JPH09511134A - 蛋白質修飾酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一般には蛋白質プレニルトランスフェラーゼに関し、特には、蛋白質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ−Ｉ）及びそれらをコードする核酸配列に関する。また、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びゲラニルゲラニル修飾ポリペプチドを製造する方法にも関する。さらに、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する能力について化合物をスクリーニングする方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質修飾酵素 本発明は、少なくとも部分的には、国立科学財団（認定番号ＤＣＢ９１０５８ ２２）及び国立衛生研究所（認定番号ＲＯ１ ＧＭ４６３７２）の支援を受けて なされた。 技術分野 本発明は、一般には、蛋白質プレニルトランスフェラーゼ、特には、蛋白質Ｉ 型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ−Ｉ）、及びそれらをコ ードする核酸配列に関する。また、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びゲラニルゲ ラニル修飾ポリペプチドの生成方法にも関する。さらに、本発明は、ＧＧＴａｓ ｅ−Ｉ活性を改変する能力について化合物をスクリーニングする方法に関する。 背景 イソプレノイド脂質による共有結合的な修飾（プレニル化）は、膜の相互作用 及び蛋白質の生理活性に寄与し、そうした蛋白質は急増している（Ｍａｌｔｅｓ ｅ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：３３１９（１９９０）；Ｇｌｏｍｓｅｔら，Ｔｒｅｎ ｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１５：１３９（１９９０））。ファ ルネシル（炭素１５個）またはゲラニルゲラニル（炭素２０個）イソプレノイド は、ゲラニルゲラニルが蛋白質に見出される優位のイソプレノイドではあるが、 特定の蛋白質に結合することが可能である（Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈら，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２４７：３２０（１９９０））。プレニルトランスフェラーゼ、蛋白質 Ｉ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ−Ｉ）は、ゲラニルゲ ラニル基をプレニル供与体ゲラニルゲラニル二リン酸からＣ末端ＣＡＡＸ−モチ ーフ（ここで、“Ａ”は脂肪族アミノ酸を含むあらゆるアミノ酸であり、“Ｘ” 残基はロイシンである）を含む基質蛋白質のシステイン残基に転移させる（Ｃｌ ａｒｋｅ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３５５（１９９２）；Ｃａ ｓｅｙ，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．３３０：１７３１（１９９２））。ＧＧＴａ ｓｅ−Ｉの既知標的には、脳ヘテロトリマーＧ蛋白質のγ−サブユニット並びに Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、Ｒａｐ１Ａ及びＲａｐ１ＢのようなＲａｓ関連小ＧＴＰ結 合蛋白質が含まれる（Ｍｅｎａｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６： ５３７（１９９２）；Ｃａｓｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８６３１（１９９１）；Ｍｏｏｒｅｓら，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３６：１４６０３（１９９１））。加えて、これらの基 質のＣＡＡＸモチーフを含む短いペプチドも前記酵素によって認識され得る（Ｃ ａｓｅｙら，前出；Ｍｏｏｒｅｓら，前出；Ｙｏｋｏｙａｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５３０２（１９９１））。この種の ペプチドの１つを固定化してアフィニティ・マトリックスとして用いることによ り、ウシの脳からＧＧＴａｓｅ−Ｉが単離されている（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓ ｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４３８（１９９２））。精製した 酵素は４８ｋＤａ及び４３ｋＤａの分子量の２つのサブユニットを有しており、 それぞれα及びβ（以下、β_GGIと呼ぶ）と呼ばれている。ＧＧＴａｓｅ−Ｉの 最適活性は、Ｍｇ²⁺及びＺｎ²⁺の両者に依存する。Ｚｎ²⁺依存性の実証には、キ レート剤に対する長時間インキュベーション、またはキレート剤の存在下での精 製が必要であった。この特性により、ＧＧＴａｓｅ−Ｉは亜鉛金属結合酵素と呼 ばれている（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ，前出）。 ＧＧＴａｓｅ−Ｉの特性は、関連酵素である蛋白質ファルネシルトランスフェ ラーゼ（ＦＴａｓｅ）の特性に似ている。 ＦＴａｓｅは、プレニル基をファルネシル二リン酸から基質蛋白質のシステイン 残基に転移させる。ＦＴａｓｅ蛋白質基質は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉの基質と同様に 、Ｃ末端ＣＡＡＸモチーフを有している。しかしながら、哺乳動物ＦＴａｓｅ基 質の“Ｘ”は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ基質がロイシンであるのに対して、一般にメチ オニン、セリンまたはグルタミンである（Ｍｏｏｒｅｓら，前出；Ｍｏｏｍａｗ 及びＣａｓｅｙ，前出）。ＦＴａｓｅの基質には、ｐ２１^ras蛋白質、ラミンＢ 及び視覚信号変換に関与する幾つかの蛋白質が含まれる（Ｃｌａｒｋｅ，前出） 。ＧＧＴａｓｅ−Ｉと同様に、ＦＴａｓｅの最適活性はＭｇ²⁺及びＺｎ²⁺イオン に依存する（Ｒｅｉｓｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６４０３（１９ ９２））。精製された哺乳動物ＦＴａｓｅは２つの異なるサブユニット、α及び β（以下、β_Fと呼ぶ）を含んでなり、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４８ｋ Ｄａ及び４６ｋＤａの見かけの分子量を有している（Ｒｅｉｓｓら，Ｃｅｌｌ ６２：８１（１９９０））。ＦＴａｓｅα及びβ_FをコードするｃＤＮＡクロー ンが単離されており、それらの推定アミノ酸配列は、それぞれ、酵母ＦＴａｓｅ のサブユニットをコードする酵母菌（Ｓａｃｃｈａ ｒａｍｏｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）蛋白質Ｒａｍ２及びＤｐｒ１／Ｒａ ｍ１と相同である（Ｍｏｏｒｅｓら，前出；Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１３６８（１９９１）；Ｋｏｈｌら，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１８８８４（１９９１）；Ｈｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１３７３（１９９１））。 哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びＦＴａｓｅの４８ｋＤａ αサブユニットは免 疫学的に交差反応性であることが示されており、これは、これら２つの酵素が共 通のαサブユニットを共有していることを示唆している（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａ ｓｅｙ，前出；Ｋｏｈｌら，前出；Ｓｅａｂｒａら，Ｃｅｌｌ ６５：４２９（ １９９１））。