KR100782607B1 - 베타,베타-카로틴 15,15'-디옥시게나제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 그의 진단학적 용도, 비타민 A의 합성 방법 및 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA를 숙주 세포에 도입시키는 방법에 관한 것이다.

Description

베타,베타-카로틴 15,15'-디옥시게나제{BETA,BETA-CAROTENE 15,15'-DIOXYGENASES}

도 1은 병아리 소장으로부터 수득한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 마지막 정제 단계의 결과를 도시한 것이다. 겔(gel) 투과 크로마토그래피 분석으로부터 수득한 개별 분획물의 SDS-PAGE 패턴 및 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성이 도시되어 있다. 겔상에서, 화살표로 지시된 단백질 A가 가장 높은 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성과 상관이 있는 것으로 생각된다. 따라서 이 단백질 A를 선택하여 이후의 아미노산 서열 분석에 사용하였다. 사용된 약어는 다음의 의미를 갖는다: std, 분자량 표준물질; conc, 겔 투과 크로마토그래피 칼럼상에 충진된 농축물.

도 2는 진핵 세포에서의 전사활성화(transactivation) 분석을 도식적으로 나타낸 것이다. cDNA는 MCF-7 세포를 형질감염시켜 MCF-7 세포에서 발현된다. 이 세포를 β-카로틴과 함께 배양할 때, 양성 풀(pool)은 절단 활성을 나타낸다. 절단된 산물인 레티날은 이후에 산화되어 레틴산(RA)이 되고, 이 레틴산은 내인성 수용체에 결합한다. 수용체/리간드 착체는 리포터 플라스미드상의 반응 요소에 결합하여 루시페라제 유전자의 전사를 증가시킨다. 고감도 CCD 카메라로 발광 신호를 감지하여 루시페라제를 분석한다.

도 3a 내지 3d는 폴리 A 테일(poly A tail)을 제외한 3090개의 염기쌍 길이를 갖는 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 cDNA 서열(서열번호:2)을 도시한 것이다. 132개의 염기쌍은 5'-비해독 서열이고, 다음 1578개의 염기쌍은 암호화 서열이며, 그다음 1380개의 염기쌍은 3'-비해독 서열이다. 추정적인 폴리 A 신호는 3073번 위치에서 찾아볼 수 있다.

도 4는 526개의 잔기를 갖는, 병아리로부터 유래한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 유도된 아미노산 서열(서열번호:1)을 도시한 것이다. 아미노산 서열은 1문자 기호로 나타나 있다.

도 5a 및 5b는 EMBL 진뱅크(Genbank)에서 서열 비교 결과 본 발명의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제와 가장 높은 상동성을 갖는 단백질로 밝혀진 RPE65 명칭의 단백질의 서열(서열번호:5)과 본 발명의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 아미노산 서열(서열번호:4)을 비교한 것이다.

도 6은 이 콜라이(E. coli)에서 발현된 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 친화성 태그(tag) 정제를 실시한 후에 10% 폴리아크릴아미드 겔로 분석한 결과를 도시한 것이다. 래인(lane) 1과 래인 2는 각각 60kD에서 주요 밴드(band)를 나타내는, Co²⁺-킬레이트(chelate) 칼럼으로부터 용리한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 2가지 분획물이고, 래인 3은 좁은 범위 분자량 표지(바이오-라드(Bio-Rad))이다.

도 7은 이 콜라이에서 클로닝(cloning)되고 발현된 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 활성을 실시예 1에서의 절차를 따라 분석한 후, 그 반응 혼합물의 HPLC 프로파일(profile)을 도시한 것이다. 크로마토그램에서의 제 1 피크(peak)는 내부 표준을 나타내고, 제 2 피크는 기질인 β-카로틴의 중심부 절단으로 형성된 유일한 산물인 레티날에 상응한다.

도 8은 도 7에서 효소적 절단의 유일한 산물을 나타내는 피크가 실제 레티날임을 증명하는 자료이다. 활성 분석(녹색 크로마토그램)에서 양성으로 나타난 시료에 레티날을 첨가하고 2차 HPLC 분석을 행하였다(적색 크로마토그램). 그다음 2회의 크로마토그램을 겹쳐 놓았다.

본 발명은 β-카로틴을 절단시켜 비타민 A를 생성시키는 작용을 담당하는 효소인 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제(EC 1.13.11.21)의 클로닝에 관한 것이다. 본 발명에 정의된 바와 같은 비타민 A란 용어는 레티날, 레티놀, 3-디하이드로레티놀, 레틴산, 이들 화합물의 이성질체 및 레티닐에스테르를 포함한다. 따라서 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성을 갖는 단백질 및 그를 암호화하는 핵산 서열은 진단학 분야, 비타민 A의 공학적 제조 분야, 과일과 야채에서 비타민 A를 제조하기 위한 유전자변형 식물 제조 분야, 또는 유전자 치료 분야를 포함하는 다양한 분야에 사용될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.

비타민 A는 인간과 동물에게 필수 비타민이며, 식물, 광합성 작용 미생물 및 일부 기타 미생물에서만 자체적으로 생성될 수 있는 전구체 카로티노이드로부터 대부분의 유기체에서 대량 형성된다. 인간과 대부분의 동물(특히 초식동물과 잡식동물)은 또한 소위 프로비타민 A로 지칭되는 상기 카로티노이드를 효소적으로 비타민 A로 전환시킬 수 있다. 이 경우에 가장 중요한 효소는 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제(EC 1.13.11.21)이다. 이 효소는 세포질에 위치하며, 하기 반응식 1에 따라 산소의 존재하에 주요 기질인 β-카로틴으로부터 레티날을 생성시킨다:

β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 효소는 1몰의 β-카로틴을 중심부 절단시켜 2몰의 레티날을 생성시킴을 특징으로 한다. 그러나 이 효소는 또한 이하에 나타낸 바와 같이, 광범위한 카로티노이드를 비타민 A-활성 화합물로 전환시킬 수 있다:

공지된 가장 높은 효소 활성은 초식동물의 소장, 특히 십이지장에서 발견된다. 간, 폐, 신장 및 뇌와 같은 다른 조직에서도 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제가 검출된다. 1955년 이래로 생화학적 방법에 의해 효소를 정제하고 특징을 분석하려는 시도가 많이 이루어져 왔다(굿만(Goodman)의 문헌[1965 및 1966], 핏지(Fidge)의 문헌[1969], 락스마난(Laksmanan)의 문헌[1972], 샤르마(Sharma)의 문헌[1977] 및 데베리(Devery) 및 밀보로우(Milborrow)의 문헌[British Journal of Nutition, 72, 397-414, 1994] 참조). 그러나, 이러한 시도들은 모두 성공적이지 않았다. 형성된 레티날의 비활성을 600pmol/h/㎎ 단백질 이상 더 증가시키지 못하였다.

본 발명의 목적은 서열번호:1(도 4에 도시됨)과 동일하거나 60% 이상 상동인 아미노산 서열을 포함하는, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 비타민 A 생성 활 성을 갖는 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명에서 부분적인 아미노산 서열을 수득할 수 있을 정도로 병아리에서의 상기 효소를 정제할 수 있었다. 이 효소는 이전의 효소 활성에 비해 226배나 증가한 2500pmol/h/mg의 비활성을 나타내었다. 최종 겔 침투 분석에서 수득한 분획물은 폴리아크릴아미드 겔상에서 코마시 블루(Coomassie blue) 염색 후에 15개의 밴드를 나타내었다. 2개의 밴드가 효소 활성 프로파일과 관련되었다. 첫 번째 단백질은 에드만(Edman) 서열 분석법을 실시하였고, 두 번째 단백질은 질량(MS) 분광학을 실시하였다. 두 번째 단백질을 트립신으로 겔중에서 분해한 후, MALDI-TOF MS 및 자동화 에드만 분해 방법과 함께 마이크로보어(microbore) RP-HPLC 펩타이드 매핑(mapping)으로 분석하여 각각 11개의 아미노산 및 18개의 아미노산으로 이루어진 2개의 펩타이드로 이루어졌음이 확인되었다. 상기 서열 정보로부터 중합효소 연쇄 반응(PCR)용 변성 프라이머(degenerate primer)를 설계하고 합성하였다.

