JP2000060562A

JP2000060562A - ヒト転写関連蛋白質とこの蛋白質をコードするｃＤＮＡ

Info

Publication number: JP2000060562A
Application number: JP10235901A
Authority: JP
Inventors: Akihiko Komuro; 晃彦小室; Mihoro Saeki; 美帆呂佐伯; Masashi Kato; 誠志加藤
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2000-02-29
Anticipated expiration: 2018-08-21
Also published as: JP3832973B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト核蛋白質Ｎpw38と結合する新規のヒト転
写関連蛋白質と、この蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ
などの遺伝子材料を提供する。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト転
写関連と、このヒト転写関連蛋白質をコードするヒト遺
伝子、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、および上
記のヒト転写関連蛋白質に対する抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ヒト核蛋
白質Ｎpw38と結合する新規なヒト転写関連蛋白質と、こ
の蛋白質をコードしているヒト遺伝子、この遺伝子のｃ
ＤＮＡ、および上記蛋白質に対する抗体に関するもので
ある。この発明の蛋白質および抗体は、各種疾患の診断
および治療に有用であり、ヒトｃＤＮＡは遺伝子診断用
プローブや遺伝子治療用遺伝子源として有用である。ま
た、ｃＤＮＡは、この発明の蛋白質を大量生産するため
の遺伝子源として用いることが出来る。

【０００２】

【従来の技術】ヒト核蛋白質Ｎpw38は、ＷＷドメインを
有する３８ｋＤａの核蛋白質として見いだされた［小室
ら、第７０回日本生化学会大会講演要旨集、p.548 ］。
ＷＷドメインとはＳＨ２、ＳＨ３、ＰＨ、ＰＴＢドメイ
ンと類似した蛋白質−蛋白質相互作用モチーフの新しい
ファミリーである。このドメインは、２個の保存された
トリプトファンを持つ約40アミノ酸残基からなり、ＳＨ
３ドメインと同様にプロリンリッチなアミノ酸配列に結
合することが知られている[H. I. Chen and M. Sudol.
(1995 ) Proc. Natl. Sci.92, 7819-7823]。Ｎｐｗ３８
のＷＷドメインは、転写活性促進作用を有することが示
されている［小室ら、第２０回日本分子生物学会年会講
演要旨集、ｐ．３６９］。したがって、このＷＷドメイ
ンに結合する蛋白質が、転写活性化に関与していると考
えられる。

【０００３】転写活性に関与する因子は、発生・分化な
どの生命現象のみならず、癌等の疾患とも密接に関係し
ている［村松正寛編、NEW メディカルサイエンス、「転
写のしくみと疾患」］。従って、これらの蛋白質は特定
遺伝子の転写・翻訳を調節する低分子医薬品を開発する
ためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めており、
できるだけ多くの転写関連蛋白質を得ることが望まれて
いる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】この出願の発明は、以
上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、医薬品
などの開発に有用なヒト蛋白質、特に、ヒト核蛋白質Ｎ
pw38と結合する新規な転写関連蛋白質を提供することを
課題としている。またこの出願の発明は、この蛋白質を
コードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡおよび蛋
白質に対する抗体などの遺伝子操作材料を提供すること
を課題としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】この出願は、上記の課題
を解決する発明として、配列番号１で表されるアミノ酸
配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。また、この
出願は、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは
複数のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。

【０００６】さらに、この出願は、上記のヒト転写関連
蛋白質をコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡ
であって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、およ
び配列番号２の一部配列からなるＤＮＡ断片を提供す
る。さらにまた、この出願は、上記ｃＤＮＡを保有する
組換えベクター、および上記のヒト転写関連蛋白質に対
する抗体を提供する。

【０００７】以下、この発明の実施の形態について詳し
く説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】この発明のヒト転写関連蛋白質
は、公知の方法、すなわちヒトの臓器、細胞株などから
単離する方法、この発明によって提供されるのアミノ酸
配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方
法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮ断片を
用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得
することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって
蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を
有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調
製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことに
よりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方
法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸
菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋白
質を大量に発現させることができる。

【０００９】この発明の蛋白質をインビトロ翻訳でＤＮ
Ａを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻
訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベク
ターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラ
ーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物
などのインビトロ翻訳系に添加してやれば、この発明の
蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６
などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ
８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢluescr
ipt IIなどが例示できる。

