Unterklone aus BAC). Die Klone lacZ^–, die gegenüber dem Antibiotikum resistent waren, wurden einzeln auf Mikroplatten übertragen für die Lagerung und die Sequenzierung.
Man erhielt so 960 Subklone, die den Insertions-Fragmenten von 1,2 kb bis 1,5 kb an der Stelle BamHI (freigemacht) des Plasmids BluescriptSK entsprachen.
Die Inserts dieser Subklone wurden durch PCR in über Nacht durchgeführten Bakterienkulturen amplifiziert unter Verwendung der Initiatoren (Starter) der die Insertionen flankierenden Vektoren. Die Sequenz der Enden dieser Inserte (durchschnittlich 500 Basen auf jeder Seite) wurden bestimmt durch fluoreszierende automatische Sequenzierung unter Verwendung eines Sequenzors ABI 377, der mit der Software ABI Prism DNA Sequencing Analysis (Version 2.1.2) ausgestattet war.
Die Sequenz-Fragmente, die aus den sub-BACs stammten, wurden mittels der Software Gap4 von R. Staden (Bonfield et al., 1995) miteinander vereinigt (zusammengesetzt). Die Software erlaubt die Rekonstruktion einer vollständigen Sequenz aus Sequenz-Fragmenten. Die von der Anordnung der verschiedenen Fragmente abgeleitete Sequenz ist die Konsensus-Sequenz.
Schließlich wurden gerichtete Sequenzierungstechniken angewendet (systematisches Fortschreiten des Initiators), um die Sequenzen zu vervollständigen und die Contigs (aneinandergrenzenden Fragmente) miteinander zu verbinden.
Analyse von Sequenzen zur Identifizierung von Genen
Die potentiellen Exone des Inserts von BAC B0725B12 wurden repariert durch eine Homologie-Untersuchung bei öffentlichen Protein-, Nucleinsäure- und EST (Expressed Sequence Tags)-Banken.
Datenbanken
Es wurden lokale Zusammenfassungen (Überarbeitungen) der öffentlichen Hauptbanken verwendet. Die Bank von verwendeten Proteinen wurde erhalten durch Vereinigen der Nicht-mehrfachen (Nicht-redundanten) der folgenden Banken miteinander: Genpept (automatische Translation der Genbank, NCBI; Benson et al., 1996); Swissprot (George et al., 1996) und PIR/NBRF (Bairoch et al., 1996). Die Dubletten wurden eliminiert durch die Software "nrdb" (öffentliche Domäne, NCBI; Benson et al., 1996). Die internen Wiederholungen wurden anschließend durch die Software "xnu" maskiert (öffentliche Domäne, NCBI; Benson et al., 1996). Die resultierende Bank, als NRPU (Non-Redundant Protein-Unique) bezeichnet, diente als Referenz für die Protein-Homologie-Nachforschungen. Die mit dieser Bank gefundenen Homologien erlaubten es, Regionen zu lokalisieren, die potentiell für ein Proteinfragment codieren, das mindestens verwandt ist mit einem bekannten Protein (codierende Exone). Die verwendete Bank EST besteht aus Untersektionen "gbest" (1–9) der Genbank (NCBI; Benson et al., 1996). Sie enthält alle öffentlichen Transkriptions-Fragmente.
Die mit dieser Bank gefundenen Homologien erlaubten es, potentiell transkribierte Regionen zu lokalisieren (die auf der Messenger-RNA vorhanden waren).
Die verwendete Bank von Nucleinsäuren (außer der Bank EST) enthält alle anderen Untersektionen der Genbank und von EMBL (Rodriguez-Tome et al., 1996), deren Dubletten wie oben angegeben eliminiert worden sind.
Software
Es wurde die Gesamtheit der BLAST-Softwares (Altschul et al., 1990) zur Suche nach Homologien zwischen einer Sequenz und den Protein-Daten oder Nucleinsäure-Daten von Banken verwendet. Die angewendeten Signifikanz-Schwellenwerte hängen von der Länge und der Komplexität der getesteten Region sowie von der Größe der Referenz-Bank ab. Sie wurden eingestellt und angepasst an jede Analyse.
Beispiel 2: Analyse der Nucleinsäure- und Peptid-Sequenzen von hDef-X Struktur des Gens, das für hDef-X codiert
Die Ausrichtung (Anordnung) des Gens, das für hDef-X codiert, auf diejenigen, die für die bekannten Defensine codieren, erlaubte die Feststellung einer maximalen Homologie zwischen hDef-X und hDef-4 (2). Der Gesamtumfang der Homologie zwischen den beiden Nucleinsäure-Sequenzen beträgt 72%. Die beiden einzelnen Regionen der genomischen DNA von hDef-X weisen keine Homologie mit derjenigen von hDef-4 auf, die zwei Zonen einer wiederholten Sequenz-Insertion in die Sequenz von hDef-X entsprechen, die in der Sequenz von hDef-4 fehlen: ein Element vom Typ Alu (Positionen 2155 bis 2335) und ein Element-Fragment der Linie 1 (Positionen 2710 bis 2780).
Man stellt eine beträchtliche Konservierung der flankierenden Region in 5' der Promotor-Region fest, aus der sich wahrscheinlich eine beträchtliche Konservierung der Elemente zur Regulierung der Stabilität des Messengers und der Expression des Gens ergibt.
Die starke Konservierung der Sequenz des nicht übersetzten Exons 1 erlaubt es endgültig, das Defensin hDef-X der Klasse der klassischen hämatopoetischen Defensine, d. h. den hDef-1, 2, 3 und 4 zuzuordnen, im Gegensatz zu den enterischen Defensinen hDef-5 und 6, deren Genom-Sequenz nur zwei Exone, beides codierende Exone, aufweist.
Die Ausrichtung der cDNA von hDef-4 und hDef-X, die eine Homologie von mehr als 60% anzeigt, ist in der 3 dargestellt.
Protein-Analyse
Die Peptid-Sequenz des erfindungsgemäßen Defensins ist in der 4 dargestellt. Die drei Domänen des Proteins sind wie folgt angeordnet:

• Signal-Peptid: aa 1–19

• Pro-Region: aa 20–63

• reifes Peptid: aa 64–94.
Die Grade der spezifischen Homologien zwischen hDef-4 und hDef-X wurden entsprechend der Region des betreffenden Proteins wie folgt errechnet:

• Signal-Peptid: 63,2%

• Pro-Region: 52,3%

• reifes Peptid: 37,9%.
Die Gesamthomologie beträgt 49,5%. Diese Ziffern bestätigen die sehr starke Homologie, die zwischen den Defensinen vorliegt, wobei die maximale Homologie im Bereich der Signal-Peptide und die minimale Homologie im Bereich der reifen Peptide vorliegt.
In der primären Protein-Sequenz von Def-X findet man die konservierten Aminosäuren aus der Klasse der klassischen Defensine wieder, insbesondere die sechs Cysteine, die an der dreidimensionalen Struktur derselben beteiligt sind (5).
Um die an dem erfindungsgemäßen Defensin vorhandenen sekundären Strukturen vorherzusagen, verwendet man Softwares zur Vorhersage von Sekundärstrukturen, die in dem Protein Interpretation Package, Copyright MRC 1994, Medical Research Council, Hillsroad, Cambridge, Großbritannien, enthalten sind.
Diese Softwares erlauben insbesondere den Vergleich der vorhergesagten Strukturen von Def-X und HNP-4. Die Profile in Bezug auf die Hydrophobität, die α-Helix-Strukturen, die β-Lamellen, die Amphiphilizität können in beiden Peptiden übereinandergelegt werden, was vermuten lässt, dass analoge Prozesse zur Membran-Insertion und zur Bildung von multimeren Ionen-Kanälen für diese beiden Defensine ablaufen.
Beispiel 3: Suche nach Mutationen, die mit diesen Fallfamilien von Krebsen kombiniert sind
Extraktion der genomischen DNA
Die genomische DNA von Patienten mit einer Immundefizienz oder die von Krebs befallen sind, wird aus dem peripheren Venenblut extrahiert, danach wird eine Zellenlysis, eine Protein-Digestion, eine organische Verteilung und schließlich eine alkoholische Fällung unter Anwendung von dem Fachmann allgemein bekannten klassischen Methoden durchgeführt.
Es ist insbesondere interessant, die Anwesenheit von Mutationen in der genomischen DNA von Individuen zu untersuchen, die aus Familien mit einer hohen Krebsrate stammen, in denen alle Krebstypen vorkommen. Ein Defizit an einem Gen von Granulozyten-Defensin, wie z. B. hDef-X, kann eine Rolle spielen bei der Prädisposition für Krebse, wie weiter oben angegeben.
Amplifikation der genomischen DNA
Für die genomische Amplifikation der Exon-Sequenzen, die von BAC B0725B12 abgeleitet sind, werden Oligonucleotid-Initiatoren bzw. -Starter verwendet; sie werden durch Informationsanalyse vorhergesagt und definiert mit Hilfe der Software OSP (Hillier et al., 1991).
Alle diese Initiatoren (Starter) enthalten oberhalb der durch die Amplifikation spezifisch angesteuerten Basen einen universellen allgemeinen Oligonucleotid-Schwanz, der dazu bestimmt ist, die Sequenzierung der amplifizierten Fragmente zu erlauben (PU: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' für die Initiatoren (Starter) stromaufwärts und RP: 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' für die Initiatoren (Starter) stromabwärts).
Die Oligonucleotid-Initiatoren werden nach dem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert in einem Synthetisator GENSET UFPS 24.1.