PCR 프로토콜(protocol)을 사용하여 51 bp(염기쌍) 단편을 더 긴 펩타이드내에서 증폭시켰다. 상기 서열로부터 상동 프라이머를 합성하고 제 2 RT-PCR(역전사효소-PCR)을 수행하여 597 bp의 단편을 증폭시켰다.

β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하기 위해, 상기 cDNA 단편을 방사선활성 표지하고 사용하여 병아리 발현 라이브러리(library)로부터의 2개의 양성 풀을 탐색하였다.

양성 풀은 세포적 트랜스액티베이션 분석에서 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성에 대해 탐색한 병아리 십이지장의 cDNA 라이브러리로부터 수득하였다. 이러한 전략으로 몇 개의 양성 cDNA 풀을 확인하였다. 상기 2가지 전략을 조합하여 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 암호화하는 유전자를 성공적으로 클로닝할 수 있었다.

본 발명의 목적은 서열번호:1(도 4에 도시됨)과 동일하거나 상동인 아미노산 서열(이때, 서열번호:1에 대한 상동성 정도는 60% 이상이다)을 포함하는, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 비타민 A를 생성시키는 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것이다.

병아리로부터 분리한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 서열을 수득한 후에는, 돼지, 소, 염소, 개, 토끼, 가금류, 어류 및 인간을 비롯한 여러 동물로부터 상응하는 단백질을 용이하게 수득할 수 있다. 상기 효소의 서열은 공지되어 있으므로, 그 핵산 서열의 적절한 영역을 프라이머로 선택하여 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 쉽고 빠르게 증폭시킬 수 있는 적절한 핵산과 함께 중합효소 연쇄 반응에 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 서열번호:1로 나타낸 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 서열번호:1에 상동인 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 그러나, 상동성 정도는 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이다. 본 발명에 정의된 바와 같은 상동성이란, 2개의 단백질의 아미노산 서열을 나란히 정렬시킬 때 적어도 상기 % 만큼 동일함을 의미한다. 아미노산의 정렬은 상업적으로 구입가능한 적절한 컴퓨터 프로그램, 바람직하게는 위스콘신 시퀀스 어날리시스 팩키지 GCG(Wisconsin Sequence Analysis Package GCG)(버전(version) 9.1, 1997, 미국 매디슨 소재의 유니버시티 리서치 파크(University Research Park), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))의 보조를 받아 수행할 수 있다. 나머지 아미노산은 상이할 수 있다. 예를 들어, 90%의 상동성은 단백질의 아미노산의 90%가 서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열과 동일한 반면, 10%의 아미노산은 상이할 수 있음을 의미하는 것이다. 그러나, 본 발명의 단백질은 보다 자세히 전술한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 생물학적 활성을 갖는다. 상기 단백질은 병아리로부터 유래한다. 바람직하게는, 다른 포유동물 또는 인간으로부터 유래한 단백질도 본 발명의 범주내에 존재한다.

본 발명의 또다른 양태는 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 관한 것이다. 병아리로부터 유래한 효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호:2(도 3a 내지 3d에 도시됨)에 나타나 있다. 본 발명의 핵산 서열은 본 발명의 단백질 또는 그의 일부를 암호화한다. PCR에 적합한 짧은 뉴클레오티드 서열은 20개 이상의 염기, 바람직하게는 25개의 염기, 가장 바람직하게는 30개 이상의 염기의 길이를 갖는다.

본 발명의 핵산 서열은 바람직하게는 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 암호화하는 유전자 또는 그의 일부를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 프라이머는 또한 전술한 cDNA의 5' 비해독 서열 또는 3' 비해독 서열을 특이적으로 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA의 핵산 서열을 암호화 영역 및 비암호화 영역 또는 이들의 일부를 검출 하기 위한 탐침으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 바람직하게는 원위치 혼성화(in situ hybridization)를 위한 안티센스(antisense) RNA 탐침으로서 사용할 수 있다.

특히 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 암호화 유전자/mRNA를 증폭시키고/시키거나 검출하기 위해 사용할 수 있는 테스트키트(testkit)에서의 프라이머 및/또는 탐침으로서, 서열번호:2에 나타낸 서열의 일부를 갖는 프라이머 및 탐침을 사용하는 것이 바람직하다. 핵산 서열의 적절한 부분은 당해 분야의 숙련자라면 어려움없이 선택할 수 있다. 프라이머 또는 탐침으로 사용된 핵산 서열은 일반적으로 상기 단백질내에서 고도로 보존된 영역으로부터 선택된다. "보존된"이란 상이한 종으로부터 수득된 단백질 영역의 핵산 서열이 매우 유사함을 의미한다. 다른 한 편으로, 바람직하게는 상기 선택된 핵산 서열은 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 암호화하지 않는 다른 핵산 서열에는 존재하지 않아야 하는데, 이는 잘못된 양성 결과를 야기할 수 있기 때문이다. 상이한 종으로부터 유래한 몇 가지 서열을 나란히 정렬시킴으로써, 상기 영역을 용이하게 결정할 수 있다. 핵산은 리보핵산 또는 안티센스 리보핵산일 수 있으며, 디옥시리보핵산이 더욱 바람직하다.

바람직한 진단학적 용도는 환자의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 측정하는 것이다. 개체군 사이의 β-카로틴 절단 능력은 매우 다양하다. 낮은 수준의 디옥시게나제를 가져서(예를 들어, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 유전자에서 돌연변이가 일어나거나 다형화현상이 일어난 결과로) 비타민 A 보충이 필요한 인간을 확인하고 선별할 수 있다.

PCR에 기초한 진단 키트는 디옥시게나제 유전자에서 빈번한 돌연변이를 검출하기 위해 고안될 수 있다. 또다른 진단 선택사항은 RT-PCR로 mRNA를 정량화하는 것이다. 이러한 진단 도구를 사용하여 여러 조직 및 상이한 종에서의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 발현 차이를 밝혀낼 수 있다.

발현된 단백질 및 이 단백질을 정제하는 방법을 하기 실시예에서 자세하게 기술하였으므로, 당해 분야의 숙련자는 아미노산 서열로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드를 사용하여 이 단백질과 특이적으로 반응하는 항체를 제조할 수 있다. 토끼, 양 또는 염소와 같은 실험 동물을 바람직하게는 쾰러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[European Journal of Immunology, 6(7), 511-519, 1976]에 기술된 널리 공지된 기법에 의해 보조제 또는 단일클론 항체로 면역시킴으로써 다형클론 항체를 제조할 수 있다. 항체는 비특이적 교차반응을 피하기 위해 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제와 특이적으로 반응하여야 한다. 이는 본 발명의 항체가 바람직하게는 본 발명의 단백질에만 존재하는 에피토프와 반응하여야 함을 의미한다.

이러한 항체는 바람직하게는 시험 유체중의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 검출하고/하거나 정량하기 위한 면역분석법에 사용할 수 있다. 시험 유체는 환자로부터 수득한 혈청과 같은 액체일 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지된 몇 가지 유형의 면역분석법이 존재한다. 대부분의 면역분석법에 항체, 바람직하게는 단일클론 항체는 고체상으로 고정된다. 그다음 이 항체를 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 함유하는 유체와 접촉시키고, 세척한 후에 상기 효소의 다른 에피토프와 결합하는 제 2 단일클론 항체와 추가로 반응시킨다. 제 2 항체는 일반적으로 표지되어 항원 및 2개의 상이한 항체로 구성된 샌드위치 형체의 존재를 보여준다.