【００１０】この発明の蛋白質を大腸菌などの微生物で
ＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複
製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部
位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有
する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を
組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿
主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養
してやれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微
生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻
訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現
させてやれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ること
ができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として
発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロ
テアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコード
する蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用
発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、
ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示
できる。

【００１１】この発明の蛋白質を真核細胞でＤＮＡを発
現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域
を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付
加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真
核細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細
胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、
ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶ
Ｌ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクタ
ー、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞と
しては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、
分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞など
が一般に用いられるが、この蛋白質を発現できるもので
あれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真
核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム
法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の
方法を用いることができる。

【００１２】この発明の蛋白質を原核細胞や真核細胞で
発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製する
ためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことがで
きる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処
理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、
遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等
電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１３】この発明の蛋白質には、配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペ
プチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これら
のペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用い
ることができる。この発明の蛋白質には、他の任意の蛋
白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、実施例に挙げ
たグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と
の融合蛋白質などである。

【００１４】この発明の遺伝子は、上記蛋白質をコード
するヒトの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮ
Ａまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノム
ライブラリーから単離することができる。この発明のｃ
ＤＮＡは、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーか
らクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞か
ら抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成する。
ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出され
たものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Berg
法［Okayama, H and Berg,P., Mol. Cell. Biol. 2:161
-170 (1982)］、Gubler−Hoffman 法［Guler, U.and Ho
ffman, J. Gene 25:263-269 (1983)］等、いかなる方法
を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に
得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法
［Kato, S. et al. Gene 150:243-250 (1994) ］を用い
ることが望ましい。また市販のヒトｃＤＮＡライブラリ
ーを用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーからこ
の発明のｃＤＮＡをクローン化するには、この発明のｃ
ＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレ
オチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の
方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼー
ションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的
とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用い
て、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法
により、この発明のｃＤＮＡ断片を調製することもでき
る。

【００１５】この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表さ
れる塩基配列を含むことを特徴とするものであり、1926
bpのオープンリーディングフレームを有している。この
オープンリーディングフレームは、641 アミノ酸残基か
らなる蛋白質をコードしている。この発明の蛋白質は、
いかなる組織でも発現しているので、配列番号２に記載
のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレ
オチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、
この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ること
ができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を
用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。

【００１６】この発明の蛋白質は、転写活性化能を有す
るヒト核蛋白質Ｎpw38と結合するものであり、また、ポ
リリボＧや一本鎖ＤＮＡとも結合する。従って、この発
明の蛋白質は、転写調節において重要な役割を有してい
ると考えられる。一般にヒト遺伝子は個体差による多型
が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１ま
たは複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または
他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡも
この発明のｃＤＮＡに含まれる。

【００１７】同様に、これらの変更によって生じる、１
または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他
のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番
号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有
する限り、この発明の蛋白質に含まれる。この発明のＤ
ＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかな
る部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も
含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からな
るＤＮＡ断片もこの範疇に入る。これらのＤＮＡ断片は
遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。

【００１８】この発明の蛋白質に対する抗体は、蛋白質
それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知
の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体として得ることができる。

【００１９】

【実施例】次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ
具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的
な操作および酵素反応は、文献［"Molecular Cloning.
Laboratory Manual" ColdSpring Harbor Laboratory, 1
989”］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に
記載の無い場合は宝酒造社製のものを用いた。各酵素反
応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従っ
た。ｃＤＮＡ合成は文献［Kato, S. et al.,Gene 150:2
43-250, (1994)］に従った。実施例１：ヒトＮpw38ｃＤＮＡのクローニングヒト胃癌細胞ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ97/03190記
載）から選択したｃＤＮＡクローンの大規模塩基配列決
定の結果、クローンＨＰ10345 を得た。このクローン
は、170bp の５’非翻訳領域、798bp のオープンリーデ
ィングフレーム、52bpの３’非翻訳領域からなる構造を
有していた（配列番号３）。オープンリーディングフレ
ームは265 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてい
た。