同様に、酵母ＦＴａｓｅのα様サブユニットをコードする酵母遺 伝子ＲＡＭ２の変異は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性及びＦＴａｓｅ活性の両者に欠陥 を有する株を生じる結果となる（Ｍｏｏｒｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６６：１８８８４（１９９１）；Ｋｏｈｌら，前出）。Ｒａｍ２とＣｄｃ４３／ Ｃａｌ１との細菌での同時発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ではＧＧＴａｓｅ −Ｉ活性 がある（Ｍａｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０５８９（１９９ ２））のに対して、Ｒａｍ２とＲａｍ１とを同時発現するとＦＴａｓｅ活性を生 じる（Ｈｅら，前出）ことからも、酵母ＦＴａｓｅとＧＧＴａｓｅ−Ｉとが共通 サブユニットを有することがさらに確認される。ＧＧＴａｓｅ−Ｉの酵母Ｃｄｃ ４３／Ｃａｌ１サブユニットが酵母Ｒａｍ１／Ｄｐｒ１及び哺乳動物β_Fに類似 するアミノ酸を示すことから、これが哺乳動物β_GGIの酵母相同体である可能性 がある（Ｏｈｙａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２３５６（１９９１ ））。 ＧＧＴａｓｅ−Ｉは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ又はＣｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓモチーフで終止 している小ＧＴＰ結合蛋白質のＣＯＯＨ−末端システインにゲラニルゲラニル基 を結合させる、蛋白質II型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとも呼ばれる、 関連酵素Ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼとは異なる（Ｍｏｏｒｅｓ ら，前出；Ｓｅａｂｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４４９７（１ ９９２）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６９８１ （１９９１））。ＧＧＴａｓｅ−IIの標的蛋白には、小胞体及びゴルジ 複合体中に存在するＲａｂ１Ａ、シナプス小胞の構成要素であるＲａｂ３Ａが含 まれる（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：４１（１９ ９２））。ＧＧＴａｓｅ−IIはその標的蛋白質に相当するＣＯＯＨ−末端ペプチ ドを認識せず、むしろ基質認識はＲａｂ蛋白質上のさらなる決定基に関与してい るものと思われる（Ｍｏｏｒｅｓら，前出；Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒら，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３６３（１９９２））。ＧＧＴａｓｅ−IIは ３つの蛋白質成分からなる。成分の１つである９５ｋＤａのＲａｂエスコート蛋 白質は、基質蛋白質を結合し、それらを酵素の触媒性サブユニットに渡すものと 思われる（Ａｎｄｒｅｓら，Ｃｅｌｌ ７３：１０９１（１９９３））。ＧＧＴ ａｓｅ−IIの触媒性成分は緊密に関係する２つのポリペプチドを含んでおり、こ れらは、それぞれ、６０ｋＤａ及び３８ｋＤａの見かけの分子量を有し、ＦＴａ ｓｅのα及びβFサブユニットとの類似性を示す（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２２１（１９９３））。 本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ、特にはβ_GGIサブユニットをコードする核酸配 列を提供する。これらの配列は、組換えによ るＧＧＴａｓｅ−Ｉの生成に用いることが可能である。この酵素が多量に利用可 能になると、診断及び治療用途のある、ゲラニルゲラニル修飾蛋白質及びペプチ ドの製造を可能にする。加えて、この酵素は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する 能力についての化合物のスクリーニングに用いることが可能である。そのような 化合物は、ガン及び炎症を含む領域での薬物療法に有用であることが予想される 。 発明の目的及び要約 本発明の一般的な目的は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ、特にそのβサブユニットをコー ドするヌクレオチド配列を提供することにある。本発明のさらなる目的は、ＧＧ Ｔａｓｅ−Ｉ、又はそのβサブユニットを合成する方法、及びＧＧＴａｓｅ−Ｉ 活性を改変する能力について化合物をスクリーニングする方法を提供することに ある。本発明の様々な他の目的及び利点は、以下の開示を読むことにより、当業 者には明らかであろう。 態様の１つにおいては、本発明はＧＧＴａｓｅ−Ｉをコードする単離された核 酸に関する。さらなる態様においては、本発明は、哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉの βサブュニット、または少なくとも１５個連続した塩基を有するその一部、また はその相 補体をコードする、単離された核酸に関する。また、本発明は、上記核酸及びベ クターを含む組換え分子、並びに該組換え分子を含む宿主細胞にも関する。加え て、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−ＩもしくはＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット、 またはその一部を製造する方法であって、上記宿主細胞を、前記核酸が発現し、 それによりＧＧＴａｓｅ−ＩもしくはＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット、また はその一部が生成するような条件下で培養することを包含する方法に関する。 さらなる態様においては、本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子を本質的に含んでなり 、そのうちの１本の鎖が哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット、又は少な くとも１５個連続した塩基対を有するそれらの一部をコードする、単離された核 酸に関する。また、本発明は、プロモーターに作用可能に結合し、あるいはプロ モーターに対して逆向きの前記核酸を含む組換え分子にも関する。さらに、本発 明は、宿主細胞におけるＧＧＴａｓｅ−Ｉの生成を阻害する方法であって、核酸 が転写され、それによりＧＧＴａｓｅ−Ｉの生成が阻害されるような条件下にお いて、細胞に前記組換え分子を導入することを包含する方法に関する。 さらに別の態様においては、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する能力 について被検化合物をスクリーニングする方法に関する。この方法は、被検化合 物の存在下及び非存在下でのサンプルのＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を比較することを 包含するものであり、被検化合物の存在下で活性が低下すれば該被検化合物の阻 害活性を示し、活性が増加すれば該被検化合物はむしろ増殖活性のあることを示 す。 図面の詳細な説明 図１。ラットＧＧＴａｓｅ−Ｉ β_GGIサブユニット（β_GGI）のヌクレオチド （配列番号１）及び推定アミノ酸（配列番号２）配列。一文字略記が推定アミノ 酸に用いられている。 図２。ヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉ β_GGIサブユニットのヌクレオチド（配列番号 ３）及び推定アミノ酸（配列番号４）配列。３′−非翻訳配列及び５′−非翻訳 配列が含まれる。一文字略記が推定アミノ酸に用いられている。 図３。中間体ｐＲＤ５６６のヌクレオチド配列（配列番号５）。これは、ヒト β_GGIの完全コーディング配列を含んでおり、最終的には翻訳によりヒト−ＦＰ Ｔａｓｅ−αサブユニッ トのコーディング配列と結合する。 図４。ｐＲＤ５７７のヌクレオチド配列（配列番号６）。これは、Ｇｌｕ−Ｇ ｌｕ−Ｐｈｅエピトープ・タグを発現し、かつβ_GGI発現のためのリボソーム結 合部位を有する配列によりヒトＦＰＴ−αサブユニットのコーディング配列に翻 訳によって結合するヒトβ_GGI完全コーディング配列を含む。 