JP2003259871A - 脳特異的発現を示す分泌タンパク質ｃｒｅｇ２とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵素Ｕ
ＳＰ１７の基質タンパク質と、その遺伝子操作材料等を
提供する。 【解決手段】 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵
素の基質タンパク質であって、特定のアミノ酸配列を有
するヒトCREG2分泌タンパク質と、別の特定アミノ酸配
列を有するマウスCreg2タンパク質、およびこれらのタ
ンパク質をそれぞれコードするヒト遺伝子およびマウス
遺伝子のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはそれ
らの相補配列から精製されたポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、脳特異的
調節を受ける脱ユビキチン化酵素USP17の基質タンパク
質（ヒトCREG2およびマウスCreg2）と、その遺伝子操作
材料および抗体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ユビキチン（ubiquitin）は真核細胞に
普遍的に見出される低分子タンパク質であり、細胞内に
おけるタンパク質の分解排除機構（ユビキチン共役タン
パク質分解またはエネルギー依存性タンパク質分解）を
担っている。このユビキチンによるタンパク質分解にお
いては、その分解酵素である脱ユビキチン化酵素（ユビ
キチンリガーゼ）が重要な役割を果たしており、その基
質特異性によって、分解排除するタンパク質を分解から
守っている。

【０００３】この出願の発明者らは、脳特異的調節を受
ける脱ユビキチン化酵素（ユビキチン特異的プロテアー
ゼ）USP17を同定し、この酵素がヒト染色体4p16.1上の
タンデム繰り返しRS447メガサテライトシーケンスにコ
ードされていることを見出している（Genomics 42: 278
-283, 1997; Genomics 54: 39-49, 1998; Genomics 67:
291-300, 2000）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】脳特異的に調節される
脱ユビキチン化酵素は、当然のことながら脳特異的に発
現するタンパク質をその基質とし、脳内の基質の機能を
調節していることが想定される。そしてそのようなタン
パク質は、中枢神経系の特徴的な構造や高次機能に重要
な担っていることが期待され、中枢神経系の構造的また
は機能的疾患に対する治療法の開発や、薬剤開発のター
ゲット等として期待される。

【０００５】しかしながら、脱ユビキチン化酵素USP17
に対する特異的な基質タンパク質は未だ見出されていな
い。

【０００６】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、この出願の発明者らが同
定した脱ユビキチン化酵素USP17に対する基質タンパク
質を提供することを課題としている。

【０００７】またこの出願の発明は、この基質タンパク
質の遺伝子操作材料と、抗体を提供することを課題とし
ている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するための発明として、以下の(1)〜(22)の発明
を提供する。 (1) 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵素USP17の
基質タンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列を
有するヒトタンパク質CREG2をコードするヒト遺伝子。 (2) cDNAが配列番号１の塩基配列を有する前記発明(1)
のヒト遺伝子。 (3) 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵素USP17の
基質タンパク質であって、配列番号４のアミノ酸配列を
有するマウスタンパク質Creg2をコードするマウス遺伝
子。 (4) cDNAの一部が配列番号３の塩基配列を有する前記
発明(3)のマウス遺伝子。 (5) 前記発明(1)のヒト遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDN
Aまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレオ
チド。 (6) 前記発明(3)のマウス遺伝子のゲノムDNA、mRNA、c
DNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌクレ
オチド。 (7) 前記発明(5)のポリヌクレオチドにストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブ。 (8) 前記発明(6)のポリヌクレオチドにストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロ
ーブ。 (9) 前記発明(5)のポリヌクレオチドをPCR増幅するオ
リゴヌクレオチドプライマーセット。 (10) 前記発明(6)のポリヌクレオチドをPCR増幅するオ
リゴヌクレオチドプライマーセット。 (11) 前記発明(5)のポリヌクレオチドを保有する組換
えベクター。 (12) 前記発明(6)のポリヌクレオチドを保有する組換
えベクター。 (13) 前記発明(11)の組換えベクターによる形質転換体
細胞。 (14) 前記発明(12)の組換えベクターによる形質転換体
細胞。 (15) 前記発明(1)の遺伝子の発現産物であって、配列
番号２のアミノ酸配列を有するヒトCREG2。 (16) 前記発明(13)の形質転換体細胞によって産生され
る前記発明(15)のヒトCREG2。 (17) 前記発明(3)の遺伝子の発現産物であって、配列
番号４のアミノ酸配列を有するマウスCreg2。 (18) 前記発明(14)の形質転換体細胞によって産生され
る前記発明(17)のマウスCreg2。 (19) 配列番号２における連続５アミノ酸残基以上のア
ミノ酸配列からなるオリゴペプチド。 (20) 配列番号４における連続５アミノ酸残基以上のア
ミノ酸配列からなるオリゴペプチド。 (21) 前記発明(15)のヒトCREG2を認識する抗体。 (22) 前記発明(17)のマウスCreg2を認識する抗体。

【０００９】すなわち、この出願の発明者らは、脱ユビ
キチン化酵素USP17と相互作用するタンパク質を、酵母t
wo-hybrid system（Clontech）を用いてヒト脳cDNAライ
ブラリーからスクリーニングし、新規タンパク質CREG2
を同定した。このCREG2のアミノ酸配列は、既知タンパ
ク質CREG（cellular repressor of E1A-stimulated gen
es：Mol. Cell. Biol. 18: 5032-5041, 1998）に対して
のみ有意（38%）な類似性を示した。CREG遺伝子は広範
囲の真核生物において良く保存されており、多能性幹細
胞の分化促進機能を有する分泌性の糖タンパク質をコー
ドしている（Mol. Cell. Biol. 18: 5032-5041, 1998;
Oncogene 19: 2120-2128, 2000）。また、発明者らは、
ヒトCREG2のマウスorthologueとしてマウスCreg2をも同
定することに成功した。

【００１０】この出願の発明は、以上のとおりの新規ヒ
トおよびマウス遺伝子、並びにそれらの発現タンパク質
を基礎とするものである。なお、前記の発明において、
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は
特定塩基数の断片を意味するものでなく、一応の目安と
して100bp以上の断片をポリヌクレオチド、100bp未満の
断片をオリゴヌクレオチドとするが、例外も存在する。
同様に、オリゴペプチドについても特定範囲のアミノ酸
残基数に限定されるものではない。

