JP2001514264A - ヒト・デフェンシンポリペプチドＤｅｆ−Ｘ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、それらを含有する組成物ならびに診断および治療処置への適用 - Google Patents

ヒト・デフェンシンポリペプチドＤｅｆ−Ｘ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、それらを含有する組成物ならびに診断および治療処置への適用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＨＮＰ−４に相同な新規ヒト・ポリペプチドデフェンシンＤｅｆ−Ｘ、そのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ、ベクター、該ベクターによって形質転換された細胞に関し、また、抗生物質、細胞傷害剤、修復剤および内分泌調節剤としてまたは殺虫剤として、または微生物感染症（特に細菌、真菌およびウイルス感染症）もしくは寄生生物感染症、または癌、炎症、免疫不全症を治療するための薬学的組成物または化粧用組成物としての前記ポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、微生物もしくは寄生生物感染または炎症を判定するための、あるいは免疫不全症または癌疾患への素質をスクリーニングするための診断方法ならびにキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ＨＮＰ−４に対して相同な新規ヒト・ポリペプチドデフェンシンＤ
ｅｆ−Ｘ、そのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡに関する。
【０００２】 本発明はまた、クローニングおよび発現ベクター、並びに該ベクターで形質転
換した細胞に関する。本発明の主題はまた、抗生物質、細胞傷害剤、修復剤およ
び内分泌調節剤としての、殺虫剤としての、ならびに微生物感染症、特に細菌、
真菌およびウイルス感染症、または寄生生物感染症、癌、炎症および免疫不全症
を治療するための薬学的組成物または化粧用組成物としての該ポリペプチドの使
用である。また、本発明は、微生物もしくは寄生生物感染症および炎症を判定す
るための、または免疫不全もしくは癌疾患への素因をスクリーニングするための
診断方法およびキットを含む。
【０００3】 抗微生物性の物質は、多細胞生物の防御において重要な要素である。これらの
物質のなかには、単純な無機化合物（過酸化水素、次亜塩素酸、酸化窒素）と複
雑なタンパク質やペプチドの両方が存在する。それらは、様々な器官の粘膜表面
で、特に生物種に応じて腸や肺の上皮細胞において、ならびに造血由来の食細胞
の殺菌性器官（ここで、それらは最初に同定された）において防御の第一線に存
在する。それらのde novo合成または貯蔵部位（不活性または潜在的な形でそれ らを貯蔵することができるリソソームあるいは細胞質性顆粒型のオルガネラ）か
らのそれらの放出は迅速に誘導され得るため、それらは感染に対する初期抵抗に
おいて特に重要である（Martinら、1995）。
【０００４】 サイズが１００個未満のアミノ酸の抗微生物性タンパク質を、本明細書では抗
微生物ペプチドと呼ぶことにする。抗微生物ペプチドにはいくつかのファミリー
が同定されており、これらのファミリーでは、ペプチド内部のジスルフィド架橋
の存在、アミノ酸組成、構造的コンホメーションおよび活性スペクトルが相違し
ている。６個の保存的システインを含む抗微生物ペプチドはデフェンシンファミ
リーを構成する。このファミリーは多くの種に豊富に存在する約３〜４ｋＤａの
抗微生物ペプチドから構成される（GanzおよびLehrer、1994）。これらのペプチ ドは３０〜４０個のアミノ酸から形成され、このうち６個の非変異システインが
３個の分子内ジスルフィド架橋を形成する。それらは複雑なコンホメーションを
有し、両親媒性であり、逆平行のβシートに富むがαへリックスを欠く（Lehrer
およびGanz、1992）。デフェンシンの抗微生物作用は、それらが標的細胞の膜に 挿入し、電位依存性チャンネルの形成を可能にすることによって生じると考えら
れている。Whiteら(1995)は、デフェンシンによる膜挿入およびマルチマー孔形 成の考えられるメカニズムを記載しており、このメカニズムにより標的細胞、例
えば、微生物または腫瘍細胞の膜の透過性を上げることが可能となる。ヒト好中
球デフェンシンＨＮＰ−３の結晶構造（以下を参照のこと）が決定されており、
さらにヒト好中球デフェンシンの二量体化の具体的なメカニズムが提案されてい
る。このファミリーのペプチドに関する知識が増え、それらの配列と活性スペク
トルが比較されると、これらのメカニズムおよびそれらの特異性、ならびにこれ
らの現象に特に関与するアミノ酸残基をより一層理解することができるであろう
。
【０００５】 デフェンシンは、構造的に異なる３つのペプチドファミリー、すなわち、「従
来型」デフェンシン、βデフェンシンおよび昆虫型デフェンシンに分類される。
これらのファミリーは、保存的システイン残基の位置および保存的システイン残
基間の距離、ならびに他の保存的アミノ酸（プロリン、グリシン）の位置および
距離に関して相違を示す（GanzおよびLehrer、1995）。
【０００６】 従来型のヒト・デフェンシンは、本質的に２つの供給源に由来する。それらは
、好中球抽出物からのペプチド精製によって最初に同定された。こうして、４種
のデフェンシン、すなわち、「ヒト好中球ペプチド」ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２、
ＨＮＰ−３、およびＨＮＰ−４が単離された。最初の３種は同一遺伝子の異なる
産物である（GanzおよびLehrer、1995）。これらの３種のペプチドは好中球のデ フェンシン含有量の９９％を占め、ＨＮＰ−４も好中球内に存在するが、１００
分の１より低い濃度である。ごく最近、２種のヒト腸デフェンシン、ＨＤ−５お
よびＨＤ−６が小腸、より正確にはPaneth細胞において特徴付けられた（Bevins
ら、1996）。マウスでは１６種の腸デフェンシン遺伝子が同定されているが、ヒ トでは僅かこれらの２つの相同体しか同定されていない（Mallowら、1996）。
【０００７】 デフェンシンは、in vitroで広域スペクトルの微生物に対して抗微生物作用を
有する（Martinら、1995）。この活性スペクトルは特に広く、グラム陽性および グラム陰性細菌、一部の真菌、マイコバクテリア、スピロヘータを含む寄生生物
、ならびにＨＳＶおよびＨＩＶウイルスを含むいくつかの包膜ウイルスを含む。
それらはまた、ＴＮＦ−αおよび細胞溶解性ＮＫ因子に抵抗性であるいくつかの
範疇の正常または悪性細胞に対して細胞傷害性である（Kaganら、1994）。デフェ
ンシンの標的が大量に存在しかつ免疫防御において特殊化された血液細胞中にそ
れらが豊富に存在すること、ならびに重度の感染症ではそれらの濃度が劇的に増
加することから、これらの分子は感染および癌に対する自然免疫に重要な役割を
果たし得ることが示唆される。特に、デフェンシン遺伝子の転写が増加し、予め
合成されたデフェンシンを含有する細胞質性顆粒が刺激に応答して放出されるこ
とによって局部の抗微生物応答が生じ、炎症反応、修復過程および感染中の内分
泌調節へのデフェンシンの関与が考えられる。造血デフェンシンは、抗体依存性
免疫応答中に好中球によって媒介される現象である癌細胞の溶解現象に寄与し得
るだろう。腸デフェンシンの正確な生理学的役割は明確には確立されていない。
それらは管内微生物叢の増殖抑制または細菌の腸粘膜への貫通防止を可能にする
（Mallowら, 1996）。Paneth細胞にデフェンシンｍＲＮＡが豊富に存在すること
も、これらの上皮細胞が腸の免疫防御に重要な役割を果たしているという仮説を
強く支持する。更に、それらの発現スキームが胚形成中のPaneth細胞の出現と同
時に生じることが明らかにされている。Mallowら(1996)は、胎児の腸デフェンシ
ンの発現レベルが低いと、局所防御が未熟となり、早産で生まれた子供は腸内微
生物による感染症にかかりやすくなると提唱している。
【０００８】 「特異的顆粒欠損症」（顆粒球の発生に関するまれな疾患）の患者では、正常
