DE60025544T2

DE60025544T2 - Protein, das die Spaltung von Beta-Carotin katalysiert

Info

Publication number: DE60025544T2
Application number: DE60025544T
Authority: DE
Inventors: Heinrich Bachmann; Roland Brugger; Arno Martin Friedlein; Gabriele Margarethe Wirtz; Wolf-Dietrich Woggon; Adrian Wyss; Markus Wyss
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2020-02-18
Also published as: ATE316140T1; ES2255903T3; EP1031627A1; KR20010006657A; CA2297438A1; KR100782607B1; US6797498B1; DE60025544D1; BR0000698A; EP1031627B1; JP2000236888A; CN1269366A; US20050059061A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, das Enzym, das für die Spaltung von β-Karotin, was zu Vitamin A führt, verantwortlich ist. Der Ausdruck Vitamin A, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, umfaßt eine Klasse von Verbindungen, einschließlich Retinal, Retinol, 3-Dehydroretinol, Retinsäure, die Isomere von diesen Verbindungen sowie Retinylester. Proteine mit β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität und Nukleinsäuresequenzen, die dafür codieren, können in unterschiedlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Diagnostiken, der technischen Herstellung von Vitamin A, der Erzeugung von transgenen Pflanzen, um Vitamin A in Früchten und Gemüse herzustellen, oder Gentherapie, sind aber nicht darauf beschränkt.
Vitamin A ist für Mensch und Tier wichtig und wird größtenteils in den meisten Organismen aus seinen Präkursorkarotenoiden gebildet, die selbst nur in Pflanzen, in photosynthetisch aktiven und einigen anderen Mikroorganismen gebildet werden. Menschen und die meisten Tiere (insbesondere Pflanzenfresser und Allesfresser) können diese Karotenoide, die ebenso Provitamine A genannt werden, enzymatisch in Vitamin A umwandeln. Das wichtigste Enzym für dieses Verfahren ist das β,β-Karotin-Spaltungsenzym. Das Enzym befindet sich im Cytosol und bildet Retinal aus β-Karotin als das Hauptsubstrat in Gegenwart von Sauerstoff gemäß Schema I:
Schema I:
Das Enzym β,β-Karotin-Spaltungsenzym ist durch die Erzeugung von 2 mol Retinal aus 1 mol β-Karotin durch zentrale Spaltung gekennzeichnet. Aber das Enzym kann ebenso einen breiten Bereich an Karotenoiden in Vitamin-A-aktive Verbindungen umwandeln, wie in Schema II gezeigt:
Schema II:
Die höchste bekannte Enzymaktivität wird im Darm von Pflanzenfressern, insbesondere im Zwölffingerdarm, gefunden. In anderen Geweben, wie Leber, Lunge, Niere und Gehirn, ist das β,β-Karotin-Spaltungsenzym ebenso nachweisbar. Beginnend im Jahr 1955 sind viele Versuche unternommen worden, um das Enzym durch biochemische Verfahren zu reinigen und zu charakterisieren [Goodman (1965 and 1966), Fidge (1969) und Laksmanan (1972)]. Jedoch ist keiner dieser Versuche erfolgreich gewesen.
Devery et al. (British Journal of Nutrition (1994) 72, S. 397–414) beschreiben die Teilreinigung von β-Karotin-15,15'-dioxygenase aus Meerschweinchendarmschleimhaut. Die Autoren waren jedoch nicht in der Lage, das Enzym zu einem solchen Ausmaß zu reinigen, daß die biochemischen Merkmale des Proteins oder einer Teilsequenz bestimmt werden konnten. Spezifische Aktivitäten von 600 pmol gebildeten Retinal/mg Protein pro Stunde sind nicht übertroffen worden.
Sharma et al. (Biochimica et Biophysica Acta (1977) 486, S. 183–194) beschreiben Untersuchungen des Stoffwechsels von β-Karotin und apo-β-Karotenoiden bei Ratten und Hühnern. Die Arbeit mit isolierten Enzymsystemen, die die Spaltung von β-Karotin durch ein sehr spezifisches Deoxygenasesystem zeigen, ist in diesem Dokument erwähnt worden. Die spezifische Aktivität von solchen Enzymen ist jedoch als sehr gering betrachtet worden.
Sklan et al. (British Journal of Nutrition (1983) 50, S. 417–425) beschreiben ein Enzym mit Karotinspaltungsaktivität in Kükendarmschleimhautcytosol. Eine Teilreinigung eines Karotinspaltungsenzyms aus Hühnerschleimhaut könnte bis zu einer scheinbaren Reinigung von etwa dem 90fachen durch Anwendung von Sepharose 48, Sephadex G-50 und DEAE-Cellulose erhalten werden. Die Reinigung von Sklan war jedoch nicht ausreichend, um die biochemischen Parameter des Enzyms zu bestimmen, um eine Teilaminosäuresequenz zu erhalten.
Im Verlauf der vorliegenden Erfindung war es möglich, das Hühnerenzym zu einem solchen Grad zu reinigen, daß eine Teilaminosäuresequenz erhalten werden könnte. Das Enzym wurde 226fach angereichert, was eine spezifische Aktivität von 2.500 pmol/h/mg ergab. Auf einem Polyacrylamidgel von Fraktionen aus dem Endgelfiltrationsdurchgang waren 15 Streifen nach der Coomassie-Blau-Färbung sichtbar. Zwei Streifen korrelierten mit dem Enzymaktivitätsprofil. Mit dem ersten Protein wurde die Edman-Sequenzierung und mit dem zweiten die MS-Spektroskopie durchgeführt. Tryptische In-Gel-Digestion und anschließende Mikrosäulen-RP-HPLC-Peptidkartierung in Kombination mit MALDI-TOF MS und automatisiertem Edman-Abbau dieses letzten Proteins zeigte 2 Peptide mit 11 und 18 Aminosäuren. Aus dieser Sequenzinformation wurden degenerierte PCR-Primer konstruiert und synthetisiert.
Mit einem PCR-Protokoll wurde ein 51-bp-Fragment (bp = Basenpaar) innerhalb des längeren Peptids amplifiziert. Aus dieser Sequenz wurde ein homologer Primer synthetisiert und in einem zweiten RT-PCR (reverse Transkriptase – PCR) verwendet, um ein 597-bp-Fragment zu amplifizieren.
Dieses cDNA-Fragment wurde radioaktiv markiert und zum Screening von zwei positiven Pools aus einer Hühnerexpressionsbibliothek verwendet, um die Voll-Längen-cDNA, die für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym codiert, zu isolieren.
Die positiven Pools wurden aus einer cDNA-Bibliothek vom Hühnerzwölffingerdarm erhalten, der hinsichtlich der β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität in einem zellulären Transaktivierungsassay gescreent wurde. Durch diese Strategie wurden mehrere positive cDNA-Pools identifiziert. Durch das Vereinigen der zwei Strategien konnte das Gen, das für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym codiert, erfolgreich kloniert werden.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Protein mit dem Vitamin A bereitzustellen, welches die Aktivität vom β,β-Karotin-Spaltungsenzym erzeugt, umfassend eine Aminosäuresequenz, die identisch oder homolog zu der Sequenz ID Nr. 1 ist (gezeigt in 4), wobei der Homologiegrad zu Sequenz ID Nr. 1 mindestens 60% beträgt.