【００２０】モチーフ配列検索を行ったところ、46番目
から78番目までの領域が、ＷＷドメインと類似性を有し
ていた。52番目と75番目のトリプトファン、78番目のプ
ロリンが、これまで知られている全てのＷＷドメインに
保存されているアミノ酸残基である。この蛋白質のアミ
ノ酸配列における他の特徴として、21番目から41番目ま
での酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸とグルタミン
酸）に富む領域、104 番目から176 番目までの酸性アミ
ノ酸残基と塩基性アミノ酸残基が交互に並ぶ領域がある
ことなどが挙げられる。実施例２：大腸菌によるＧＳＴ融合蛋白質の発現 EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる25
merのセンスプライマー(5'-CCGAATTCATGCCGCTGCCCGTTG
C-3') とEcoRI 認識部位を付加した停止コドンまでを含
む25 merのアンチセンスプライマー(5'-CCGAATTCTCAATC
CTGCTGCTTGG-3') を用い、ｐＨＰ10345 を鋳型としてＰ
ＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物を EcoRIで
消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社製) の EcoRI
部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌Ｂ
Ｌ21の形質転換を行った。ＬＢ培地中で37℃で５時間培
養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さら
に37℃で2.5 時間培養した。菌体を遠心により分離し、
溶解溶液（50 mM Tris-HCl（pH7.5 ）, 1mM EDTA-1 % T
riton X-100 , 0.2% SDS, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一
度-80 ℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行っ
た。1000 x gで30分遠心し、上清にグルタチオンセファ
ロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。
ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-50 mM
グルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。その結果、分
子量約 60 kDa の GST-HP10345融合蛋白質を得た。（３）Ｎpw38結合蛋白質の精製 HeLa-S3 細胞（1 x 10¹⁰個）に低張バッファー（20 mM
Hepes (pH7.4), 10 mMKCl, 1.5 mM MgCl₂）を加え、4
℃で10分間放置し、ダウンス型ホモジェナイザーにより
均一化した。1000 x g, 15分の遠心により核画分を得
た。核画分を0.5％NP-40 を含む低張バッファーで２回
洗浄した後、高張バッファー（20 mM Hepes (pH7.4), 2
50 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.5% NP-40）により４℃、
30分間抽出し、核抽出液とした。