【００１１】以下、この出願の発明について、実施形態
を詳しく説明する。

【００１２】

【発明の実施の形態】発明(1)のヒト遺伝子は、脱ユビ
キチン化酵素USP17に対する基質タンパク質であって、
配列番号２のアミン酸配列を有するヒトCREG2をコード
するゲノム遺伝子である。そしてこのヒト遺伝子は、転
写されるmRNAから合成されるcDNAが配列番号１の塩基配
列を有している。

【００１３】また、発明(3)のマウス遺伝子は、配列番
号４のアミノ酸配列を有するマウスCreg2をコードする
ゲノム遺伝子であり、このマウス遺伝子は、そのcDNAが
配列番号３の塩基配列を有している。

【００１４】なお、このヒトおよびマウス遺伝子には、
それがコードするタンパク質の発現に対する制御領域
（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も含
まれる。これらの発現制御領域は、新規ヒトタンパク質
CREG2およびマウスタンパク質Creg2の更なる機能や遺伝
子の欠失変異等のメカニズムを解明するためにも有用で
ある。

【００１５】発明(1)および(3)の遺伝子は、例えば、そ
れぞれ配列番号１および３の塩基配列またはその一部配
列からなる精製ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドをプローブとしてヒトおよびマウスゲノムDNAライ
ブラリーをスクリーニングすることによって単離するす
ることができる。得られたゲノム遺伝子は、例えば、PC
R（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic a
cid sequence based amplification）法、TMA（Transcr
iption-mediated amplification）法およびSDA（Strand
Displacement Amplification）法などの通常行われる
遺伝子増幅法により増幅することができる。

【００１６】そして、このゲノム遺伝子やこの遺伝子が
転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから、発明(5)お
よび(6)の精製ポリヌクレオチド（DNA断片やRNA断片）
を調製することができる。例えば、cDNAはヒトおよびマ
ウスのそれぞれの細胞から抽出したポリ(A)＋RNAを鋳型
として合成することができる。例えばヒト細胞として
は、人体から手術などによって摘出されたものでも培養
細胞でもよい。cDNAは、公知の方法（Mol. Cell Biol.
2, 161-170, 1982； J. Gene 25, 263-269, 1983；Gen
e, 150, 243-250, 1994）を用いて合成することができ
る。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−とし
て、ヒトおよびマウス細胞から単離したmRNAを鋳型とす
るRT-PCR法を用いて、目的cDNAを合成することもでき
る。このようにして調製されるヒトCREG2 cDNAは、具体
的には配列番号１の塩基配列を有している。また、マウ
スCreg2 cDNAの一部は配列番号３の塩基配列を有してい
る。これらのポリヌクレオチドは、例えばこの発明のヒ
トCREG2およびマウスCreg2の遺伝子工学的な製造に使用
することができる。

【００１７】発明(7)および(8)のオリゴヌクレオチドプ
ローブは、前記のポリヌクレオチドにストリンジェント
条件下でハイブリダイズするDNA断片またはRNA断片であ
る。例えば、配列番号１または３の塩基配列における連
続10〜100bpのDNA断片等である。ここで、ストリンジェ
ント条件とは、前記のポリヌクレオチドとプローブとの
特異的なハイブリッド形成を可能とする条件であり、ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、
有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、温度条件によって
規定される。詳しくは、米国特許No. 6,100,037等に詳
しく規定されている。

【００１８】発明(9)および(10)のプライマーセット
は、前記のポリヌクレオチドをPCR増幅するための１対
のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセッ
トは、配列番号１または３の塩基配列に基づき設計し、
合成・精製の各工程を経て調製することができる。な
お、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘
することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、
鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングを満足させるこ
とを考慮し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。
ただし、LA（long accurate）PCRを行う場合には、少な
くとも30塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）と
アンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対
（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両
プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー
内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列を
も避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合
を確保するためGC含量を約50％にし、プライマー内にお
いてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。
アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存
するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55-
65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PC
Rにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約１μM
になるよう調整する等を留意すうことも必要である。ま
た、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOl
igoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENET
YX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いるこ
ともできる。

【００１９】発明(11)および(12)の組換えベクターは、
クローニングベクターまたは発現ベクターであり、イン
サートしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的
等に応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたは
そのORF領域をインサートとしてこの発明のヒトCREG2ま
たはマウスCreg2を生産する場合には、インビトロ転写
用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、
酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれ
に適した発現ベクターを使用することができる。また、
前記のゲノム遺伝子DNAをインサートとする場合には、B
AC（BacterialArtificial Chromosome）ベクターやコス
ミドベクター等を使用することもできる。

【００２０】発明(13)および(14)の形質転換体細胞は、
例えば、前記発明(11)または(12)の組換えベクターを用
いてヒトCREG2またはマウスCreg2を製造する場合には、
大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳
動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これ
らの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム
法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法
によって組換えベクターを細胞に導入することによって
調製することができる。

【００２１】発明(15)は、発明(1)のヒト遺伝子の発現
産物であり、配列番号２のアミノ酸配列を有する精製タ
ンパク質（ヒトCREG2）である。この精製タンパク質
は、抗体作製のための免疫源として、あるいは脱ユビキ
チン化酵素USP17やヒヒトCREG2が関与する各種疾患の治
療薬を開発するための標的分子等として有用である。ま
た、発明(17)は、発明(3)のマウス遺伝子の発現産物で
あり、配列番号４のアミノ酸配列を有する精製タンパク
質である。

【００２２】これらのタンパク質は、後記のとおり、多
能性幹細胞の分化促進機能を有する分泌性の糖タンパク
質であり、例えば、ニューロンまたはグリア細胞の生存
を促進したり、未分化脳幹細胞のニューロンへの分化誘
導等のために使用することができる。また特殊なニュー
ロンまたはグリア細胞を識別するマーカータンパク質と
しても有用である。

