DE4445562C1

DE4445562C1 - Klonierung, Expression und Charakterisierung einer neuen Form der Phosphatidylinositol-3-Kinase

Info

Publication number: DE4445562C1
Application number: DE4445562A
Authority: DE
Inventors: Borislav Stoyanov; Theodor Dr Hanck; Reinhard Prof Dr Wetzker
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2014-12-21
Also published as: DE59509495D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Phosphatidyl inositol-3-Kinase (PI3Kγ), eine dafür kodierende Nuclein säure, einen gegen das Protein gerichteten Antikörper sowie die diagnostische und therapeutische Anwendung des Pro teins, der Nucleinsäure und des Antikörpers.

Phosphatidylinositol-Kinasen gehören neben spezifischen Phospholipasen zu einer Enzymgruppe, welche die Bildung von intrazellulären Botensubstanzen aus dem Membranlipid Phosphatidylinositol (PI) katalysiert. Die Aktivität dieser Enzyme wird durch extrazelluläre Effektoren wie Hormone, Wachstumsfaktoren und Neurotransmitter reguliert. Man nimmt an, daß die PI abhängigen Botenstoffe an der Regulation wichtiger Zellfunktionen, wie etwa der Zellproliferation, der Sekretion von Zellinhaltsstoffen, endozytotischen Vorgängen, der gerichteten Bewegung bestimmter Zellen, gesteuerten Veränderungen des Zytoskeletts u. a. Prozessen beteiligt sind. Der physiologischen Bedeutung der PI-Kina sen und Phospholipasen entsprechend korrelieren eine Reihe von Krankheitsbildern mit Veränderungen der Funktionen dieser Enzyme.

Aus verschiedenen experimentellen Ergebnissen kann man schließen, daß das Produkt der durch die PI3-Kinase kataly sierte Reaktion PI, -3,4,5-triphosphat eine wesentliche Rolle bei der Regulation der im folgenden genannten physio logischen Zellfunktionen spielt:

- Regulation der Zellprofileration und -differenzierung durch PI 3-Kinase.

Mitogene, wie Wachstumsfaktoren und Zytokine führen im allgemeinen zu einer Stimulation der PI 3-Kinaseeaktivität in teilungsfähigen Zellen. Auch die onkogene Transformation von Zellen wird vielfach von einer Erhöhung der meßbaren PI 3-Kinase-Aktivität begleitet (Varticovski et al., Biochim. Biophys. Acta 1266, 1-11 (1994), Berggren et al., Cancer Research 53, 4297-4302 (1993), Solid et al., Onco gene 9, 2253-2260 (1994). Inhibitoren der PI 3-Kinase sind in der Lage, das durch PDGF stimulierte Wachstum von norma len Bindegewebszellen oder glatten Muskelzellen und die Proliferation von src-supratransformierten Fibroblasten (Krebszellen) zu hemmen (Berggren et al., Cancer Research 53, 4297-4302 (1993), Vlahos et al., j.Biol.Chem. 269, 5241-5248 (1994)). Berggren et al., vermuten, daß die tumorstatische Wirkung von Ether-Lipidanalogen wesentlich auf deren hemmende Wirkung auf die PI 3-Kinase beruht.

Die Differenzierung der Nervenzellinie PC12 wird durch den Hemmstoff der PI 3-Kinase Wortmannin unterdrückt (Kimurea et al., j.Biol.Chem. 269, 18961-18967 (1994)). Diese Be funde wie auch eine klinische Studie, bei der ein selekti ver Verlust von PI 3-Kinase-Aktivät im Hirn von Alzheimer patienten nachgewiesen wurde (Bothmer et al., Dementia 5, 6-11 (1994)), deuten auf eine wesentliche Funktion des Enzyms bei der Ausbildung und Erhaltung von Nervengewebe hin.

- Regulation von Zytoskelett-abhängigen Prozessen durch PI 3-Kinase.

Mikroskopisch sichtbare Veränderungen von Zellen verlaufen häufig unter Beteiligung des Zytoskeletts. Eine Reihe von Ergebnissen zeigen, daß solche Vorgänge zumindest zum Teil durch PI 3-Kinase und deren enzymatische Produkte (PI3,4,5,P₃, PI3, 4P₂ und PI3P) gesteuert werden. So kann das durch Insulin oder PDGF induzierte "membrane ruffling" epidermaler Zellen durch den PI 3-Kinase-Inhibitor Wortman nin unterdrückt werden (Kotani et al., EMBO J. 13, 2313-2321 (1994), Wennström et al., Curr.Biol. 4, 385-393 (1994)).