図５。Ｓｆ９細胞発現により得られるＧＧＴａｓｅ−ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析。１１％アクリルアミドゲルでの精製における処理工程の各々から得られるプ ールのアリコート。ポリペプチドはクーマシーブルー染色により可視化した。矢 印は分子量標準の移動位置を示す；レーン１、可溶抽出物２５μｇ；レーン２、 ＤＥＡＥプール２５μｇ；レーン３、Ｑ−ＨＰプール１μｇ。 図６。精製組換えＧＧＴａｓｅ−Ｉの蛋白質基質特異性。検定は標準的な手順 （Ｃａｓｅｙら，前出；Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ，前出）で行い、各反応混 合物は示される濃度の基質蛋白質を含有していた。用いられる記号は、（□）、 ｒａｓ−ＣＶＬＬ；（◆）、ｒａｓ−ＣＶＬＳである。 発明の詳細な説明 本発明は、一般にはＧＧＴａｓｅ−Ｉ、特にはそれらのβサブユニットをコー ドする核酸配列、又は前記コーディング配列の一部に関する。さらに、本発明は 、コードされた蛋白質、ポリペプチド又はペプチドに関する。ここで用いられ、 かつ核酸配列に適用される場合には、“一部”という用語は、少なくとも１５塩 基、好ましくは少なくとも３０塩基、より好ましくは少なくとも１５０塩基、最 も好ましくは少なくとも３００塩基を有する断片に関する。蛋白質に適用される 場合には、“一部”という用語は、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくと も１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、最も好ましくは少な くとも１００アミノ酸を有するペプチド及びポリペプチドに関する。また、本発 明は、上記核酸配列を含む組換え分子及びそれで形質転換された宿主細胞に関す る。加えて、本発明は、前記形質転換宿主細胞を適当な条件下で培養することに よる、該核酸配列中にコード化されている蛋白質、ポリペプチド又はペプチドの 製造方法に関する。さらに、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する能力に ついて化合物をスクリーニングする方法に関する。 より具体的には、本発明は、哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉ、特にはそのβサブユ ニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は上に定義されるよう なその一部に関する。特には、本発明は、配列番号２又は配列番号４（図１及び ２も参照のこと）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は上に定義 される通りのその一部（単に例示であるが、配列番号１又は配列番号３のＤＮＡ 配列（図１及び図２も参照のこと））に関する。さらに、本発明が関与するヌク レオチド配列には、配列番号２又は配列番号４に示されるものと実質的に同じ蛋 白質が含まれる。この実質的に同じ蛋白質には、例えば、配列番号２又は配列番 号４に示される配列の機能的均等物の他に、それらの種内変種が含まれる。さら に、本発明は、配列番号１及び配列番号３に示される配列に実質的に等しいヌク レオチド配列に関する。“実質的に等しい”配列は、４２℃で、４０％ホルムア ミドを含有する４×生理食塩水／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中において、そ の相補物が配列番号１又は配列番号３の核酸配列にハイブリダイズし、かつ４２ ℃で、０．１％ＳＤＳ（注：２０×ＳＳＣ＝３Ｍ塩化ナトリウム／０．３Ｍクエ ン酸ナトリウム）を含有する０．２×ＳＳＣで洗浄した場合 も結合を保持するものである。また、本発明は、上述のものに相補的な核酸にも 関する。 また、本発明は、上述のヌクレオチド配列を含む組換え分子及びこの組換え分 子で形質転換された宿主細胞にも関する。当該技術分野で周知の標準的な方法を 用いて、ベクター及びＧＧＴａｓｅ−Ｉ（特に、それらのβサブユニット）をコ ードするヌクレオチド配列、又は上に定義される通りのその一部を含む組換え分 子を構築することが可能である。本発明での使用に適するベクターには、プラス ミド及びウイルスベクターが含まれる。哺乳動物ＧＧＴａｓｅのα及び／又はβ サブユニットをコードするＤＮＡ配列がクローン化されるプラスミドベクターは 、選択される宿主細胞、例えば細菌細胞への形質転換に適合するいかなるベクタ ーであってもよい。このようなベクターには、ＣｏｌＥ１（例えば、ｐＢＲ３２ ２、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒ ｒｏｎら，Ｇｅｎｅ ３３：１０３（１９８５））又はＰ１５ａ（例えば、ｐＡ ＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４等）（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １３４：１１４１（１９７８））の派生体が含まれるが、 こ れらに限定されるものではない。本発明での使用に適する他のベクターには、ｐ ＧＥＭ４Ｚ、ｐＶＬ１３９２及びｐＣＭＶが含まれる。本発明のヌクレオチド配 列は、調節要素、例えばプロモーター、に作用可能に連結するベクター中に存在 させることが可能である。適切なプロモーターには、ｔａｃプロモーター（Ａｍ ｍｏｎら，Ｇｅｎｅ ２５：１６７（１９８３））、ｌａｃプロモーター（Ｓｉ ｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ ２０：２６９（１９８０））及びｔｒｐプロモ ーター（Ｂｅｎｎｅｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１１３（１９７８） ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのプロモーターは、 ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写に大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いる。本発明の態様 の１つにおいては、プロモーターはプラスミドｐＢＴａｃ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販されている）に見 出されるｔａｃプロモーターである。本発明での使用に適する他のプロモーター ／ＲＮＡポリメラーゼ系には、ＲＮＡバクテリオファージ・プロモーター及びそ れらの同族ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。このようなシステムの例には、バク テリオファージＴ７プロモーター及びＴ７ ＲＮＡポリ メラーゼ（Ｓｔｕｄｉｅｒ及びＭｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９： １１３（１９８６））が含まれる。バクテリオファージＴ７プロモーター及びＲ ＮＡポリメラーゼにより、ｔａｃプロモーターよりも高いレベルの蛋白質発現が 得られることが期待される。ＳＰ６、ＳＶ４０、ポリヘドリン又はアデノウイル スから誘導されるプロモーターも用いることができる。ＧＧＴａｓｅ−Ｉの合成 が求められる場合には、α及びβサブユニットをコードする配列は同じベクター 中に存在していても、あるいは別々のベクター中に存在していてもよい。いずれ の場合においても、各配列は、都合よく独立に転写される。 前述のように、本発明の組換え分子を宿主細胞の形質転換に適するように構築 することが可能である。適切な宿主細胞には、細菌のような原核細胞、酵母のよ うな低級真核細胞、並びに哺乳動物及び昆虫細胞のような高級真核細胞が含まれ る。当業者は、様々な周知の方法を用いて、本発明の組換え分子を適正な宿主細 胞に導入することができる。 さらに、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ（特に、そのβサブユニット）、又は上 に定義される通りのその一部の製造方法に関する。この方法は、上記形質転換宿 主細胞を、コーディング配 列が発現し、それにより蛋白質が産生されるような条件下において培養すること を包含する。 