【００２３】これらの精製タンパク質は、ヒトまたはマ
ウスの細胞から単離する方法、配列番号２または４のア
ミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製す
る方法等によって得ることができるが、好ましくは、前
記発明(13)または(14)の形質転換細胞から単離・精製す
る方法によって大量に生産することができる（発明(16)
(18)）。すなわち、形質転換体細胞を培養し、その培養
物から、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による
処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透
析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点
電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィー等によって単離、精製すること
によりこの発明の精製ヒトCREG2またはマウスCreg2を大
量に得ることができる。なお、このような遺伝子工学的
手法によって得られたヒトCREG2またはマウスCreg2に
は、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれ
る。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（GS
T）や緑色蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質などが例示
できる。さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻訳さ
れた後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したが
って、修飾されたタンパク質もこの発明のMASKの範囲に
含まれる。このような翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチ
オニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プ
ロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレ
ニル化、リン酸化などである。

【００２４】発明(19)および(20)のオリゴペプチドは、
それぞれ配列番号２および４における連続５アミノ残基
以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。このペプ
チドは、前記発明(15)のヒトCREG2または前記発明(17)
のマウスCreg2を適当な分解酵素で分解する方法や、公
知の固相ペプチド合成法によって調製することができ
る。これらのペプチドはこの発明のヒトCREG2またはマ
ウスCreg2に対する抗体作製の抗原として有用である。

【００２５】発明(21)および(22)の抗体は、それぞれ前
記のヒトCREG2およびマウスCreg2を認識するポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体であり、ヒトCREG2
またはマウスCreg2のエピトープに結合することができ
る全体分子、およびFab、F(ab')₂、Fv断片等が全て含ま
れる。このような抗体は、前記の精製ヒトCREG2または
マウスCreg2、もしくはそれらのペプチドを抗原として
用いて動物を免役した後、血清から得ることができる。
あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝
子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を
採取することによって作製することができる。動物とし
ては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが
用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞を
ミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、
モノクロ−ナル抗体を産生することができる。

【００２６】以下、この発明のヒトCREG2およびマウスC
reg2の同定とその機能確認のために行った実験とその結
果について説明する。 1. クローニング 最初に酵母two-hybridスクリーニングを用いてヒトCREG
2のcDNAクローンを入手したが、このクローンにはCREG2
タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレ
ーム（ORF）全体の約1/2が含まれていた。全長のCREG2
cDNAを得るために、ヒト全脳および海馬のMarathon Rea
dy( cDNAライブラリー（Clonetech）を用いたcDNA端の
5'RACEを行った。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、Exp
and( Long Templete PCR System（Roche）を用いて行っ
た。個別のRACE産物に対する配列分析の結果、開始メチ
オニンをコードすると思われるATGコドンが存在した
が、このATGコドンより上流側にはフレーム内のストッ
プコドンが存在しないことが分かった。これらのcDNAが
確実な最初のATGコドンを持つORFシーケンス全体を含む
かどうかについては、その時点では不明であった。ヒト
CREG2タンパク質のN末端をマウスCreg2に対するオーソ
ログと比較しつつ確認するため、マウスCreg2cDNAの単
離を次のように試みた。すなわち、GenBankデータベー
スを調べ、アミノ酸配列レベルでヒトCREG2に対する高
いホモロジーを示すマウス由来のEST（アクセッショク
ン番号AW048995）がヒトCREG2タンパク質と約83%の相同
性を有することから、このESTがマウスCreg2 cDNAの一
部であると同定した。AW048995の配列に基づき、いくつ
かのプライマーを設計し、5'RACE法を用いてORF全体に
わたる配列を得た。一連の5'RACEにより、３種類の独立
した全長Creg2 cDNAクローンを得たが、これには3つの
フレーム内ストップコドンが、推定される最初のATGコ
ドンのさらに上流にあることが分かった（図２）。さら
に、最初のATGコドン周辺の配列はKozakのコンセンサス
シーケンスに対応している（図２）（Nucleic Acids Re
s. 15: 8125-8148, 1987）。このため、マウスCreg2 cD
NAにはCreg2タンパク質の全ORFが含まれていることが認
められる。得られたヒトCREG2 cDNAには推測されるATG
コドンの上流にフレーム内ストップコドンが存在しない
が、ヒトおよびマウスタンパク質のN末端における高レ
ベルの保存性のため、これらのcDNAには全ORFが含まれ
ている可能性が高く、このことからこれらのCREG2クロ
ーンは確実なN末端にわたっていることが確認された。C
REG2およびCreg2 cDNAは、それぞれ290および288個のア
ミノ酸残基をコードしている（図１、２）。ヒトCREG2
およびマウスCreg2のアミノ酸配列は、全領域で83%の同
一性を有している。しかしながらCREG2およびCREGのN末
端半分の保存性は比較的小さい（図３）。 2. ノーザンブロット解析 Human Normal Type Blot I（Gene Hunter）に対し、³²P
-標識ヒトCREG2 cDNAプローブを用いたハイブリダイゼ
ーションを行った。脱ハイブリダイゼーション後、全て
の膜に対し、³²P-標識ヒトGAPDH cDNAを用いた再ハイブ
リダイゼーションを行いった。

【００２７】その結果は図４に示したとおりであり、CR
EG2は成人の脳に特異的に発現しており、心臓、肝臓、
膵臓、胎盤、肺などには発現が見られなかった。図４に
示すように、ヒト脳では2つの主な転写産物、すなわち
2.6kbおよび7.0kbが検出された。胎児組織でも、CREG2
転写産物は脳のみに検出された。

【００２８】また、2つの異なるプライマーセットによ
るMultiple Tissue cDNA (MTC() Panels（Clontech）を
用いたRT-PCR分析により、脳特異的なCREG2発現が確認
され、この結果はノーザンブロット分析の結果と完全に
一致していた。

【００２９】次に成人脳組織内のCREG2発現を、Human B
rain MTN Blot II（Clontech）およびHuman Brain MTN
Blot IV（Clontech）を用いて調べた。ノーザンブロッ
ト分析の方法は前記と同様である。脳内2.6kbおよび7.0
kb転写産物の集中発現は、大脳皮質、扁桃体および海馬
にみられたが、小脳にはみられず、脊髄にはほとんど存
在しなかった（図５および６）。また、比較的強い発現
が視床に、これより弱い発現が尾状核、脳梁、および黒
質に見られた。これらの結果から、CREG2タンパク質は
ニューロンおよび/あるいはヒト脳辺縁系を形成するグ
リア細胞において重要な役割を果たしていることが示唆
される。