レベルの１０％に相当するデフェンシン濃度しか認められない。患者は普通の細
菌により引き起こされる感染症を頻繁に患う（GanzおよびLehrer、1995）。
【０００９】 生化学的に修飾されたデフェンシンは、感染症に対する潜在的な予防薬および
治療薬である（GanzおよびLehrer、1995）。従来の抗生物質に対する微生物の耐 性現象が出現し始めたため、これらの抗微生物ペプチドまたは自然免疫に関与す
る他の分子に関する研究が特に重要となってきている（Bevinsら、1996）。
【００１０】 デフェンシン、特にヒトのデフェンシンの一次構造は、最近の研究の主題とな
っている（Whiteら、1995;Mallowら、1996）。従来のデフェンシンは２９〜３５個
のアミノ酸を含むが、９０〜１００個のアミノ酸を含む前駆体（前駆タンパク質
）から誘導される。ヒト好中球デフェンシンの成熟ペプチドへのタンパク質分解
性成熟化は、それらの顆粒球への輸送と結びついている。プロペプチドの機能と
しては、デフェンシンの前駆体形態の不活性化および成熟ペプチドの活性型コン
ホメーションの獲得のためのサポートが挙げられる（Martinら、1995）。ペプチ ド相同体はシグナルペプチドのレベルで最大であり、成熟ペプチドのレベルで最
小であるが、成熟ペプチドは完全に保存されている６個のシステイン残基を含む
。これらの残基の保存はデフェンシンの活性に関与する二次構造の獲得に必要で
あるようであるが、これらの抗微生物ペプチドの極めて多くのファミリー内に存
在する配列の差異、特にそれらのＮ末端の差異、さらには他の非保存的領域の差
異は、それらの活性スペクトル、およびそれらの抗微生物または細胞傷害性の効
力の重要な決定因子となるようである。従って、このファミリーのペプチドの新
規メンバー、特にヒト・デフェンシンの同定は、それらの作用機構およびそれら
の特異性を理解するために、ならびに抗感染剤および／または細胞傷害剤として
それらを使用するために、あるいは特異的なスペクトルを示すおよび／または効
力が低いもしくは高い改変ペプチドを設計するために必要である。
【００１１】 Sparkesら(1989)は、ＨＮＰ−１をコードする遺伝子の位置を第８染色体の８ ｐ２３領域とした。Bevinsら(1995)およびMallowら(1996)は、ＨＤ−５およびＨ
Ｄ−６をコードする２つの遺伝子の位置を第８染色体、より正確には８ｐ２１−
ｐｔｅｒ領域（造血デフェンシンを担うとして先に同定された領域を含む領域）
とした。ヒト腸デフェンシンＨＤ−５およびＨＤ−６をコードする遺伝子は２つ
のエキソンを含有するが、造血デフェンシンをコードする遺伝子は内部に３個の
エキソンを含有し、ヒトおよびモルモットとウサギのいずれにおいても最後の２
つのエキソンはプレプロペプチドをコードする（Mallowら、1996）。ＨＤ−５お よびＨＤ−６遺伝子のゲノム配列を比較すると、５’の非コードフランキング配
列間に極めて高い類似性が認められていることから、後者はこれらの遺伝子の発
現の組織特異性に必要な情報を含有していることが示唆される。更に、これらの
同一領域は、２個のＡＰ２部位および６個のＩＬ６部位を含めて、転写因子のた
めの多くの結合部位を有することから、炎症過程においてこれら遺伝子の発現を
調節する経路が示唆される。より一般的には、デフェンシンＨＮＰ−１、２、３
、４ならびにＨＤ−５および６の配列およびゲノム構成間の極めて高度の類似性
から、Bevinsら(1995)は、このファミリーの染色体構成、および遺伝子のそれぞ
れの対の相同画分を関連付けることを試みる進化モデルを作製した。
【００１２】 染色体領域８ｐ２３が多くの病状、特に癌性病状に関与することに注目するこ
とは最終的に有利である。例えば、肝細胞癌（Beckerら、1996）、非小細胞肺癌 （SundareshanおよびAugustus、1996）、前立腺癌（Ichikawaら、1996）、および 大腸癌（Yaremkoら、1994）について言及し得る。このことについてはこれまで論
述されていないが、ヒト・デフェンシンのいずれかの欠損は、そのような病状へ
の傾向、またはそれらの発症においてある役割を担っていると考えられる。
【００１３】 本発明は、デフェンシンＨＮＰ−４に対して相同な新規ヒト・デフェンシンＤ
ｅｆ−Ｘに関する。
【００１４】 従って、本発明の主題は以下のポリペプチドから選択される単離されたポリペ
プチドである： ａ）アミノ酸配列が配列番号３の配列であるポリペプチド； ｂ）アミノ酸配列が配列番号３の配列であるポリペプチドの相同、改変または修
飾ポリペプチド； ｃ）アミノ酸配列が、ａ）またはｂ）に規定されるポリペプチドの生物学的に活
性なフラグメントのアミノ酸配列であるポリペプチド； ｄ）ｃ）に規定される少なくとも１つのフラグメントを含むポリペプチド。
【００１５】 本発明の説明において、「ポリペプチド」とはタンパク質またはペプチドをさ
すものとする。
【００１６】 好ましい実施態様に従えば、本発明のポリペプチドは以下のフラグメントの少
なくとも１つから成ることを特徴とする： ａ）アミノ酸配列が配列番号４の配列であって、配列番号３のアミノ酸配列の１
位〜１９位（両端を含む）の配列に対応するシグナルペプチド； ｂ）アミノ酸配列が配列番号５の配列であって、配列番号３のアミノ酸配列の２
０位〜６３位（両端を含む）の配列に対応するプロ領域； ｃ）アミノ酸配列が配列番号６の配列であって、配列番号３のアミノ酸配列の６
４位〜９４位（両端を含む）の配列に対応する成熟ペプチド；または ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に記載のペプチドの相同、改変または修飾フラグメン
ト。
【００１７】 より好ましくは、本発明のポリペプチドは先に規定された成熟デフェンシンの
一次構造、即ち、以下の配列番号６のアミノ酸配列： Ile Cys His Cys Arg Val Leu Tyr Cys Ile Phe Gly Glu His Leu Gly Gly Thr
Cys Phe Ile Leu Gly Glu Arg Tyr Pro Ile Cys Cys Tyr その相同体、改変体または修飾体ならびにそれらの生物学的に活性なフラグメン
トおよびそれらを含有するポリペプチドに対応する構造に一致する。
【００１８】 本発明のポリペプチドは非天然の形態をとり、即ち、該ポリペプチドは天然の
環境では取得されないが、天然の供給源から精製することによって得られるか、
あるいは以下に記載のように遺伝子組換えまたは化学合成によって得ることがで
きることが明確に理解される。
【００１９】 「相同ポリペプチド」は、アミノ酸配列が少なくとも８０％、好ましくは９０
％の共通のアミノ酸を示すポリペプチドを意味すると理解される。
【００２０】 「改変ポリペプチド」は、変異ポリペプチド、あるいは特にヒトに存在しうる
多型に対応しかつ本発明のポリペプチドと比較して少なくとも１個のアミノ酸の
末端切断（トランケーション）、置換、欠失および／または付加を示しうるポリ
ペプチドをさすものとする。
【００２１】 「修飾ポリペプチド」は、正常配列に対して修飾があり、以下に記載するよう
な遺伝子組換えまたは化学合成により得られるポリペプチドを表すことが理解さ
れる。これらの修飾は、特に本発明のポリペプチドのプレ、プロまたは成熟ドメ
イン、活性スペクトルの特異性もしくは活性効力に関与するアミノ酸、または構
造コンホメーション、電荷または疎水性、および本発明のポリペプチドの多量体
形成と膜への挿入に関与するアミノ酸に適用しうる。従って、活性が等しい、高
いまたは低い、および特異性が等しい、狭いまたは広いポリペプチドを作製する
ことができる。修飾はまた、ポリペプチドの成熟化、輸送および局在に関与する
配列に適用される。
【００２２】 本発明のポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」は、それが誘導さ
れる該ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保存しているポリペプチドフラグ
メントであって、特に、 ・本発明のポリペプチドに特異的な抗体によって認識され得る；および／または ・抗生物質として作用し得る；および／または ・細胞傷害剤として作用し得る；および／または ・抗腫瘍剤として作用し得る；および／または ・組織の修復、内分泌調節または炎症過程を、特に感染中に、調節し得る； フラグメントをさす。