Nachdem die Sequenz des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, das aus Hühnern isoliert worden ist, bereitgestellt wurde, können entsprechende Proteine aus unterschiedlichen Tieren, wie Schwein, Kuh, Ziege, Hund, Kaninchen, Geflügel, Fisch und Menschen, leicht erhalten werden. Da die Sequenz bekannt ist, können geeignete Bereiche der Nukleinsäuresequenz als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion mit einer geeigneten Nukleinsäure ausgewählt werden, was eine leichte und schnelle Amplifikation des Gens, das für das Protein codiert, ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung umfaßt daher nicht nur Nukleinsäuren, die für Proteine mit einer Aminosäuresequenz codieren, welche zu der Sequenz identisch ist, die in Sequenz ID Nr. 1 angegeben wird, sondern ebenso die Proteine, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche homolog zu der Sequenz ID Nr. 1 ist. Der Homologiegrad beträgt jedoch mindestens 60%, vorzugsweise 70%, stärker bevorzugt 80% und besonders bevorzugt mindestens 90%. Homologie, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, bedeutet, daß, wenn die Aminosäuresequenzen der zwei Proteine ausgerichtet sind, mindestens der angegebene Prozentsatz identisch ist. Die Ausrichtung der Aminosäuren kann mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms, welches kommerziell erhältlich ist, vorzugsweise Wisconsin Sequence Analysis Package GCG (Genetics Computer Group, University Research Park, Madison), Version 9.1, 1997, durchgeführt werden. Der Rest der Aminosäuren kann anders sein. Eine Homologie von 90% bedeutet beispielsweise, daß 90% der Aminosäuren des Proteins im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, die in der Sequenz ID Nr. 1 angegeben wird, identisch sind, während 10% der Aminosäuren anders sein können.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms codieren. Eine Nukleinsäureseuqenz, die für das Enzym codiert, das aus Hühnern stammt, wird in Sequenz ID Nr. 2 gezeigt (siehe 3). Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codieren für ein Protein der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon. Kürzere Nukleotidsequenzen, die für PCR geeignet sind, weisen eine Länge von mindestens 20 Basen, vorzugsweise 25 Basen und am stärksten bevorzugt mindestens 30 Basen auf.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise als Primer für die spezifische Amplifikation eines Gens oder Teils davon, der für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym codiert, verwendet werden. Primer können ebenso für die spezifische Amplifikation von 5'-nicht-translatierenden oder 3'-nicht-translatierenden Sequenzen der oben beschriebenen cDNA verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenzen der β,β-Karotin-Spaltungsenzym-cDNA können als eine Sonde zur Detektion der Kodierung sowie für nicht-codierende Bereiche oder Teile davon verwendet werden. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise als Antisense-RNA-Sonde für die in-situ-Hybridisierung verwendet werden.
Es ist besonders bevorzugt, Primer und Sonden mit einem Teil der Sequenz, die in Sequenz ID Nr. 2 angegeben ist, als Primer und/oder Sonden in Testkits zu verwenden, die für die Amplifikation und/oder Detektion von Genen/mRNAs, die für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym codieren, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden können. Die Auswahl von geeigneten Teilen der Nukleinsäuresequenz kann durch einen Fachmann ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden. Eine Nukleinsäuresequenz, die als Primer oder Sonde verwendet wird, wird normalerweise aus einem Bereich ausgewählt, der innerhalb des Proteins stark konserviert wurde. Konserviert bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenzen dieser Bereiche von Proteinen, die aus unterschiedlichen Spezies erhalten wurden, sehr ähnlich sind. Andererseits sollte die bevorzugte Nukleinsäuresequenz in anderen Nukleinsäuresequenzen, die nicht für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym codieren, nicht vorhanden sein, da dies zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnte. Durch das Anordnen mehrerer Sequenzen, die aus unterschiedlichen Spezies stammen, können diese Bereiche leicht bestimmt werden. Obwohl die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure sein kann, sind Desoxyribonukleinsäuresequenzen stärker bevorzugt.
Eine bevorzugte Verwendung bei Diagnostiken ist die Bestimmung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms bei Patienten. Es besteht eine Variabilität in dem β-Karotin-Spaltungspotential unter den Populationen. Menschen mit geringen β,β-Karotin-Spaltungsenzym- Niveaus (mit beispielsweise Mutationen oder Polymorphismen in dem Gen für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym) könnten für die Vitamin-A-Ergänzung identifiziert und ausgewählt werden.
Ein Diagnosekit, basierend auf PCR, kann gestaltet werden, um häufige Mutationen in dem β,β-Karotin-Spaltungsenzymgen nachzuweisen. Eine andere Diagnoseoption ist die Quantifizierung von mRNA durch RT-PCR. Mit diesem Diagnosewerkzeug können Unterschiede bei der Expression von β,β-Karotin-Spaltungsenzym in verschiedenen Geweben und in unterschiedlichen Spezies festgestellt werden.
Da das Protein exprimiert worden ist und ein Verfahren zur Reinigung des Proteins ausführlich in den Beispielen beschrieben ist, kann der Fachmann das Protein oder die Peptide verwenden, die aus den Aminosäuresequenzen stammen, um Antikörper zu erzeugen, die speziell mit dem Protein reagieren. Es ist eher möglich, polyklonale Antikörper durch Immunisieren von Labortieren, wie Kaninchen, Schafen oder Ziegen, vorzugsweise mit einem Hilfsmittel oder monoklonalen Antikörpern durch allgemein bekannte Techniken, die von Köhler und Milstein [European Journal of Immunology, 1976, 6 (7), S. 511–519] beschrieben werden, zu erzeugen. Die Antikörper sollten spezifisch mit dem β,β-Karotin-Spaltungsenzym reagieren, um eine unspezifische Kreuzreaktion zu vermeiden. Dies bedeute, daß die Antikörper der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mit einem Epitop reagieren sollten, das nur auf einem Protein der vorliegenden Erfindung vorliegt.
Diese Antikörper können vorzugsweise in Immunoassays zur Detektion und/oder Quantifizierung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms in einer Testflüssigkeit verwendet werden. Die Testflüssigkeit kann eine Flüssigkeit wie Serum sein, die von einem Patienten erhalten wurde. Es gibt mehrere Typen von Immunoassays, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Sehr häufig wird ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper an einer Feststoffphase fixiert. Dieser Antikörper wird dann mit der Flüssigkeit, die das β,β-Karotin-Spaltungsenzym enthält, kontaktiert und wird nach dem Waschen weiter mit einem zweiten monoklonalen Antikörper umgesetzt, der an ein anderes Epitop des Enzyms bindet. Der zweite Antikörper wird normalerweise markiert und zeigt die Gegenwart des Sandwichs, das aus dem Antigen und zwei unterschiedlichen Antikörpern besteht.
Die Antikörper können ebenso in Laborverfahren wie Western-Blots oder Immunopräzipitationen verwendet werden. Vorzugsweise können diese Antikörper in der Immunohistochemie verwendet werden, um Epitope des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms in eingebetteten oder fixierten Geweben oder Zellen von irgendwelchen Spezies von Interesse nachzuweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das β,β-Karotin-Spaltungsenzym zur Herstellung von Vitamin A verwendet, wobei das Enzym β-Karotin in zwei Moleküle von Retinal enzymatisch spaltet, das anschließend durch Retinoldehydrogenase zu Vitamin A reduziert wird. Das β,β-Karotin-Spaltungsenzym kann verwendet werden, um β-Karotin enzymatisch umzuwandeln, das aus Pflanzenquellen erhalten werden kann. Eine bevorzugte Quelle von β-Karotin ist die Alge Dunaliella bardawil, die ein hohes endogenes Niveau von β-Karotin aufweist. Geeignete Algen können konventionell wachsen und β-Karotin kann daraus bei ziemlich geringen Kosten gereinigt werden. Das Karotin kann konventionell unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung enzymatisch gespalten werden. Das Karotinspaltungsenzym kann vorzugsweise immobilisiert werden, um ein kontinuierliches Verfahren bereitzustellen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Einführung des Gens, das für ein Protein mit β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität codiert, in eine geeignete Wirtszelle.