【００３０】次に、マウス組織中のCreg2の発現を、Mou
se MTN Blot（Clontech）を用いて調査した。この膜に
対し、³²P-標識マウスCreg2 cDNAプローブを用いたハイ
ブリダイズさせ、脱ハイブリダイゼーション後、³²P-標
識マウスGAPDH cDNAプローブを用いた再ハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００３１】その結果、ヒトCREG2転写産物とは異な
り、5.5kbの転写産物のみが塗末産物を伴って脳内に検
出された。ヒトの場合と同様に、Creg2転写産物は心
臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、および腎臓には見られな
かった（図７）。脳特異的な発現がヒトおよびマウスの
両方にみられることから、CREG2およびCreg2は中枢神経
系において重要な役割を果たしていることが示唆され
た。 3. ウェスタンブロット分析 EGFP（enhanced green fluorescent protein）のN末端
を結合したCREG2、Creg2およびCREGタンパク質のそれぞ
れの発現プラスミド作製した。すなわち、ストップコド
ンを欠いた各タンパク質cDNAの全ORFをPCR増幅し、各PC
R産物をpEGFP-N1ベクター（Clontech）にクローニング
した。これら3種類のプラスミドをNIH3T3、HeLaおよびC
OS7細胞にトランスフェクションし、細胞内の局在化を
調べた。CREG2、Creg2およびCREGについて、EGFPの同様
な細胞内局在化シグナルが検出されたが、これは分泌性
タンパク質に典型的な現象である。CREGタンパク質は分
泌型糖タンパク質として知られている（Oncogene 19: 2
120-2128, 2000）が、ヒトCREG2およびマウスCreg2もま
た分泌タンパク質である可能性がある。

【００３２】CREGを含むほとんどの分泌タンパク質はグ
リコシル化されていることが示されている。CREG2のグ
リコシル化の有無を調べるため、pcDNA3.1(-)Myc-HisB
ベクター（Invitrogen）を用いて、カルボキシ末端にmy
cタグを持つ全長CREG2またはCreg2の発現ベクターを作
成し、LipofectAMINE PLUS(試薬（BRL）を用いてこれら
のプラスミドをHeLa細胞へトランスフェクションした。
ヒトCREG2およびマウスCreg2には、N-グリコシル化を受
ける可能性のある部位がそれぞれ2カ所存在しており、
これらの部位の1つはヒト、マウス間で保存されてい
る。CREG2のN165（165番目Asn）およびN166（166番目As
n）、そしてマウスCreg2のN164（164番目Asn）およびN1
86（186番目Asn）はN-グリコシル化を受ける可能性があ
るアスパラギン残基である。ヒトCREG2およびマウスCre
g2の分子量は、抗-mycタグ抗体（MBL）を用いたウェス
タンブロットでは、ほぼ同一であった（図８）。mycタ
グを持つCREG2またはCreg2をトランスフェクションした
細胞に由来する全細胞抽出物について、ペプチド-N-グ
ルコシダーゼF（PNGase F）を処理した結果、CREG2およ
びマウスCreg2のバンドは低分子量側に移動し、ペプチ
ド-N-グルコシダーゼにより糖鎖が除去されたことを示
唆した結果となった（図８）。ツニカマイシン処理もま
た、PNGase F処理と同様の結果を示した（図８）。これ
らの結果全ては、ヒトCREG2およびマウスCreg2はN-グリ
コシル化を受けている事実を示している。

【００３３】次に、ヒトCREG2およびマウスCreg2がN-グ
リコシル化されることを確認するため、N-グリコシル化
欠損CREG2タンパク質をコードする変異発現プラスミド
を作製した。このプラスミドでは2つのコンセンサスア
スパラギン残基を、それぞれグルタミン残基に変異させ
ている。mycタグを持つCREG2（N165Q、N166Q）、Creg2
（N164Q、N186Q）をコードする発現プラスミドを、それ
ぞれHeLa細胞にトランスフェクションした。CREG2（N16
5Q、N166Q）およびCreg2（N164Q、N186Q）変異タンパク
質は、予想通りにN-グリコシル化を受けなかった（図
８）。マウスCreg2の場合では、さらに2種類のプラスミ
ドを作成した。すなわち、それぞれmycタグを持つCreg2
N164QおよびCreg2N186Qをそれぞれコードするプラスミ
ドである。Creg2N164Q変異タンパク質は、N186が未変化
のままであったにも関わらず、N-グリコシル化を受けな
かった。一方、Creg2N186Qの結果は野生型Creg2の場合
と全く同一であった。

【００３４】これらの結果から、ヒトCREG2およびマウ
スCreg2の両方で保存されているN164がN-グリコシル化
されることが示された。ヒトCREG2の場合では、N165ま
たはN166のいずれがN-グリコシル化を受けるかという問
題については確認されていないが、1つのアスパラギン
残基のみがN-グリコシル化を受けている可能性が高く、
これはヒトおよびネズミのCREG2タンパク質がウェスタ
ンブロット分析において同一の分子量を示すという事実
から推定されている（図８）。

【００３５】特記すべき点としては、N末端を欠いたΔ4
6NCREG2およびΔ46NCreg2はもはやN-グリコシル化の基
質にはならないという点である（図８）。

【００３６】これらの結果から、CREG2タンパク質にはN
末端シグナル配列が存在し、これが小胞体内部への移行
に必要とされることが示される。このトランスフェクシ
ョン実験ではmycタグを持つCREGタンパク質もやはりN-
グリコシル化されておりシグナル配列が存在していた
が、これは文献（Oncogene 19: 2120-2128, 2000）の記
述と一致している。

【００３７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、脳特異的調節を受けている脱ユビキチン
化酵素の基質タンパク質として、ヒトCREG2およびマウ
スCreg2と、その遺伝子材料および抗体が提供される。
これらの発明は、脳内、特に大脳偏縁系のニューロンま
たはグリア細胞の生存を促進したり、未分化脳幹細胞を
大脳偏縁系に特化したニューロンに分化誘導するなど
の、医療分野において有用である。また、基礎研究にお
いては、ある特殊なニューロンまたはグリア細胞を識別
するマーカータンパク質としても利用可能である。