【００２３】 本発明によれば、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、
最低１０個のアミノ酸、好ましくは１５個のアミノ酸を有する。
【００２４】 上記のように、生物学的に活性なフラグメントのうち好ましいフラグメントは
、配列番号６のアミノ酸配列を有する成熟ペプチドである。
【００２５】 成熟ペプチドの相同体のうち、５個までのアミノ酸が修飾されているか、Ｎま
たはＣ末端で切断されているか、欠失または付加されており、該配列の約８０％
に相当するポリペプチドが言及されるべきである。
【００２６】 この成熟ペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、好ましくは１０〜１５
個のアミノ酸を含み、これらの利点は、化学合成によって容易に得ることができ
ることである。
【００２７】 示されるように、成熟ポリペプチドの修飾の目的は、特に、 −デフェンシンの活性を調節すること、 −デフェンシンが活性である微生物のレベルでかつその組織局在化の点で、デフ ェンシンの特異性を変更すること、 −デフェンシンの生物学的利用能を変更すること である。
【００２８】 先の化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いることによって得ること
ができる。コンビナトリアルケミストリーでは、モデル、細胞培養または微生物
上で試験を行う前に、例えば、最も活性が高く、所望の特性を有する化合物を選
択するために、ポリペプチドの一部を体系的に改変することが可能である。
【００２９】 化学合成はまた、 −非天然アミノ酸、または −非ペプチド結合 を使用することができるという利点を有する。
【００３０】 従って、ペプチドの寿命を増大するためには、非天然アミノ酸、例えば、Ｄ体
、またはアミノ酸類似体、特に例えばイオウ含有形態を使用することが有利であ
るかもしれない。
【００３１】 最後に、成熟デフェンシンまたはその相同体、変異体もしくは修飾体の構造な
らびに対応するフラグメントの構造を、ポリペプチド型などの化学構造に組み入
れてもよい。こうして、プロテアーゼに認識されないＮおよびＣ末端化合物を提
供することは有利であろう。
【００３２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００３３】 好ましい実施態様によれば、本発明の核酸は、以下の核酸から選択される： ａ）配列番号１の配列を有する核酸（ゲノム）； ｂ）配列番号２の配列を有する核酸（ｃＤＮＡ）； ｃ）ａ）またはｂ）に記載の核酸と比較して等価な、相同な、変異した、また
は修飾された核酸； ｄ）少なくとも１０個の塩基を有するａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のフ
ラグメント； ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）において規定された配列のうちの１つとハイ
ブリダイズ可能な核酸。
【００３４】 本発明は、天然の染色体環境におけるゲノム配列に関するものではないことが
理解される。それらは単離された配列であって、即ち、それらは直接的または間
接的に回収されており、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。
【００３５】 従って、それらは、非天然のヌクレオチドを含むまたは含まないゲノムＤＮＡ
、ｃＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。それらはまた、単離された天然の核酸また
は合成の核酸でありうる。
【００３６】 等価な核酸は、遺伝子コードの縮重を考慮して、本発明のポリペプチドをコー
ドする核酸、ならびに対応するｃＤＮＡおよびＲＮＡを意味すると理解される。
【００３７】 相同な核酸は、配列が本発明の核酸配列と少なくとも８０％、好ましくは９０
％の相同性を示す核酸を意味すると理解される。
【００３８】 変異核酸は、本発明の改変ポリペプチドをコードする任意の核酸、ならびに配
列番号１および配列番号２の配列と比較して、ポリペプチドの発現（特にその発
現レベルおよびその組織特異性）に対して影響を及ぼしうるプロモーターおよび
／または調節配列に少なくとも１つの変異を含む任意の核酸を意味すると理解さ
れる。従って、ヒトに存在する多形性を示す配列も本発明に含まれる。これらの
多形のうち、いくつかは、感染症に対する応答における免疫不全、癌素質および
／または癌発生へと至らせる。
【００３９】 修飾された核酸は、本発明の修飾ポリペプチドをコードする任意の核酸、ある
いは当業者に周知の技術に従って突然変異誘発法により得られ、正常配列に対す
る変更、特に、ポリペプチドの発現レベルおよび／または組織特異性に変更を生
じる特に調節および／またはプロモーター配列における変異、を含む任意の核酸
を意味すると理解される。
【００４０】 本発明は、特にハイブリダイゼーションまたは増幅（例えばＰＣＲによる）に
基づく技法によって本発明の核酸配列を同定すること（正常配列と変異配列とを
区別することを含む）が可能な、当業者に周知の方法に従って標識され得る全て
のプライマーおよびプローブに関する。
【００４１】 対象となる核酸フラグメントのうち、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド
、即ち、その構造が標的配列とのハイブリダイゼーションによって対応する産物
の発現抑制を確実にするオリゴヌクレオチドを挙げるべきである。更に、対応す
る産物の発現調節に関与するタンパク質と相互作用することによって、該発現の
抑制または活性化を誘導するセンスオリゴヌクレオチドも言及されるべきである
。
【００４２】 それらは、記載されるエキソンまたはイントロン配列のレベルおよびフランキ
ング配列の両方に作用する、特にプロモーターおよび／または５’ＵＴＲ領域に
作用する配列でありうる。
【００４３】 本発明はまた、上記のヌクレオチド配列を含むクローニングまたは発現ベクタ
ーに関する。
【００４４】 これらのクローニングまたは発現ベクターは、宿主細胞内での該配列の発現を
確実にする要素、特に該細胞において有効なプロモーター配列および調節配列を
含むことができる。
【００４５】 対象となるベクターは自律的に複製することが可能であるか、宿主細胞の染色
体への該配列の組込みを確実にすることが意図されるものである。
【００４６】 自律複製系の場合は、宿主細胞（原核または真核のいずれか）に依存して、プ
ラスミド型の系またはウイルス系を使用することが好ましく、ベクターウイルス
としては、特にアデノウイルス（Perricaudetら、1992）、レトロウイルス、ポッ
クスウイルスまたはヘルペスウイルス（Epsteinら、1992）が可能である。当業者
であれば、これらのウイルスのそれぞれについての使用可能な技術を熟知してい
るだろう。
【００４７】 従って、ウイルスベクターとして、補足細胞中で培養が行われる欠損ウイルス
を使用することが知られており、これにより感染性ウイルスベクターが増殖しう
る危険性を回避することができる。
【００４８】 宿主細胞の染色体への配列の組込みが所望される場合は、組込みすべきヌクレ
オチド配列の両側に、組換えを確実にするために宿主細胞由来の１つ以上の配列
を提供する必要がある。これらも先行技術において広範に記載されている方法で
ある。例えば、プラスミドまたはウイルス型の系を使用することが可能であり、
そのようなウイルスとしては、例えば、レトロウイルス（Temin、1986）またはＡ
ＡＶ、アデノ随伴ウイルス（Carter、1993）がある。
【００４９】 本発明はまた、天然、正常もしくは改変、または修飾されたデフェンシンDef-
Xあるいは例えば、そのフラグメントの１つの発現を確実にするために、上記の ベクターによって形質転換された原核細胞または真核細胞に関する。
【００５０】 上記のように、本発明はまた、そのように形質転換された細胞を培養し、発現
されたタンパク質を回収することによって得られるポリペプチドに関し、例えば
「シグナル」配列によってタンパク質の分泌が確実であるように前記ベクターが