さらに、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ（例えば、哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉ） 、特には、そのβサブユニット、又は上に定義される通りのその一部に関し、通 常は関連する蛋白質が実質的に存在しない。本発明の蛋白質、ポリペプチド及び ペプチドは、前述の核酸配列を用いて組換えにより、あるいは周知の方法を用い て化学的に生成させることができる。本発明の蛋白質は単独で、あるいは、例え ば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はマルトース結合蛋白質のような蛋 白質との融合蛋白質として生成させることが可能である。このような融合生成物 は組換えにより生成させることができる。例えば、本発明のコーディング配列（ 例えば、哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニットをコードする配列）を他の 蛋白質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はマルトース結合蛋 白質）をコードする配列と共にフレームを合せてクローン化し、適正な宿主細胞 中で融合生成物を発現させることが可能である（例えば、Ｇｕａｎら，Ｇｅｎｅ ６７：２１（１９８７）；Ｍａｉｎａら，Ｇｅｎｅ ７４：３６５（１９８８ ）；Ｓｍｉ ｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）を参照のこと）。 本発明の蛋白質、ポリペプチド及びペプチドは、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ特異抗体、 特には、ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニットに特異的な抗体の生成に、抗原とし て用いることができる。抗体生成の方法は当該技術分野において周知である。モ ノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両者、さらにその結合断片が意図さ れる。当業者は、そのような抗体が本発明の蛋白質の選択的な同定及び単離に利 用可能であることを認識するであろう。あるいは、これらの抗体を、生体内又は 生体外において、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ作用を阻止するのに用いることができる。 また、本発明は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する（例えば、阻害する）能力 についての化合物のスクリーニング、並びにそれによる、例えば、アゴニスト又 はアンタゴニストとして役立ち得る化合物の同定に、本発明の蛋白質（例えば、 組換えにより産生されたＧＧＴａｓｅ−Ｉ）を用いる方法にも関する。典型的な スクリーニング検定においては、ＧＧＴａｓｅ−Ｉを、ゲラニルゲラニル二リン 酸及びＧＧＴａｓｅ−Ｉ基質（例えば、ＧＧＴａｓｅ−Ｉによって認識されるＣ ＡＡＸモチーフを含む 蛋白質又はペプチド）と共に、その酵素改変活性（例えば、阻害能力）を試験し ようとする化合物の存在下及び非存在下においてインキュベートする。その後、 ゲラニルゲラニル基の基質への取り込みを測定する。被検サンプルにおける酵素 活性の低下（すなわち、取り込みの減少）があれば、被検化合物が酵素の阻害剤 であることを示している。被検サンプルにおける酵素活性の上昇があれば、被検 化合物が酵素の増強剤であることを示している。このようなスクリーニング方法 は、ガン及び炎症のような領域での薬物療法剤の潜在的な用途の同定だけではな く、ＧＧＴａｓｅ−ＩとＦＴａｓｅのような関連酵素との間での阻害剤の選択性 の区別にも有用である。 ＧＧＴａｓｅ−Ｉ阻害剤には、ＧＧＴａｓｅ−Ｉの特異的基質に似せた構造を 有する化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、ゲ ラニルゲラニル二リン酸の類似体は、ＦＴａｓｅではなくＧＧＴａｓｅ−Ｉに対 する相互作用の特異性を示すことが期待される（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ， 前出；Ｍｏｏｒｅｓら，前出）。同様に、Ｃ末端残基がロイシンであるＣＡＡＸ 含有ペプチドもＧＧＴａｓｅ−Ｉとは強く相互作用するが、ＦＴａｓｅとの相互 作用は不十分 であり、このようなペプチド又はそれらの類似体（例えば、ペプチド擬似体（例 えば、Ｋｏｈｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９３４（１９９３）を参照）） はＧＧＴａｓｅ−Ｉの特異的阻害剤として用いることができる（Ｃａｓｅｙら， 前出；Ｙｏｋｏｙａｍａら，前出）。ＧＧＴａｓｅ−Ｉの他の潜在的阻害剤には 、ＧＧＴａｓｅ−Ｉに含まれる、酵素活性に必要な亜鉛原子と特異的に相互作用 する化合物（例えば、キレート剤）が含まれる（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ， 前出）。 本発明の核酸及びアミノ酸配列には診断上及び治療上の用途がある。例えば、 基質蛋白質に特異的に結合し、ＧＧＴａｓｅ−Ｉによる認識を妨げることにより それらの修飾をブロックするβ_GGIの一部に相当するペプチド（例えば、ＧＧＴ ａｓｅ−Ｉサブユニットの活性部位環境を模倣するペプチド）。ＧＧＴａｓｅ− Ｉ活性は、β_GGIの発現を減少させ、又は排除することによってもブロックする ことができる。例えば、β_GGIｍＲＮＡに相補的なアンチセンス・オリゴヌクレ オチドを、蛋白質の発現の選択的な減少又はオブレイト（ｏｂｌａｔｅ）に用い ることができる（例えば、Ｃａｌａｂｒｉｅｔｔａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ ５１：４５０５（１９９１）を参照 のこと）。加えて、触媒性ＲＮＡ分子（“リボザイム”）を、β_GGIｍＲＮＡの 選択的な開裂と、それによるその転写の阻害に用いることができる（例えば、Ｓ ｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１５６６（１９６３ ）を参照のこと）。ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性の阻害は、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性が病 的に活性化している臨床状況において利点がある（蛋白質活性化に対するＧＧＴ ａｓｅ−Ｉの効果の検討については、Ａｎｄｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６７：２５７０９（１９９２）及びＨｅｙｗｏｒｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｅｌｌ ４：２６１（１９９３）を参照のこと）。 また、本発明は、本発明の蛋白質、ペプチド又は核酸を含有する医薬組成物に も関する。本発明は、上記スクリーニング法を用いて選択された化合物を含有す る組成物にも関する。このような組成物は、活性作用物質を、薬学的に許容し得 る担体と組み合わせて含有する。組成物中の活性作用物質の量は、作用物質、患 者及び求められる効果によって変化し得る。同様に、投与計画も組成物及び治療 しようとする疾患／障害によって変化する。 本発明の特定の側面を、以下の非限定的な例により詳細に記 載する。 実施例 少なくとも以下の特定の例において用いられる手法及び試薬は以下の通りであ る： 用いられる分子生物学的技術には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０））及びＳａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２３９：４８７（１９９８））によって記述されたものが含まれる。酵素類 は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｅｔｔｓ）又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎ ａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）から入手した。