【００２１】上記の核抽出物40 ml にGST-Ｎpw38融合蛋
白質25 mg を加え、４℃、ローテーターにて２時間攪拌
した。グルタチオンセファロース４Ｂを加え、さらに、
４℃、２時間インキュベートし、ビーズを十分洗浄した
後、10 mM Tris、50 mM グルタチオンで溶出した。溶出
液をSDS-PAGEにかけたところ、約100kDaの蛋白質が含ま
れていた。この蛋白質をＮpw38ＢＰ１と命名した。SDS-
PAGEゲル上のバンドをPVDF膜に転写後、100 kDa のバン
ドをプロテインシーケンサーG1000A (HEWLETTPACKARD
社) にのせ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。その結
果、配列番号４で表されるアミノ酸配列が得られた。実施例４：Ｎpw38ＢＰ１をコードするｃＤＮＡのクロー
ニング決定したアミノ酸配列25残基を用いてデータベースをサ
ーチしたところ、この配列はＥＳＴクローン（GenBank
^TM登録番号AA206624）がコードする蛋白質のアミノ酸配
列と一致した。このＥＳＴクローンの塩基配列をもとに
して、６アミノ酸残基をコードする領域に対するアンチ
センスプライマー（5'-TGTAGATCTCCGTCCCAT-3'）を合成
した。ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−1080ｃＤＮ
Ａライブラリー（ＷＯ98/11217に記載）を鋳型とし、ア
ンチセンスプライマーとＴ７プライマーを用い、Ｎpw38
ＢＰ１ｃＤＮＡの5'上流領域をＰＣＲにより増幅したと
ころ約200bp のｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片
をプローブとしてヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−
1080ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ98/11217記載）をスク
リーニングした結果、クローンＨＰ00169 を得た。この
クローンは、配列番号２に示したとおり、1,926 bpのオ
ープンリーディングフレームを有していた。また、オー
プンリーディングフレームは配列番号１に示した６４１
アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。実施例５：インビトロ翻訳による蛋白質合成Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用
いて、Ｔ_NＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ
社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。その際
に［³⁵Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイ
ソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属の
プロトコールに従って行なった。プラスミド２μg を、
Ｔ_NＴウサギ網状赤血球溶解物12.5μl 、緩衝液（キッ
トに付属）0.5 μl 、アミノ酸混合液（メチオニンを含
まない）２μl 、［³⁵Ｓ］メチオニン（アマーシャム
社）２μl （0.3 ＭＢq/μl ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼ0.5 μl 、ＲＮasin20Ｕを含む総量25μl の反応液中
で30℃で90分間反応させた。反応液３μl にＳＤＳサン
プリングバッファー（125mM トリス塩酸緩衝液、pH6.8
、120mM ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶
液、0.025 ％ブロモフェノールブルー、20％グリセロー
ル）２μl を加え、95℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラ
ジオグラフィーを行なったところ、約100kDaの翻訳産物
のバンドが得られた。オープンリーディングフレームか
ら予想されるＮpw38ＢＰ１の分子量は、約70kDa であ
る。翻訳産物の分子量はそれよりも大きい値を示すが、
細胞から単離したＮpw38ＢＰ１の分子量も約100kDaであ
ることから、この蛋白質の見かけの分子量は約100kDaで
あることが判明した。実施例６：Ｎpw38ＢＰ１の大腸菌による発現 EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる26
mer のセンスプライマー（5'-CCGAATTCATGGGACGGAGATCT
ACA-3'）とSalI認識配列を付加した停止コドンまでを含
む26mer のアンチセンスプライマー（5'-CCGTCGACTCACA
GTAGCCCTTCCAT-3'）を用い、クローンHP00169 を鋳型と
してＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をEc
oRI とSalIで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社
製) のEcoRI とSalI部位に挿入した。塩基配列を確認し
た後、宿主大腸菌ＪＭ109 の形質転換を行った。ＬＢ培
地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMに
なるように加え、さらに37℃で4 時間培養した。菌体を
遠心により分離し、溶解溶液（50 mM Tris-HCl pH7.5,
1mM EDTA, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一度-80 ℃で凍結
させ融解させた後、超音波破砕を行った。10,000 x gで
30分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加
え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗
浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-HCl, 50 mM グルタチ
オン）で融合蛋白質を溶出した。実施例７：抗体作製上記の融合蛋白質を抗原として家兔に常法により免疫を
行い抗血清を得た。抗血清はまず、40％飽和硫安沈殿画
分をGST アフィニティーカラムによりGST 抗体を除い
た。素通り画分をさらにGST-HP00169 の抗原カラムによ
り精製した。実施例８：ウェスタンブロット HeLa-S3 細胞ライセートを SDS-PAGE により分離し、PV
DF膜ブロットした後、５％スキムミルクを含む0.05 % T
ween20 -PBS （TPBS）で１時間室温でブロッキングし、
抗体をTPBSで10,000倍希釈したものと１時間インキュベ
ートした。TPBSで３回洗浄し、さらにTPBSで10,000倍希
釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ I
gGと１時間インキュベートした。TPBSで４回洗浄し、EC
L 試薬（Amersham社製）により発光させて検出したとこ
ろ、約100kDaの位置にシグナルが得られた。実施例９：Ｎpw38ＢＰ１の核酸結合能Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを鋳型とした、ウサギ網状赤血球
インビトロ翻訳産物と種々の核酸との結合能を検討し
た。ポリリボＡアガロース、ポリリボＧアガロース、ポ
リリボＵアガロース、ポリリボＣアガロース、二本鎖Ｄ
ＮＡセルロース、一本鎖ＤＮＡセルロース（いずれもフ
ァルマシア社製）とインビトロ翻訳産物をHKN 緩衝液
［Hepes(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.01% NP40 ］中で室
温、20分間インキュベートした。HKN 緩衝液で５回洗浄
し、担体に結合した蛋白質をSDS-PAGEにより分析したと
ころ、Ｎpw38ＢＰ１はポリリボＧならびに一本鎖ＤＮＡ
に特異的に結合することがわかった。

【００２２】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、癌などの病態の診断および治療等に有用な新規
なヒト転写関連蛋白質とその抗体が提供される。また、
この発明のｃＤＮＡ等の遺伝子操作材料を用いることに
よって、このヒト蛋白質を大量に製造することができ
る。そして、この蛋白質と結合する低分子化合物をスク
リーニングすることによる、新しい型の抗腫瘍剤などの
医薬を探索することが可能となる。