Basophile Leukozyten sind in der Lage, Histamin - einen Mediator von Entzündungen und allergischen Erscheinungen - auszuschütten. Dieser Sekretionsprozeß verläuft unter Beteiligung des Zytoskeletts der Zellen. Yano et al., J. Biol.Chem. 268, 25846-25856 (1993) konnten nachweisen, daß die durch Antikörper induzierte Histaminsekretion wiederum durch den PI 3-Kinase-Inhibitor Wortmannin gehemmt werden kann, also offenbar durch 3-phosphorylierte Phosphoinosi tide gesteuert wird.

- Beteiligung der PI 3-Kinase an intrazellulären Transport prozessen.

Untersuchungen von Hefemutanten zeigen, daß eine Form der PI 3-Kinase (Vps 34) in diesen Organismen an der selektiven Verteilung von Proteinen in Richtung der Hefevacuole betei ligt ist (Schu et al., Science 260, 88-91 (1993)). Ähnliche Mechanismen liegen möglicherweise der durch Insulin stimu lierten Translokation von Glukosetransportprotein (GLUT 4) aus dem Zellinneren zur Plasmamembran zugrunde (Kanai et al., Biochem.Biophys.Res.Commun. 195, 762-768 (1993)). Auch dieser in verschiedenen Organen wichtige Vorgang wird durch Wortmannin inhibiert und läuft offenbar unter Beteiligung von PI 3-Kinase ab.

- Hemmung der O₂⁻-Produktion in neutrophilen Granulozyten.

Mit dem Ziel phagozytierte Fremdzellen zu vernichten produ zieren Granulozyten Superoxidanionen (O₂⁻). Dieser Vorgang wird durch das Chemoattraktanz fMLP stimuliert. Die Bloc kade der fMLP-induzierten O₂⁻-Bildung durch Wortmannin deutet auf die regulatorische Funktion einer PI 3-Kinase-Spezies an diesem für die Immunantwort des Körpers wichti gen Vorgang hin.

Die aufgeführten Ergebnisse weisen auf die zentrale Bedeu tung der PI 3-Kinase und 3-phosphorylierter Inositollipide bei der Regulation wichtiger Zellfunktionen hin. Zweifellos liegen wichtigen Krankheitsbildern erworbene oder ererbte Defekte der genannten Zellfunktionen zugrunde. Beispiele seien genannt: Krebs, Artheriosklerose, Immunopathien, Hautkrankheiten (wie Psoriasis), degenerative Erkrankungen des Nervensystems.

Da die PI 3-Kinase ein essentielles Element bei der Regula tion der aufgeführten Zellfunktionen ist, lassen sich mit hoher Wahrscheinlichkeit einige der Krankheitsbilder auf Fehlfunktionen von PI 3-Kinase-Spezies zurückführen. Die klinische Studie zur PI 3-Kinase im Hirn von Alzheimerpa tienten, die Befunde zur Rolle der PI 3-Kinase bei der Bildung des Allergieinduktors Histamin und auch die kanze rostatische Wirkung der PI 3-Kinase inhibierenden Etherli pide deuten in dieser Richtung.

Es ist ein zentrales Anliegen der Zellbiologie, die Mecha nismen der intrazellulären Signalübertragung und die betei ligten Botenstoffe aufzudecken. Diese Untersuchungen dienen letztlich dem Ziel, Zellfunktionen im medizinischen Sinne selektiv zu beeinflussen.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Identifizierung, Klonierung, Expression und Charakterisierung einer neuen Spezies PI 3-Kinase.