【００３８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> A substrate for the brain-specific ubiquitin ligase <130> NP01329-YS <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 3201 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (139)..(1011) <400> 1 gcgggggacc gcgcccgggg atcctgcagg ggcgggaagg gggctcgggc tccttgcttc 60 cgccgcagtg gggcgctgcc gggctccccg gcactagcgc tgctggcggc cccggcggcc 120 gggcgtgctg cctgcaag atg tcc gtg cgc cgc ggc cgg cgg ccg gcg cgg 171 Met Ser Val Arg Arg Gly Arg Arg Pro Ala Arg 1 5 10 ccg ggg acc cgc ctc tcc tgg ctg ctg tgc tgc agc gcc ctg ctg tcc 219 Pro Gly Thr Arg Leu Ser Trp Leu Leu Cys Cys Ser Ala Leu Leu Ser 15 20 25 ccg gcc gcg ggc tac gtg atc gtg agc tcc gtg tct tgg gcc gtc acc 267 Pro Ala Ala Gly Tyr Val Ile Val Ser Ser Val Ser Trp Ala Val Thr 30 35 40 aac gag gtg gac gag gag ctg gac agc gcc tcc act gag gag gct atg 315 Asn Glu Val Asp Glu Glu Leu Asp Ser Ala Ser Thr Glu Glu Ala Met 45 50 55 ccc gcg ctg cta gag gat tcg ggc agc atc tgg cag caa agc ttc ccc 363 Pro Ala Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ile Trp Gln Gln Ser Phe Pro 60 65 70 75 gcc tct gcc cac aag gag gac gcg cac ctg cgg ccc cgg gcg ggc gcc 411 Ala Ser Ala His Lys Glu Asp Ala His Leu Arg Pro Arg Ala Gly Ala 80 85 90 gcc cgg gcc agg ccg ccc ccc gcg cca ccc ggg atg ttc tcc tac cgg 459 Ala Arg Ala Arg Pro Pro Pro Ala Pro Pro Gly Met Phe Ser Tyr Arg 95 100 105 cgc gag ggc ggc cag acg gcc agt gcg ccc ccg ggc cct aga ctg cgc 507 Arg Glu Gly Gly Gln Thr Ala Ser Ala Pro Pro Gly Pro Arg Leu Arg 110 115 120 gcc gcc acc gcc cgc tcc ctg gcc cat gcc agc gtc tgg ggc tgc ctg 555 Ala Ala Thr Ala Arg Ser Leu Ala His Ala Ser Val Trp Gly Cys Leu 125 130 135 gcc acc gtg tcc acc cac aag aag atc caa gga ctg cca ttt ggg aac 603 Ala Thr Val Ser Thr His Lys Lys Ile Gln Gly Leu Pro Phe Gly Asn 140 145 150 155 tgc ctg ccc gtc agt gat ggc ccc ttc aac aat agc act ggg att cct 651 Cys Leu Pro Val Ser Asp Gly Pro Phe Asn Asn Ser Thr Gly Ile Pro 160 165 170 ttc ttc tac atg aca gcc aag gac ccc gtg gtg gct gat ctg atg aag 699 Phe Phe Tyr Met Thr Ala Lys Asp Pro Val Val Ala Asp Leu Met Lys 175 180 185 aac ccc atg gcc tcg ctg atg ctg cca gaa tca gaa ggg gag ttc tgc 747 Asn Pro Met Ala Ser Leu Met Leu Pro Glu Ser Glu Gly Glu Phe Cys 190 195 200 aga aaa aac atc gtt gat ccg gaa gat ccc cga tgt gtc cag tta acg 795 Arg Lys Asn Ile Val Asp Pro Glu Asp Pro Arg Cys Val Gln Leu Thr 205 210 215 ctc act ggc cag atg atc gca gtg tct cca gaa gaa gta gaa ttt gcc 843 Leu Thr Gly Gln Met Ile Ala Val Ser Pro Glu Glu Val Glu Phe Ala 220 225 230 235 aag caa gcc atg ttt tca agg cac cca ggg atg agg aag tgg cct cgt 891 Lys Gln Ala Met Phe Ser Arg His Pro Gly Met Arg Lys Trp Pro Arg 240 245 250 caa tat gaa tgg ttc ttt atg aag atg agg ata gaa cat atc tgg ctt 939 Gln Tyr Glu Trp Phe Phe Met Lys Met Arg Ile Glu His Ile Trp Leu 255 260 265 cag aaa tgg tat gga ggc gca tcc agt att tca agg gag gaa tat ttc 987 Gln Lys Trp Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Ile Ser Arg Glu Glu Tyr Phe 270 275 280 aaa gca gtt ccc aga aag gcc tga tggagtgaga agaaagtcct tggtgtttgc 1041 Lys Ala Val Pro Arg Lys Ala 285 290 acttaaataa aaaccttttc agtgatgcag ccagacagct attgaccact gtctctttgt 1101 tgaagggttc atagcagccc tgccatccct gcagcagaat gagagagggt gaacagggaa 1161 ctctatgcta gatttgagat taaagtggtc atttgcagat ctccaactca cacagatact 1221 tcacgtagat agtctttatt ccattgtatt caatccagac tcatcgattc agaaatcata 1281 taatagctgg tggtcaaaat gacatgttga gatcattgtt gtttcattgt ttaagaaaaa 1341 aaaaaaatgc ctgtacctac aatgtgattg ctttgtattg tgagagtatc tttgttgctt 1401 gctctgccaa atgcagtctt ggttctaagt tcacttgtga ccacgaagca gctgactgtg 1461 catcacgcag tcacaatatt gtttttaggg tgagggtggg aggactgtgt gtccgtggat 1521 tactcctcct gctggtggat tgcagatgca ttattaggtc atactggcta gaatgcagct 1581 tttctcccac cataacatga aaacagtgta agaacatagg gtgctttgtg catagccctt 1641 ctctatgtaa gcagccatgg cagtcattaa agagaaagga gtagctttga cattaagctc 1701 cccagatccc tgctgctcat acttctggca agggttcccc tctctcatgc