設計されており、前記ポリペプチドがプレポリペプチドまたはプレプロポリペプ
チドの形態である場合、前記回収は培養培地において細胞内または細胞外より行
うことができる。ポリペプチドの分泌を可能にする構築物は、原核細胞系および
真核細胞系の両方において公知である。本発明においては、ポリペプチドＤｅｆ
−Ｘのいくつかは、該ポリペプチド自体の分泌系または膜への挿入系を含み得る
。
【００５１】 本発明の組換えペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化形態で得るこ
とができ、天然の３次元構造を有しても有さなくてもよいことが明らかに理解さ
れている。
【００５２】 これらのポリペプチドの製造に使用することができる細胞のうち、もちろん、
細菌細胞（OlinsおよびLee、1993）も挙げられるが、更に、酵母細胞（Buckholz、
1993）、ならびに動物細胞、特に哺乳動物細胞（EdwardsおよびAruffo、1993）、
更に例えば、バキュロウイルスを用いる方法（Luckow、1993）を使用することが できる昆虫細胞についても言及するべきである。
【００５３】 そのようにして得られる細胞により、天然、改変または修飾ポリペプチド、Ｄ
ｅｆ−Ｘ、更にこれらのペプチドのフラグメント、特に生物学的に活性なフラグ
メントに対応し得るポリペプチドを調製することが可能である。
【００５４】 本発明は更に、化学合成によって得られる本発明と同一のポリペプチドに関し
、該ポリペプチドは非天然または修飾されたアミノ酸を含んでもよい。
【００５５】 本発明のポリペプチド、特に成熟デフェンシン、ならびに相同体、誘導体また
は修飾された成熟ポリペプチドは、公知の多くのペプチド合成のいずれか１つ、
例えば、固相を使用する技術または半固相を使用する技術を用いて化学的に合成
することによって、フラグメントの濃縮によってあるいは溶液中における従来の
合成によって得ることができる。
【００５６】 本発明の化合物を固相法によって合成する場合、Ｃ末端のアミノ酸を不活性固
相支持体に結合させ、α位アミノ基の保護基（必要であれば、側鎖官能基の保護
）を加える。
【００５７】 前記工程の終了時に、アミノ末端基の保護基を除去し、必要な保護基を含む第
２のアミノ酸を結合させる。
【００５８】 それぞれのアミノ酸が結合した後に、Ｎ末端保護基を除去するが、その一方で
、もちろん側鎖の保護基は維持する。
【００５９】 ポリペプチド鎖が完成したら、支持体からペプチドを切断して、側鎖の保護基
を除去する。
【００６０】 固相合成技術については、特にStewartら(1984)およびBondanszky(1984)にお いて記載されている。
【００６１】 本明細書では、合成の詳細については記載しないが、αアミノ基に対する好ま
しい保護基はウレタン型（ＢＯＣまたはＦＭＯＣ）の保護基であることを簡単に
想起しておく。カップリング試薬については、極めて多くの種類があるが、もち
ろん、それらのうち一般的にＤＭＦまたはＤＣＭ中において使用されるＮ，Ｎ’
−ジイソプロピルカルボジイミン（ＤＩＣ）を挙げるべきであろう。
【００６２】 非天然のアミノ酸を使用することが所望される場合は、他のタイプの試薬およ
び特に他のタイプの保護系を提供する必要があり得る。
【００６３】 本発明はまた、本発明のポリペプチド、特に記載されている細胞の１つを培養
することによって得られる、または上記の化学合成によって得られるポリペプチ
ドから成る免疫原性薬剤によるヒトおよび動物身体における免疫学的反応によっ
て得られるポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。
【００６４】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるモ
ノクローナルおよびポリクローナル抗体またはそれらのフラグメント、キメラ抗
体の１つにまで及ぶ。
【００６５】 本発明はまた、標識されることを特徴とする本発明の抗体を含む。
【００６６】 標識される抗体は、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ
などの酵素と免疫結合するか、あるいは蛍光化合物、ビオチンで標識するか、あ
るいは放射性標識することができる。標識技術は当業者に周知であるため、本明
細書の説明ではこれ以上説明しない。
【００６７】 本発明はまた、抗微生物、特に抗細菌、抗真菌、抗ウイルスおよび／または抗
寄生生物薬剤として、特に抗癌のための使用のための細胞傷害性薬剤、および／
または炎症、組織修復および内分泌、特にコルチコステロイド調節過程を調節す
るための薬剤としての本発明のポリペプチドの使用にまで及ぶ。
【００６８】 もう１つの局面によれば、本発明は、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物
に関し、該医薬組成物は薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせることができ
る。
【００６９】 そのような組成物は、全身、局部または局所経路により投与することができる
。
【００７０】 投与の様式では、患者に適切な治療を確立する場合に一般に考慮される基準、
特にその年齢、体重、治療の耐性、認められる副作用などに従って投与量、最適
な生薬形態を決定することができる。
【００７１】 本発明はまた、本発明のポリペプチドをin vivoで発現することができる本発 明のベクターを含む医薬組成物を含み、該医薬組成物は薬学的に受容可能なビヒ
クルと組み合わせることができる。
【００７２】 特に遺伝子治療によっておよび上記のベクターを使用することによって、ポリ
ペプチドまたはそれらのフラグメントのin vivoでの発現を想定することも可能 である。
【００７３】 遺伝子治療では、遺伝子または上記のｃＤＮＡの配列、「naked」、の使用を 想定することが可能であり、本技術は、特にウイルスベクターの支持に依存する
ことなく、これらの条件下でいくつかの組織においてポリペプチドを発現するこ
とが可能であることを明らかにしているVical社により開発された。
【００７４】 更に遺伝子治療では、ex vivoで形質転換された細胞を使用することを想定す ることが可能であり、次いで、該細胞はそれ自体でまたは類器官型内部系のいず
れかで再移植され、これも当該分野において公知である（Danosら、1993)。規定 された細胞型の標的化、細胞への貫通または核への輸送を容易にする薬剤の使用
を想定することも可能である。
【００７５】 本発明によると、前記医薬組成物は、微生物感染症、特に細菌、グラム陽性ま
たはグラム陰性細菌、マイコバクテリア、真菌およびウイルス由来の感染症、ま
たは寄生生物、特にスピロヘータ感染症の予防および／または治療を意図する。
【００７６】 好ましい実施態様によると、本発明は、ウイルス感染症が包膜化ウイルス、特
にＨＳＶおよびＨＩＶウイルスに関連の感染症であることを特徴とする本発明の
医薬組成物に有利に関する。
【００７７】 本発明の主題はまた、癌、特に黒色腫、肝癌、前立腺癌または肺非小細胞癌、
または大腸癌の予防および／または治療を目的とする本発明の医薬組成物である
。
【００７８】 本発明は、更に、免疫防御の増強、後天性免疫不全症の場合の免疫防御の増強
または特に乾癬を治療する場合の免疫不全症の予防、または特に慢性炎症性疾患
の場合の炎症過程の調節を目的とする医薬組成物を含む。
【００７９】 本発明のポリペプチドは、外部局部用剤形で、例えば、皮膚および粘膜上でよ
り好ましく使用することができる。これらの外部局部用剤形は、薬学的、皮膚科
または化粧用途であってもよい。
【００８０】 特に、これらの組成物は、皮膚または身体表面での増殖を洗浄するための薬学
的防腐剤またはいくつかの化粧品の防腐剤として、および／または該組成物の保
存剤として使用することができる。
【００８１】 本発明の局所用組成物は、特にいくつかの皮膚、眼、膣または口内症状におい
て使用することができる。それらはまた、更なる化粧品用薬剤、特にいくつかの
トリートメントシャンプーとして使用することができる。
【００８２】 本発明はまた、感染または以下に記載の病因のマーカーとしてのデフェンシン
Ｘに対応するタンパク質または核酸の不在または異常量の検出に関する。