ｃＤＮＡクローンは、ｐＧＥＭ −４Ｚ又はｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９にサブクローン化し、汎用プライマー もしくは特異的内部プラィマーを用いてジデオキシ鎖終止法（Ｓａｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７） ）により配列決定を行った。全ての ｃＤＮＡ及びＰＣＲ産物の両鎖について配列決定を行った。［³²Ｐ］標識ＤＮＡ プローブは、無作為プライマー標識キット（ＢＲＬもしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及び［³²Ｐ］ｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて合 成した。全細胞ＲＮＡは、グアニジン・チオシアネート／ＣｓＣｌ遠心法（Ｃｈ ｉｒｇｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４（１９７９））により、組織 から単離した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグ ラフィにより単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）。 例Ｉ ＧＧＴａｓｅ−Ｉの蛋白質配列決定 開示されている（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ，前出）通りにアフィニティク ロマトグラフィを用いてウシ脳から精製されたＧＧＴａｓｅ−Ｉ約１ナノモルを 、１１％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に処し、ニトロセルロー ス紙に移した。次いで、このニトロセルロース紙をＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色し てサブユニットポリペプチドの位置を決定した。４８ｋＤａ及び４３ｋＤａバン ド（それぞれ、α及びβ_GGIポリペプチド成分に相当する）をニトロセルロース から切り離し、処 理のためＨａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に送った。簡潔に述べると、これには、トリプシンによる その場での消化、生成したペプチドの微孔質ＨＰＬＣによる単離、及び配列決定 が含まれる（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：６９７０（１９８７））。 ＨＰＬＣにより明瞭に分離された３つのαサブユニットペプチド及び５つのβ_GGI サブユニットペプチドの信頼性の高い配列が得られた。ウシＧＧＴａｓｅ− Ｉの４８ｋＤａαサブユニットから得られたペプチドと、ｃＤＮＡクローン（Ｋ ｏｈｌら，前出）から推定されたウシＦＴａｓｅ−αの対応領域との配列の比較 を示す（表Ｉ） ＧＧＴａｓｅ−Ｉのαサブユニットに由来する３つの異なるペプチドの配列決 定を行い、ＦＴａｓｅαの領域と１００％等しいことを見出した。これは、ＧＧ Ｔａｓｅ−Ｉ及びＦＴａｓｅの両者が共通のサブユニットを共有することを示し ている（下記例IIIも参照のこと）。 例II 哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉβ_GGIサブユニットｃＤＮＡのクローニング ２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマー［ＧＣＴＣ−ＧＧＡＴＣＣ−Ｃ−（ Ａ／Ｇ）ＡＡ−（Ａ／Ｇ）ＴＴ−ＮＧＴ−（Ａ／Ｇ）ＴＡ−（Ｔ／Ｃ）ＴＧ−（ Ａ／Ｇ）Ａ（配列番号１５）及びＧＴＣＧ−ＧＡＡＴＴＣ−ＡＣＮ−ＡＴ（Ａ／ Ｃ／Ｔ）−ＧＣＮ−ＴＴ（Ｃ／Ｔ）−ＴＴ（Ｃ／Ｔ）−ＧＣ（配列番号１６）］ を、２つのβ_GGIサブユニットペプチド配列［それぞれ、ＩＦＱＹＴＮＦＥＫ（ アンチセンスオリゴ）及びＴＩＡＦＦＬＳＧＬＤＭＬＤ］の一部に基づいて合成 した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３ ９：４８７（１９８８））を、ウシ脳ｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ を鋳型として用いて行った（Ｖｏｇｅｌ ら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：９０（１９８８））。ペプチドＧＳＳＹＬＧＩＰＦ ＮＰＳＫ（表Ｉにおけるペプチド２）の一部をコードする縮重オリゴヌクレオチ ド［ＧＴＡＣ−ＴＣＴＡＧＡ−ＧＧＮ−ＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｔ）−ＣＣＮ−ＴＴ（Ｔ ／Ｃ）−ＡＡ（Ｔ／Ｃ）−ＣＣ（配列番号１７）］にハイブリダイズする７３０ ｂｐのＰＣＲ産物を単離した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（Ｐ ＣＲオリゴ体における制限部位）で開裂させ、ｐＵＣ１９にクローン化してｐＲ Ｄ５４８を作製した。 β_GGIサブユニットをコードするヒトｃＤＮＡを単離するため、ｐＲＤ５４８ 中のコーディング配列のＮ−末端部分を有する３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄIII断片を［³²Ｐ］標識し、開示されている（Ｋｏｈｌら，前出）通りに、各 々λｇｔ１１中のヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）及びλ ｍａｘ１中のヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の両者に由 来する約１０⁶プラークのスクリーニングに用いた。６つのｃＤＮＡクローンが ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離され、７つのｃＤＮＡクローンがヒト腎 臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された。λｇｔ１１ライブラリ ーからのファージを単離し、ｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩ断片としてｐＵＣ １８にサブクローン化した。λｍａｘ１ライブラリーに由来するクローンからの ｃＤＮＡインサートをファージミドとして切り出した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブ ラリーに由来するクローン３からの１．５５ｋｂのｃＤＮＡを含むプラスミドを ｐＲＤ５５０と名付けた。ｐＲＤ５５０中のインサートは、Ｎ−末端の３６コド ンを除いてβ_GGIに対する全てを有している。ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーに 由来するクローン２７からの０．７ｋｂのｃＤＮＡを有するファージミドをｐＲ Ｄ５５８と名付けた。ｐＲＤ５５８中のインサートはβ_GGIのＮ−末端の１２３ アミノ酸をコードする。完全なヒトβ_GGIコーディング配列を有するプラスミド を以下の通り構築した：ＢａｍＨＩ及びＳｃａＩ部位をβ_GGI開始コドンの上流 に配置したｐＲＤ５５８に対してＰＣＲを行った。このＤＮＡを、β_GGIコーデ ィング配列内での開裂をもたらすＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで開裂させ、０．１３ ｋｂの断片１を作製した。断片２は、ＸｈｏＩ部位の下流のコーディング配列を 含む、ｐＲＤ５５０由来の１．５２ｋｂのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片であった。 断片１及び２をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１８に クローン化し、ヒトβ_GGI及び３′−非翻訳配列の完全なコーディング配列を含 むｐＲＤ５６６を作製した。ｐＲＤ５６６の塩基配列を図３に示す。 β_GGIサブユニットをコードするラットｃＤＮＡを単離するため、ｐＲＤ５４ ８に由来するＰＣＲプローブを標識し、ラット脳５′−伸長ｃＤＮＡλｇｔ１０ ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のスクリーニングに用いた。