항체는 또한 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 면역-침전법과 같은 실험 방법에 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 항체는 면역조직화학에 사용되어 임의의 목표 종의 삽입되거나 고정된 조직 또는 세포에서의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 에피토프를 검출할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제는 비타민 A의 제조에 사용된다. 이 경우 β-카로틴이 상기 효소에 의해 효소적으로 절단되어 2분자의 레티날이 생성되고, 이어서 레티날이 레티놀 디하이드로게나제에 의해 비타민 A로 환원된다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제는 식물 원료로부터 수득될 수 있는 β-카로틴을 효소적으로 전환시키기 위해 사용될 수 있다. β-카로틴의 바람직한 출처는 β-카로틴의 높은 내부 수준을 갖는 조류 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil)이다. 적절한 조류를 편리하게 생육시킬 수 있으며, β-카로틴을 그로부터 비교적 저비용으로 정제할 수 있다. 카로틴은 본 발명의 단백질을 사용하여 효소적으로 편리하게 절단시킬 수 있다. 카로틴 디옥시게나제는 바람직하게는 고정되어 연속식 방법으로 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 적절한 숙주 세포에 도입시키는 것에 관한 것이다. 이러한 방법의 제 1 단계는 일반적으로 cDNA를 적절한 벡터에 삽입시키는 것이다. 벡터는 유전자가 도입될 숙주 세포에 부합되는 것이어야 한다. 상기 숙주 세포는 식물세포, 원핵 세포, 효모 세포 또는 다른 진균류, 조류, 및 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포를 포함할 수 있으며, 식물 세포, 박테리아, 효모, 곤충 세포, 조류 또는 포유동물 세포에 대해 사용가능한 특이적인 벡터가 존재한다. 바람직하게는 상기 유전자는 프로모터(promotor), 인핸서(enhancer), 리보솜(ribosome) 결합 부위 등과 같은 필요한 유전자 조절 구성물들이 제공된 유전자 구조물과 결합된다.

원핵 세포, 특히 이 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 플라보박터(Flavobacter), 및 진핵 세포, 예를 들어 진균류에서 카로티노이드 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현 시스템은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허 공개공보 제 EP 747 483 호 또는 제 EP 872 554 호에 기술되어 있다.

제 2 단계는 목표 유전자 및 기타 필요한 유전자 구조물을 갖는 벡터를 형질전환, 형질감염, 전기충격법(electroporation) 또는 유전자총과 같은 널리 공지된 방법에 의해 적절한 숙주 세포에 도입시킨다. 숙주 세포에 따라서 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자를 숙주 세포의 게놈(genome)에 안정하게 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다. 그다음 이러한 방법에 의해 수득된 세포를 이후에 증식시키고, 세포가 식물 세포인 경우 이로부터 유전자변형 식물을 제조할 수 있다. 상기 숙주 세포는 다른 종으로부터 수득된 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포는 식물 세포이고, 토마토 세포가 특히 바람직하다. 유전자변형 토마토를 생산하는 기술은 잘 확립되어 있으며, 이러한 토마토는 충분한 β-카로틴을 함유하므로 카로틴 디옥시게나제가 토마토 식물로 도입된 후에 양호한 비타민 A 수준을 생산한다. 피망, 멜론 또는 특히 당근은 β-카로틴의 내부 수준이 더 높으므로, 이들 식물도 특히 바람직하다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태는 조류에 관한 것이다. 내염성 조류는 높은 수준의 β-카로틴을 함유할 수 있다. 이러한 조류를 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA를 포함하는 발현 벡터로 형질감염시키면, 높은 세포내 비타민 A 수준을 유도할 수 있으므로, 이러한 비타민 A는 상기 조류로부터 간단한 정제 단계에 의해 쉽게 회수될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자는 포유동물 세포, 특히 인간 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 암호화하는 유전자를 적절한 세포, 예를 들어 말초 혈관 줄기 세포에 삽입시킬 수 있다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 유전자를 함유하는 이러한 세포를 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 유전자에서 돌연변이 또는 결손이 발생한 사람에게 투여할 수 있다. 상기 돌연변이 및 결손으로 인해, 환자는 β-카로틴을 효소적으로 절단시킬 수 없을 것이다. 따라서, 이러한 환자는 항상 비타민 A 수준이 낮아서 다양한 발육상 문제점 및 안과적인 문제점을 겪는다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제를 발현하는 적절히 형질감염된 세포를 체세포 유전자 치료법을 사용하여 상기 환자에게 투여함으로써 이들의 상태를 호전시킬 수 있을 것으로 기대된다.

실시예

실시예 1: β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 활성 분석

본 실험을 위해 하기 용액을 제조하였다:

a) 용액 1(혼합된 마이셀(micelle) 용액): 글리코콜산(1.16g)을 5N NaOH를 적가하고 교반하면서 5㎖ H₂O에 용해시켰다. pH를 아세트산으로 6.8 내지 7.2로 조정한 후에, 부피를 H₂O로 10㎖로 증가시키고 80㎎의 아솔렉틴(플루카(Fluka))을 첨가하여 교반하면서 용해시켰다.

b) 용액 2(기질 용액): 500㎕의 α-토코페롤 용액(헥산내 10㎎/㎖) 및 235㎍의 β-카로틴 용액(벤젠내 순수한 모든-E-β-카로틴 80㎍/㎖)을 빛이 차단된 유리 용기에서 혼합하고, 용매를 온건한 질소 스트림하에서 증발시켰다. 1㎖의 용액 1을 보텍싱(vortexing)하면서 첨가하고, 나중에는 맑은 용액이 수득될 때까지 수 초간 초음파 처리하였다.

c) 용액 3(균질화용 완충액): 4mM의 MgCl₂·6H₂O 및 30mM의 니코틴아미드를 함유하고, 5N KOH을 사용하여 pH 7.8로 조정된 100mM KH₂PO₄.

d) 용액 4(GSH 용액): 용액 3에 용해된 환원된 글루타티온 60㎎/㎖.

e) 용액 5(표준 용액): 헥산/클로로포름(9:1)중의 비타민 A 아세테이트 10㎍/㎖.

활성 분석: 2㎖의 효소 제조액(BCA 단백질 분석법으로 분석시 약 4㎎의 단백질 함유, 피어스 케미칼즈(Pierce Chemicals))을 광차단 유리 용기에 넣고, 이를 진탕 수욕(30분, 37℃)에 넣었다. 0.2㎖의 용액 4를 첨가하고, 2분 후에 온도가 평형에 도달하면 50㎕의 용액 2를 첨가하여 반응을 개시하였다. 3시간 후에, 용기를 얼음에 놓은 후, 1㎖의 아세토니트릴 및 이어서 5㎖의 클로로포름을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 상기 반응 혼합물을 7초간 3회 소용돌이 치게 진탕시키고, 5000g에서 5분간 원심분리하여 상분리를 촉진시켰다. 0.6㎖의 클로로포름을 사용하여 추출을 2회 반복하였다. 수거한 클로로포름 상을 증발시키고, 200㎕의 용액 5에 짧은 초음파 처리를 행하여 재용해시켰다. 불용성 물질을 0.45μm 필터를 통해 여과하여 제거하였다. 20㎕의 분취량을 역상 C₁₈ 칼럼(리크로스퍼(Lichrospher) 100, 5μm, 12.5㎝×4.6㎜, 독일 레온베르크 소재의 비스코프(Bischoff) 크로마토그래피; 1㎖/분, 칼럼 온도 25℃) 상에서 50:20:30(용리액 A) 내지 50:44:6(용리액 B)의 아세토니트릴/테트라하이드로푸란/(H₂O중의 1% 아세트산암모늄)의 불연속식, 최적화된 구배를 사용하여 HPLC로 분리하였다. 이러한 조건에서는 β,β-카로틴 및 레티날 뿐만 아니라 아포-β-카로티날 및 레틴산도 완전히 분리할 수 있다. 2 내지 40ng/㎕ 농도의 β,β-카로틴 및 1 내지 10ng/㎕ 농도의 레티날 둘다의 보정 곡선을 각각 제조하고, 내부 표준으로서 기능하는 비타민 A 아세테이트의 수치와 상관시켰다. 효소 활성은 37℃에서 3시간의 항온처리 동안 활성 분석에서 생성된 레티날의 양으로 표현하였다(100%=17.6nmol).

실시예 2: β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 정제

가능한 빨리 정제하였고, 모든 완충액 및 실험 장치는 4℃로 냉각시켰다.

용액 6(프로테아제 저해제-함유 균질화용 완충액): 125mM 벤즈아미딘·HCl, 250mM의 6-아미노카프르산 및 125μM의 대두 트립신 저해제를 초음파 처리하여 H₂O에 용해시켰다. 상기 용액의 4㎖ 분취량을 100㎖의 용액 3과 혼합하였다.

용액 7: 10mM KH₂PO₄, 1mM 환원된 글루타티온, pH 7.8.

용액 8(용리액 A, 페닐-세파로즈(Sepharose) 크로마토그래피): 10mM KH₂PO₄, 1mM 환원된 글루타티온, 0.5M (NH₄)₂SO₄, pH 7.8.

용액 9(용리액 B, 페닐-세파로즈 크로마토그래피): 10mM KH₂PO₄, 1mM 환원된 글루타티온, 10% 글리세롤, pH 7.8.