【００８３】 本発明はまた、完全に不活性となり得る変異デフェンシンに対応するタンパク
質の異常形態または異常核酸の存在の検出に関する。この場合、この異常形態の
存在は、特定の症状、特に免疫不全症および／または癌の素質を示すマーカーで
あり得る。
【００８４】 従って、本発明は、患者由来のサンプルにおいて異常デフェンシンおよび／ま
たは異常デフェンシンをコードする配列の存在が検出されることを特徴とする免
疫不全症および／または癌の特定の型の素質の診断方法に関する。
【００８５】 本発明の診断方法は、免疫不全症および／または特に危険率の高い家族におけ
る１つ以上の癌、特に上記の癌の素質の検出を特に可能にする。このタイプの診
断は、一般に、タンパク質または核酸配列の変異型の検出によって行われる。
【００８６】 しかし、本発明はまた、炎症、免疫不全症、癌型症状への素質および／または
微生物によるかもしくは免疫不全症もしくは炎症現象に関連する感染症の診断方
法に関し、これらの方法は、生物学的サンプルにおける本発明のタンパク質また
は核酸をアッセイし、等価な生物学的サンプルにおいて正常に存在する量のポリ
ペプチドまたは核酸で得られる前記アッセイの結果と比較することを含むことを
特徴とする。
【００８７】 この場合、ペプチドのアッセイは一般に、微生物または寄生生物感染症および
／または炎症の検出を可能にする。ペプチドのアッセイは、任意の公知の方法、
例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって行うことができる。デフェンシンＸの
異常形態の検出は、例えば、この形態に特異的なモノクローナル抗体、特に本発
明の主題である抗体を用いて行うことができる。
【００８８】 好ましい実施態様によれば、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ
および／またはプライマーを使用することを特徴とする方法を有利に含む。
【００８９】 本発明に対応する核酸をアッセイすることによって予めポリペプチドＤｅｆ−
Ｘに対応する配列の全てまたは一部を増幅する方法が一般に好ましく、これらの
増幅方法はいわゆるＰＣＲまたはＰＣＲ様方法によって行うことが可能である。
ＰＣＲ様とは、核酸配列の直接的または間接的再生成物を用いるか、または標識
系が増幅されている全ての方法を表すことが理解され、これらの技術はもちろん
既知であり、一般に、それらの技術はポリメラーゼによるＤＮＡの増幅に関与す
る。本来のサンプルがＲＮＡである場合、予め逆転写を行うことを薦める。現在
、このような増幅を可能にする極めて多くの方法が存在する。例えば、いわゆる
NASBA「核酸配列に基づく増幅」(Compton、1991)、TAS「転写に基づく増幅系」(G
uatelliら、1990)，ＬＣＲ「リガーゼ連鎖反応」(Landegrenら、1998)、「エンド ラン増幅」(ERA)、「循環プローブ反応」(CPR)、およびSDA「鎖置換増幅」(Walk
er、1992)があり、これらの方法は当該分野において周知である。
【００９０】 更に本発明は、本発明の抗体を含むことを特徴とする、微生物または寄生生物
感染症、炎症、免疫不全症および／または癌型症状への素質を検出するための診
断キットまたはボックスに関する。
【００９１】 本発明のプローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする、微生物
または寄生生物感染症、炎症、免疫不全症および／または癌型症状への素質を検
出するための診断キットまたはボックスも本発明に含まれる。
【００９２】 最後に、本発明の主題は、殺虫剤、特に、例えば、とうもろこし、麦、大豆、
米またはナタネなどの食用植物、飼料用植物、果樹、ブドウの木あるいは観賞植
物などの産業目的の植物の培養のために本発明のポリペプチドを使用することで
ある。
【００９３】 本発明の他の特徴および利点については以下の実施例より明らかであり、以下
に説明する図により例示される。
【００９４】
【実施例】実施例１：hDef-Xをコードする遺伝子の同定 BAC B0725B12の単離 ヒトゲノムの８ｐ２３領域、特に、ヒト・デフェンシンをコードする遺伝子を
保持することが知られている領域を解析するために、前記領域に対応するBAC（ 「細菌人工染色体」）を単離した。CEPHファミリーの個体番号8445由来のヒトリ
ンパ芽球株のＡＤＮから全ヒトゲノムを含むBACライブラリーを調製した。この 株は、高分子量ＤＮＡの供給源として使用した。制限酵素BamHIでＤＮＡを部分 消化し、次いで、プラスミドpBeloBacIIのBamHI部位にクローニングした。その ようにして得られたクローンを「プール」して、ＹＡＣ（「酵母人工染色体」）
ライブラリーのスクリーニングについて先に記載された３次元解析手順(Chumako
vら、1992および1995)に従ってスクリーニングした。得られた３次元プールを、 好中球デフェンシン４前駆体（GeneBank:受託番号U18745号）に対するマーカーS
HGC-10793を挟むプライマーの補助を伴うＰＣＲよってスクリーニングした。こ のようにしてBAC B0725B12クローンを単離した。
【００９５】 制限酵素NotIによる消化後、このBACにより保有される挿入物のサイズを、交 互フィールド電気泳動(CHEF)(9ボルト／cmで4時間、0.5×TAE緩衝液中11℃で100゜
の角度)による泳動後、0.8％アガロースゲル上で決定した。このように、BAC B
07025B12は、酵素NotIの内部部位を伴う２２０ｋｂの挿入物を保有することが明
らかにされた。
【００９６】蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)によるBAC B0725B12の染色体位置付 け Cherifらにより記載の方法(1990)による中期染色体上の蛍光in situハイブリ ダイゼーション(FISH)により、候補領域８ｐ２３．１−２３．２におけるBACの 染色体位置付けを確認した。
【００９７】BAC B0725B12挿入物の配列決定 BAC B0725B12挿入物の配列を決定するために、このBACの音波処理したＤＮＡ
からサブクローンライブラリーを調製した。
【００９８】 １リットルの「１晩」培養物由来の細胞を、従来の技術によるアルカリ溶解に
より処置した。塩化セシウム勾配において得られる産物の遠心分離後、１２μｇ
のBAC B0725B12 ＤＮＡを精製した。サイズが１．２ｋｂ〜１．５ｋｂに均一 に分布しているフラグメントを得るために、３μｇのＤＮＡを音波処理した。得
られるフラグメントを、４種のデオキシ三リン酸（１００μＭ）の存在下、５０
μｌの容積中、２単位のVentポリメラーゼで70℃で20分間処理した。この工程に
より生じる末端をブロックされたフラグメントを、１％低融点アガロースゲル上
の電気泳動（６０ボルトで３時間）により分離した。サイズによりグループに分
かれたフラグメントを切り出し、得られたバンドをアガロースで処理した。クロ
ロホルムによる抽出およびMicrocon100カラム上での透析後、溶液中のＤＮＡを1
00ng/μlの濃度に調整した。BAC B0725B12のフラグメント化ＤＮＡ100ngを、酵
素消化によって線状化したベクターBluescriptSKのＤＮＡ20ngに接触させること
によって、連結を「１晩」行い、アルカリホスファターゼで処理した。40単位/ μlのＴ４ ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)の存在下、最終容積10μlで この反応を行った。次いで、株XL-Blue（マルチコピープラスミド用）またはD10
HB株（BAC由来のサブクローン用）のいずれかのエレクトロポレーションによっ て、連結産物を形質転換に供した。抗生物質に耐性のlacZ−クローンを、保存お
よび配列決定のために個々に継代培養した。
【００９９】 プラスミドBluescriptSKのBamHI部位（平滑末端を作製する）の1.2kb〜1.5kb のフラグメントの挿入に対応する960個のサブクローン。
【０１００】 これらのサブクローンの挿入物を、挿入物を挟むベクタープライマーを使用し
て、「１晩」行った細菌培養物上でＰＣＲにより増幅した。これらの挿入物の末