Der erste Schritt bei einem solchen Verfahren ist normalerweise die Insertion von cDNA in einen geeigneten Vektor. Der Vektor muß zu der Wirtszelle, in die das Gen eingeführt werden soll, passen. Es gibt spezifische Vektoren, die für Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen erhältlich sind. Vorzugsweise wird das Gen mit genetischen Strukturen, die die erforderliche genetische Regulation bereitstellen, vereinigt, wie Promotoren, Enhancer, ribosomale Bindungsstellen usw.
Systeme für die Expression von Genen, die Karotenoidbiosyntheseenzyme in Prokaryoten, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis oder Flavobakterium und Eukaryoten, beispielsweise Fungi, codieren, sind in der Technik bekannt und werden beispielsweise in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. (EP) 747 483 oder in EP 872 554 beschrieben.
Der Vektor mit dem Gen und den anderen erforderlichen genetischen Strukturen wird dann in geeignete Wirtszellen durch allgemein bekannte Verfahren, wie Transformation, Transfektion, Elektroporation oder Mikroprojektilbombardment, eingeführt. In Abhängigkeit der Wirtszelle kann es bevorzugt sein, das Gen, das für ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in das Genom der Wirtszelle fest zu integrieren. Die Zellen, die durch solche Verfahren erhalten wurden, können dann weiter vermehrt werden, und wenn die Zelle eine Pflanzenzelle ist, ist es möglich, daraus transgene Pflanzen zu erzeugen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Wirtszellen Pflanzenzellen, und Tomatenzellen sind besonders bevorzugt. Die Technologie zur Herstellung von transgenen Tomaten ist allgemein anerkannt, und die Tomate enthält ausreichend β-Karotin, damit sie mit einem vernünftigen Vitamin-A-Niveau nach der Einführung von Karotindioxygenase in die Tomatenpflanze wächst. Bei grünem Pfeffer, Melone oder insbesondere Karotten ist das endogene Niveau an β-Karotin sogar höher und daher sind diese Pflanzen ebenso besonders bevorzugt.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Algen. Halotolerante Algen können hohe Niveaus an β-Karotin enthalten. Eine Transfektion von diesen Algen mit einem Expressionsvektor, umfassend die β,β-Karotin-Spaltungsenzym-cDNA, führt zu einem hohen intrazellulären Vitamin-A-Niveau, das leicht aus diesen Algen durch einfache Reinigungsschritte gewonnen werden kann.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein Gen, das für ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in Säugetierzellen und insbesondere menschliche Zellen eingeführt werden. Es ist beispielsweise möglich, das Gen, das für ein β,β-Karotin-Spaltungsenzym codiert, in geeignete Zellen, beispielsweise periphäre Blutstammzellen, einzuführen. Diese Zellen, die das Gen für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym enthalten, können den Menschen mit Mutationen oder Deletionen in dem β,β-Karotin-Spaltungsenzymgen verabreicht werden. Diese Mutationen bzw. Deletionen können die Wirkung aufweisen, daß die Patienten nicht in der Lage sind, β-Karotin enzymatisch zu spalten. Deshalb weisen diese Patienten immer ein geringes Vitamin-A-Niveau auf und leiden daher unter verschiedenen Entwicklungs- und Augenproblemen. Die Verabreichung von geeignet transfektierten Zellen, die das β,β-Karotin-Spaltungsenzym exprimieren, an die Patienten durch somatische Gentherapie ist ein vielversprechender Weg, ihre Situation zu verbessern.
Einige der wichtigsten Ergebnisse der vorliegenden Erfindung werden in den Figuren zusammengefaßt.
1 zeigt das Ergebnis aus dem letzten Schritt der Reinigung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms aus dem Dünndarm von Hühnern. Das SDS-PAGE-Muster und die β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität von einzelnen Fraktionen aus dem Gelpermeationschromatographiedurchlauf werden gezeigt. Auf dem Gel wird das Protein A durch einen Pfeil markiert und scheint bestens mit der β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität zu korrelieren. Es wurde daher für die weitere Aminosäuresequenzanalyse ausgewählt. Die Abkürzungen weisen die folgenden Bedeutungen auf: Std.: Molekulargewichtsstandard; Konz.: Konzentrat, das auf die Gelpermeationschromatographiesäule geladen wurde.
2 zeigt schematisch den Transaktivierungsassay in eukaryotischen Zellen. cDNAs werden transfektiert und in MCF-7-Zellen exprimiert. Wenn sie mit β-Karotin inkubiert werden, zeigt ein positiver Pool die Spaltungsaktivität. Das Spaltungsprodukt Retinal wird weiter zu Retinsäure (RA) oxidiert, die an den endogenen Rezeptor bindet. Der Rezeptor/Ligand-Komplex bindet an das Reaktionselement auf dem Reporterplasmid und führt zu einer verbesserten Transkription des Luciferasegens. Die Lumineszenzsignale werden in einem Luciferaseassay mit einer empfindlichen CCD-Kamera detektiert.
3 zeigt die cDNA-Sequenz (Sequenz ID Nr. 2) für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym, das eine Länge von 3.090 Basenpaaren aufweist, ausschließlich dem Poly-A-Schwanz. 132 Basenpaare sind die 5'-nicht-translatierende Sequenz, die codierende Sequenz weist 1.578 Basenpaare auf bzw. die 3'-nicht-translatierende Sequenz 1.380 Basenpaare. Ein vermeintlichese Poly-A-Signal wird an Position 3.073 festgestellt.
4 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz (Sequenze ID Nr. 1) des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, das aus Hühnern stammt, mit 526 Resten. Die Aminosäuresequenz wird in dem Einbuchstabencode angegeben.
5 zeigt einen Vergleich der β,β-Karotin-Spaltungsenzym-Aminosäuresequenz mit einem Protein mit der Bezeichnung RPE65, das durch einen Sequenzvergleich in der EMBL-Genbank als das Protein mit der höchsten Homologie zu dem erfindungsgemäßen β,β-Karotin-Spaltungsenzym festgestellt wurde.
6 zeigt zwei Fraktionen des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, das aus einer Co²⁺-Chelatsäule eluierte. In den Spuren 1 und 2 wurden zwei unterschiedliche Fraktionen geladen und Spur 3 ist ein Marker mit geringem Molekulargewichtsbereich.
7 zeigt eine HPLC-Analyse eines Aktivitätstests des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, welches kloniert und in E. coli exprimiert wurde.
8 ist ein Beweis, daß der Peak, der das einzige Produkt der enzymatischen Spaltung darstellt, Retinal ist.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter dargestellt:
Beispiel 1:
Assay der β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität
Für die Tests wurden folgende Lösungen hergestellt:

a) Lösung 1 (gemischte Mizellenlösung): Glykocholsäure (1,16 g) wurde in 5 ml H₂O unter Rühren und durch tropfenweise Zugabe von 5 N NaOH gelöst. Nachdem der pH auf 6,8 bis 7,2 mit Essigsäure eingestellt war und das Volumen auf 10 ml mit H₂O erhöht wurde, wurden 80 mg Asolectin (Fluka) zugegeben und unter Rühren gelöst.
b) Lösung 2 (Substratlösung): 500 μl einer α-Tocopherollösung (10 mg/ml in Hexan) und 235 μg einer β-Karotinlösung (80 μg/ml reines all-E-β-Karotin in Benzol) wurden in einer Glasphiole gemischt, vor Licht geschützt und die Lösungsmittel unter einem schwachen Stickstoffstrom eingedampft. 1 ml Lösung 1 wurden unter Verwirbeln und eventuell wenigen kurzen Ultraschallimpulsen zugegeben, bis eine klare Lösung auftrat.
c) Lösung 3 (Homogenisierungspuffer): 100 mM KH₂PO₄, eingestellt mit 5 N KOH auf pH 7,8 und enthaltend 4 mM MgCl₂, 6 H₂O und 30 mM Nicotinamid.
d) Lösung 4 (GSH-Lösung): 60 mg/ml reduziertes Glutathion, gelöst in Lösung 3.
e) Lösung 5 (Standardlösung): 10 μg/ml Vitamin-A-Acetat in Hexan/Chloroform 9 : 1.