【００２３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：６４１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質ハイポセティカル：Ｎｏ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：フィブロサルコーマセルライン：ＨＴ−１０８０クローン名：ＨＰ００１６９配列 Met Gly Arg Arg Ser Thr Ser Ser Thr Lys Ser Gly Lys Phe Met Asn 1 5 10 15 Pro Thr Asp Gln Ala Arg Lys Glu Ala Arg Lys Arg Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Asn Lys Lys Gln Arg Met Met Val Arg Ala Ala Val Leu Lys Met Lys 35 40 45 Asp Pro Lys Gln Ile Ile Arg Asp Met Glu Lys Leu Asp Glu Met Glu 50 55 60 Phe Asn Pro Val Gln Gln Pro Gln Leu Asn Glu Lys Val Leu Lys Asp 65 70 75 80 Lys Arg Lys Lys Leu Arg Glu Thr Phe Glu Arg Ile Leu Arg Leu Tyr 85 90 95 Glu Lys Glu Asn Pro Asp Ile Tyr Lys Glu Leu Arg Lys Leu Glu Val 100 105 110 Glu Tyr Glu Gln Lys Arg Ala Gln Leu Ser Gln Tyr Phe Asp Ala Val 115 120 125 Lys Asn Ala Gln His Val Glu Val Glu Ser Ile Pro Leu Pro Asp Met 130 135 140 Pro His Ala Pro Ser Asn Ile Leu Ile Gln Asp Ile Pro Leu Pro Gly 145 150 155 160 Ala Gln Pro Pro Ser Ile Leu Lys Lys Thr Ser Ala Tyr Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Arg Ala Val Ser Ile Leu Pro Leu Leu Gly His Gly Val Pro Arg 180 185 190 Leu Pro Pro Gly Arg Lys Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro 195 200 205 Pro Gln Val Val Gln Met Tyr Gly Arg Lys Val Gly Phe Ala Leu Asp 210 215 220 Leu Pro Pro Arg Arg Arg Asp Glu Asp Met Leu Tyr Ser Pro Glu Leu 225 230 235 240 Ala Gln Arg Gly His Asp Asp Asp Val Ser Ser Thr Ser Glu Asp Asp 245 250 255 Gly Tyr Pro Glu Asp Met Asp Gln Asp Lys His Asp Asp Ser Thr Asp 260 265 270 Asp Ser Asp Thr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Ser Asp Gly Asp Glu Phe 275 280 285 Val His Arg Asp Asn Gly Glu Arg Asp Asn Asn Glu Glu Lys Lys Ser 290 295 300 Gly Leu Ser Val Arg Phe Ala Asp Met Pro Gly Lys Ser Arg Lys Lys 305 310 315 320 Lys Lys Asn Met Lys Glu Leu Thr Pro Leu Gln Ala Met Met Leu Arg 325 330 335 Met Ala Gly Gln Glu Ile Pro Glu Glu Gly Arg Glu Val Glu Glu Phe 340 345 350 Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Ser Asp Asp Ser Glu Ala Glu Lys 355 360 365 Gln Ser Gln Lys Gln His Lys Glu Glu Ser His Ser Asp Gly Thr Ser 370 375 380 Thr Ala Ser Ser Gln Gln Gln Ala Pro Pro Gln Ser Val Pro Pro Ser 385 390 395 400 Gln Ile Gln Ala Pro Pro Met Pro Gly Pro Pro Pro Leu Gly Pro Pro 405 410 415 Pro Ala Pro Pro Leu Arg Pro Pro Gly Pro Pro Thr Gly Leu Pro Pro 420 425 430 Gly Pro Pro Pro Gly Ala Pro Pro Phe Leu Arg Pro Pro Gly Met