atgaacaggg 1761 gcatccaaaa taagaagctc tccattctgt ggtggggaaa gcggagaggg gagtgggtga 1821 agctgggaaa gtaaaggcag cacgttacag aaggaagaaa ggaagccagt aactgagggc 1881 ccactgcctg cccggccctg ggccaggccc tcaacagaag ccatctcatt taagcccttg 1941 caaccaatga gatgcacgtc atcattggct cttacagaca agaaaactag actcagaggg 2001 gctgagtcca catcccagac agctcactgc agacacaggt ggagtggttc ctacaagaca 2061 tccagtttta acaacaaaag agttattgaa atgcatgggt agaaattgaa ccaggaaaat 2121 cagtaaagtg attgtaaaaa agaaggacta gcttgcctgg agatgatgtt tcttgctttt 2181 ggaaaaaaaa aaaaaagtct ctgaaatttg attcttacta cagatttaaa actttctaca 2241 tattatatgt aggagctcct agtgtttttg agaaattaga ctgtacctgt gtacacttct 2301 aaggtctaca tggacctatg tatatatatc taagacctct gatcattaaa acctataaag 2361 ggttgagctg tcccaagttt tctgtctttc tgtaatggct acaaactttc tttggtaggt 2421 tagggaggtt gtataacata aaaaacacat cactatatgt aggaaatata catttttcaa 2481 gtaaataaga gtgttattaa tgattatgaa cttttgctta acaaaataac atacaacgag 2541 agcttgagtt gtcaaaatat attttaatta tctattgcta aaaacatagt aagatgcaga 2601 gaattcttta tttgtcataa gccagtcctc aaaagagttc ctaacagtag tgatttctaa 2661 tatataagaa taaggtactt ctgagggaat tttatatttt cagagtttaa aattattgct 2721 actcccaatt tagaaaaatg gggagaaagc tggaagaaca aatgacatgc tcaaatgtat 2781 tgcataagtc aacctcacac cttaatactg ggagcttctc tgcctcctga tcctgtcttg 2841 cagataaggt cccctggcta ggtttgcgtt tatagtcagg ttccatttag ctcattaaag 2901 gtcactgctg cttcaaagga ctttgcccag tggatgccat tcataaccac agatgaatgt 2961 tatcagctat ttatccaaat tacaggaaat gaaacctgaa aaggttgggt aagaatagtg 3021 ttgaaaattc atagttttaa gtttgatggt ctccattcag gcaagtgtgt ttcagcaaat 3081 ctctagaaat ttacattgat taaaatgtta gaggctgttc tggaagttct agacatggca 3141 ataaggcaag aaaaagagat taaatgcata cagacctcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3201 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Val Arg Arg Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Gly Thr Arg Leu 1 5 10 15 Ser Trp Leu Leu Cys Cys Ser Ala Leu Leu Ser Pro Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Val Ile Val Ser Ser Val Ser Trp Ala Val Thr Asn Glu Val Asp Glu 35 40 45 Glu Leu Asp Ser Ala Ser Thr Glu Glu Ala Met Pro Ala Leu Leu Glu 50 55 60 Asp Ser Gly Ser Ile Trp Gln Gln Ser Phe Pro Ala Ser Ala His Lys 65 70 75 80 Glu Asp Ala His Leu Arg Pro Arg Ala Gly Ala Ala Arg Ala Arg Pro 85 90 95 Pro Pro Ala Pro Pro Gly Met Phe Ser Tyr Arg Arg Glu Gly Gly Gln 100 105 110 Thr Ala Ser Ala Pro Pro Gly Pro Arg Leu Arg Ala Ala Thr Ala Arg 115 120 125 Ser Leu Ala His Ala Ser Val Trp Gly Cys Leu Ala Thr Val Ser Thr 130 135 140 His Lys Lys Ile Gln Gly Leu Pro Phe Gly Asn Cys Leu Pro Val Ser 145 150 155 160 Asp Gly Pro Phe Asn Asn Ser Thr Gly Ile Pro Phe Phe Tyr Met Thr 165 170 175 Ala Lys Asp Pro Val Val Ala Asp Leu Met Lys Asn Pro Met Ala Ser 180 185 190 Leu Met Leu Pro Glu Ser Glu Gly Glu Phe Cys Arg Lys Asn Ile Val 195 200 205 Asp Pro Glu Asp Pro Arg Cys Val Gln Leu Thr Leu Thr Gly Gln Met 210 215 220 Ile Ala Val Ser Pro Glu Glu Val Glu Phe Ala Lys Gln Ala Met Phe 225 230 235 240 Ser Arg His Pro Gly Met Arg Lys Trp Pro Arg Gln Tyr Glu Trp Phe 245 250 255 Phe Met Lys Met Arg Ile Glu His Ile Trp Leu Gln Lys Trp Tyr Gly 260 265 270 Gly Ala Ser Ser Ile Ser Arg Glu Glu Tyr Phe Lys Ala Val Pro Arg 275 280 285 Lys Ala 290 <210> 3 <211> 1278 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (412)..(1278) <400> 3 ggggtgcaat aactgagcct ggtgatgccc ttcttgttgg ctcagagaag ttaatcagct 60 tggtagagtc gcacagctga cgagcggagg ggtgcattga gcctgagctg tgaacgccca 120 ccctctggct gcaaaacgct tgccatcctg cggaaaacca agacacgcgt ggactctgcg 180 cccagcagcg gcggtggacg caggggactc tggtcgtgca gcagacttcg cttcttacgg 240 gagtgtaagg caatagggaa ccccggcccc cggactgatt ggagaccctc aacccgggaa 300 tcctatcacg aggagaaggg ttccgacgca cgctccgccg caggggggcg cccctggctg 360 gccgctgctt ggtcagtggt ccccgccaca gggcgcgtcg cctccaagaa g atg tcg 417 Met Ser 1 ctg tcc ggc agg gag cgt cct gct tgg cca ggg agt cgc ctg tcc tgg 465 Leu Ser Gly Arg Glu Arg Pro Ala Trp Pro Gly Ser Arg Leu Ser Trp 5 10 15 