Aktivitätsassay: 2 ml Enzympräparat (ungef. 4 mg Protein, analysiert durch BCA-Proteinassay, Pierce Chemicals) wurden in lichtgeschützte Glasphiolen in ein Schüttelwasserbad (30 min, 37°C) gegeben. 0,2 ml Lösung 4 wurden zugegeben und die Reaktion begann nach 2 min der Temperaturäquilibrierung durch die Zugabe von 50 μl Lösung 2. Nach 3 h wurde die Reaktion durch das Plazieren der Phiolen auf Eis und anschließende Zugabe von 1 ml Acetonitril, gefolgt von 5 ml Chloroform gestoppt. Die Phiolen wurden dreimal für 7 s verwirbelt und die Phasentrennung wurde durch Zentrifugation für 5 min bei 5000 g durchgeführt. Die Extraktion wurde zweimal mit 0,6 ml Chloroform wiederholt. Die vereinigten Chloroformphasen wurden eingedampft und in 200 μl Lösung 5 unter kurzer Ultraschallbehandlung resolubilisiert. Unlösliches Material wurde durch Filtration durch 0,45-μm-Filter entfernt. Ein aliquoter Teil von 20 μl wurde durch HPLC auf einer Umkehrphasen-C18-Säule (Lichrospher 100, 5 μm, 12,5 cm × 4,6 mm, Bischoff Chromatography, Leonberg, Deutschland; 1 ml/min, Säulentemperatur 25°C) mit einem diskontinuierlichen, optimierten Gradienten von Acetonitril/Tetrahydrofuran/(1% Ammoniumacetat in H₂O) von 50 : 20 : 30 (Elutionsmittel A) bis 50 : 44 : 6 (Elutionsmittel B) abgetrennt. Diese Bedingungen ermöglichen die vollständige Abtrennung von β,β-Karotin und Retinal sowie apo-β-Karotenalen und Retinsäuren. Kalibrierungskurven wurden für sowohl β,β-Karotin als auch Retinal in den Konzentrationsbereichen von 2 bis 40 bzw. 1 bis 10 ng/μl hergestellt und wurden auf den Wert von Vitamin-A-Acetat korreliert, das als ein interner Standard diente. Die Enzymaktivität wurde als die Menge an Retinal ausgedrückt, das sich in dem Aktivitätsassay während der Inkubation von 3 h bei 37°C (100% = 17,6 nmol) entwickelte.
Beispiel 2:
Reinigung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms
Die Reinigung wurde so schnell wie möglich durchgeführt, und alle Puffer und Vorrichtungen wurden auf 4°C abgekühlt.

