KR100202387B1 - 인간 아데닐레이트 키나제 2b 단백질 및 이의 제조방법 - Google Patents

인간 아데닐레이트 키나제 2b 단백질 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체로부터 유도된 아데닐레이트 키나제(adenylate kinase: AK) 2B 단백질에 관한 것으로, 인간 태아의 간조직으로부터 인간 AK2B 유전자를 유도하여 이의 염기 서열 및 아미노산 서열을 규정하고, 이를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균을 인간 AK2B의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 인간 AK2B 단백질을 대량 발현시킴으로써 인간 AK2B 단백질의 특성 및 이들과 관련된 질환의 분자병학적 연구에 크게 이바지할 수 있다.

Description

인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질 및 이의 제조방법
본 발명은 인체로부터 유도된 아데닐레이트 키나제(adenylate kinase: AK) 2B 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에너지 대사과정에서 생리적으로 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 아데닐레이트 키나제 2B 단백질을 인간 태아의 간 조직으로부터 유도하여 이의 염기 서열 및 아미노산 서열을 규정하고, 이를 포함하는 플라스미드로 대장균을 형질전환시키고 형질전환된 대장균으로부터 아데닐레이트 키나제 2B 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
AK는 세포내에 존재하는 에너지원인 ATP, ADP 및 AMP 사이에서 일어나는 인산기의 가역적 전이반응을 촉매하고(Lu, Q.,et al., PNAS, 93,5720-5725(1996)), 이들 간의 균형을 유지시킴으로써 세포내에서 아데닌 뉴클레오타이드(adenie nucleotide)의 항상성을 조절하는 작용을 하는 효소이다. 즉, AK의 존재는 세포내에서 일어나는 신호전달 과정 등과 관련한 인산화 반응에 매우 중요하며, 이외에도 인간 세포내의 에너지 대사에 관여하므로 세포가 괴사하는 현상인 아폽토시스(apoptosis)와 세포의 이상 발육에 의한 발암작용 등과도 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Hamada, M.,et al., Adenylate kinase in A study of Enzymes Vol II,Florida CRC Press. 403-444(1991)).
최근까지 밝혀진 AK 효소들의 생체 내에서의 기능에 관하여 좀더 구체적으로 살펴보면, AK 효소는 근육조직 및 뇌조직에서 크레아틴 키나제(creatine kinase)와 함께 TTP(thiamine triphosphate)를 생합성하는 과정에 작용할 뿐만 아니라 인산화 전이체계를 통한 ATP 생성을 유도하여 세포가 활동하는 중에 소모되는 에너지를 보충하는 역할을 하는데, 이 과정은 직접적으로 체내 에너지 대사에서 매우 중요하다. 예를 들면, 피루브산 키나제 또는 헥소 키나제 등의 효소에 유전적으로 결함이 생길 때 중증의 용혈성 빈혈이 일어나는 것과 비슷한 현상으로 AK 효소에 유전적으로 결함이 생길 경우, 이에 의해 선천성 비구상성 빈혈 등이 유발된다. 즉, 노후 적혈구내 해당 작용계의 기능이 약화된 상태에서 AK 효소의 유전적 결함이 일어나면 세포내에서 적혈구가 파괴되어 아데닌 뉴클레오타이드가 생성되는 과정에 영향을 미치게 된다(Miwa, S.,et al., Am. J. Hematol, 14,325(1989); Majkic-Singh N.,et al., Hum. Hered., 32,367-368(1982)).
이와 같이 AK 효소는 용혈성 빈혈 및 에너지 대사가 관여하는 근육 질환 등에 깊이 관련되어 있으므로 이러한 질환 등의 진단 및 치료와 관련하여 매우 중요하다. 또한 AK 효소에 대한 많은 연구가 진행되어 지금까지 여러 종류의 생물에서 30 여종의 AK 효소가 존재하는 것이 확인되었다.
특히, 척추동물에는 AK1, AK2 및 AK3의 3 가지 종류의 AK 유전자들이 여러 가지 조직들에 각기 다른 정도로 분포되어 있으며(Fukami, K.,et al., BS Lett., 385,214-220(1996)), 세포내에서의 생리적 기능이 약간씩 다른 것으로 보고되어 있는데 구체적으로 AK1의 경우는 근육세포, 뇌세포 및 적혈구의 세포질 등에 AK2의 경우는 간세포, 신장세포, 비장세포 및 심장세포 내의 미토콘드리아 막 사이에 존재하는 것으로 알려져 있다(Khoo, J. C.,et al., Biochem. Biophys. Acta., 268,98-101(1972)). 또한 AK3의 경우는 GTP와 AMP 사이의 인산화 전이효소로 작용하는데 심장세포와 간세포의 미토콘드리아 기질내에 존재한다(Tomosselli, A. G.,et al., Eur. J. Biochem., 93,257-262(1979)).
현재까지는 이러한 AK 효소 유전자들 중에서 사람의 AK1 유전자, 닭의 AK1 유전자 그리고 소의 AK2 유전자 등이 클로닝되어 그 특성이 연구되고 있다(Kishi, F.,et al., J. Biol. Chem., 261,2942-2945(1988); Matsuura, S.,et al., J. Biol. Chem., 264,10148-10155(1989)). 특히 AK2는 소에서 분리되어 그 특성이 밝혀진 바 있는데, 소의 AK2 효소는 효소 단백질의 C-말단 부위에 위치하는 아미노산 염기 서열과 효소가 분포하는 조직부위에 따라 AK2A와 AK2B로 구분된다. 구체적으로 AK2A 단백질의 C-말단은 8개의 아미노산, 즉, Cys, Lys, Asp, Leu, Val, Met, Phe 및 Ile로 구성되어 총 241개의 아미노산으로 이루어져 있고, AK2B 단백질의 C-말단은 AK2A 단백질의 C-말단 8개의 아미노산이 Ser으로 치환됨으로써 총 234개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이는 AK2A 효소 단백질의 이 AK2B 효소 단백질의 차이로 인한 것이다. 이와 같은 효소 단백질의 C-말단에서 아미노산 서열의 차이는 AK2 유전자의 전사과정에서 일어나는 교대 스프라이싱(alternate splicing) 기작에 의해 유발되는 것으로 추정되고 있다(Tanaka, H.,et al., Gene, 93,221-227(1990)).