ttg cta tgc tgc agc gcc ctg ttg tcc cca gcc gcc ggc tac gtg atc 513 Leu Leu Cys Cys Ser Ala Leu Leu Ser Pro Ala Ala Gly Tyr Val Ile 20 25 30 gtg agc tcc gtg tcc tgg gct gtc acc aac gag gta gat gag gag ctg 561 Val Ser Ser Val Ser Trp Ala Val Thr Asn Glu Val Asp Glu Glu Leu 35 40 45 50 gac agt gca tcc act gag gag gcg ctg ccc gcg ctg ctg gag gac tcg 609 Asp Ser Ala Ser Thr Glu Glu Ala Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asp Ser 55 60 65 agt agc atc tgg cag cag agc ttt ccg gcc tcg gcg cac aag gag gac 657 Ser Ser Ile Trp Gln Gln Ser Phe Pro Ala Ser Ala His Lys Glu Asp 70 75 80 acg cac ctg cga cct cgg ggc tcc gcc cgc gcc agg ccc gca ccg gcc 705 Thr His Leu Arg Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ala 85 90 95 gcg cgt ggc atg ttc tcc tac cgg cgg gag agc ggc tca tct gag gca 753 Ala Arg Gly Met Phe Ser Tyr Arg Arg Glu Ser Gly Ser Ser Glu Ala 100 105 110 tcc cct ggc ccc agg gtg cat gcc ggc acc gcc cgc tcc cta gcc cac 801 Ser Pro Gly Pro Arg Val His Ala Gly Thr Ala Arg Ser Leu Ala His 115 120 125 130 gct agc tcc tgg ggc tgt ctg gcc act gtg tcc acc cac gaa aag atc 849 Ala Ser Ser Trp Gly Cys Leu Ala Thr Val Ser Thr His Glu Lys Ile 135 140 145 caa gga ctg ccc ttt ggg agc tgc ctg gcc atc agt gat ggc ccc gtc 897 Gln Gly Leu Pro Phe Gly Ser Cys Leu Ala Ile Ser Asp Gly Pro Val 150 155 160 cac aac agc aca ggg atc cct ttc ttc tac atg aca gcc aag gac cct 945 His Asn Ser Thr Gly Ile Pro Phe Phe Tyr Met Thr Ala Lys Asp Pro 165 170 175 gcg gtg gct gac ctg gtg aag aat ccc aca gcc tcg ctg gtg ctg ccg 993 Ala Val Ala Asp Leu Val Lys Asn Pro Thr Ala Ser Leu Val Leu Pro 180 185 190 gag tct gag ggg gag ttt tgc aga aaa aac atc gtc gac cca gaa gac 1041 Glu Ser Glu Gly Glu Phe Cys Arg Lys Asn Ile Val Asp Pro Glu Asp 195 200 205 210 ccc cga tgt gcc cgg tta acg ctc acc ggc cgg atg gtc acg gtg cca 1089 Pro Arg Cys Ala Arg Leu Thr Leu Thr Gly Arg Met Val Thr Val Pro 215 220 225 cca ggg gag gtg gag ttc gcc aag caa gcc atg ttt tca agg cac cca 1137 Pro Gly Glu Val Glu Phe Ala Lys Gln Ala Met Phe Ser Arg His Pro 230 235 240 ggg atg agg aag tgg ccc cga cag tat gaa tgg ttc ttc atg aag atg 1185 Gly Met Arg Lys Trp Pro Arg Gln Tyr Glu Trp Phe Phe Met Lys Met 245 250 255 tgg gta gaa cac atc tgg ctt cag aaa tgg tat gga ggt gta tct gac 1233 Trp Val Glu His Ile Trp Leu Gln Lys Trp Tyr Gly Gly Val Ser Asp 260 265 270 atc ccg agg gag gaa tac ttc aag gca gct cca agg aag gcc tga 1278 Ile Pro Arg Glu Glu Tyr Phe Lys Ala Ala Pro Arg Lys Ala 275 280 285 <210> 4 <211> 288 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ser Leu Ser Gly Arg Glu Arg Pro Ala Trp Pro Gly Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Trp Leu Leu Cys Cys Ser Ala Leu Leu Ser Pro Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Val Ile Val Ser Ser Val Ser Trp Ala Val Thr Asn Glu Val Asp Glu 35 40 45 Glu Leu Asp Ser Ala Ser Thr Glu Glu Ala Leu Pro Ala Leu Leu Glu 50 55 60 Asp Ser Ser Ser Ile Trp Gln Gln Ser Phe Pro Ala Ser Ala His Lys 65 70 75 80 Glu Asp Thr His Leu Arg Pro Arg Gly Ser Ala Arg Ala Arg Pro Ala 85 90 95 Pro Ala Ala Arg Gly Met Phe Ser Tyr Arg Arg Glu Ser Gly Ser Ser 100 105 110 Glu Ala Ser Pro Gly Pro Arg Val His Ala Gly Thr Ala Arg Ser Leu 115 120 125 Ala His Ala Ser Ser Trp Gly Cys Leu Ala Thr Val Ser Thr His Glu 130 135 140 Lys Ile Gln Gly Leu Pro Phe Gly Ser Cys Leu Ala Ile Ser Asp Gly 145 150 155 160 Pro Val His Asn Ser Thr Gly Ile Pro Phe Phe Tyr Met Thr Ala Lys 165 170 175 Asp Pro Ala Val Ala Asp Leu Val Lys Asn Pro Thr Ala Ser Leu Val 180 185 190 Leu Pro Glu Ser Glu Gly Glu Phe Cys Arg Lys Asn Ile Val Asp Pro 195 200 205 Glu Asp Pro Arg Cys Ala Arg Leu Thr Leu Thr Gly Arg Met Val Thr 210 215 220 Val Pro Pro Gly Glu Val Glu Phe Ala Lys Gln Ala Met Phe Ser Arg 225 230 235 240 His Pro Gly Met Arg Lys Trp Pro Arg Gln Tyr Glu Trp Phe Phe Met 245 250 255 Lys Met Trp Val Glu His Ile Trp Leu Gln Lys Trp Tyr Gly Gly Val 260 265 270 Ser Asp Ile Pro Arg Glu Glu Tyr Phe Lys Ala Ala Pro Arg Lys Ala 275 280 285