Pro 435 440 445 Gly Leu Arg Gly Pro Leu Pro Arg Leu Leu Pro Pro Gly Pro Pro Pro 450 455 460 Gly Arg Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Pro Gly Leu Pro Pro 465 470 475 480 Gly Pro Pro Pro Arg Gly Pro Pro Pro Arg Leu Pro Pro Pro Ala Pro 485 490 495 Pro Gly Ile Pro Pro Pro Arg Pro Gly Met Met Arg Pro Pro Leu Val 500 505 510 Pro Pro Leu Gly Pro Ala Pro Pro Gly Leu Phe Pro Pro Ala Pro Leu 515 520 525 Pro Asn Pro Gly Val Leu Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ile Gln Arg Pro 530 535 540 Lys Ala Asp Asp Thr Ser Ala Ala Thr Ile Glu Lys Lys Ala Thr Ala 545 550 555 560 Thr Ile Ser Ala Lys Pro Gln Ile Thr Asn Pro Lys Ala Glu Ile Thr 565 570 575 Arg Phe Val Pro Thr Ala Leu Arg Val Arg Arg Glu Asn Lys Gly Ala 580 585 590 Thr Ala Ala Pro Gln Arg Lys Ser Glu Asp Asp Ser Ala Val Pro Leu 595 600 605 Ala Lys Ala Ala Pro Lys Ser Gly Pro Ser Val Pro Val Ser Val Gln 610 615 620 Thr Lys Asp Asp Val Tyr Glu Ala Phe Met Lys Glu Met Glu Gly Leu 625 630 635 640 Leu 641 配列番号：２配列の長さ：１９２６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：フィブロサルコーマセルライン：ＨＴ−１０８０クローン名：ＨＰ００１６９配列 ATGGGACGGA GATCTACATC ATCCACCAAG AGTGGAAAAT TTATGAACCC CACAGACCAA 60 GCCCGAAAGG AAGCCCGGAA GAGAGAATTA AAGAAGAACA AAAAACAGCG CATGATGGTT 120 CGAGCTGCAG TTTTAAAGAT GAAGGATCCA AAACAGATAA TCCGAGACAT GGAGAAATTG 180 GATGAAATGG AGTTTAACCC AGTGCAACAG CCACAATTAA ATGAGAAAGT ACTGAAAGAC 240 AAGCGTAAAA AGCTGCGTGA AACCTTTGAA CGTATTCTAC GACTCTATGA AAAAGAGAAT 300 CCAGATATTT ACAAAGAATT GAGAAAGCTA GAAGTAGAAT ATGAACAGAA GAGGGCTCAA 360 CTTAGCCAAT ATTTTGATGC TGTCAAGAAT GCTCAGCATG TGGAAGTGGA GAGTATTCCT 420 TTGCCAGATA TGCCACATGC TCCTTCCAAC ATTTTGATCC AGGACATTCC ACTTCCTGGT 480 GCCCAGCCAC CCTCTATCCT AAAGAAAACC TCAGCCTATG GACCTCCAAC TCGGGCAGTT 540 TCTATCCTTC CTCTTCTTGG ACATGGTGTT CCACGTTTGC CCCCTGGCAG AAAACCTCCT 600 GGCCCTCCCC CTGGTCCACC TCCTCCTCAA GTCGTGCAGA TGTATGGCCG TAAAGTGGGT 660 TTTGCCCTAG ATCTTCCCCC TCGTAGGCGA GATGAAGACA TGTTATATAG TCCTGAACTT 720 GCCCAGCGAG GTCATGATGA TGATGTTTCT AGCACCAGTG AAGATGATGG CTATCCTGAG 780 GACATGGATC AAGATAAGCA TGATGACAGT ACTGATGACA GTGACACCGA CAAATCAGAT 840 GGAGAAAGTG ACGGGGATGA ATTTGTGCAC CGTGATAATG GTGAGAGAGA CAACAATGAA 900 GAAAAGAAGT CAGGTCTGAG TGTACGGTTT GCAGATATGC CTGGAAAATC AAGGAAGAAA 960 AAGAAGAACA TGAAGGAACT GACTCCTCTT CAAGCCATGA TGCTTCGTAT GGCAGGTCAA 1020 GAAATCCCTG AGGAGGGACG GGAAGTAGAG GAATTTTCAG AGGACGATGA TGAAGATGAT 1080 TCTGATGACT CTGAAGCAGA AAAGCAATCA CAAAAGCAGC ATAAAGAGGA ATCCCATTCT 1140 GATGGCACAT