용액 10(용리액 B, 포로스(Poros) HQ 크로마토그래피): 10mM KH₂PO₄, 1mM 환원된 글루타티온, 0.5M NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8.

용액 11(겔 투과 크로마토그래피용 용리 완충액): 50mM KH₂PO₄, 1mM 환원된 글루타티온, 150mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8.

20 내지 24주된 산란기의 암탉(뢰만(Lohmann) LSL 종, 스위스 체하-3123 벨프 소재의 하트셰리 부에트리히(Hatchery Wuethrich))을 무색소 병아리 사료(클리바(Kliba) 3179, 스위스 체하-4303 카이서아우그스트 소재의 클리바)로 계속 사육하였다. 상기 동물의 목을 잘라 죽이고 십이지장 루프의 처음 20㎝를 제거하여 췌 장으로부터 분리한 후, 40㎖의 0.9% NaCl 용액으로 세척하였다. 이 십이지장을 즉시 무수 얼음에 냉동시키고 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다.

십이지장을 약 2시간내에 얼음상에서 해동시키고, 빙냉된 페트리 접시에서 길이 방향으로 절개하였다. 점막을 슬라이드로 긁어내어 중량을 측정한 후, 4체적의 용액 6중에서 테플론-글래스(Teflon-glass) 포터-엘베젬(Potter-Elvehjem) 균질기에서 6회의 스트로크(stroke)로 균질화시켰다. 62000g에서 1시간 동안 원심분리한 후에, 맑은 상징액을 각각 15㎖씩 32개의 분취량으로 분할하였다. 이들 제조액으로부터 황산암모늄 분획물을 제조하였다. 20 내지 45% 단계로부터 수득한 침전물을 5000g에서 10분간 원심분리한 후, 펠렛(pellet)을 이후의 사용을 위해 -80℃에 저장하였다.

(NH₄)₂SO₄ 펠렛의 분취량을 150㎖의 용액 7에 용해시키고, 멸균-여과한 후, 용액 8로 평형된 하이로드(HiLoad) 26/10 페닐-세파로즈 고성능 칼럼(칼럼 용적 53㎖; 스웨덴 웁살라 소재의 파마샤(Pharmacia))상에 충진시켰다. 단백질을 8㎖/분의 유속으로 1 칼럼 용적(CV)에 걸쳐서 용액 8 내지 용액 9의 가파른 구배를 사용하여 용리하였다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제는 15mS/㎝ 미만의 전도도에서 용리되었지만, 1mS/㎝ 미만의 전도도에서의 분획물만을 모아서 용액 9로 평형된 30㎖들이 블루 세파로즈 6 패스트 플로우 칼럼(Fast Flow column)(파마샤)상에 직접 충진시켰다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성은 용액 9로 평형된 20㎖들이 포로스 HQ/M 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(미국 매사츄세츠주 프라밍햄 소재의 퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems))상에 (다시) 직접 충진시켜 빠져나온 분획물에서 (8㎖/분의 유속으로) 용리되었다. β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제는 18 CV에 걸쳐 용액 9 내지 용액 10의 선형 구배로 15㎖/분의 유속에서 용리되었다. 10 내지 20mS/㎝의 전도도 범위의 구배에서 활성을 검출하였다. 수거한 분획물(70㎖)을 울트라프리-15(Ultrafree-15) 필터 장치(분자량 컷-오프 50,000; 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore))를 사용하여 약 1.3㎖로 농축시켰다. 농축물의 분취량(500㎕)을 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30 겔 침투 칼럼(CV 24㎖; 파마샤)상에 충진시키고, 용액 11과 함께 0.5㎖/분의 유속에서 용리하였다. 각 분획물의 분취량을 활성 분석(실시예 1 참조)에 사용하였고, 각 농도에 대해 10% NuPAGE 겔(미국 캘리포니아주 산 디에고 소재의 노벡스(Novex))상에서 (MOPS 유동 완충액을 사용하여) SDS-PAGE로 분석하였다. 본 실험의 결과를 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다.

(NH4)2SO4 펠렛중의 10개의 분취량에서 출발한 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 정제(3 또는 4개의 측정치의 평균치)
정제 단계	총 단백질 [㎎]	총 활성 [nmol/h]	수율 [%]	비활성 [pmol/(h·㎎)]	정제율
(NH4)2SO4펠렛	779	8.61	100	11.0	-
페닐-세파로즈	80.8	8.27	96.1	102	9.27
블루 세파로즈	16.0	8.86	103	554	50.1
포로스 HQ	1.56	3.90	45.3	2500	226

실시예 3: β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 아미노산 서열 정보

아미노산 서열 분석에서, 겔 침투 분석상의 분획물(도 1에 도시된 바와 같음)을 8 내지 16% 트리스(Tris)/글리신 겔(노벡스)상에서 분리하고, 단백질을 이모빌론(Immobilon) P^SQ 멤브레인(membrane)(밀리포어)에 옮겨 아미도 블랙으로 염색하였다.

단백질 A는 N-말단이 블록킹(blocking)된 것으로 확인되었으므로, 겔 침투 분석(도 1 참조)으로부터 수득한 분획물 18의 다중 분취량을 10% 트리스/글리신 겔(노벡스)상에서 분리하고, 겔을 콜로이달(Colloidal) 코마시 블루(노벡스)로 염색하였다. 단백질 A에 상응하는 밴드를 겔로부터 절제하고, 이 단백질을 겔중에서 트립신으로 분해하였다. 트립신 분해물을 150×1.0㎜ 바이닥(Vydac) C₁₈ 칼럼(미국 캘리포니아주 헤스페리아 소재의 바이닥)상에서 마이크로보어 역상 HPLC를 실시하여 분리하였다. 펩타이드를 0.1% 트리플루오로아세트산중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리하고, 펩타이드를 함유하는 분획물을 이후의 분석에 사용하기 위해 수거하였다. 2가지 분획물이 MALDI-TOF-MS(보이아저 엘리트(Voyager Elite), 퍼셉티브 바이오시스템즈)로 분석한 결과 각각 단일 펩타이드를 함유하는 것으로 확인되었다. N-말단 에드만 분해에 의해 이들이 하기 서열을 가짐을 알 수 있었다:

(1) Ala-Glu-Val-Gln-Gly-Gln-Leu-Pro (서열번호:3)

(2) Asn-Lys-Glu-Glu-His-Pro-Glu-Pro-Ile-Lys-Ala-Glu-Val-Gln-Gly-Gln-Leu

-Pro (서열번호:6)

펩타이드 (2)의 마지막 8개의 아미노산이 펩타이드 (1)의 아미노산에 상응함을 주지한다.

실시예 4: 완전한 길이의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA의 클로닝

a) RNA 분리

4주된 베데트(Vedette) 병아리를 죽이고, 십이지장을 제거하여 멸균 PBS로 세척한 후, 가위로 절개하였다. 점막층을 유리 슬라이드로 긁어내어 중량을 측정한 후, 조직 100㎎당 1㎖의 트리졸(Trizole) 시약(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))중에서 폴리트론(Polytron)으로 즉시 균질화하였다. 그다음 라이프 테크놀로지스의 표준 프로토콜에 따랐다. 폴리 A mRNA를 미국 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corporation)에서 시판중인 polyATract mRNA 아이솔래이션(Isolation) 키트를 사용하여 분리하였다.

b) PCR 및 RT-PCR

펩타이드 서열 NKEEHPEPIKAEVQGQLP(실시예 3의 펩타이드 (2))(서열번호:7)에서, 2가지 변성 프라이머를 설계하였다. 더 낮은 변성을 수득하기 위해, 염기 이노신을 각각 1개의 동요 위치(wobble position) 및 2개의 동요 위치에서 사용하였다(이하에서, R은 A 또는 G이고, S는 C 또는 G이고, Y는 C 또는 T이다).

5' 프라이머: 5' AAC AAR GAR GAS CAY CCI GA 3' (서열번호:8; 16배의 변성을 갖는 20량체)

3' 프라이머: 5' SAG CTG ICC CTG IAC YTC SGC 3' (서열번호:9; 8배의 변성을 갖는 21량체)

표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 파마샤 진 어셈블러 플러스(Pharmacia Gene Assembler Plus)상에서 올리고(oligo)를 합성하였다. 1㎖ 의 진한 수산화암모늄 용액(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 탈보호시키고, NAP 10 칼럼(아머샴 파마샤 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 사용하여 최종적으로 탈염시켰다.