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトCREG2 cDNAのヌクレオチドおよびアミノ酸
配列であり、配列番号１と同一配列を示す。最長ORF
は、139番から始まり1011番で終わる290個のアミノ酸残
基をコードしている。星印は下流のフレーム内ストップ
コドン（TGA）を示す。円で囲んだ部位は2種類のN-グリ
コシル化部位である。

【図２】マウスCreg2 cDNAのヌクレオチドおよびアミノ
酸配列であり、配列番号３と同一配列を示す。最長ORF
は、412番から始まり1278番で終わる288個のアミノ酸残
基をコードしている。上流のフレーム内ストップコドン
（TAA、TAA、TAG）には下線を引いてある。下流のフレ
ーム内ストップコドン（TGA）は星印で示す。円で囲ん
だ部位は2種類のN-グリコシル化部位である。

【図３】ヒトCREG2、マウスCreg2、ヒトCREG（GenBank
No. AF084523）、マウスCREG（GenBank No. AF08452
4）、ハエCREG（GenBank No.AF084522）のアミノ酸配列
の比較である。保存された残基は黒い箱中の白文字で、
保存性の置換はカゲ付き箱で示す。

【図４】ヒトCREG2遺伝子のノーザンブロット分析の結
果である。Poly(A)⁺RNAは、心臓（レーン1）、脳（レー
ン2）、肝臓（レーン3）、膵臓（レーン4）、胎盤（レ
ーン5）、および肺（レーン6）に由来している。

【図５】ヒトCREG2遺伝子のノーザンブロット分析の結
果である。Poly(A)⁺RNAは、小脳（レーン1）、大脳皮質
（レーン2）、髄質（レーン3）、脊髄（レーン4）、大
脳後頭極（レーン5）、前頭葉（レーン6）、側頭葉（レ
ーン7）、および果核（レーン8）に由来している。

【図６】ヒトCREG2遺伝子のノーザンブロット分析の結
果である。Poly(A)⁺RNAは、扁桃体（レーン1）、尾状核
（レーン2）、脳梁（レーン3）、海馬（レーン4）、全
脳（レーン5）、黒質（レーン6）、および視床（レーン
7）に由来している。

【図７】マウスCreg2遺伝子のノーザンブロット分析の
結果である。Poly(A)⁺RNAは、心臓（レーン1）、脳（レ
ーン2）、脾臓（レーン3）、肺（レーン4）、肝臓（レ
ーン5）、骨格筋（レーン6）、および腎臓（レーン7）
に由来している。

【図８】ヒトCREG2またはマウスCreg2のcDNA、若しくは
それらの変異体をトランスフェクションした細胞の全細
胞抽出物に対するウェスタンブロット分析の結果であ
る。C末端にmycタグの存在するCREG2（レーン1、2、5、
6）、Creg2（レーン3、4、11、12）、CREG2（N165Q、N1
66Q）（レーン7、8）、Creg2（N164Q、N186Q）（レーン
13、14）、Δ46NCREG2（レーン9、10）、またはΔ46NCr
eg2（レーン15、16）をそれぞれ発現させた。細胞抽出
物は、PNGase Fの非存在（レーン1、3）または存在（レ
ーン2、4）条件下で、製造元（TaKaRa）のプロトコルに
従いインキュベーションを行った。ツニカマイシン（レ
ーン6、8、10、12、14、16）あるいは溶剤としてDMSO
（レーン5、7、9、11、13、15）を細胞培養に添加し（2
0μg/ml）、12時間後に細胞を収穫した。ウェスタンブ
ロット分析は抗-myc抗体（MBL）により、Enhanced Chem
iluminescence（ECL）detection system（Amersham）を
用いて行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA12 DA03 HA17 4B063 QA13 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 QX07 4B065 AA91Y AA93X AA93Y AB01 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA45 DA75 EA21 EA50 FA74

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵
   素USP17の基質タンパク質であって、配列番号２のアミ
   ノ酸配列を有するヒトタンパク質CREG2をコードするヒ
   ト遺伝子。
2. 【請求項２】 cDNAが配列番号１の塩基配列を有する請
   求項１のヒト遺伝子。
3. 【請求項３】 脳特異的調節を受ける脱ユビキチン化酵
   素USP17の基質タンパク質であって、配列番号４のアミ
   ノ酸配列を有するマウスタンパク質Creg2をコードする
   マウス遺伝子。
4. 【請求項４】 cDNAの一部が配列番号３の塩基配列を有
   する請求項３のマウス遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１のヒト遺伝子のゲノムDNA、mRN
   A、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリヌ
   クレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のマウス遺伝子のゲノムDNA、m
   RNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリ
   ヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項５のポリヌクレオチドにストリン
   ジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
   ドプローブ。
8. 【請求項８】 請求項６のポリヌクレオチドにストリン
   ジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチ
   ドプローブ。
9. 【請求項９】 請求項５のポリヌクレオチドをPCR増幅
   するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
10. 【請求項１０】 請求項６のポリヌクレオチドをPCR増
    幅するオリゴヌクレオチドプライマーセット。
11. 【請求項１１】 請求項５のポリヌクレオチドを保有す
    る組換えベクター。
12. 【請求項１２】 請求項６のポリヌクレオチドを保有す
    る組換えベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１１の組換えベクターによる形
    質転換体細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１２の組換えベクターによる形
    質転換体細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１の遺伝子の発現産物であっ
    て、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトCREG2。
16. 【請求項１６】 請求項１３の形質転換体細胞によって
    産生される請求項１５のヒトCREG2。
17. 【請求項１７】 請求項３の遺伝子の発現産物であっ
    て、配列番号４のアミノ酸配列を有するマウスCreg2。
18. 【請求項１８】 請求項１４の形質転換体細胞によって
    産生される請求項１７のマウスCreg2。
19. 【請求項１９】 配列番号２における連続５アミノ酸残
    基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
20. 【請求項２０】 配列番号４における連続５アミノ酸残
    基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
21. 【請求項２１】 請求項１５のヒトCREG2を認識する抗
    体。
22. 【請求項２２】 請求項１７のマウスCreg2を認識する
    抗体。