Die Amplifikation jeder oben genannten Exon-Sequenz erfolgt durch eine Amplifikations-Kettenreaktion mit Polymerase (PCR) unter den folgenden Bedingungen:

Endvolumen	50 μl
genomische DNA	100 ng
MgCl₂	2 mM
dNTP (für jede)	200 μM
Initiator (für jede)	7,5 pmol
AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Perkin)	1 Einheit
PCR-Puffer (10X = 0,1 M Tris HCl pH 8,3, 0,5 M KCl)	1 X.

Die Amplifikation wird in einem Thermocyclator Perkin Elmer 9600 oder MJ Research PTC200 mit Heizmantel durchgeführt. Nach dem Erwärmen auf 94°C innerhalb von 10 min werden 35 Zyklen durchgeführt. Jeder Zyklus umfasst: 30 s bei 94°C, 1 min bei 55°C und 30 s bei 72°C. Eine Schluss-Segment-Verlängerung von 7 min bei 72°C beendet die Amplifikation.
Die Menge der erhaltenen Amplifikations-Produkte wird in einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen durch Fluorometrie unter Verwendung des Interkalierungsmittels Picogreen (Molekularsonden) bestimmt.
Nachweis von Polymorphismen/Mutationen
Die Produkte der genomischen Amplifikation durch PCR werden auf einem automatischen Sequenzor ABI 377 sequenziert unter Verwendung von fluoreszierenden Initiatoren, die mit den Fluorochromen ABI (Joe, Fam, Rox und Tamra) markiert sind, und der DNA-Polymerase Thermosequanase (Amersham).
Die Reaktionen werden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen auf einem Thermozyklator Perkin Elmer 9600 unter klassischen Temperaturzyklus-Bedingungen durchgeführt:

– 8 Zyklen: Denaturierung 5 s bei 94°C; Hybridisierung 10 s; Verlängerung 30 s bei 72°C, dann
– 13 Zyklen: Denaturierung 5 s bei 94°C; Verlängerung 30 s bei 72°C.

Für die Sequenzierungs-Reaktion werden 6 Einheiten von Thermosequanase und 5 bis 25 ng Amplifikationsprodukt verwendet.
Am Ende der Amplifikationszyklen werden die Produkte der Sequenzierungs-Reaktionen in Ethanol ausgefällt, in einem Ladungspuffer, der Formamid enthält, wieder suspendiert, denaturiert und auf 4%igen Acrylamid-Gelen abgeschieden; die Elektrophoresen (2 h bei 30 bis 3000 Volt) werden auf Sequenzoren ABI 377 durchgeführt, die mit Sammel- und Analysen-Software ABI (ABI Prism DNA Sequencing Analysis Software, Version 2.1.2.) ausgestattet sind.
Die Sequenzen, die erhalten werden bei Patienten, die unter den untersuchten Defizienzen leiden, insbesondere bei Patienten, die aus Familien mit einer starken Prädisposition für Krebse stammen, werden mit den Sequenzen verglichen, die bei Kontroll-Patienten erhalten werden, die verwandt sind oder nicht verwandt sind. Eine statistische Analyse (Berechnung der Iodzahl) erlaubt eine Schlussfolgerung in Bezug auf die Signifikanz der Anwesenheit einer Heterozygotie-Stelle und in Bezug auf ihre Kombination mit einer Prädisposition für Krebse.
Beispiel 4: Suche nach punktuellen Mutationen
Die wie vorstehend angegeben identifizierten punktuellen Mutationen können anschließend bei den Patienten nachgewiesen werden, die eine potentielle Defizienz an dem für hDef-X codierenden Gen aufweisen, unter Anwendung zahlreicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Unter diesen können insbesondere die folgenden (nicht erschöpfend) aufgezählt werden:

• Sequenzierung
• "einzelne Nucleotid-Primer-Extension" (Syvanen et al., 1990)
• RFLP
• Suche nach einem "Einfachstrang-Konformations-Polymorphismus"
• Verfahren auf Basis einer Spaltung der falsch gepaarten Regionen (enzymatische Spaltung mit S1-Nuclease, chemische Spaltung mit verschiedenen Verbindungen wie Piperidin oder Osmiumtetroxid)
• Nachweis eines Heteroduplex in der Elektrophorese
• Verfahren auf Basis der Verwendung eines spezifischen "Oligonucleotid-Allels" (ASO, Stoneking et al., 1991)
• OLA-Verfahren "dualer Farboligonucleotid-Ligations-Assay", Samiotaki et al., 1994)
• ARMS-Verfahren ("amplification refractory mutation system"), oder ASA ("allele specific amplification")- oder PASA ("PCR amplification of specific allele")-Verfahren (Wu et al., 1989).

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LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus den folgenden Polypeptiden: a) Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist; b) Polypeptid, das zu mindestens 80% identisch ist mit dem Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Sequenz SEQ ID Nr. 6 ist; c) Polypeptid, dessen Aminosäure-Sequenz die Aminosäure-Sequenz eines biologisch aktiven Fragments aus mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren des Polypeptids ist, wie es unter (a) definiert ist, wobei das genannte Fragment mindestens eine Aktivität, ausgewählt unter den folgenden Aktivitäten, aufweist: • Erkennung des unter (a) definierten Polypeptids durch einen spezifischen Antikörper; • antibiotische Aktivität; • zytotoxische Aktivität; oder • Antitumor-Aktivität; und d) Polypeptid, das mindestens ein Polypeptid umfasst, wie es unter (a), (b) oder (c) definiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Fragment mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure-Sequenz des genannten Polypeptids die Sequenz SEQ ID Nr. 3 ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es durch chemische Synthese erhalten worden ist.
Isolierte Nucleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
Nucleinsäure nach Anspruch 5, die ausgewählt ist unter den folgenden Nucleinsäuren: a) Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1; b) Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2; c) Nucleinsäure, die zu 80% identisch ist mit den Nucleinsäuren gemäß (a) oder (b); und d) Nucleinsäure-Fragment mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, das mindestens ein Sequenz-Exon nt 1836 bis 1874, nt 3394 bis 3577 oder nt 4164 bis 4379 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Vektor zum Klonieren oder Exprimieren einer Nucleotid-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Sequenz nach einem der Ansprüche 5 oder 6 umfasst.
Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er die Elemente umfasst, die eine Expression der genannten Sequenz in der genannten Wirtszelle gewährleisten.
Zelle, die durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 und 8 transformiert worden ist.
Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dabei um eine Prokaryontenzelle handelt.
Zelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dabei um eine Eukaryontenzellen handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 kultiviert und das gebildete Polypeptid daraus gewinnt.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper oder eines ihrer Fragmente, Chimären-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er (es) in der Lage ist, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 spezifisch zu erkennen.
Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass er markiert ist.
Oligonucleotid-Sonde oder -Initiator, dadurch gekennzeichnet, dass sie (er) aus einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 5 und 6 besteht.
Sonde nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie markiert ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Verwendung als antimikrobielles, antiparasitäres und/oder antivirales Agens.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Verwendung als zytotoxisches Agens.
Polypeptid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte zytotoxische Agens als Antikrebsmittel verwendbar ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Verwendung als Agens zur Modulierung von Entzündungs-, Gewebsreparatur- und endokrinen Regulations-Prozessen.