PCR 분석을 위해, 100ng의 병아리 십이지장 cDNA를 주형으로 취하여 하기 단계를 수행하였다: 94℃에서 30초간; 52℃에서 30초간; 72℃에서 1분간의 40주기. 생성된 51 bp의 밴드를 10% 폴리아크릴아미드 겔로부터 잘라내고, 300V에서 1.5시간 동안 DEAE 페이퍼(paper)상에서 전기용리(electroeluting)시키고, DEAE 페이퍼로부터 1.5M NaCl, 5mM 트리스, 0.5mM EDTA 40㎕로 1회 및 30㎕로 2회 용리시킨 후, 100% 에탄올 2.5체적 및 1㎍의 글리코겐으로 침전시키고, 80% 에탄올 0.5㎖로 세척하고 건조시킨 다음 20㎕의 TE(10mM 트리스, 1mM EDTA)에 용해시켰다.

생성된 51 bp의 단편을 시판중인 T/A 클로닝 벡터인 pGEM-T Easy(미국 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션)에 클로닝시켰다. 상응하는 cDNA 서열을 비스트라 DNA 시퀀서 725(Vistra DNA Sequencer 725)(아머샴 파마샤 바이오테크)상에서 자동화 형광 서열 분석법으로 분석하였다.

상기 DNA 서열로부터 상동성 전방 프라이머를 유도해내었다:

5' TCTGAATTCCGGAGCCCATAAAAGC 3' (프라이머 디옥시12)(서열번호:10).

5' 말단에 EcoRI 부위(밑줄친 서열)를 도입하였고, 그 이후의 17개 뉴클레오티드는 이전에 수득한 디옥시게나제 서열과 상동이다.

RT-PCR 반응에서, polyT/Not 프라이머(미국 산 디에고 소재의 인비트로진(Invitrogen)으로부터 상업적으로 구입가능함)를 프라이머 디옥시12와 함께 역전사 프라이머로 사용하였다.

뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)으로부터 구입한 튜브(tube) RT-PCR 키트를 사용하였고, 상응하는 프로토콜은 다음과 같다:

믹스(mix) 1(총 25.0㎕):

18.3㎕ H₂O, 2.5㎕ DTT(100mM), 1.0㎕ dNTPs(10mM), 1.0㎕ 올리고 dT/Not(0.2㎍/㎕)(3' 프라이머), 1.0㎕ 디옥시12(5' 프라이머)(20μM), 0.2㎕ RNAse 저해제(40U/㎕), 1.0㎕ 병아리 십이지장의 총 RNA(2.2㎍/㎕).

믹스 2(총 25.0㎕):

14.0㎕ H₂O, 10.0㎕ RT-PCR 완충액 5x, 1.0㎕ 효소 믹스(AMV RT, Taq 및 Pwo DNA 중합효소).

상기 2가지 믹스를 혼합하고 PCR 프로토콜을 MJ 리서치 PTC200 DNA 엔진에서 개시하였다:

50℃ 30분, 94℃ 2분; 94℃ 30초, 57℃ 30초, 68℃ 45초의 10주기; 94℃ 30초, 62℃ 30초, 68℃ 45초+(3초/주기)의 25주기; 68℃ 7분, 4℃ 하룻밤.

상기 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 597 bp의 밴드를 병아리의 총 십이지장 RNA로부터 증폭시켰다. PCR 밴드를 1% 아가로즈(agarose) 겔로부터 분리하고, pGEM-T Easy 클로닝 벡터로 클로닝시킨 후, 서열 분석하였다. 원래 펩타이드는 상기 서열 및 597 bp의 전체 서열에 걸쳐 개방 판독 프레임(frame)에 존재한다.

c) 병아리 cDNA-라이브러리

병아리 십이지장의 polyA⁺ RNA로부터 cDNA를 변형된 구블러-호프만(Gubler-Hoffman) 절차를 따르는 카피 키트(Copy Kit)(미국 산 디에고 소재의 인비트로진)를 사용하여 제조하였다. cDNA를 크기별로(0.9 내지 5.5 kb) 선별하고, 진핵 세포 발현 벡터 pcDNA1.1/Amp(인비트로진)로 클로닝시켰다.

표준 프로토콜을 따라 바이오-라드 진 펄서(Gene Pulser) II 시스템을 사용하여 이 콜라이 Top10으로 전기충격시켰다. 그 결과, 480,000개의 개별 클론으로 구성된 cDNA 라이브러리가 수득되었다. 이 라이브러리를 각각 1500 내지 2500개의 개별 클론으로 이루어진 250개의 풀로 나누었다. 각 풀을 100㎖의 LB 배지에서 생육시키고, 광학 밀도(OD) 0.8 내지 1.0에서 170㎍/㎖의 최종 농도로 클로람페니콜을 첨가하여 균주 생육을 정지시켰다. DNA 양을 증가시키기 위해 하룻밤 동안 항온처리를 계속하였다.

d) 병아리 cDNA 라이브러리의 활성 탐색

상기 풀중 90개를 진핵 세포에서 β-카로틴 절단 후에 생산된 레틴산을 검출하는 것에 기초한 전사활성화 분석법으로 활성을 시험하였다. 활성 시험의 원리는 도 2에 도시되어 있다.

각 풀로부터 수득한 5㎍의 DNA로, tk 프로모터(헤르페스 심플렉스(Herpes sympex) 티미딘 키나제 프로모터) 전방에 RARE(레틴산 반응 요소)가 존재하는 루시페라제 리포터 플라스미드가 포함된 리포터 세포주를 20㎍의 리포펙틴(라이프 테크놀로지스)과 함께 형질감염시켰다. 형질감염은 무혈청 조건하에서 7시간 동안 행하였다. 7시간 후에, 형질감염된 믹스를 제거하고 10% 탄처리된 FCS(송아지 태아 혈청)를 함유하는 RPMI 배지를 첨가하였다. 20시간 동안 항온처리한 후에, β-카로틴(β-카로틴 10% CWS, 에프. 호프만-라 로슈 리미티드(F. Hoffmann-La Roche Ltd.)) 또는 플라시보(placebo) 제형물을 최종 β-카로틴 농도가 5μM이 되도록 배양 배지에 첨가하였다. 18시간 동안 항온처리를 계속하였다. 그다음 세포를 PBS로 세척하고, 기질을 첨가한 후에 루시페라제 발현을 질소 냉장된 슬로우 스캔(slow scan) CCD 카메라(아스트로캄 리미티드(AstroCam Ltd.))로 측정하였다. 일반적으로 노출 시간은 8분이었다. 이미지 프로 플러스(Image Pro Plus) 3.0 소프트웨어 팩키지(미국 매릴랜드 소재의 미디아 사이버나틱(Media Cybernatic))를 사용하여 분석하였다. 3개의 풀이 강한 양성 활성을 나타내었고, 7개의 풀이 약하지만 검출가능한 활성을 나타내었다.

양성 풀중 하나를 정사각형 아가(agar) 평판배지상에 도말하였다. 2개의 필터(나일론 멤브레인, 진 스크린(Gene Screen), 미국 보스턴 소재의 NEN 리서치 프로덕츠(Research Products))를 제조하고, 방사선활성([α³²P]dATP, 아머샴) 표지된 597 bp의 PCR-단편을 사용하여 탐색하였다. 9500개의 콜로니(colony)를 탐색한 결과 14개가 2회의 탐색에서 모두 양성이었다. 선택한 36개의 콜로니중에서 5개의 콜로니가 제한 부위 분석에서 동일한 패턴을 나타내었다. 2개의 클론의 서열을 5' 말단으로부터 분석하여 원 서열 51 bp를 밝혀내었다. 이어서 전체 cDNA의 서열을 분석하여 이중으로 확인하였다.

모든 분자 생물학적 절차는 달리 지시하지 않는 한, 샘브루크(Sambrook), 프리츠히(Fritsch) 및 마니아티스(Maniatis)의 문헌[Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 따랐다.

수득한 cDNA 서열은 도 3a 내지 3d에 나타내었고, 그로부터 유도된 아미노산 서열은 도 4에 나타내었다.

도 4는 526개의 잔기를 갖는 유도된 아미노산 서열을 도시한다.