Diese neue Spezies wird durch G-Pro tein-Untereinheiten aktiviert und unterscheidet sich damit von den bisher aus Säugetierzellen klonierten Spezies PI3Kα (Hiles et al., Cell 70 (1992) 419-429) und PI3Kβ (Hu et al., J. Mol.Cell.Biol. 13, (1993), 7677-7688) sowie der PI3K-Vps34 aus Hefe (Schu et al., supra und Herman et al., Cell 64 (1991), 425-438) durch den Regulationsmechanismus. Die funktionellen Unterschiede zwischen den bekannten Enzymen PI3Kα und PI3Kβ einerseits sowie dem erfindungs gemäßen Enzym PI3Kγ andererseits finden ihre Entsprechung in Sequenzunterschieden in den regulatorisch wichtigen Domänen des Enzyms.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Protein mit Phosphatidylinositol-3-Kinase-Aktivität, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, daß es

a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz,
b) die in SEQ ID NO. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder
c) Varianten der Sequenz aus (a) oder (b) umfaßt.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße PI3Kγ ein aus dem Menschen erhältliches Protein, d. h. es ist das in SEQ ID NO. 1 und NO. 2 gezeigte Protein, das in SEQ ID NO. 3 und NO. 4 gezeigte Protein oder eine natürlich vorkommende humane Variante davon.

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein neues Protein, das Teile der in SEQ ID NO. 1 und 2 bzw. SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt. Vorzugsweise be trifft die Erfindung eine PI3K, welches die in SEQ ID NO. 1 und 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder die in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt, es kann jedoch auch Varianten dieser Sequenz enthalten. Unter dem Begriff "Variante" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Sequenzen zu verstehen, die durch Substitution, Deletion oder/und Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Amino säureabschnitte sich von der in SEQ ID NO. 1 und 2 bzw. der in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden.

Unter dem Begriff "Variante" fallen sowohl natürlich vor kommende allelische Variationen der PI3Kγ sowie durch rekombinante DNA-Technologie (insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligo nukleotiden) erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen oder/und immunologischen Aktivität dem in SEQ ID NO. 1 und 2 dargestellten Protein bzw. dem in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Protein im wesentlichen entsprechen.

Erfindungsgemäße Proteine zeichnen sich vorzugsweise da durch aus, daß sie auf Aminosäureebene eine Homologie von mindestens 80%, besonders bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% gegenüber der in SEQ ID NO. 1 und 2 darge stellten Aminosäuresequenz oder der in SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

Die in SEQ ID NO. 1 und 2 gezeigte Aminosäuresequenz stellt eine gesamte PI3Kγ dar. Dieses Protein weist 1049 Amino säuren auf und besitzt eine Molekularmasse von ca. 120 kDa. Die in SEQ ID NO. 3 und 4 gezeigte Aminosäuresequenz stellt eine PI3Kγ mit 1050 Aminosäuren dar.

Die Aminosäuresequenz von PI3Kγ zeigt eine Homologie von 19 bis 39% zu den den Sequenzen anderer bekannter PI3K, wie etwa humane PI3Kα (36% Homologie), humane PI3Kβ (33,5% Homologie) und PI3K-Vps34 aus Hefe (27,7%). Die am höch sten konservierte Region in dieser Gruppe von Enzymen sind die 400 C-terminalen Aminosäurereste, welche vermutlich die Kinasedomäne enthalten. Es gibt keine signifikante Homolo gie zwischen PI3Kγ und den anderen Enzymen in der Amino terminalen Region, von der man weiß, daß sie für die Bin dung von PI3Kα und β-Enzymuntereinheiten an die regulatori schen und adaptorischen Untereinheiten p85α und p85β ver antwortlich sind (Dhand et al., EMBO J. 13 (1994), 511-521).

PI3Kγ kann in der Zelle durch Immunpräzipation und Western-Blot-Analyse von U937 und K562 Zellen als 110 kDa Protein unter Verwendung von Antipeptid-Antiseren nachgewiesen werden. Eine Northern-Blot-Analyse zeigte eine 5,3 kb lange mRNA in mehreren unterschiedlichen Gewebearten.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Phospatidylino sitol-3-Kinase oder Teile davon kodiert. Diese Nucleinsäure kann z. B. genomische DNA, cDNA oder RNA sein. Vorzugsweise handelt es sich um ein rekombinantes DNA-Molekül.

Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist eine Nucleinsäu re, welche

a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte kodierende Sequenz,
b) die in SEQ ID NO. 3 dargestellte kodierende Sequenz,
c) eine der Sequenz aus (a) oder (b) im Rahmen der Degne ration des genetischen Codes entsprechende Nucleinsäu resequenz oder
d) eine mit den Sequenzen aus (a), (b) und/und (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisierende Sequenz enthält.

Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man, daß eine Hybridisie rung auch nach Waschen bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C, besonders bevorzugt bei 68°C in einem wäßrigen Niedrig salz-Puffer (z. B. 0,2 × SSC, 0,1% SDS) noch auftritt (siehe auch Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual).

Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, die einen minde stens 20 Nucleotide langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 3 dargestellten Sequenz enthalten. Vorzugs weise besitzt dieser Abschnitt eine für die PI3Kγ-spezi fische Nucleotidsequenz. Diese Nucleinsäuren eignen sich insbesondere zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense-Nucleinsäuren, die vorzugsweise bis zu 50 Nucleo tide lang sind.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Kopie einer erfindungsgemäßen Nuclein säure oder einen Teil davon enthält. Der Vektor kann in Eukaryonten oder Prokaryonten replizierbar sein. Er kann ein in das Genom der Wirtszelle integrierbarer Vektor, z. B. Bakteriophage Lambda, oder ein Vektor sein, der extrachro mosomal vorliegt (z. B. ein Plasmid). Der erfindungsgemäße Vektor kann durch Subklonierung der PI3Kγ DNA in einen Basisvektor erhalten werden. Derartige Basisvektoren, insbesondere Vektoren mit den zur Proteinexpression erfor derlichen Elementen sind einem Fachmann geläufig.

Bei Klonierung einer für PI3Kγ kodierenden Nucleinsäure kann ein Expressionsvektor hergestellt werden, der in einer geeigneten Wirtszelle zur Expression gebracht wird, wobei das erfindungsgemäße Protein entsteht. Bevorzugte Wirts zellen sind Mikroorganismen wie E. coli oder Hefe, aber auch höhere Zellen (z. B. Säuger- oder Insektenzellen). Bevorzugte Expressionsvektoren sind z. B. Plasmide, Bakte riophage Lambda für Prokaryonten, Hefevektoren oder virale Vektoren für höhere Zellen (z. B. SV40, Vaccinia, Baculovi ren). Bezüglich der Expression einer für PI3Kγ kodierten Nucleinsäure soll insbesondere auf die bei Sambrook et al. (1989), supra genannten Methoden verwiesen werden.

Ein spezifisches Beispiel für ein zur Expression von PI3Kγ geeignetes System ist die Expression als GST-Fusionsprotein in Sf9-Insektenzellen unter Verwendung von Baculovektoren gemäß der bei Davis et al. (Biotechnology 11 (1993), 933-936) beschriebenen Methode.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryontische als auch eine prokaryon tische Zelle sein. Verfahren zur Transformation von Zellen mit Nucleinsäuren sind allgemeiner Stand der Technik und brauchen daher nicht näher erläutert werden.

Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des PI3Kγ Proteins oder Fragmenten dieses Pro teins als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständi gen PI3Kγ Protein oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfol gen. Nach der Methode von Köhler und Milstein oder deren Weiterentwicklungen können aus den Antikörper-produzieren den Zellen der Versuchstiere auf bekannte Weise durch Zell fusion monoklonale Antikörper erhalten werden. Ebenso können humane monoklonale Antikörper hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung des Proteins zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein Protein mit Phosphatidylino sitol-3-Kinase-Aktivität, der für Phosphatidylinositol-3-Kinase-γ spezifisch ist und keine Kreuzreaktion mit anderen Phosphatidylinositol-3-Kinasen zeigt. Ein solcher Antikör per ist beispielsweise durch Verwendung einer PI3Kγ-spezi fischen Peptidsequenz als Immunogen erhältlich, z. B. einer Peptidsequenz, die aus den Aminosäuren 741 bis 755 der in SEQ ID NO. 1 und 2 darstellten Aminosäuresequenz bzw. den Aminosäuren 742 bis 756 der in SEQ ID NO. 3 und 4 darge stellten Aminosäuresequenz entspricht.

Die Bereitstellung der PI3 Kinase γ, einer dafür kodieren den Nucleinsäure und eines dagegen gerichteten Antikörpers schafft die Voraussetzung für eine gezielte Suche nach Effektoren dieses Proteins. Angriffspunkt für diese Sub stanzen sollten die regulatorischen Domänen des Enzyms sein, die sich im Bereich der Aminosäurereste 1 bis 700 der in SEQ ID NO. 1 und 2 bzw. SEQ ID NO. 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenzen befinden. Stoffe, die über diese Region des Proteins inhibitorisch oder aktivierend auf die Aktivi tät wirken, sind in der Lage, durch PI3Kγ-gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder eingesetzt werden. Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall der PI3Kγ zurückzuführen sind, könnte eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für PI3Kγ-kodierenden Nucleinsäure, ggf. zusammen mit einer Nucleinsäure, welche für die aktivierenden G-Proteine kodiert, mittels Vektoren, z. B. viralen Vektoren in das entsprechende Zielgewebe umfaßt.