フィルター２枚 を、４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１５ｍＭクエン酸ナトリ ウム、ｐＨ＝７）及び４０％ホルムアミド（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）中にお いて、４２℃で、ハイブリダイゼーション緩衝液１ｍｌ当り２×１０⁶ｃｐｍの ［³²Ｐ］標識プローブとハイブリダイズさせた。このフィルターを、４２℃で１ ５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて２回、次いで、４２℃で３０分間 、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて洗浄した。スクリーニングした１× １０⁶プラークのうち５つの陽性が同定され、プラークを精製した。最も長い５ ′−末端を有するクローン（クローン２２と命名）をｐＧＥＭ−４Ｚにサブクロ ーン化し、両鎖について配列決定を行った。このクローンのＤＮＡ配列決定によ り、このクローンが最初の ２つのコドンを除いてラットβ_GGIサブユニットの全てを含むことが示された。 ラットβ_GGIのＮ−末端コーディング配列を単離するため、ｃＤＮＡ末端の５ ′−急速増幅（ＲＡＣＥ）をクローン２２の５′−末端の伸長に用いた（Ｆｒｏ ｈｍａｎ ｉｎ ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔ ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編），ｐｐ．２８ −３８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０））。 ３つのプライマーをクローン２２の５′−末端配列に基づいて調製した。これら のプライマーの１つを用いて第１のｃＤＮＡ鎖をラット脳ｍＲＮＡから合成した 後、ターミナルトランスフェラーゼでこのｃＤＮＡの後にｄＡＴＰを付けた。２ 組のプライマー及びオリゴｄＴプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を２ラウンド行 った。得られたＲＡＣＥ産物をｐＧＥＭ−４Ｚにクローン化した。異なるＰＣＲ 反応からの１２のクローンを両鎖について配列決定し、全てから同一の配列が得 られた。これらのクローンのＤＮＡ配列は、クローン２２中のｃＤＮＡの５′− 末端の上流にフレーム内ＡＴＧコドン３塩基対を有していた。このＡＴＧコドン は、 ヒトβ_GGIのｃＤＮＡ配列（図２）に見出される開始コドンと同じ位置に存在す る。 ＧＧＴａｓｅ−Ｉの完全なラットβ_GGIサブユニットをコードするｃＤＮＡを 、７３０ｂｐのＰＣＲプローブと上述のＲＡＣＥ技術との組合せにより得た。ラ ットＧＧＴａｓｅ−Ｉのβ_GGIサブユニットをコードするｃＤＮＡのヌクレオチ ド配列を配列番号１に示す。このｃＤＮＡ配列はＡＴＧ開始コドンを有し、その 配列が精製β_GGIサブユニットのトリプシン消化により得られた５つのペプチド （例Ｉの表Ｉを参照）を全て含む３７７アミノ酸の蛋白質をコードする。クロー ン化ラットβ_GGIポリペプチドの予想分子量４２．４ｋＤａは、ウシ脳から精製 された酵素のβ_GGIサブユニットに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察される４ ３ｋＤａに非常に近似している（Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１３６：１４６０３（１９９１））。 ラット及びヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉ β_GGIサブユニットのアミノ酸配列の整合 を、他の蛋白質プレニルトランスフェラーゼβサブユニットと共に作成した。こ れらの付加的なβサブユニットには、ラットＦＴａｓｅ（Ｃｈｅｎら，Ｃｅｌｌ ６６： ３２７（１９９１））、ラットＧＧＴａｓｅ−II（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，前出 ）及び酵母のＣＤＣ４３遺伝子産物（Ｏｈｙａら，前出）のものが含まれる。３ ７７個のアミノ酸のうちの僅か１０個のみがラット及びヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉ β_GGIサブユニットの間で異なり、この１０個の置換部分のうちの７個は保存的 アミノ酸変化に関与する。一般に、Ｃ−末端領域は、蛋白質プレニルトランスフ ェラーゼβサブユニットの間ではＮ−末端領域よりも保存性が高い。例外は、ラ ット及びヒトのＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びＣｄｃ４３のβ_GGIサブユニットのＮ−末 端領域であり、これらは他の蛋白質プレニルトランスフェラーゼβサブユニット よりも高い相同性を互いに示す。この観察は、異なる種に由来するＧＧＴａｓｅ −Ｉのβサブユニットである蛋白質と一致する。 例III 組換えＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びＦＴａｓｅの発現及び精製 ａ）大腸菌内におけるヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉの発現 大腸菌においてヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉを発現させるため、クローン化ヒトβ_{GG I} サブユニットｃＤＮＡ及び既にクローン化されているヒトＦＴａｓｅ−αサブ ユニットｃＤＮＡ （Ｏｍｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：５１６７（１９９３））を、翻訳により 結合させたプラスミドにおいて同時発現させた。大腸菌において、プラスミドｐ Ｔ５Ｔ−ｈＦＰＴａｓｅ−αは、バクテリオファージＴ７プロモーターから、Ｃ −末端Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅエピトープ・タグを有するヒトαサブユニット蛋 白質を発現する。このプラスミドｐＴ５Ｔ−ｈＦＰＴａｓｅ−αプラスミドは、 Ｏｍｅｒらが記述する通りに得た（前出）。具体的には、ヒトＦＰＴａｓｅのα サブユニットのコーディング領域を、ＥｃｏＲＩ制限部位がαサブユニットコー ディング配列の直前及び直後に配置されるようにＰＣＲで修飾し（Ｓａｉｋｉら ，前出）、ｐＵＣ１８にクローン化してｐＲＤ４５２を作製した。ｐＲＤ４５２ のインサートの配列は以下の通りである： ｐＲＤ４５２を、プラスミドのポリリンカー領域内のみを切断するＳａｃＩで 切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び ｄＮＴＰで鈍端化して再環化した。このプラスミドをＥｃｏＲＩで部分的に消化 し、末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片及びｄＮＴＰで平滑化して 再環化した。ヒトＦＰＴａｓｅのαサブユニットをコードするコーディング配列 の下流のＥｃｏＲＩ部位が平滑化されている、この工程で得られたプラスミドが 同定され、ｐＲＤ４９４と名付けられた。ｐＲＤ４９４中のインサートの配列は 以下の通りである： このプラスミドではＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は完全に失われてい た。αサブユニットコーディング配列の５′−末端の約７０ｂｐのＥｃｏＲＩ− ＢａｎII断片をコードし、各コドンの３位に主にＡ又はＴを含む合成オリゴヌク レオチドを作製し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｎIIで切断したｐＲＤ４９４に挿入して ｐＲＤ４９３を作製した。ｐＲＤ４９３におけるαサブユニットコーディング配 列及び周囲の制限部位の配列は以下の通りである： ｐＲＤ４９３のαサブユニット・コーディング領域の５′−末端を、αサブユ ニットのφ１０被覆蛋白質への翻訳による結合を容易にする付加配列に加えて、 ＢａｍＨＩ部位を配置するＰＣＲによって修飾した。この０．８ｋｂのＢａｍＨ Ｉ−ＳｐｅＩ断片をｐＲＤ４７１由来のＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII断片と接合し、 ｐＴ５Ｔ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３４１（１９９０） ）をＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII切断してｐＴ５Ｔ−ＦＰＴａｓｅαを作製した。 