Lösung 6 (Proteaseinhibitor-enthaltender Homogenisierungspuffer): 125 mM Benzamidin·HCl, 250 mM 6-Aminocapronsäure und 125 μM Sojabohnentrypsininhibitor wurden in H₂O durch Ultraschallbehandlung gelöst. Ein aliquoter Teil von 4 ml dieser Lösung wurde mit 100 ml der Lösung 3 gemischt.
Lösung 7: 10 mM KH₂PO₄, 1 mM reduziertes Glutathion, pH 7,8.
Lösung 8 (Elutionsmittel A, Phenyl-Sepharose-Chromatographie): 10 mM KH₂PO₄, 1 mM reduziertes Glutathion, 0,5 M (NH₄)₂SO₄, pH 7,8.
Solution 9 (Elutionsmittel B, Phenyl-Sepharose-Chromatographie): 10 mM KH₂PO₄, 1 mM reduziertes Glutathion, 10% Glycerol, pH 7,8.
Lösung 10 (Elutionsmittel B, Poros HQ Chromatographie): 10 mM KH₂PO₄, mM reduziertes Glutathion, 0,5 M NaCl, 10% Glycerol, pH 7,8.
Lösung 11 (Elutionspuffer für Gelpermeationschromatographie): 50 mM KH₂PO₄, 1 mM reduziertes Glutathion, 150 mM NaCl, 10% Glycerol, pH 7,8.

Legende Hühner bei einem Alter von 20 bis 24 Wochen (Stamm Lohmann LSL, Hatchery Wuethrich, CH-3123 Belp, Schweiz) wurden auf einer pigmentfreien Hühnernahrung gehalten (Kliba 3179, Kliba, CH-4303 Kaiseraugst, Schweiz). Die Tiere wurden durch Köpfung getötet und die ersten 20 cm der Zwölffingerdarmschleife wurden entfernt, von der Bauchspeicheldrüse abgetrennt und mit jeweils 40 ml der 0,9%igen NaCl-Lösung abgespült.
Die Därme wurden direkt in Trockeneis eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
Zehn Därme wurden auf Eis ungefähr 2 h aufgetaut und längs in einer eisgekühlten Petrischale geöffnet. Die Schleimhaut wurde mit einem Objektträger abgekratzt, abgewogen und in einem Teflon-Glas-Potter-Elvehjem-Homogenisator in 4 Volumen der Lösung 6 mit sechs gleitenden Bewegungen homogenisiert. Bei der Zentrifugation bei 62000 g für 1 h wurde der klare Überstand in 32 aliquote Teile von jeweils 15 ml geteilt. Aus diesen Präparaten wurde eine Ammoniumsulfatfraktionierung hergestellt. Der Niederschlag, der aus dem 20 bis 45%igen Schritt erhalten wurde, wurde bei 5000 g für 10 min zentrifugiert und das Pellet wurde bei –80°C zur weiteren Verwendung gelagert.
Zehn aliquote Teile des (NH₄)₂SO₄-Pellets wurden in 150 ml der Lösung 7 gelöst, steril filtriert und auf eine HiLoad-26/10-Phenyl-Sepharose-Hochleistungssäule (Säulenvolumen 53 ml; Pharmacia, Uppsala, Schweden), die mit der Lösung 8 äquilibriert wurde, geladen. Die Proteine wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min mit einem Einweichungsgradienten über 1 Säulenvolumen (CV) von Lösung 8 bis Lösung 9 eluiert. β,β-Karotin-Spaltungsenzym, das bei einer Leitfähigkeit von < 15 mS/cm eluiert wurde, aber nur Fraktionen mit einer Leitfähigkeit von < 1 mS/cm wurden gesammelt und direkt auf eine 30 ml Blue-Sepharose-6-Fast-Flow-Säule (Pharmacia), die mit der Lösung 9 äquilibriert wurde, geladen. Die β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität eluierte (bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min) in den Durchbruchfraktionen, die (erneut) direkt auf eine 20-ml-Poros-HQ/M-Anionenaustauschchromatographiesäule (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA), die mit der Lösung 9 äquilibriert wurde, geladen wurden. Das β,β-Karotin-Spaltungsenzym wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/min mit einem linearen Gradienten über 18 CV von Lösung 9 bis Lösung 10 eluiert. Die Aktivität wurde in dem Gradienten in einem Leitfähigkeitsbereich von 10 bis 20 mS/cm detektiert. Die zusammengefaßten Fraktionen (70 ml) wurden auf ~1,3 ml mit Ultrafree-15-Filtereinheiten konzentriert (MW-Durchschnitt 50.000; Millipore, Bedford, MA, USA). Ein aliquoter Teil des Konzentrats (500 μl) wurde auf eine Superdex-200-HR-10/30-Gelfiltrationssäule (CV 24 ml; Pharmacia) geladen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit der Lösung 11 eluiert. Aliquote Teile jeder Fraktion wurden für die Aktivitätsassays (siehe Beispiel 1) und bei der Konzentration für SDS-PAGE (mit MOPS-Elektrophoresepuffer) auf 10% NuPAGE-Gelen (Novex, San Diego, CA, USA) verwendet. Die Ergebnisse dieses Experimentes werden in 1 und Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Zusammengefaßte Tabelle zur Reinigung des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms, ausgehend von 10 aliquoten Teilen des (NH₄)₂SO₄-Pellets (Mittel von 3 bis 4 Messungen).
Beispiel 3:
Aminosäuresequenzinformation für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym
Zur Aminosäuresequenzanalyse wurden die Fraktionen des Gelfiltrationsdurchlaufs (wie in 1 gezeigt) auf einem 8 bis 16%igen Tris/Glycin-Gel (Novex) abgetrennt, und die Proteine auf eine Immobilon-P^SQ-Membran (Millipore) übertragen und mit Amidoschwarz gefärbt.
Da das Protein A nachweislich N-terminal blockiert ist, wurden mehrere aliquote Teile der Fraktion 18 aus dem Gelfiltrationsdurchlauf (siehe 1) auf einem 10%igen Tris/Glycin-Gel (Novex) abgetrennt und das Gel wurde mit Colloidal Coomassie Blue (Novex) eingefärbt. Der Streifen, der dem Protein A entspricht, wurde aus dem Gel exzidiert, und das Protein in Gel mit Trypsin digeriert. Die tryptische Digestion wurde durch Mikrosäulen-Umkehrphasen-HPLC auf einer 150 × 1,0 mm Vydac-C₁₈-Säule (Vydac, Hesperia, CA, USA) abgetrennt. Die Peptide wurden mit einem Acetonitrilgradienten in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert und die Peptid-enthaltenden Fraktionen wurden für die weitere Analyse gesammelt.
Zwei Fraktionen konnten durch MALDI-TOF-MS (Voyager Elite, PerSeptive Biosystems) identifiziert werden, damit sie jeweils ein einzelnes Peptid enthalten. Der N-terminale Edman-Abbau offenbarte die folgenden Sequenzen:

(1) Ala-Glu-Val-Gln-Gly-Gln-Leu-Pro (Seq. ID Nr. 3)
(2) Asn-Lys-Glu-Glu-His-Pro-Glu-Pro-Ile-Lys-Ala-Glu-Val-Gln-Gly-Gln-Leu-Pro (Seq. ID Nr. 6)

Man beachte, daß die letzten 8 Aminosäuren des Peptids (2) dem Peptid (1) entsprechen.
Beispiel 4:
Klonierung der Volllängen-cDNA für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym
A) RNA-Isolation:
4 Wochen alte Vedette-Hühner wurden getötet, der Zwölffingerdarm entfernt, mit sterilem PBS gewaschen und mit Scheren aufgeschnitten. Die Schleimhautschicht wurde mit einem Glasobjektträger abgekratzt, abgewogen und direkt mit einem Polytron in 1 ml Trizole-Reagens (Life Technologies) pro 100 mg Gewebe homogenisiert. Dann folgte das Standardprotokoll von Life Technologies. Poly-A-mRNA wurde durch polyATtract-mRNA-Isolationskit von Promega Corporation, Madison, isoliert.
B) PCR und RT-PCR:
In der Peptidesequenz NKEEHPEPIKAEVQGQLP (Peptid 2 von Beispiel 3) (Seq. ID Nr. 7) wurden zwei degenerierte Primer konstruiert: Um eine geringere Degeneriertheit zu erhalten, wurde das Grundinosin in einem bzw. in zwei Wackelsitzen verwendet.
5'-Primer: 5'AAC AAR GAR GAS CAY CCI GA 3' (Seq. ID Nr. 8) (20 mer mit einer Degeneriertheit von 16×)
3'-Primer: 5'SAG CTG ICC CTG IAC YTC SGC 3' (Seq. ID Nr. 9) (21 mer mit einer Degeneriertheit von 8×)
R = A oder G, S = C oder G, Y = C oder T
Die Oligos wurden aus einem Pharmacia Gene Assembler Plus unter Verwendung der Standardphosphoramiditchemie synthetisiert. Die Entschützung wurde mit 1 ml konz. Ammoniumhydroxidlösung (Applied Biosystems) durchgeführt und das endgültige Entsalzen wurde mit einer NAP-10-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Für PCR wurden 100 ng Hühnerzwölffingerdarm-cDNA als Matrize verwendet und die folgenden Schritte wurden durchgeführt: 94°C 30''; 52°C 30''; 72°C 1' für 40 Kreisläufe. Der resultierende Streifen mit 51 bp wurde aus einem 10%igen Polyacrylamidgel geschnitten, auf DEAE-Papier bei 300 V für 1,5 h elektroeluiert, aus dem DEAE-Papier einmal mit 40 μl und zweimal mit 30 μl 1,5 M NaCl, 5 mM Tris, 0,5 mM EDTA eluiert, mit 2,5 Volumen Ethanol 100% und 1 μg Glycogen ausgefällt, mit 0,5 ml 80%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE gelöst (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
Das resultierende Fragment mit 51 bp wurde in pGEM-T Easy, einen kommerziell erhältlichen T/A-Klonierungs-Vektor (Promega Corporation, Madison), kloniert. Die entsprechende cDNA-Sequenz wurde durch automatisiertes Fluoreszenzsequenzieren auf einem Vistra DNA Sequencer 725 (Amersham Pharmacia Biotech) bestimmt.
Aus der obigen DNA-Sequenz wurde ein homologer Vorwärtsprimer abgeleitet:
5' TCTGAATTCCGGAGCCCATAAAAGC 3' (Primerdioxy12) [Seq. ID Nr. 10]
Am 5'-Ende wurde eine EcoRI-Stelle (unterstrichene Sequenz) eingeschoben; die folgenden 17 Nukleotide sind homolog zu der zuvor erhaltenen β,β-Karotin-Spaltungsenzymsequenz.
Bei einer RT-PCR-Reaktion wurde ein polyT/Not-Primer (kommerziell erhältlich von Invitrogen, San Diego) als Umkehrprimer zusammen mit Primerdioxy12 verwendet.