Die vorgestellten Ergebnisse schaffen überdies die Voraus setzungen für eine gezielte Diagnostik von Krankheiten, die mit Veränderungen der PI3Kγ-Aktivität ursächlich verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nucleinsäuresonden zum Nachweis auf DNA-Ebene, d. h. auf Gen- bzw. Transkriptebene oder mit Hilfe von Antikörpern gegen PI3Kγ zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch eine pharma zeutische Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil ein PI3Kγ-Protein, einen dagegen gerichteten Antikörper oder einen dafür kodierende Nucleinsäure, ggf. zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs-, Träger-, Füll- und Ver dünnungsmitteln umfaßt.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann insbesondere zur Beeinflussung der Zellproliferation, der Rezeptor-vermittelten Signalübertragung, der Struktur der Zellmembran, der Ausschüttung von Histaminen, der Differen zierung von Nervenzellen, dem Glucosetransport und der Antilipolyse verwendet werden. Weiterhin ist eine Verwen dung im Zusammenhang mit der Therapie der Alzheimerschen Krankheit möglich.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, Abbildun gen und Sequenzprotokolle näher erläutert. Es zeigen:

Abb. 1 den Nachweis von PI3Kγ in humanen Blutzellen über spezifische Antikörper,

Abb. 2a die rekombinante Expression von PI3Kγ in Insek tenzellen,

Abb. 2b den Nachweis der enzymatischen Aktivität von gereinigter rekombinanter PI3Kγ,

Abb. 3 die fehlende Wechselwirkung von PI3Kγ mit den Proteinen p85α und p85β,

SEQ ID NO. 1 eine Nucleinsäuresequenz, die eine für PI3Kγ kodierende genetische Information enthält und

SEQ ID NO. 2 die Aminosäuresequenz einer PI3Kγ.

SEQ ID NO. 3 eine Nucleinsäuresequenz, die eine für eine weitere PI3Kγ kodierende genetische Information enthält und

SEQ ID NO. 4 die Aminosäuresequenz einer weiteren PI3Kγ.

Beispiel 1 Isolierung der PI3Kγ cDNA

Zur Isolierung von cDNA Sequenzen, die für neue PI3K kodie ren, wurde eine humane Knochenmark-cDNA-Bank unter Ver wendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchmustert. Hierbei wurden degenerierte Oligonucleotidprimer entspre chend den Aminosäuresequenzen KNGDDLR und HIDFG verwendet. Es wurde ein 402 bp langes DNA Fragment erhalten. Dieses Fragment wurde subkloniert und sequenziert.

Unter Verwendung dieses PCR-Fragments als Sonde wurden mehrere überlappende Klone aus einer humanen U937 cDNA-Bank isoliert. Der größte Klon enthielt die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz mit einem offenen Lese rahmen, der für ein Protein mit 1049 Aminosäuren kodiert (SEQ ID NO. 2). Dieses als PI3Kγ bezeichnete Protein hat eine Molekularmasse von ungefähr 120 kDa.

Eine weitere PI3Kγ-Sequenz, die aus einer cDNA-Bank erhal ten wurde, ist in SEQ ID NO. 3 dargestellt und kodiert für ein Protein mit 1050 Aminosäuren (SEQ ID NO. 4).

Beispiel 2 Nachweis von PI3Kγ auf Protein- und Transkriptebene

Es wurde ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen PI3Kγ durch Immunisierung mit einem 15 Aminosäuren langen Peptid der Sequenz NSQLPESFRVPYDPG (entsprechend den Aminosäuren 741 bis 755 in SEQ ID NO. 2 bzw. den Aminosäuren 742 bis 756 in SEQ ID NO. 4) hergestellt. Das Serum wurde durch Protein A Chromatographie und Affinitätschromatographie unter Verwendung des an Actigel (Sterogene) gekoppelten Peptidantigens gereinigt.