ｐＴ５Ｔ−ＦＰＴａｓｅ−αにおけるインサートの配列は以下の通りである： ヒトβ_GGI蛋白質のコーディング配列を、以下のようにして、ｐＴ５Ｔ−ｈＦ ＰＴａｓｅ−α中のαサブユニットコーディング配列の下流にクローン化した。 αのＣ−末端とβ_GGIサブユニット・コーディング配列のＮ−末端との間にＣＴ 配列を有する、０．５ｋｂのＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ断片である断片１を、ｐＴ５Ｔ −ｈＦＰＴａｓｅ−α及びｐＲＤ５６６を鋳型として用いる組換えＰＣＲにより 作製した（Ｈｉｇｕｃｈｉ（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕ ｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉ ｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．＆ Ｗｈ ｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．編），ｐｐ１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。ｐＲＤ５６６に由来する１．５２ｋｂのＸｈｏＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片である断片２は、断片１には含まれないβ_GGIコーディング配列の一 部を有していた。断片３はｐＴ５Ｔ−ｈＦＰＴａｓｅ−αに由来する６．２ｋｂ のＳｐｅＩ（部分消化）−ＥｃｏＲＩ断片であり、これは断片１に含まれないα コーディング配列の一部及びベクター並びにｐＴ５Ｔ−ｈＦＰＴａｓｅ−αに由 来するプロモーター配列を有してい た。断片１、２及び３を一緒に接合して、下記構造を有するｐＲＤ５７７を作製 した。 ヒトβ_GGIサブユニツトのコーディング配列を、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅエピ トープ・タグ内にβ_GGIの発現のためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する αサブユニット・コーディング配列に翻訳により結合させた。ｐＲＤ５７７の塩 基配列を図３に示す。 ヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉを発現させるため、開示されている（Ｏｍｅｒら，前出 ）ように、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＲＤ５７７で形質転換してＲＤ５７８ 株（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１ ２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａ ｎｄに寄託され、受託番号 が与えられている）を作製し、成長さ せて、０．５ｍＭイソプレニル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘発させた。組換 えヒト ＧＧＴａｓｅ−Ｉを、ヒトＦＴａｓｅについて本質的に開示されるように、αサ ブユニット上のＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅエピトープ・タグを結合するＹＬ１／２ 抗体カラム、及び任意のＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラムを用いて、細胞から精 製した（Ｏｍｅｒら，前出）。約０．２５ＭのＮａＣｌで、ＧＧＴａｓｅ−Ｉが ＭｏｎｏＱカラムから溶出した。 ｂ）Ｓｆ９細胞におけるラットＧＧＴａｓｅ−Ｉの発現 ラットβ_GGIｃＤＮＡを標準的な手法を用いてＰＶＬ１３９２ベクターにサブ クローン化し、得られたプラスミドをＰＶＬ１３９２−β_GGIと名付けた。また 、ＦＴａｓｅ−αサブユニットｃＤＮＡの全コーディング領域（ＡＴＣＣより入 手）もＰＶＬ１３９２にサブクローン化した（ＰＶＬ１３９２−α）。組換えバ キュロウイルスを生成するため、Ｓｆ９細胞に野生型ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒ Ｍｉｎｇｅｎ）０．５μｇ並びにＰＶＬ１３９２−β_GGI及びＰＶＬ１３９２− αの両者２μｇを形質移入した。得られた組換えウイルスを標準的な手法（Ｓｕ ｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ ｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃１５５５（１９８７） ）で精製し、１リ ットルのＳｆ９細胞の感染多重度５での感染に用いた。感染の７５時間後に細胞 を回収し、抽出物を調製した。ＧＧＴａｓｅ−Ｉを、抽出物の可溶性画分から、 ＤＥＡＥ−セファセルＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ及びＱ−ＨＰ樹脂での順次ク ロマトグラフィーにより精製した。精製ＧＧＴａｓｅ−ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分 析により、〜４８ｋＤａ及び〜４３ｋＤａに、サブユニット・ポリペプチドの期 待される組成が示された（図５）。 β_GGI及びＦＴ−αの両者に対して抗−ペプチド抗血清を作製した。β_GGIにつ いては、合成ペプチドは配列［Ｃ］ＧＳＳＹＬＧＩＰＦＮＰＳＫ（配列番号２４ ）を有しており、これは、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に 交差反応するために付加したＣｙｓ残基を伴う、β_GGIｃＤＮＡ中のａａ９７な いしａａ１０９の推定アミノ酸配列に相当する。ＦＴ−αについては、合成ペプ チドはＩＧＲＳＬＱＳＫＨＳＴＥ［Ｃ］（配列番号２５）であり、これは、付加 Ｃｙｓ残基を伴う、ラットＦＴ−αｃＤＮＡ（Ｃｈｅｎら，前出）中のａａ３５ ９ないしａａ３７１の推定アミノ酸配列に相当する。両ペプチドをシステイン残 基を介してＫＬＨに結合させ、ウサギの 免疫及び血清作製のためにＮｏｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．に送付した 。既に開示されている（Ｍｕｍｂｙ及びＧｉｌｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ ｌ．１９５：２１５（１９８９））通りに、免疫血清を用いて免疫ブロッティン グを行った。β_GGIペプチドに対して生じた抗血清は、精製組換えＧＧＴａｓｅ −Ｉ中の４３ｋＤａポリペプチドを特異的に認識した。これに対して、ＦＴ−α ポリペプチドに対して生じた抗血清は、４８ｋＤａポリペプチドを特異的に認識 した。 例IV 組換えＧＧＴａｓｅ−Ｉの酵素特性 ＹＬＹ２抗体カラムを用いて調製したヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉの酵素活性を、蛋 白質基質Ｒａｓ−ＣＶＬＳもしくはＲａｓ−ＣＡＩＬ及び脂質基質ファルネシル 二リン酸（ＦＰＰ）もしくはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を用いて、 ヒトＦＴａｓｅの酵素活性と比較した（Ｍｏｏｒｅｓら，前出；Ｙｏｋｏｙａｍ ａら，前出；Ｍｏｏｍａｗら，前出）。 組換えヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉの酵素活性 精製組換えヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉ及びＦＴａｓｅを、開示されている（Ｍｏｏｒ ｅｓら，前出）通りに、ａ）Ｒａｓ−ＣＶＬＳ（１ｍＭ）及び［³Ｈ］ＦＰＰ（ ０．５ｍＭ）［Ｒａｓ−ＣＶＬＳ＋ＦＰＰ］、ｂ）Ｒａｓ−ＣＡＩＬ（１ｍＭ） 及び［³Ｈ］ＦＰＰ（０．５ｍＭ）［Ｒａｓ−ＣＡＩＬ＋ＦＰＰ］、ｃ）Ｒａｓ −ＣＶＬＳ（１ｍＭ）及び［³Ｈ］ＧＧＰＰ（０．５ｍＭ）［Ｒａｓ−ＣＶＬＳ ＋ＧＧＰＰ］並びにｄ）Ｒａｓ−ＣＡＩＬ（１ｍＭ）及び［³Ｈ］ＧＧＰＰ［Ｒ ａｓ−ＣＡＩＬ＋ＧＧＰＰ］を用いて、活性について検定した。簡潔に述べると 、１００ｎｇのＧＧＴａｓｅ−Ｉ又はＦＴａｓｅを ３００ｍｌ反応液中で３０分間インキュベートし、５０ｍｌアリコートを２、４ 、６、８及び１０分後に取り除いて酸／エタノール不溶物の放射能を測定した。 