端の配列（それぞれの部位で平均500塩基）を、ABI Prism ＤＮＡ配列決定解析 ソフトウェア(2.1.2版)を備えたABI377自動化配列決定機上で自動化蛍光配列決 定により決定した。
【０１０１】 サブBACより得られる配列を有するフラグメントをR. Standen(Bonfieldら、199
5)のGap4ソフトウェアにより組み立てた。このソフトウェアは、配列のフラグメ
ント由来の全配列の再構築を可能にする。異なるフラグメントの整列から推定さ
れる配列はコンセンサス配列である。
【０１０２】 最後に、指向性配列決定技術（体系的プライマー歩行）を使用して、配列を完
成し、コンティグを結合する。
【０１０３】遺伝子を同定するための配列の解析 公知のタンパク質、核酸およびＥＳＴ（発現された配列タグ）に対する相同性
を調べることによって、BAC B0725B12の挿入物の潜在的エキソンを位置付けた 。
【０１０４】 データーバンク 主要な公知のバンクに若干の変更を加えて使用した。使用したタンパク質バン
クは、ライブラリーGenpept(GenBankの自動翻訳、NCBI;Bensonら、1996);Swisspro
t(Georgeら、1996)およびPIR/NBRF(Bairochら、1996)の重複のない融合物から成る
。ダブレットは「nrdb」ソフトウェア（共有の知識領域、NCBI;Bensonら、1996）
により消去した。次いで、「xnu」ソフトウェア（共有の知識領域、NCBI;Benson
ら、1996）によって内部反復を遮蔽した。得られたバンクをNRPU（重複を含まな い独自のタンパク質）と呼び、タンパク質の相同性を調べるための基準として使
用した。バンクにより見出された相同性により、少なくとも既知のタンパク質に
関連するタンパク質フラグメントをコードする可能性のある（エキソンをコード
する）領域を位置付けることが可能である。使用されるＥＳＴバンクは、GenBan
k(NCBI;Bensonら、1996)の下位区分「gbest」(1-9)から成る。それは、公知の転写 物の全てのフラグメントを含む。
【０１０５】 該バンクにより見出される相同性は、（メッセンジャーＲＮＡ上に存在する）
潜在的に転写された領域を位置付けることが可能である。
【０１０６】 使用される核酸バンク（ＥＳＴ以外）は、上記のようにダブレットが消去され
たGenBankおよびEMBL(Rodriguez-Tomeら、1996)の他の全ての小区分を含有する。
【０１０７】 ソフトウェア 配列およびタンパク質または核酸データバンク間の相同性を調査するためのす
べてのBLASTソフトウェア(Altshulら、1990)を使用した。使用した重要度のレベルは、 試験した領域の長さおよび複雑性ならびに基準バンクのサイズに依存した。それ
らを調節してそれぞれの解析に適応させた。
【０１０８】実施例２：hDef-Xの核酸およびペプチド配列の解析 hDef-Xをコードする遺伝子の構造 hDef-Xをコードする遺伝子と既知のデフェンシンをコードする遺伝子とを整列
することによって、hDef-XとhDef-4との間の最大相同性を観察することができる
（図２）。２つの核酸配列間の相同性の全体的レベルは７２％である。hDef-4の
ゲノムＤＮＡとの相同性を示さないhDef-XのゲノムＤＮＡの僅か２つの領域は、
hDef-Xの配列において反復される配列の挿入部分の２つの領域に対応する。この
領域はhDef-4の配列には存在せず、Alu型の１つのエレメント(2155〜2335位)お よび株１のエレメントの１つのフラグメント(2710〜2780位)である。
【０１０９】 プロモーター領域の５’側のフランキング領域に高い保存性が認められ、この
ためおそらくメッセンジャーの安定性および遺伝子発現を調節するためのエレメ
ントの保存性も高いであろう。
【０１１０】 翻訳されないエキソン１の配列の保存性が高いことから、デフェンシンhDef-X
と造血細胞由来の従来のデフェンシンのクラス、即ちhDef-1、2、3および4のクラ スと明確に結び付けることができるが、これとは対照的に、腸デフェンシンhDef
-5および6には結び付かない。それらのゲノム配列は僅か２つのエキソンしか含 まないが、両方ともコーディング領域である。
【０１１１】 hDef-4およびhDef-Xに対するｃＤＮＡの整列を図３に示す。これは６０％を超
える相同性を示す。
【０１１２】タンパク質の解析 本発明のデフェンシンのペプチド配列を図４に示す。該タンパク質の３つのド
メインの位置は以下の通りである： ・シグナルペプチド： ａａ １−１９ ・プロ領域： ａａ ２０−６３ ・成熟ペプチド： ａａ ６４−９４。
【０１１３】 hDef-4とhDef-Xとの間の相同性の特異度を、タンパク質の相当領域について計
算した： ・シグナルペプチド： ６３．２ ％ ・プロ領域： ５２．３ ％ ・成熟ペプチド： ３７．９ ％。
【０１１４】 全体的な相同性は４９．５％である。これらの図では、デフェンシン間に存在
する極めて高い相同性が確認される。相同性はシグナルペプチドのレベルで最大
であり、成熟ペプチドのレベルで最小である。
【０１１５】 従来のデフェンシンのクラスで保存されているアミノ酸は、Def-Xの主なタン パク質配列に認められ、特に６個のシステインがDef-Xの３次元構造に関与する （図５）。
【０１１６】 本発明のデフェンシンに存在する２次構造を予測するために、Protein Interp
retation Package、Copyright MRC 1994、Medical Research Council、Hillsroad、C
ambridge、United Kingdomに含まれる２次構造を予測するためのソフトウェアを 使用した。
【０１１７】 これらのソフトウェアにより、特に、Def-XおよびHNP-4の予測された構造を比
較することができる。２つのペプチドの疎水性プロフィール、αへリックス構造
、βシート、両親媒性を重ね合わせることが可能で、これにより、これらの２つ
のデフェンシンについて、膜への挿入および多量体イオンチャンネルの形成が同
様の過程であることが示唆される。
【０１１８】実施例３：家族性癌症例に関連する変異のための調査 ゲノムＤＮＡの抽出 当業者に周知の従来技術に従い、免疫不全症および癌患者のゲノムＤＮＡを、
末梢静脈血より、細胞溶解、タンパク質消化、有機溶媒による分配および最後に
アルコール沈殿を行った後抽出する。
【０１１９】 高い割合で癌（あらゆる型の癌が組み合わせられる）を有する家族由来の個体
のゲノムにおける変異の存在を研究することは特に有利である。hDef-Xなどの顆
粒球デフェンシンの遺伝子の欠損は、実際に、上記の癌への素質に役割を果たす
ことができる。
【０１２０】ゲノムＤＮＡの増幅 BAC B0725B12由来のエキソン配列のゲノム増幅にオリゴヌクレオチドプライ マーが使用される。それらはコンピュータ解析によって予測され、OSPソフトウ ェア(Hillierら、1991)によって規定される。
【０１２１】 これらの全てのプライマーは、増幅によって特異的に標的にされる塩基の上流
に、増幅されたフラグメントの配列決定を可能にすることを目的とした共通の普
遍オリゴヌクレオチドテイル（PU：上流プライマーとして5’-TGTAAAACGACGGCCA
GT-3’およびRP：下流プライマーとして5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)を含有す る。
【０１２２】 ホスホロアミダイト法により、GENSET UFPS 24.1合成機でオリゴヌクレオチド
プライマーを合成する。
【０１２３】 以下の条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりそれぞれの予測され
たエキソン配列の増幅を行う： 最終容積 ５０μｌ ゲノムＤＮＡ １００ｎｇ ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ ｄＮＴＰ（それぞれについて） ２００μＭ プライマー（それぞれについて） ７．５ピコモル
AmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin) １単位 ＰＣＲ緩衝液(10X=0.1M TrisHCl pH8.3、0.5M KCl) 1×
【０１２４】 加熱カバー付きPerkin Elmer9600またはMJ Research PCT200サーモサイクラー