Polypeptid nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Modulation eine corticostatische Modulation ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 für die äußere topische Anwendung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Kosmetische Zusammensetzung für die äußere topische Anwendung, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dabei um eine Zusammensetzung handelt, die als antiseptisches Agens verwendet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 und 8 umfasst, der in der Lage ist, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in vivo zu exprimieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11 umfasst, die in der Lage ist, ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in vivo zu exprimieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22, 23, 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein pharmazeutisch akzeptables Vehiculum umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22, 23 und 26 bis 28, die für die Prävention und/oder Behandlung von Mikroben-, Parasiten- oder Viren-Infektionen bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroben- oder Parasiten-Infektionen Infektionen bakteriellen Ursprungs, Infektionen von Gram-positiven oder Gram-negativen Bakterien, Mycobakterien, Fungi sind oder mit Spirochäten in Verbindung stehen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die viralen Infektionen Infektionen sind, die mit Hüllen-Viren in Verbindung stehen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Hüllen-Viren die Viren HSV und HIV sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22, 23 und 26 bis 28, die für die Prävention und/oder Behandlung von Krebsen bestimmt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Krebse Melanome sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Krebs um Leberkrebs, Prostatakrebs, Lungenkrebs mit kleinen Zellen oder um das Colorectal-Carcinom handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22, 23 und 26 bis 28, die zur Erhöhung der Immunabwehr, zur Erhöhung der Immunabwehr im Falle einer erworbenen Immundefizienz oder zur Prävention der Immundefizienz bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur Behandlung der Psoriasis bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22, 23 und 26 bis 28, dass sie zur Modulation der entzündlichen Prozesse bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass sie dazu bestimmt ist, die Entzündungsprozesse der Erkrankungen mit chronischer Entzündung zu modulieren.
Verfahren zum Nachweis einer anormalen Expression des Proteins mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 in einer vorher entnommenen biologischen Probe eines Patienten, der leidet unter einer Entzündung, einer Immundefizienz, Prädispositionen für Erkrankungen vom Krebs-Typ und/oder Infektionen durch Mikroorganismen oder solchen, die mit einem Immundefizit oder einem Entzündungsphänomen in Verbindung stehen, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: a) Bestimmung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in der biologischen Probe; und b) Vergleich des erhaltenen Ergebnisses der Bestimmung mit der Menge des Polypeptids, die normalerweise in einer äquivalenten biologischen Probe vorhanden ist.
Verfahren zum Nachweis einer anormalen Expression des Proteins mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 in einer vorher entnommenen biologischen Probe eines Patienten, der leidet unter einer Entzündung, einem Immundefizit, unter Prädispositionen für Erkrankungen vom Krebs-Typ und/oder Infektionen, die auf Mikroorganismen zurückzuführen sind oder mit einem Immundefizit oder einem Entzündungsphänomen in Verbindung stehen, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: c) Bestimmung einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 5 und 6 in der biologischen Probe; und d) Vergleich des erhaltenen Ergebnisses der Bestimmung mit der Menge der Nucleinsäure, die normalerweise in einer äquivalenten biologischen Probe vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Antikörper nach einem der Ansprüche 13 und 14 einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Oligonucleotid-Sonde und/oder einen Oligonucleotid-Initiator nach einem der Ansprüche 15 und 16 einsetzt.
Diagnostisches Kit oder diagnostisches Gerät zur Bestimmung einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion, einer Entzündung, eines Immundefizits und/oder einer Prädisposition für Erkrankungen vom Krebs-Typ, dadurch gekennzeichnet, dass er (es) einen Antikörper nach einem der Ansprüche 13 und 14 umfasst.
Diagnostisches Kit oder diagnostisches Gerät zur Bestimmung einer Mikroben- oder Parasiten-Infektion, einer Entzündung, eines Immundefizits und/oder einer Prädisposition für Erkrankungen vom Krebs-Typ, dadurch gekennzeichnet, dass er (es) eine Sonde und/oder einen Initiator nach einem der Ansprüche 15 und 16 umfasst.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Pestizid.
Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Pestizid zur Kultivierung von industriell verwertbaren Pflanzen eingesetzt wird.