各検定を２回行い、取り込み率（ｎｍｏｌ・ｈ^-1・ｍｇ^-1）を測定して２回の平 均値を示す。 これらのデータは、大腸菌発現ヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉ酵素が、Ｒａｓ−ＣＶＬ Ｓ及びＦＰＰを基質として優先的に取り込むＦＴａｓｅとは異なり、Ｒａｓ−Ｃ ＡＩＬ及びＧＧＰＰを基質として優先的に取り込むことを示している。これは、 ウシ脳のような天然源から単離された場合にこれら２つの酵素に見られるのと同 様である（Ｍｏｏｒｅｓら，前出，Ｍｏｏｍａｗ及びＣａｓｅｙ，前出）。大腸 菌発現ＧＧＴａｓｅ−Ｉの特異的活性は、ウシ脳から精製されたＧＧＴａｓｅ− Ｉの値に類似している（４９０ｎｍｏｌ・ｈ^-1・ｍｇ^-1、Ｍｏｏｍａｗ及びＣａ ｓｅｙ，前出）。したがって、組換えヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉは天然源に由来する 酵素に類似しているもとの思われる。 精製組換えラットＧＧＴａｓｅ−Ｉを検定して、その酵素特性が天然源から単 離されたＧＧＴａｓｅ−Ｉに類似するかどうかを決定した。そのような実験の１ つの結果を示す（図６）。 検定条件及び基質蛋白質の作製は開示されている（Ｃａｓｅｙら，前出；Ｍｏｏ ｍａｗ及びＣａｓｅｙ，前出）。組換えＧＧＴａｓｅ−Ｉは、Ｃ−末端にロイシ ン残基を有するｒａｓ蛋白質（Ｒａｓ−ＣＶＬＬ）は効率的に修飾することがで きるが、セリン残基を有するもの（Ｒａｓ−ＣＶＬＳ）は効率的には修飾できな い。その代わり、Ｒａｓ−ＣＶＬＳはＦＴａｓｅの良好な基質である（Ｃａｓｅ ｙら，前出；Ｒｅｉｓｓら，前出）。加えて、組換えＧＧＴａｓｅ−Ｉは、哺乳 動物組織から精製される酵素と区別がつかないような形でＣ−末端にロイシン残 基を有する、短いＣＡＡＸ型のペプチドを特異的に認識することができる（Ｃａ ｓｅｙら，前出）。 上に引用される全ての文献は、その全体が、参照することによりここに組込ま れる。 当業者は、この開示を読むことにより、本発明の本質的な範囲を離れることな く、形式及び詳細の様々な変更をなし得ることを認識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ケイジイ，パトリック・ジエイ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27713、ダーラム、ロイヤル・プレイス・ 5421 (72)発明者 ツアン，フアン アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27705、ダーラム、プラツト・アベニユ ー・3011 (72)発明者 デイール，ロナルド・イー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・18932、 ライン・レキシントン、メイプル・アベニ ユー・24 (72)発明者 コール，ナンシー・イー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19118、 ウインドムーア、ステントン・アベニユ ー・8055 (72)発明者 オーメル，チヤールズ・エイ アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19446、 ランズデイル、ブロード・エイカーズ・ロ ード・100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｉ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴａｓｅ−Ｉ）をコード する単離された核酸。 ２． ＧＧＴａｓｅ−Ｉが哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉである請求項１記載の核酸 。 ３． 該ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニットが配列番号２又は配列番号４に記載 のアミノ酸配列を有する請求項１記載の核酸。 ４． 該哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉが齧歯類動物又はヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉであ る請求項２記載の核酸。 ５． 哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニットをコードする単離された核酸 、又は少なくとも１５個の連続した塩基を有するその一部、又はその相補体。 ６． 該哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉが齧歯類動物又はヒトＧＧＴａｓｅ−Ｉであ る請求項５記載の核酸。 ７． 核酸が配列番号２もしくは配列番号４に記載のアミノ酸配列、又は少なく とも５アミノ酸を有するその一部をコードする請求項５記載の単離された核酸。 ８． 核酸が配列番号１もしくは配列番号３に示される配列、 又はそれと実質的に等しい配列、又は少なくとも１５個の連続した塩基を有する その一部を有する請求項７記載の単離された核酸。 ９． 該核酸が配列番号１もしくは配列番号３に示される配列、又は少なくとも １５個の連続した塩基を有するその一部を有する請求項８記載の単離された核酸 。 １０． 核酸が配列番号１もしくは配列番号３に示される配列を有する請求項９ 記載の単離された核酸。 １１． 請求項１記載の核酸及びベクターを含む組換え分子。 １２． 該核酸配列に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む請求項１１ 記載の組換え分子。 １３． 請求項１１記載の組換え分子を含む宿主細胞。 １４． 請求項１３記載の宿主細胞を、該核酸配列が発現し、それにより該ＧＧ Ｔａｓｅ−Ｉが産生されるような条件下において培養することを包含するＧＧＴ ａｓｅ−Ｉの製造方法。 １５． 請求項１４記載の方法により製造されるＧＧＴａｓｅ−Ｉ。 １６． 請求項５記載の核酸配列及びベクターを含む組換え分子。 １７． 該核酸配列に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む請求項１６ 記載の組換え分子。 １８． 請求項１６記載の組換え分子を含む宿主細胞。 １９． 請求項１８記載の宿主細胞を、該核酸配列が発現し、それにより該哺乳 動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット又はその一部が産生されるような条件下 において培養することを包含する、哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット 又はその一部の製造方法。 ２０． 請求項１９記載の方法により製造された哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβ サブユニット。 ２１． 二重鎖ＤＮＡ分子から本質的になる単離された核酸であって、該二重鎖 ＤＮＡ分子の鎖の１つが哺乳動物ＧＧＴａｓｅ−Ｉのβサブユニット、又は少な くとも１５個の塩基対を有するその一部をコードする単離された核酸。 ２２． プロモーターに作用可能に結合し、又はプロモーターと逆向きの、請求 項２１記載の核酸を含む組換え分子。 ２３． 請求項２２記載の組換え分子を含む宿主細胞。 ２４． 宿主細胞におけるＧＧＴａｓｅ−Ｉの産生を阻害する方法であって、該 細胞に、該核酸が転写され、それにより該 ＧＧＴａｓｅ−Ｉの産生が阻害されるような条件下で、請求項２２記載の組換え 分子を導入することを包含する方法。 ２５． 被検化合物をＧＧＴａｓｅ−Ｉ活性を改変する能力についてスクリーニ ングする方法であって、 ｉ）該被検化合物の存在下又は非存在下において、ＧＧＴａｓｅ−Ｉ基質をゲ ラニルゲラニル二リン酸及びＧＧＴａｓｅ−Ｉと反応させ、並びに ii）ゲラニルゲラニル二リン酸から該基質へのゲラニルゲラニル基の転移を測 定すること、 を包含する方法であり、ここで、 被検化合物の非存在下における該基質へのゲラニルゲラニル基の転移に比べて 、被検化合物の存在下における該基質へのゲラニルゲラニル基の転移が減少すれ ば被検化合物が阻害活性を有することを示し、かつ 被検化合物の非存在下における該基質へのゲラニルゲラニル基の転移に比べて 、被検化合物の存在下における該基質へのゲラニルゲラニル基の転移が増加すれ ば被検化合物が増大活性を有することを示す方法。