で増幅を行う。９４℃で１０分間加熱後、35サイクルを行う。それぞれのサイク ルは、94℃で30秒、55℃で1分および72℃で30秒を含む。72℃で7分間の最終セグメ ントの伸張で増幅を終了する。
【０１２５】 得られる増幅産物の量を、９６ウェルマイクロプレート上で蛍光測定により、
Picogreen挿入剤(Molecular Probes)を用いて決定する。
【０１２６】多型／変異の検出 ABIフルオロクロム(Joe、Fam、RoxおよびTamra)によって標識された蛍光プライ マーおよびThermosequanase DNAポリメラーゼ(Amersham)を使用するABI377自動 化配列決定機上で、ＰＣＲによるゲノム増幅の産物の配列を決定する。
【０１２７】 従来の温度サイクル条件下、Perkin Elmer 9600サーモサイクラー上の９６ウ ェルマイクロプレートにおいて反応を行う： −８サイクル：変性：９４℃で５秒間；アニーリング：１０秒間；伸張：７２℃
で３０秒間、次いで、 −１３サイクル：変性：９４℃で５秒間；伸張：７２℃で３０秒間。
【０１２８】 配列反応あたり６単位のThermosequanase、および５〜２５ｎｇの増幅産物を 使用する。
【０１２９】 増幅サイクルの終了時に、配列反応の産物をエタノールで沈殿し、ホルムアミ
ドを含有する充填緩衝液中に再懸濁し、変性させ、４％アクリルアミドゲル上に
置く。回収および解析用のABIソフトウェア(ABI Prism ＤＮＡ配列決定解析ソフ
トウェア、2.1.2版）を備えたABI 377配列決定機上で電気泳動（3000ボルトで２
時間３０分）を行う。
【０１３０】 研究された不全症を患う患者、特に癌への高い素質を有する家族由来の患者に
おいて得られる配列と、関連または関連しない対照被験体において得られる配列
とを比較する。統計解析（負荷スコア計算）により、ヘテロ接合性部位の存在の
有意性および癌の素質との関連性について結論することができる。
【０１３１】実施例４：点変異の検索 次いで、当業者に公知の多くの方法によって、上に記載のように同定される点
変異を、hDef-Xをコードする遺伝子を欠損する可能性のある患者において検出す
ることができる。これらの方法のうち、以下のものを上げることができるが、そ
れらに制限されるわけではない： ・配列決定 ・「単一ヌクレオチドプライマー伸張」(Syvanenら、1990) ・ＲＦＬＰ ・「一本鎖コンホメーション多型」の検索 ・ミスマッチ領域の切断に基づく方法（Ｓ１ヌクレアーゼによる酵素的切断、ピ
ペリジンまたは四酸化オスミウムなどのさまざまな化合物による化学的切断） ・電気泳動におけるヘテロ二本鎖の検出 ・「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」の使用に基づく方法（ASO、Stonekin
gら、1991) ・OLA法（二色オリゴヌクレオチド連結アッセイ、Samiotakiら、1994) ・ARMS（「増幅耐性変異系」）、またはASA（「対立遺伝子特異的増幅」）、ま たはPASA（「特異的対立遺伝子のＰＣＲ増幅」）（Wuら、1989)法。
【０１３２】 （参考文献）
【０１３３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 hDef-Xのゲノム配列 hDef-4(HNP-4)をコードする遺伝子に顕著な相同性を示すhDef-Xの全ゲノムＤ ＮＡ配列を示す。 以下の部位を有する配列、該部位の存在はhDef-4との相同性により推定される
。 ・ＣＡＡＴボックス １７１１−１７１４ ・ＴＡＴＡボックス １７５８−１７６７ ・ｍＲＮＡ開始 １８３６ ・エキソン１ １８３６−１８７４ ・スプライシング部位１ ＧＴＣＡＧＴ ・Alu挿入 ２１５５−２３３５ ・Ｌ１フラグメント挿入 ２７１０−２７８０ ・スプライシング部位２ ＣＡＧ ・エキソン２ ３３９４−３５７７ ・コーディング領域の開始 ３４０６ ・スプライシング部位３ ＧＴＧＡＧＡ ・スプライシング部位４ ＣＡＧ ・エキソン３ ４１６４−４３７９ ・コーディング領域の終了 ４２７６ ・ポリアデニル化部位 ４３７４−４３７９
【図２】 ヒト・デフェンシンDef-XおよびDef-4(HNP-4)のゲノム配列のアライメント。 hDef-4のゲノムＤＮＡ(GenBank受託番号U18745)に相同性を示す新規デフェン シンDef-Xの全ゲノムＤＮＡ配列のアライメント。 注釈は、シグナルＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、スプライシング部位
、イントロン／エキソンの開始および終了、転写およびポリアデニル化部位の開
始 のhDef-4配列上の位置を示す。
【図３】 hDef-4(HNP-4)およびhDef-XのｃＤＮＡ配列のアライメント。 配列は全体として６１．４％の相同性を示す。アライメントは終結コドンの約
７５塩基下流の挿入部位を示す。これはhDef-4の配列上に存在するが、hDef-Xの
配列上には存在しない。この挿入部位の末端とｃＤＮＡとの間の全領域上に高い
相同性が継続する。従って、この挿入領域以外は、核酸配列間の相同性の程度は
顕著である。
【図４】 タンパク質hDef-Xのペプチド配列。 シグナルペプチドおよびプロ領域の切断部位の位置を、hDef-4およびhDef-Xの
ペプチド配列のアライメントから推定した。
【図５】 既知のヒト・デフェンシンhDef-1、hDef-4、hDef-5、およびhDef-6のペプチド 配列とhDef-Xとのアライメント。
【符号の説明】
＊ 星印は、５つの配列上に保存されたアミノ酸を示す。 ・ ドットは、クラスが５つの配列上に保存されているアミノ酸（いずれも同
一であるか、または保存的に置換されているアミノ酸）を示す。 ＾ ６個の矢印は、従来のデフェンシンのクラス間で保存されており、これら
のペプチドの活性に必要な３次元構造の原因である６個のシステインの位置を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のポリペプチド： ａ）アミノ酸配列が配列番号３の配列であるポリペプチド； ｂ）アミノ酸配列が配列番号３の配列であるポリペプチドの相同、改変または
    修飾ポリペプチド； ｃ）アミノ酸配列が、ａ）またはｂ）に規定されるポリペプチドの生物学的に
    活性なフラグメントのアミノ酸配列であるポリペプチド； ｄ）ｃ）に規定される少なくとも１つのフラグメントを含むポリペプチド； から選択される単離されたポリペプチド。
  2. 【請求項２】 以下のフラグメント： ａ）アミノ酸配列が配列番号４の配列であるシグナルペプチド； ｂ）アミノ酸配列が配列番号５の配列であるプロ領域； ｃ）アミノ酸配列が配列番号６の配列である成熟ペプチド；または ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に記載のペプチドの相同、改変または修飾フラグメ
    ント； の少なくとも１つから成ることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 アミノ酸配列が配列番号６の配列であるポリペプチド、その
    相同体、改変体または修飾体ならびにそれらの生物学的に活性なフラグメント、
    およびそれらを含むポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード
    する核酸。
  5. 【請求項５】 以下の核酸： ａ）配列番号１の配列を有する核酸； ｂ）配列番号２の配列を有する核酸； ｃ）ａ）またはｂ）に記載の核酸と比較して、等価な、相同な、変異または修
    飾された核酸； ｄ）少なくとも１０個の塩基を有するａ）、ｂ）またはｃ）に記載の配列のフ
    ラグメント； ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に規定される配列の１つとハイブリダイズ可
    能な核酸； から選択される核酸。
  6. 【請求項６】 請求項４および５のいずれか１項に記載の配列を含むことを
    特徴とする、適切な宿主細胞においてヌクレオチド配列をクローニングまたは発
    現するためのベクター。
  7. 【請求項７】 前記宿主細胞において前記配列の発現を確実にするエレメン