Ein Rohr RT-PCR-Kit von Boehringer Mannheim wurde verwendet und das entsprechende Protokoll folgte: Mischung 1:

18,3 μl	H₂O
2,5 μl	DTT (100 mM)
1,0 μl	dNTPs (10 mM)
1,0 μl	Oligo dT/Not (0,2 μg/μl) (3'-Primer)
1,0 μl	Dioxy12 (5'-Primer) (20 μM)
0,2 μl	RNAse-Inhibitor (40 U/μl)
1,0 μl	Hühnerzwölffingerdarm-Gesamt-RNA (2,2 μg/μl)
25,0 μl	–

Mischung 2:

14,0 μl	H₂O
10,0 μl	RT-PCR-Puffer 5×
1,0 μl	Enzymmischung (AMV RT, Taq und Pwo DNA Polymerase)
25,0 μl	–

Die 2 Mischungen wurden vereinigt und das PCR-Protokoll begann auf einer MJ Research PTC200 DNA Engine.

50°C 30'

94°C 2'

94°C 30''

57°C 30'' 10 Kreisläufe

68°C 45''

94°C 30''

62°C 30'' 25 Kreisläufe

68°C 45'' + 3''/Kreislauf

68°C 7'

4°C über Nacht
Mit diesem RT-PCR-Protokoll wurde ein Streifen mit 597 bp aus Hühnergesamtzwölffingerdarm-RNA amplifiziert. Der PCR-Streifen wurde aus einem 1%igen Agarosegel isoliert, in einen pGEM-T-Easy-Klonierungs-Vektor kloniert und anschließend sequenziert. Das ursprüngliche Peptid liegt in der Sequenz sowie ein offener Ableserahmen über der gesamten Sequenz mit 597 bp vor.
C) Hühner-cDNA-Bibliothek:
Aus der Hühnerzwölffingerdarm-polyA⁺-RNA wurde cDNA mit dem Copy Kit (Invitrogen, San Diego) unter Verwendung einer modifizierten Gubler-Hoffman-Verfahrensweise hergestellt. Die cDNA wurde nach der Größe ausgewählt (0,9 bis 5,5 kb) und in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA1.1/Amp (Invitrogen) kloniert.
Die Elektroporation zu E. Coli Top10 wurde mit einem Bio-Rad Gene Pulser II System nach dem Standardprotokoll durchgeführt. Dies führte zu einer cDNA-Bibliothek von 480.000 einzelnen Klonen. Die Bibliothek wurde in 250 Pools mit jeweils 1500 bis 2500 einzelnen Klonen geteilt. Jeder Pool wurde in 100 ml LB-Medium amplifiziert: das Bakterienwachstum wurde bei OD 0,8 bis 1,0 durch die Zugabe von Chloramphenicol auf eine Endkonzentration von 170 μg/ml gestoppt. Die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt, um die DNA-Menge zu erhöhen.
D) Aktivitätsscreening der Hühner-cDNA-Bibliothek:
90 der obigen Pools wurden hinsichtlich der Aktivität in einem Transaktivierungsassay, basierend auf der Detektion von Retinsäure, die in eukaryotischen Zellen nach der β-Karotinspaltung erzeugt wurde, getestet. Das Grundprinzip des Aktivitätstests wird in 2 gezeigt.
5 μg DNA aus jedem Pool wurden mit 20 μg Lipofectin (Life Technologies) zu einer Reporterzellinie, die ein Luciferasereporterplasmid mit einem RARE (Retinsäurereaktionselement) vor dem tk-Promotor (Herpes-simplex-Thymidinkinasepromotor) trägt, transfektiert. Die Transfektionen wurden für 7 h unter serumfreien Bedingungen durchgeführt. Nach 7 h wurde die Transfektionsmischung entfernt und RPMI-Medium mit 10% Aktivkohle-behandelten FKS (fetales Kalbsserum) zugegeben. Nach 20 h der Inkubation wurden β-Karotin (β-Karotin 10% CWS, F. Hoffmann-La Roche Ltd.) oder eine Placeboformulierung zu dem Kulturmedium auf eine β-Karotinendkonzentration von 5 μM zugegeben. Die Inkubation wurde für 18 h fortgesetzt. Dann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und die Luciferaseexpression wurde nach der Substratzugabe mit einer stickstoffgekühlten langsamen Scan-CCD-Kamera gemessen (AstroCam Ltd.). Die Belichtungszeit betrug normalerweise 8 min. Die Analyse wurde mit dem Image Pro Plus 3.0 Softwarepaket (Media Cybernatic, Maryland) durchgeführt. 3 Pools waren stark positiv, 7 Pools zeigten schwächere, aber nachweisbare Aktivität.
Einer der positiven Pools wurde auf einer quadratischen Agarplatte plattiert. 2 Filter (Nylonmembranen, Gene Screen, NEN Research Products, Boston) wurden verarbeitet und mit dem radioaktiv ([α³²P]dATP, Amersham) markierten PCR-Fragment mit 597 bp gescreent. Aus 9500 gescreenten Kolonien waren 14 doppelt positiv. Aus 36 ausgewählten Kolonien zeigten 5 dasselbe Muster nach der Restriktionsstellenanalyse. 2 Klone wurden aus dem 5'-Ende sequenziert und die ursprüngliche Sequenz mit 51 bp wurde gefunden. Anschließend wurde die gesamte cDNA sequenziert und zweimal bestätigt.
Alle molekularbiologischen Verfahren wurden gemäß Sambrook, Fritsch und Maniatis, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.
Die erhaltene cDNA-Sequenz wird in 3 und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz in 4 gezeigt.
4 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz mit 526 Resten.
Beispiel 5: Sequenzvergleich:
Durch den Sequenzvergleich mit der EMBL-Genbank wurde eine hohe Homologie zwischen dem bekannten Protein RPE65 (Hamel et al., J. Biol. Chem. [1993] S. 15751–15757) und dem β,β-Karotin-Spaltungsenzym festgestellt. Eine Homologie von 55,5% auf dem Aminosäureniveau wurde festgestellt. Die Sequenzanordnung wird in 5 gezeigt.
Beispiel 6:
Expression der cDNA für das β,β-Karotin-Spaltungsenzym in E. Coli:
Mit PCR wurde die Kodierungsequenz der β,β-Carotin-Spaltungsenzym-cDNA amplifiziert und das resultierende Fragment mit 1578 bp wurde in die EcoRI/BamHI-Stelle des prokaryotischen Expressionsvektors pQE-12 (Qiagen) kloniert. Der Vektor enthält eine Inframe-hexa-His-Affinitätsmarkierung am C-Ende des β,β-Karotin-Spaltungsenzyms.
Außerdem enthält dieses Plasmid einen regulierten Promotor mit zwei lacI-Repressorbindungsstellen.
Der E. Coli-Stamm M15pREP4 wurde mit dem Expressionsplasmid umgewandelt. Für die Expression 1 wurde 1 LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Kanamycin, mit 30 ml einer Übernachtkultur inokuliert. Das Wachstum erfolgte bis zu OD₆₀₀ von 0,6 bis 0,8. An diesem Punkt wurde die Kultur mit 1 mM IPTG (Isopropyl-β- thiogalactosid) induziert und das Wachstum für weitere 1,5 bis 2 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und das Pellet wurde bei –80°C eingefroren.
Das Pellet wurde unter Rühren in 20 ml Extraktionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 20 mM Tris-HCl, 1 mg/ml Tween 40; pH 7,8), einschließlich 2,5 mg/ml Dodecyl-β-D-maltosid aufgetaut. 1 ml Proteaseinhibitorcocktail (5,9 mM Benzamidin-HCl, 10 mM 6-Amino-capronsäure, 5 μM Sojabohnentrypsininhibitor) wurde gleichzeitig zugegeben.
Die Bakterienzellen wurden durch 4-minütige Behandlung mit einem Polytron (Kinematica AG, Schweiz) unter Verwendung einer PT7-Einheit nach 4 min Ultraschallbehandlung mit einem Branson-Sonifier 250 lysiert.
Das Lysat wurde bei 12000 × g geschleudert und der Überstand über einer Co²⁺-Chelatsäule gereinigt (Talon Superflow Resin, Clontech, Heidelberg, Deutschland). Das Protein wurde mit 15 bis 20 ml Extraktionspuffer, enthaltend 150 mM Imidazol, eluiert.
Die Fraktionen wurden auf ein 10%iges Polyacrylamidgel geladen und die Protein-enthaltenden Fraktionen gegen 150 mM Tricin, 5 mM FeSO₄, 3 mg/ml reduziertes Glutathion, 0,21 mg/ml Natriumcholat dialysiert. Das Gel wird in 6 gezeigt. Die Proben wurden dann in dem β,β-Karotin-Spaltungsenzym-Aktivitätsassay analysiert.
Beispiel 7:
Expression des rekombinanten β,β-Karotin-Spaltungsenzyms in der menschlichen Zwölffingerdarmzellinie HuTu80:
Mit PCR wurde die Kodierungssequenz der β,β-Karotin-Spaltungsenzym-cDNA amplifiziert und das resultierende Fragment mit 1578 bp wurde in die BamHI/XhoI-Stelle des Plasmids pSFV2gen kloniert. Dieser Vektor ist Teil des Semliki Forest Virus-Expressionssystems, welches in den meisten Säugetierzellen sehr wirksam arbeitet.
Das Plasmid wurde für die in-vitro-Synthese der rekombinanten RNA verwendet, die anschließend zusammen mit dem Helfervirus zu den BHK-Zellen (Babyhamsternierenzellen) zur Herstellung eines Virusstammes mit hohem Titer elektroporiert wurde. Mit einem aliquoten Teil von diesem Stamm wurde die menschliche Zwölffingerdarmzellinie HuTu80 infiziert. 16 bis 18 h nach der Infektion wurden die Zellen geerntet und das Pellet bei –80°C eingefroren. Entweder wurde das gesamte Zellpellet, die Zytoplasmafraktion oder die Membranfraktion in einem Aktivitätsassay verwendet. Die β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität wurde in dem gesamten Zellextrakt und in den Zytosolfraktionen gefunden, während in der Membranfraktion keine Aktivität nachgewiesen wurde.
Beispiel 8:
β,β-Karotin-Spaltungsenzymaktivität des rekombinanten Proteins, das in E. Coli und in menschlichen Zellen exprimiert wurde:
Nach der Expression in E. Coli und Reinigung über einer Metallchelatsäule zeigt das Protein Spaltungsaktivität mit β-Karotin als Substrat. Retinal war das einzige Produkt, das durch HPLC nach der Inkubation mit β-Karotin delektiert wurde. Keine Apokarotenale oder andere Stoffwechselprodukte wurden festgestellt. Dies konnte durch die HPLC-Analyse, wie in den 7 und 8 gezeigt, nachgewiesen werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein mit Enzymaktivität bei der Spaltung von β-Karotin zum Erhalt von Retinal codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mit SEQ ID Nr. 1 identisch ist, wobei der Identitätsgrad zu SEQ ID Nr. 1 mindestens 60% beträgt.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei der Identitätsgrad mindestens 70% beträgt.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei der Identitätsgrad mindestens 80% beträgt.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei der Identitätsgrad mindestens 90% beträgt.
Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sequenz aus Huhn stammt.
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, enthaltend die Sequenz von SEQ ID Nr. 2.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure Desoxyribonukleinsäure ist.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure eine Antisense-Ribonukleinsäure ist.
Primer für die spezifische Amplifikation einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Oligonukleotid eine Länge von mindestens 20 Basen von SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Sonde zur Detektion einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Oligonukleotid eine Länge von mindestens 20 Basen von SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Testkit zur Amplifikation und/oder Detektion einer Nukleinsäure oder eines Teils davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend mindestens einen Primer nach Anspruch 9 und/oder mindestens eine Sonde nach Anspruch 10.
In vitro-Verfahren zur Einführung einer cDNA in eine Wirtszelle, wobei eine cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einen Vektor eingeführt wird, der für die Wirtszelle geeignet ist, und der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelte ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle oder ein anderer Pilz ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine Alge ist.
In vitro-Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Säugetierzelle eine menschliche Zelle ist.
Transformierte Wirtszelle, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18.
Wirtszelle nach Anspruch 19, die eine cDNA nach Anspruch 7 umfaßt, die aus einer anderen Spezies erhalten wurde.