CCACTGCTTC TTCACAGCAG CAGGCTCCGC CGCAGTCTGT TCCTCCTTCT 1200 CAGATACAAG CACCTCCCAT GCCAGGACCA CCACCTCTTG GACCACCACC TGCTCCACCA 1260 TTACGGCCTC CTGGGCCACC TACAGGCCTT CCTCCTGGTC CACCTCCAGG AGCTCCTCCA 1320 TTCCTGAGAC CACCTGGAAT GCCAGGACTC CGAGGGCCCT TACCCCGACT TTTACCTCCA 1380 GGACCACCAC CAGGCCGACC CCCTGGCCCT CCCCCAGGTC CACCTCCAGG TCTGCCTCCT 1440 GGTCCCCCTC CTCGTGGACC CCCACCAAGG CTACCTCCCC CTGCACCTCC AGGTATTCCT 1500 CCACCTCGTC CTGGCATGAT GCGCCCACCT TTGGTGCCTC CCCTTGGACC TGCCCCCCCT 1560 GGGCTGTTCC CACCAGCTCC CTTGCCAAAC CCTGGGGTTT TAAGTGCCCC ACCCAACTTG 1620 ATTCAGCGAC CCAAGGCGGA TGATACAAGT GCAGCCACCA TTGAGAAGAA AGCCACAGCA 1680 ACCATCAGTG CCAAGCCACA GATCACTAAT CCCAAGGCAG AGATTACTCG ATTTGTGCCC 1740 ACTGCACTGA GAGTACGTCG GGAGAATAAA GGGGCTACTG CTGCTCCCCA AAGAAAGTCA 1800 GAGGATGATT CTGCTGTGCC TCTTGCCAAA GCAGCACCCA AATCTGGTCC TTCTGTTCCT 1860 GTCTCAGTAC AAACTAAGGA TGATGTCTAT GAGGCTTTCA TGAAAGAGAT GGAAGGGCTA 1920 CTGTGA 1926 配列番号：３配列の長さ：１０２０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：胃癌クローン名：ＨＰ１０３４５配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１７１．．９６８特徴を決定した方法：Ｅ配列 AGTTACTTTC AGGCTCGGGG AGTGAAGGCC TCGTTGAGAG AAGGTCTCAT TCGGTGTTTT 60 GGGAAGAGAG TCGTGTGGGC CCAGGTATCG TAGCGGCGAC ACGAGAGAGA CGGGCGGTGT 120 GACAGCCTTC CACTACCTGC ACGAGTGTAT TGGTCTGTCT GCTATCAGCT ATG CCG CTG 179 Met Pro Leu 1 CCC GTT GCG CTG CAG ACC CGC TTG GCC AAG AGA GGC ATC CTC AAA CAT 227 Pro Val Ala Leu Gln Thr Arg Leu Ala Lys Arg Gly Ile Leu Lys His 5 10 15 CTG GAG CCT GAA CCA GAG GAA GAG ATC ATT GCC GAG GAC TAT GAC GAT 275 Leu Glu Pro Glu Pro Glu Glu Glu Ile Ile Ala Glu Asp Tyr Asp Asp 20 25 30 35 GAT CCT GTG GAC TAC GAG GCC ACC AGG TTG GAG GGC CTA CCA CCA AGC 323 Asp Pro Val Asp Tyr Glu Ala Thr Arg Leu Glu Gly Leu Pro Pro Ser 40 45 50 TGG TAC AAG GTG TTC GAC CCT TCC TGC GGG CTC CCT TAC TAC TGG AAT 371 Trp Tyr Lys Val Phe Asp Pro Ser Cys Gly Leu Pro Tyr Tyr Trp Asn 55 60 65 GCA GAC ACA GAC CTT GTA TCC TGG CTC TCC CCA CAT GAC CCC AAC TCC 419 Ala Asp Thr Asp Leu Val Ser Trp Leu Ser Pro His Asp Pro Asn Ser 70 75 80 GTG GTT ACC AAA TCG GCC AAG AAG CTC AGA AGC AGT AAT GCA GAT GCT 467 Val Val Thr Lys Ser Ala Lys Lys Leu Arg Ser Ser Asn Ala Asp Ala 85 90 95 GAA GAA AAG TTG GAC CGG AGC CAT GAC AAG TCG GAC AGG GGC CAT GAC 515 Glu Glu Lys Leu Asp Arg Ser His Asp Lys Ser Asp Arg Gly His Asp 100 105 110 115 AAG TCG GAC CGC AGC CAT GAG AAA CTA GAC AGG GGC CAC GAC AAG TCA 563 Lys Ser Asp Arg Ser His Glu Lys Leu Asp Arg Gly His Asp Lys Ser 120 125 130 