실시예 5: 서열 비교

EMBL 진뱅크로 서열을 비교하여, 공지된 단백질 RPE65(하멜(Hamel) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 15751-15757, 1993])과 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 사이의 고도의 상동성을 발견하였다. 아미노산 수준에서는 55.5%의 상동성이 발견되었다. 서열의 정렬은 도 5a 및 5b에 나타내었다.

실시예 6: 이 콜라이에서 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA의 발현

β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA의 암호화 서열을 PCR로 증폭시키고, 생성된 1578 bp의 단편을 원핵 세포 발현 플라스미드 pQE-12(퀴아진(Qiagen))의 EcoRI/BamHI 부위로 클로닝시켰다. 이 플라스미드는 디옥시게나제의 C-말단에서 6개의 히스티딘 친화성 태그 프레임을 함유한다.

또한 상기 플라스미드는 2개의 lacI 리프레서(represser) 결합 부위를 갖는 조절 프로모터를 함유한다.

이 콜라이 균주 M15pREP4를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시켰다. 이를 발현시키기 위해, 100㎍/㎖의 암피실린 및 25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1ℓ의 LB 배지에 하룻밤 배양한 배양물 30㎖를 접종시켰다. OD₆₀₀이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 생육시켰다. 이 시점에서 배양물을 1mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토사이드)로 유도하고 추가로 1.5 내지 2시간 동안 계속 생육시켰다. 균주를 원심분리하여 수확하고 펠렛을 -80℃에서 냉동시켰다.

상기 펠렛을 2.5㎎/㎖의 도데실-β-D-말토사이드를 함유하는 20㎖ 추출 완충액(300mM NaCl, 50mM NaH₂PO₄, 20mM 트리스-HCl, 1㎎/㎖ 트윈(Tween) 40; pH 7.8)에서 교반하면서 해동시켰다. 1㎖의 프로테아제 저해제 칵테일(cocktail)(5.9mM 벤즈아미딘-HCl, 10mM 6-아미노-카프로산, 5μM 대두 트립신 저해제)을 동시에 첨가하였다.

균주 세포를 4분간 PT7 단위를 사용하는 폴리트론(스위스 키네마티카(Kinematica) AG)으로 처리하여 용균시킨 후, 4분간 브란손 소니피어(Branson Sonifier) 250으로 초음파 처리하였다.

용균물을 12000×g에서 회전시키고, 상징액을 Co²⁺-킬레이트 칼럼(탈론 수퍼플로우 레진(Talon Superflow Resin), 독일 하이델베르크 소재의 클론테흐(Clontech))상에서 정제하였다. 단백질을 150mM의 이미다졸을 함유하는 15 내지 20㎖의 추출 완충액으로 용리하였다.

분획물을 10% 폴리아크릴아미드 겔상에 충진시키고 단백질을 함유하는 분획물을 150mM 트리신, 5mM FeSO₄, 3㎎/㎖의 환원된 글루타티온, 0.21㎎/㎖의 나트륨 콜레이트에서 투석하였다. 이 경우의 겔을 도 6에 도시하였다. 그다음 시료의 디옥시게나제 활성을 분석하였다.

실시예 7: 인간 십이지장 세포주 HuTu80에서 재조합 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제의 발현

β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 cDNA의 암호화 서열을 PCR로 증폭시키고, 생성된 1578 bp의 단편을 플라스미드 pSFV₂gen의 BamHI/XhoI 부위로 클로닝시켰다. 이 플라스미드는 대부분의 포유동물 세포에서 매우 효율적으로 작용하는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest Virus) 발현 시스템의 일부분이다.

상기 플라스미드를 재조합 RNA의 시험관내 합성에 사용하고, 이어서 높은 농도의 바이러스 스톡(stock)을 생산하기 위해 헬퍼(helper) 바이러스와 함께 BHK 세포(새끼 햄스터 신장 세포)로 전기충격시켰다. 이 스톡의 분취량으로 인간 십이지장 세포주 HuTu80을 형질감염시켰다. 형질감염시킨 후 16 내지 18시간 후에 세포를 수확하고, 펠렛을 -80℃에서 냉동시켰다. 전세포 펠렛, 세포질 분획물 또는 멤브레인 분획물을 활성 분석에 사용하였다. 전세포 추출물 및 세포질 분획물에서 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성이 발견되었으며, 멤브레인 분획물에서는 활성이 검출되지 않았다.

실시예 8: 이 콜라이 및 인간 세포에서 발현된 재조합 단백질의 β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성

이 콜라이에서 발현되고 금속 킬레이트 칼럼상에서 정제한 후의 단백질은 기질로서의 β-카로틴에 대해 절단 활성을 나타내었다. 레티날은 β-카로틴과의 항온처리 후에 HPLC에 의해 검출된 유일한 산물이었다. 아포-카로티날 또는 그밖의 대사산물은 발견되지 않았다. 이는 도 7 및 8에 도시된 바와 같은 HPLC 분석으로 입증될 수 있다.