PI3Kγ kann durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Ana lyse von U937 und K562 Zellen als 110kDa Protein unter Verwendung dieses Antiserums nachgewiesen werden (Abb. 1). Die Immunpräzipitation und der Western-Blot wurden nach der Methode von Hiles et al. (Cell 70 (1992) 419-429) durch geführt. Als sekundärer Antikörper wurde ein Konjugat aus Meerrettich-Peroxidase und Anti-Kaninchen-Antiserum (Sigma, 1 : 2000 Verdünnung) verwendet. Die gebundene Peroxidase wurde durch Chemilumineszenz sichtbar gemacht.

Eine Northern-Blot-Analyse von menschlichem Gewebe aus Pankreas, Niere, Skelettmuskel, Leber, Lunge, Placenta, Gehirn und Herz zeigte jeweils unterschiedliche Konzen trationen einer 5,3 kb-langen mRNA.

Beispiel 3 Rekombinante Expression von PI3Kγ

Die für PI3Kγ-kodierende DNA wurde in den Vektor pAcG2T (Davis et al., Biotechnology 11 (1993), 933-936) kloniert. Der resultierende rekombinante Vektor pAcG2T-PI3Kγ enthielt die PI3Kγ-cDNA ab Codon 4 in Fusion mit dem Glutathion S Transferase (GST) Gen. Sf9-Zellen wurden mit pAcG2T-PI3Kγ und linearisierter Baculovirus-DNA (BaculoGold, Pharmingen) cotransfiziert. Einzelne rekombinante Baculovirus GST-PI3Kγ Plaques wurden gereinigt und amplifiziert. Die Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins wurden unter Verwendung von Standardprotokollen (Dhand et al., EMBO J. 13 (1994), 511-521) durchgeführt. Abb. 2a zeigt die Expression von rekombinantem PI3Kγ GST-Fusionsprotein oder GST alleine nach Fraktionierung auf einen SDS Polyacryl amidgel. Der Nachweis erfolgte durch Anfärbung mit Coomassie blau.

Abb. 2b zeigt einen Nachweis der enzymatischen Aktivi tät von gereinigter rekombinanter PI3Kγ. Als Substrate wurden Phosphatidylinositol (PI, Spur 1), Phosphatidylino sitol-4-Phosphat (PI4-P, Spur 2) und Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PI 4,5-P₂, Spur 3) verwendet. Die Durch führung des Tests wurde im wesentlichen nach der Methode von Stephens et al. (Cell 77 (1994), 83-93) aber ohne Cholat durchgeführt. Es wurden 30 µm sonifizierte Lipidve sikel mit 320 µM Phosphatidylethanolamin, 140 µM Phosphati dylcholin, 300 µM Phosphatidylserin, 30 µM Sphingomyelin und 320 µM Substrat zu 10 µl Enzym (0,1 ng) gegeben und 8 Minuten lang auf Eis inkubiert. Der Test wurde durch Zugabe 10 µl 20 µM ATP mit 10 µCi γ(³²P)ATP gestartet und 15 Minu ten bei Raumtemperatur inkubiert. Die extrahierten Lipide wurden aufgetrennt und sichtbar gemacht. Die Identität der 3-phosphorylierten Phosphoinositide wurde durch Anionen austauscher-HPLC nach Deacylierung der Lipide bestätigt (Auger et al., Cell 57 (1989), 167-175).

Abb. 2b zeigt, daß die Substrate in der D-3 Position des Inositolrings phosphoryliert wurden. Weiterhin wurde gefunden, daß PI3Kγ durch Wortmannin bei nanomolaren Kon zentrationen inhibiert wurde.

Beispiel 4 Regulation von PI3Kγ

Um eine Wechselwirkung zwischen den regulatorischen und adaptorischen Untereinheiten von p85 (p85α bzw. p85β) mit PI3Kγ nachzuweisen, wurden humane PI3Kγ und Rinder PI3Kα (Hiles et al., supra) nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren als GST-Fusionsproteine entweder alleine oder zusammen mit p85α oder p85β in Sf9-Insektenzellen expri miert. Nach Lyse und Zentrifugation der Zellen wurde Glu tathion-Sepharose zum Überstand gegeben, um die GST-Fus ionsproteine zu binden. Die Körner wurden gewaschen und durch SDS-PAGE und Western-Blot analysiert. Der Nachweis von PI3Kγ erfolgte unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen polyklonalen Antipeptid-Antikörper. Zum Nachweis von p85α, p85β und Rinder PI3Kα wurden entspre chende Mischungen spezifischer monoklonaler Antikörper (Dhand et al., supra) als primäre Antikörper und Konjugate von Meerrettich-Peroxidase und Anti-Maus-Antikörpern (Dia nova, 1 : 4000 Verdünnung) als sekundäre Antikörper verwen det.