    トを含むことを特徴とする、請求項６に記載のベクター。
  8. 【請求項８】 請求項６および７のいずれか１項に記載のベクターで形質転
    換された細胞。
  9. 【請求項９】 原核細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の細胞。
  10. 【請求項１０】 真核細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の細胞
    。
  11. 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の細胞を培養し、産
    生されるポリペプチドを回収することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１
    項に記載のポリペプチドの製造方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法を用いて得ることが可能なポリペ
    プチド。
  13. 【請求項１３】 化学合成によって得れらることを特徴とする、請求項１〜
    ３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポ
    リペプチドを特異的に認識することが可能であることを特徴とする、モノクロー
    ナルまたはポリクローナル抗体あるいはそれらのフラグメント、キメラ抗体のう
    ちの１つ。
  15. 【請求項１５】 標識されていることを特徴とする、請求項１４に記載の抗
    体。
  16. 【請求項１６】 請求項４および５のいずれか１項に記載の核酸から成るこ
    とを特徴とする、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー。
  17. 【請求項１７】 標識されていることを特徴とする、請求項１６に記載のプ
    ローブ。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポ
    リペプチドの抗微生物剤および／または抗寄生生物剤としての使用。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポ
    リペプチドの細胞傷害剤としての、特に抗癌用途のための使用。
  20. 【請求項２０】 請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポ
    リペプチドの炎症、組織修復および内分泌（特にコルチコスタチック）調節過程
    を調節するための薬剤としての使用。
  21. 【請求項２１】 請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポ
    リペプチドの少なくとも１つを含むことを特徴とする、外部局所用途のための組
    成物。
  22. 【請求項２２】 化粧品組成物であることを特徴とする、請求項２１に記載
    の組成物。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜３ならびに１２および１３のいずれか１項に記
    載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
  24. 【請求項２４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをｉｎ
    ｖｉｖｏで発現することが可能な請求項６および７のいずれか１項に記載のベ
    クターを含む薬学的組成物。
  25. 【請求項２５】 薬学的に受容可能なビヒクルを含むことを特徴とする、請
    求項２１、２３および２４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  26. 【請求項２６】 微生物または寄生生物感染症の予防および／または治療を
    目的とする請求項２１、２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  27. 【請求項２７】 微生物または寄生生物感染症が細菌、グラム陽性またはグ
    ラム陰性細菌、マイコバクテリアまたは真菌由来の感染症であるか、あるいはス
    ピロヘータに関連する感染症であることを特徴とする、請求項２６に記載の薬学
    的組成物。
  28. 【請求項２８】 ウイルス感染症が包膜化ウイルス、特にＨＳＶおよびＨＩ
    Ｖウイルスに関連する感染症であることを特徴とする、請求項２６に記載の薬学
    的組成物。
  29. 【請求項２９】 癌、特に黒色腫の予防および／または治療を目的とする請
    求項２１、２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】 癌が肝癌、前立腺癌、非小細胞肺癌または大腸癌であるこ
    とを特徴とする、請求項２９に記載の薬学的組成物。
  31. 【請求項３１】 免疫防御の増強、後天性免疫不全症の場合の免疫防御の増
    強、または特に乾癬を治療する場合の免疫不全症の予防を目的とする請求項２１
    、２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  32. 【請求項３２】 特に慢性炎症性疾患の場合の、炎症過程の調節を目的とす
    る、請求項２１、２３〜２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  33. 【請求項３３】 患者由来のサンプル中の異常デフェンシンおよび／または
    異常デフェンシンをコードする配列の存在を検出することを特徴とする、免疫不
    全症および／または癌型症状への素因を診断する方法。
  34. 【請求項３４】 生物学的サンプル中の請求項１〜３のいずれか１項に記載
    のポリペプチドまたは請求項４および５のいずれか１項に記載の核酸をアッセイ
    し、得られる該アッセイの結果を、等価な生物学的サンプル中のそれぞれ正常に
    存在する前記ポリペプチドまたは前記核酸の量と比較することを含むことを特徴
    とする、微生物による感染症または免疫不全もしくは炎症現象に関連した感染症
    を診断する方法。
  35. 【請求項３５】 生物学的サンプル中の請求項１〜３のいずれか１項に記載
    のポリペプチドまたは請求項４および５のいずれか１項に記載の核酸をアッセイ
    し、得られる該アッセイの結果を、等価な生物学的サンプル中のそれぞれ正常に
    存在する前記ポリペプチドまたは前記核酸の量と比較することを含むことを特徴
    とする、炎症、免疫不全症および／または癌型症状への素因を診断する方法。
  36. 【請求項３６】 請求項１４および１５のいずれか１項に記載の抗体を使用
    することを特徴とする、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の診断方法。
  37. 【請求項３７】 請求項１６および１７のいずれか１項に記載のオリゴヌク
    レオチドプローブおよび／またはプライマーを使用することを特徴とする、請求
    項３３〜３５のいずれか１項に記載の診断方法。
  38. 【請求項３８】 請求項１４および１５のいずれか１項に記載の抗体を含む
    ことを特徴とする、微生物または寄生生物感染症、炎症、免疫不全症および／ま
    たは癌型症状への素因を判定するための診断用キットまたはボックス。
  39. 【請求項３９】 請求項１６および１７のいずれか１項に記載のプローブお
    よび／またはプライマーを含むことを特徴とする、微生物または寄生生物感染症
    、炎症、免疫不全症および／または癌型症状への素因を判定するための診断用キ
    ットまたはボックス。
  40. 【請求項４０】 殺虫剤、特に産業上の植物を栽培するための殺虫剤として
    の請求項１〜３、１２および１３のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
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