본 발명에 의해, 진단학 분야, 비타민 A의 공학적 제조 분야, 과일과 야채에서 비타민 A를 제조하기 위한 유전자변형 식물 제조 분야, 또는 유전자 치료 분야를 포함하는 다양한 분야에 사용될 수 있는, β,β-카로틴 15,15'-디옥시게나제 활성을 갖는 단백질 및 그를 암호화하는 핵산 서열을 수득할 수 있다.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> beta,beta-carotene 15,15'-dioxygenases <130> 1 <150> EP 99103382.0 <151> 1999-02-22 <160> 10 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 526 <212> PRT <213> chicken <400> 1 Met Glu Thr Ile Phe Asn Arg Asn Lys Glu Glu His Pro Glu Pro Ile 1 5 10 15 Lys Ala Glu Val Gln Gly Gln Leu Pro Thr Trp Leu Gln Gly Val Leu 20 25 30 Leu Arg Asn Gly Pro Gly Met His Thr Ile Gly Asp Thr Lys Tyr Asn 35 40 45 His Trp Phe Asp Gly Leu Ala Leu Leu His Ser Phe Thr Phe Lys Asn 50 55 60 Gly Glu Val Tyr Tyr Arg Ser Lys Tyr Leu Arg Ser Asp Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Cys Asn Ile Glu Ala Asn Arg Ile Val Val Ser Glu Phe Gly Thr Met 85 90 95 Ala Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile Phe Ala Lys Ala Phe Ser Tyr 100 105 110 Leu Ser His Thr Ile Pro Glu Phe Thr Asp Asn Cys Leu Ile Asn Ile 115 120 125 Met Lys Thr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ala Thr Ser Glu Thr Asn Phe Ile 130 135 140 Arg Lys Ile Asp Pro Gln Thr Leu Glu Thr Leu Asp Lys Val Asp Tyr 145 150 155 160 Ser Lys Tyr Val Ala Val Asn Leu Ala Thr Ser His Pro His Tyr Asp 165 170 175 Ser Ala Gly Asn Ile Leu Asn Met Gly Thr Ser Ile Val Asp Lys Gly 180 185 190 Arg Thr Lys Tyr Val Leu Phe Lys Ile Pro Ser Ser Val Pro Glu Lys 195 200 205 Glu Lys Lys Lys Ser Cys Phe Lys His Leu Glu Val Val Cys Ser Ile 210 215 220 Pro Ser Arg Ser Leu Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr His Ser Phe Gly Ile 225 230 235 240 Thr Glu Asn Tyr Ile Val Phe Ile Glu Gln Pro Phe Lys Leu Asp Ile 245 250 255 Val Lys Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Arg Gly Val Asn Trp Ala Ser Cys 260 265 270 Leu Ser Phe His Lys Glu Asp Lys Thr Trp Phe His Phe Val Asp Arg 275 280 285 Lys Thr Lys Lys Glu Val Ser Thr Lys Phe Tyr Thr Asp Ala Leu Val 290 295 300 Leu Tyr His His Ile Asn Ala Tyr Glu Glu Asp Gly His Val Val Phe 305 310 315 320 Asp Ile Val Ala Tyr Arg Asp Asn Ser Leu Tyr Asp Met Phe Tyr Leu 325 330 335 Lys Lys Leu Asp Lys Asp Phe Glu Val Asn Asn Lys Leu Thr Ser Ile 340 345 350 Pro Thr Cys Lys Arg Phe Val Val Pro Leu Gln Tyr Asp Lys Asp Ala 355 360 365 Glu Val Gly Ser Asn Leu Val Lys Leu Pro Thr Ser Ala Thr Ala Val 370 375 380 Lys Glu Lys Asp Gly Ser Ile Tyr Cys Gln Pro Glu Ile Leu Cys Glu 385 390 395 400 Gly Ile Glu Leu Pro Arg Val Asn Tyr Asp Tyr Asn Gly Lys Lys Tyr 405 410 415 Lys Tyr Val Tyr Ala Thr Glu Val Gln Trp Ser Pro Val Pro Thr Lys 420 425 430 Ile Ala Lys Leu Asn Val Gln Thr Lys Glu Val Leu His Trp Gly Glu 435 440 445 Asp His Cys Trp Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Pro Ser Pro Asp Ala 450 455 460 Arg Glu Glu Asp Glu Gly Val Val Leu Thr Cys Val Val Val Ser Glu 465 470 475 480 Pro Asn Lys Ala Pro Phe Leu Leu Ile Leu Asp Ala Lys Thr Phe Lys 485 490 495 Glu Leu Gly Arg Ala Thr Val Asn Val Glu Met His Leu Asp Leu His 500 505 510 Gly Met Phe Ile Pro Gln Asn Asp Leu Gly Ala Glu Thr Glu 515 520 525 <210> 2 <211> 3111 <212> DNA <213> chicken <400> 2 cggatccact agtaacggcc gccagtgtgg tggaatccat ccttctatgt aacaggaaag 60 agctgttctt agcccagaga ggagggcacc gtacgcctgc aggagcagct gggtagagga 120 cacaggagag cgatggagac aatatttaac agaaacaaag aagagcatcc agagcccata 180 aaagctgagg tgcaaggtca gttgcccact tggttgcaag gggtacttct ccgaaatggc 240 ccagggatgc acacaatagg ggacactaaa tacaaccact ggtttgatgg cttggctctg 300 ctgcacagct tcacgtttaa aaatggtgaa gtttactaca gaagtaagta cctccgaagt 360 gacacataca actgcaatat agaagcaaac cgaatcgtgg tgtctgagtt tggaaccatg 420 gcttatccgg atccatgcaa aaacatattt gccaaggcat tctcatactt atctcacacc 480 attcctgagt tcacggacaa ctgcctgatc aacattatga aaactgggga tgattattat 540 gctaccagtg agactaactt catcagaaaa attgatccac agactctgga gacactagat 600 aaggtagact acagcaaata tgtagctgta aacttggcaa cttctcaccc acactatgac 660 agtgctggaa atattctcaa catgggtact tcaattgttg ataaagggag aacaaaatat 720 gttctcttta agatcccttc ctctgtacca gaaaaagaaa agaagaaatc ttgttttaaa 780 cacctggaag tagtatgctc catcccttct cgctccctgc tccaaccaag ctactaccac 840 agctttggaa tcacagaaaa ttatattgtg ttcatagagc agccatttaa actggatatt 900 gtcaaactgg caactgccta catccgaggt gtgaactggg cttcctgcct ttcctttcat 960 aaggaggata agacgtggtt tcactttgta gacagaaaga cgaaaaaaga agtatccacc 1020 aagttttaca ctgatgcttt ggtgctttat caccacataa atgcttacga agaagatggc 1080 cacgttgttt ttgatatcgt tgcctacaga gacaatagct tgtacgatat gttttactta 1140 aaaaaactgg acaaagactt tgaagtgaac aacaagctta cctccatccc aacctgcaag 1200 cgctttgttg tgcctctgca gtatgacaag gatgcagaag taggttctaa tttagtcaaa 1260 cttccaactt ccgcaactgc tgtaaaagaa aaagatggca gcatctattg tcaacctgaa 1320 atattatgtg aagggataga actgcctcgt gtcaactatg actacaatgg caaaaaatac 1380 aagtatgtct atgcaacaga agtccagtgg agcccagttc ctacaaagat tgcaaaactg 1440 aatgtccaaa caaaggaagt actgcactgg ggagaagacc actgctggcc ctcagagccc 1500 atctttgttc ccagccccga tgcaagagaa gaggatgaag gtgttgtttt gacctgtgtt 1560 gtggtgtctg agccaaataa agcacccttc ctactcatct tggatgctaa aacattcaaa 1620 gaattgggcc gagccacagt taacgtagaa atgcatctgg acctgcatgg gatgtttata 1680 ccacagaatg atttgggggc tgagacggaa taaaacgcta ttgatccgac tacacaaact 1740 gagacaactt tctactgaac atgagttaat atccctttta ccattcaaga acaaccatat 1800 aacgacacaa aatgactatg tataatctct taaataatag atataatcct tttaaggcac 1860 agcgatgagt tttactacag gtaacgatat gcacaactgg catataacta ttccaaaaga 1920 agaagaacga tcagtgtttt agaagtgcta atgttgtaca taacggcggc agagggaaca 1980 ggagagaaag gtaacgggaa tatttaatag aatatagatt tctgagcaaa tgaagtgcag 2040 tatttatggt gtgatgcatg gcatgagtca cataggtctg cagctcatgt atcttttaga 2100 gatcgtttca agattgcagc ttgtgatgca agttttctcc agccagaaaa cctcatttta 2160 aaccatctgc tactggtaat tcataccaat gcattttctt ggtgctcgat ttacactata 2220 accaaagtta agtattacat tcaggtgcta caactttcta atttacaacc gaaacaaaca 2280 agcaaacagc acttgctttg ctaataaccc catggtgtat ttttcctttt tatgatgaca 2340 aaaccaagta catatggttt tatgtagcat tcaattatac ttcagtgcta ttccatccta 2400 atgttataag caatttgtat ttaaatcagt tttccttgag aatatctgac ataacatttt 2460 gtgtaatgag atgactatgt tgtctaaaga tgaacaggaa tgtatctttt attagtattg 2520 ttaattgtgt tactaatact atgcatatga atgagagcaa tgtatttcta ggagaactca 2580 gatatacatt caacaatttc tgtaggtgaa aatgcattta ctgatgaaag ttgaatcgtt 2640 aatgagggag aaaactgggt atccatccat ccaactatgt taggtgttca cctggtctgt 2700 atgtgacacc acgctgtttg ggtatctctc actttcacat acctgttctc atggtttctg 2760 ctactcactg tattttgcag gagagaaaca aaatgaaatc actgtcactt actatcgccc 2820 catcacataa gaacaatggg gctttggtga cttgttcatg attacataag atgtttgcag 2880 cagagcagca atagaaccaa caccatccac agttcttgct tgctctgtta tgactccctt 2940 tgctgtcttt atggtttgca tgtatgaaga atacactgcc taattctaat gttaaaaagt 3000 cactggggtc agatctagag cttaagtaag cagtctgggg ttttcaaatg tttatatgtt 3060 ccataaaatg gaaataaaca cctccataat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3111 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> chicken <400> 3 Ala Glu Val Gln Gly Gln Leu Pro 1 5 <210> 4 <211> 506 <212> PRT <213> chicken <400> 4 Glu Glu His Pro Glu Pro Ile Lys Ala Glu Val Gln Gly Gln Leu Pro 1 5 10 15 Thr Trp Leu Gln Gly Val Leu Leu Arg Asn Gly Pro Gly Met His Thr 20 25 30 Ile Gly Asp Thr Lys Tyr Asn His Trp Phe Asp Gly Leu Ala Leu Leu 35 40 45 His Ser Phe Thr Phe Lys Asn Gly Glu Val Tyr Tyr Arg Ser Lys Tyr 50 55 60 Leu Arg Ser Asp Thr Tyr Asn Cys Asn Ile Glu Ala Asn Arg Ile Val 65 70 75 80 Val Ser Glu Phe Gly Thr Met Ala Tyr Pro Asp Pro Cys Lys Asn Ile 85 90 95 Phe Ala Lys Ala Phe Ser Tyr Leu Ser His Thr Ile Pro Glu Phe Thr 100 105 110 Asp Asn Cys Leu Ile Asn Ile Met Lys Thr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ala 115 120 125 Thr Ser Glu Thr Asn Phe Ile Arg Lys Ile Asp Pro Gln Thr Leu Glu 130 135 140 Thr Leu Asp Lys Val Asp Tyr Ser Lys Tyr Val Ala Val Asn Leu Ala 145 150 155 160 Thr Ser His Pro His Tyr Asp Ser Ala Gly Asn Ile Leu Asn Met Gly 165 170 175 Thr Ser Ile Val Asp Lys Gly Arg Thr Lys Tyr Val Leu Phe Lys Ile 180 185 190 Pro Ser Ser Val Pro Glu Lys Glu Lys Lys Lys Ser Cys Phe Lys His 195 200 205 Leu Glu Val Val Cys Ser Ile Pro Ser Arg Ser Leu Leu Gln Pro Ser 210 215 220 Tyr Tyr His Ser Phe Gly Ile Thr Glu Asn Tyr Ile Val Phe Ile Glu 225 230 235 240 Gln Pro Phe Lys Leu Asp Ile Val Lys Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Arg 245 250 255 Gly Val Asn Trp Ala Ser Cys Leu Ser Phe His Lys Glu Asp Lys Thr 260 265 270 Trp Phe His Phe Val Asp Arg Lys Thr Lys Lys Glu Val Ser Thr Lys 275 280 285 Phe Tyr Thr Asp Ala Leu Val Leu Tyr His His Ile Asn Ala Tyr Glu 290 295 300 Glu Asp Gly His Val Val Phe Asp Ile Val Ala Tyr Arg Asp Asn Ser 305 310 315 320 Leu Tyr Asp Met Phe Tyr Leu Lys Lys Leu Asp Lys Asp Phe Glu Val 325 330 335 Asn Asn Lys Leu Thr Ser Ile Pro Thr Cys Lys Arg Phe Val Val Pro 340 345 350 Leu Gln Tyr Asp Lys Asp Ala Glu Val Gly Ser Asn Leu Val Lys Leu 355 360 365 Pro Thr Ser Ala Thr Ala Val Lys Glu Lys Asp Gly Ser Ile Tyr Cys 370 375 380 Gln Pro Glu Ile Leu Cys Glu Gly Ile Glu Leu Pro Arg Val Asn Tyr 385 390 395 400 Asp Tyr Asn Gly Lys Lys Tyr Lys Tyr Val Tyr Ala Thr Glu Val Gln 405 410 415 Trp Ser Pro Val Pro Thr Lys Ile Ala Lys Leu Asn Val Gln Thr Lys 420 425 430 Glu Val Leu His Trp Gly Glu Asp His Cys Trp Pro Ser Glu Pro Ile 435 440 445 Phe Val Pro Ser Pro Asp Ala Arg Glu Glu Asp Glu Gly Val Val Leu 450 455 460 Thr Cys Val Val Val Ser Glu Pro Asn Lys Ala Pro Phe Leu Leu Ile 465 470 475 480 Leu Asp Ala Lys Thr Phe Lys Glu Leu Gly Arg Ala Thr Val Asn Val 485 490 495 Glu Met His Leu Asp Leu His Gly Met Phe 500 505 <210> 5 <211> 529 <212> PRT <213> bovine <400> 5 Glu Glu Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ala His Val Thr Gly Arg Ile Pro 1 5 10 15 Leu Trp Leu Thr Gly Ser Leu Leu Arg Cys Phe Thr Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Phe Glu Val Gly Ser Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln Ala 35 40 45 Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His Arg 50 55 60 Arg Phe Ile Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys Arg 65 70 75 80 Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Phe Thr Thr Cys Ala Phe Pro Asp Pro 85 90 95 Cys Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Arg Gly Val Glu 100 105 110 Val Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr 115 120 125 Tyr Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Glu Thr 130 135 140 Leu Glu Thr Ile Phe Thr Lys Gln Val Asp Leu Cys Asn Tyr Val Ser 145 150 155 160 Val Asn Gly Ala Thr Ala His Pro His Ile Glu Asn Asp Gly Thr Val 165 170 175 Tyr Asn Ile Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Ile Ala Tyr Asn 180 185 190 Ile Val Lys Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Ile Ser 195 200 205 Lys Phe Thr Ser Glu Ile Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe 210 215 220 Lys Pro Ser Tyr Val His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val 225 230 235 240 Phe Val Glu Thr Pro Val Lys Ile Asn Leu Phe Lys Phe Leu Ser Ser 245 250 255 Trp Ser Leu Trp Gly Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Phe Thr 260 265 270 Asn Glu Thr Met Gly Val Trp Leu His Ile Ala Asp Lys Lys Arg Lys 275 280 285 Lys Tyr Leu Asn Asn Lys Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Asn Leu Phe His 290 295 300 His Ile Asn Thr Tyr Glu Asp Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys 305 310 315 320 Cys Trp Lys Gly Phe Glu Phe Val Tyr Asn Tyr Phe Thr Leu Tyr Leu 325 330 335 Ala Asn Leu Arg Glu Asn Trp Glu Glu Val Lys Lys Asn Ala Arg Lys 340 345 350 Ala Pro Gln Pro Glu Val Arg Arg Tyr Val Leu Pro Leu Asn Ile Asp 355 360 365 Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val Thr Leu Pro Asn Thr Thr Ala 370 375 380 Thr Ala Ile Leu Cys Ser Asp Glu Phe Thr Thr Ile Trp Leu Glu Pro 385 390 395 400 Glu Val Leu Phe Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe Glu Phe Pro Gln Ile 405 410 415 Asn Tyr Gln Lys Tyr Cys Gly Lys Pro Tyr Thr Tyr Ala Tyr Gly Leu 420 425 430 Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys Lys Leu Asn Val Lys 435 440 445 Thr Lys Glu Thr Trp Phe Thr Val Trp Gln Glu Pro Asp Ser Tyr Pro 450 455 460 Ser Glu Pro Ile Phe Val Ser His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Asp Asp 465 470 475 480 Gly Val Val Leu Ser Val Val Val Ser Pro Gly Ala Gly Gln Lys Pro 485 490 495 Ala Tyr Leu Leu Ile Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ser Glu Val Ala Arg 500 505 510 Ala Glu Phe Thr Val Glu Ile Asn Ile Pro Val Thr Phe His Gly Leu 515 520 525 Phe <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> chicken <400> 6 Asn Lys Glu Glu His Pro Glu Pro Ile Lys Ala Glu Val Gln Gly Gln 1 5 10 15 Leu Pro <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> chicken <400> 7 Asn Lys Glu Glu His Pro Glu Pro Ile Lys Ala Glu Val Gln Gly Gln 1 5 10 15 Leu Pro <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> i <400> 8 aacaargarg ascayccnga 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (7)..(7) <223> i <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> i <400> 9 sagctgnccc tgnacytcsg c 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tctgaattcc ggagcccata aaagc 25