Aus Abb. 3 ist ersichtlich, daß PI3Kγ im Gegensatz zu PI3Kα nicht an p85α oder p85β Untereinheiten bindet. PI3Kγ unterscheidet sich daher im Regulationsmechanismus von PI3Kγ.

Um eine Wechselwirkung zwischen PI3Kγ und G-Proteinen nachzuweisen, wurden gereinigte rekombinante humane PI3Kγ und Rinder PI3Kα mit der Transducinspezies G_tβγ inkubiert. Es wurde hierbei eine deutliche Verstärkung der Kinase-Aktivität von PI3Kγ gefunden. Diese Stimulation konnte durch Zusatz von GDP-beladenem G_tα unterdrückt werden, wodurch die Spezifität der Wechselwirkung bestätigt wurde. Die enzymatische Aktivität von PI3Kα konnte hingegen nicht durch Zusatz von G_tβγ stimuliert werden. Eine ähnliche Aktivierung des Enzyms wurde nach Zugabe von Gα in Anwesen heit von 20 µM AlCl₃ und 10 mM NaF gefunden. Als aktivie rende Spezies wirkt der Komplex Gα-GDP-AIF₄⁻.

Die Aktivitätsbestimmung erfolgte wie in Beispiel 3 be schrieben. Die aus Rinderretina nach der Methode von Camps et al. (Nature 360 (1992) 684-686) gereinigten G_t-Proteine wurden mit den Lipidvesikeln für 5 min (G_tβγ) oder 20 min (G_tβγ plus G_tα-GDP) auf Eis inkubiert, bevor das Enzym zugegeben wurde.

Bindungsstudien mit der rekombinanten PI3Kγ zeigen, daß das Regulatorprotein Ras in seiner aktiven GTP-beladenen Form mit dem Enzym assoziiert. Ras ist in seiner konstitutiv aktiven Version in der Lage, Zellen onkogen zu transformie ren. Damit ergibt sich ein weiterer Hinweis für die poten tielle Bedeutung von PI3Kγ bei der Regulation der zellulä ren Proliferation.

Claims

1. Protein mit Phosphatidylinositol-3-Kinase-Aktivität dadurch gekennzeichnet, daß es

(a) die in SEQ ID NO. 2 dargestellte Aminosäuresequenz,
(b) die in SEQ ID NO. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder
(c) Varianten der Sequenz aus (a) oder (b) umfaßt, wobei SEQ ID NO. 2 und NO. 4 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Menschen erhältlich ist.

3. Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine Phosphatidylinositol-3-Kinase nach Anspruch 1 oder 2 kodiert.

4. Nucleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein rekombinantes DNA-Molekül ist.

5. Nucleinsäure nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(a) die in SEQ ID NO. 1 dargestellte Protein-kodierende Sequenz,
(b) die in SEQ ID NO. 3 dargestellte Protein-kodierende Sequenz,
(c) eine der Sequenz aus (a) oder (b) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nucleinsäuresequenz oder
(d) eine mit den Sequenzen aus (a), (b) oder/und (c) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisierende Sequenz enthält, wobei SEQ ID NO. 1 und NO. 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

6. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen mindestens 20 Nucleotide langen Abschnitt der in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 3 dargestellten Sequenz enthält, wobei SEQ ID NO. 1 und NO. 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

7. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 6 enthält.

8. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.

9. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 oder von Fragmenten dieses Proteins als Immunogen zur Her stellung von Antikörpern.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper für PI3Kγ-spezifisch ist und keine Kreuzreaktion mit anderen Phosphatidylinositol-3-Kinasen zeigt.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen eine Peptidsequenz gerichtet ist, die den Aminosäuren 741-745 der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. den Aminosäuren 742-746 der in SEQ ID NO. 4 dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, wobei SEQ ID NO. 2 und NO. 4 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

12. Verwendung einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Herstellung eines Mittels für die Gentherapie.

14. Verwendung einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 7 zur Bestimmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase-Aktivität in Zellen, insbesondere von humanen Zellen.

15. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.

16. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase-Aktivität in Zellen, insbesondere von humanen Zellen.