GAC CGG GGC CAC GAC AAG TCT GAC AGG GAT CGA GAG CGT GGC TAT GAC 611 Asp Arg Gly His Asp Lys Ser Asp Arg Asp Arg Glu Arg Gly Tyr Asp 135 140 145 AAG GTA GAC AGA GAG AGA GAG CGA GAC AGG GAA CGG GAT CGG GAC CGC 659 Lys Val Asp Arg Glu Arg Glu Arg Asp Arg Glu Arg Asp Arg Asp Arg 150 155 160 GGG TAT GAC AAG GCA GAC CGG GAA GAG GGC AAA GAA CGG CGC CAC CAT 707 Gly Tyr Asp Lys Ala Asp Arg Glu Glu Gly Lys Glu Arg Arg His His 165 170 175 CGC CGG GAG GAG CTG GCT CCC TAT CCC AAG AGC AAG AAG GCA GTA AGC 755 Arg Arg Glu Glu Leu Ala Pro Tyr Pro Lys Ser Lys Lys Ala Val Ser 180 185 190 195 CGA AAG GAT GAA GAG TTA GAC CCC ATG GAC CCT AGC TCA TAC TCA GAC 803 Arg Lys Asp Glu Glu Leu Asp Pro Met Asp Pro Ser Ser Tyr Ser Asp 200 205 210 GCC CCC CGG GGC ACG TGG TCA ACA GGA CTC CCC AAG CGG AAT GAG GCC 851 Ala Pro Arg Gly Thr Trp Ser Thr Gly Leu Pro Lys Arg Asn Glu Ala 215 220 225 AAG ACT GGC GCT GAC ACC ACA GCA GCT GGG CCC CTC TTC CAG CAG CGG 899 Lys Thr Gly Ala Asp Thr Thr Ala Ala Gly Pro Leu Phe Gln Gln Arg 230 235 240 CCG TAT CCA TCC CCA GGG GCT GTG CTC CGG GCC AAT GCA GAG GCC TCC 947 Pro Tyr Pro Ser Pro Gly Ala Val Leu Arg Ala Asn Ala Glu Ala Ser 245 250 255 CGA ACC AAG CAG CAG GAT TGAAGCTTCG GCCTCCCTGG CCCTGGGTTA 995 Arg Thr Lys Gln Gln Asp 260 265 AAATAAAAGC TTTCTGGTGA TCCTG 1020 配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：子宮頚癌上皮様細胞セルライン：ＨｅＬａ−Ｓ３配列 Gly Xaa Arg Ser Thr Ser Ser Thr Lys Ser Gly Lys Phe Met Asn Pro 1 5 10 15 Thr Asp Gln Ala Arg Lys Glu Ala 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵＡ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵＥＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者佐伯美帆呂神奈川県相模原市西大沼２−52−12 グリーンヴィラ 301号 (72)発明者加藤誠志神奈川県相模原市若松３−46−50 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA04 CA20 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 HA11 4B063 QA13 QQ08 QQ42 QQ43 QR56 QS34 4B064 AG01 CA02 CA50 CC01 CC24 CD09 CE02 CE12 DA01 DA13 4C085 AA13 AA17 CC03 CC21 EE01 4H045 AA10 AA11 CA41 DA75 EA28 EA50 FA70 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト転
写関連蛋白質。
【請求項２】配列番号１のアミノ酸配列における１も
しくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された
アミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質。
【請求項３】請求項１または請求項２記載のヒト転写
関連蛋白質をコードするヒト遺伝子。
【請求項４】請求項３のヒト遺伝子のｃＤＮＡであっ
て、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項５】配列番号２の塩基配列における一部連続
配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項６】請求項４のｃＤＮＡを保有する組換えベ
クター。
【請求項７】請求項１または２のヒト転写関連蛋白質
に対する抗体。