Claims (19)

1. 서열번호:2에 나타낸 뉴클레오티드 서열로 표시되는, β-카로틴을 절단시켜 레티날을 생성시키는 효소적 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 1 항에 따른 핵산 분자에 의해 암호화되는, β-카로틴을 절단시켜 레티날을 생성시키는 효소적 활성을 갖는 단백질.
13. 서열번호:2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 20개 이상의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 프라이머(primer)를 사용하여 제 1 항에 따른 핵산 분자를 증폭시키는 방법.
14. 서열번호:2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 20개 이상의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 탐침을 사용하여 제 1 항에 따른 핵산 분자를 검출하는 방법.
15. 서열번호:2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 20개 이상의 염기를 갖는 프라이머 하나 이상, 서열번호:2에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 20개 이상의 염기를 갖는 탐침 하나 이상, 또는 상기 프라이머 및 탐침 모두를 함유하는 테스트키트(testkit)를 사용하여, 제 1 항에 따른 핵산 분자 또는 그의 일부를 증폭 또는 검출, 또는 증폭 및 검출하는 방법.
16. 제 1 항에 따른 핵산 분자의 cDNA를 숙주 세포에 적합한 벡터에 삽입시키는 단계 및 이 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 상기 핵산 분자의 cDNA를 생체외 도입시키는 방법.
17. 제 16 항에 있어서,

    숙주 세포가 식물 세포, 원핵 세포, 효모 세포, 진균 세포, 조류 세포 및 포유동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
18. 제 17 항에 있어서,

    포유동물 세포가 인간 세포인 방법.
19. 제 17 항 또는 제 18 항에 따른 방법에 의해 수득되는 형질전환된 숙주 세포.

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