또한 AK는 생체내의 에너지 대사를 포함한 인체내 생리활성에 중요한 역할을 담당하기 때문에(Nupenko, E. V.,et al., Biochem. Biophys. Acta., 1091,213-21(1991)), 인체 유래의 AK 유전자들의 확보는 심장질환을 비롯한 근육질환에 관한 분자병태학적 연구 및 임상활용에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
이에 본 발명자들은 인간 태아의 간 조직으로부터 AK2A를 제조하여, 이를 특허 출원한 바 있으며(대한민국 특허출원 제 96-17039 호), 본 발명에서는 인간 AK2A 유전자와 상이한 염기 서열을 갖는 인간 AK2B 유전자를 인간 태아의 간 조직으로부터 유도하여 이의 염기 서열 및 아미노산 서열을 규정함으로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 인간 태아의 간 조직으로부터 유도된 인간 아데닐레이트 키나제(adenylate kinase: AK) 2B 단백질, 상기 단백질을 코드하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 인간 AK2B(HAK2B) 유전자의 아미노산 서열과 소의 AK2B(BOVAK2B) 유전자 및 쥐의 AK2(RATAK2) 유전자의 아미노산 서열간의 유사성을 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 인간 아데닐레이트 키나제 2B(AK2B) 유전자를 포함하는 cDNA 클론 HAK2B의 전체 염기 서열 및 이로부터 예상되는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 인간 태아의 간 조직으로부터 아데닐레이트 키나제의 발현을 노던 블롯팅(Northern Blotting) 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 아데닐레이트 키나제 2B 유전자를 포함하는 발현벡터 pHT-AK2B의 제작과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 대장균에서 발현된 인간 AK2B 유전자가 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 활성을 가짐을 나타낸 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 인간 태아의 간 조직으로부터 유래된 하기 서열 1을 갖는 아데닐레이트 키나제 2B 단백질,
[서열 1]
Figure kpo00001
이를 코드하는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균 및 상기 형질전환된 대장균을 인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 제조방법을 제공한다.
인간 태아의 간 조직으로부터 mRNA를 분리하고, 이에 상응하는 cDNA를 올리고-뉴클레오타이드 프라이머와 역전사효소를 사용하여 합성한다. 합성된 cDNA를 λZAPII XR 벡터에 클로닝하여 인간 태아의 간 조직에서 발현되는 유전자들의 cDNA 라이브러리를 제조한다. 이들 라이브러리로부터 부분 염기 서열을 결정하고, 이를 컴퓨터 프로그램을 이용하여 이미 밝혀진 유전자들의 데이타 베이스와 비교하여 유전자들을 동정한다. 그 결과, 소의 AK2A와는 아미노산 수준에서 93%의 상동성을 가지며, 아미노산 서열과 그 특성 면에서 보면, 전체적으로 97%의 유사성을 나타내는 cDNA 클론인 P05D07을 분리할 수 있다.
인간 태아의 간 조직의 cDNA 라이브러리로부터 AK2B의 전체 염기 서열을 포함하는 cDNA 클론을 얻기 위하여, P05D07을 탐침으로 하여 AK2B 유전자의 전체 염기 서열을 포함하는 클론을 선별분리하여 이를 HAK2B로 명명하고, 이의 전체 염기 서열을 결정한다.
인간 AK2B 유전자가 실제로 세포내에서 발현되는 양상을 확인하기 위하여 인간 태아의 간 조직에서 mRNA를 분리하여 상보적 cDNA 클론 HAK2B에서 얻은 DNA 절편을 하이브리다이제이션 탐침으로 하여 노던 블롯팅(Northern Blotting) 분석한 결과, 본 발명의 AK2B는 AK2A와는 구별되는 특이적인 서열을 포함함을 확인할 수 있다.
이어서 상기 재조합 벡터로 대장균을 형질전환시킨 다음, 본 유전자의 발현에 적당한 조건에서 배양한다. 이들 대장균에서 AK2B 유전자의 발현을 유도하기 위하여, 배양세포의 대수적 증식기에 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 배양하고 배양 후 수거한 균체를 파쇄한 조세포액에서의 아데닐레이트 키나제 활성을 분광 분석법으로 조사한 결과, 대조군에 비해 본 발명의 AK2B 유전자는 효소의 활성이 크게 증가한 것을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
실 시 예 1 : 인간 태아의 간 조직으로부터 cDNA 라이브러리의 제조
인간 태아의 간 조직으로부터 구아니딘 티오시아네이트와 산성 페놀을 이용하여 세포내에 포함된 전체 RNA를 추출한 다음, 전체 RNA를 올리고-dT 셀룰로스 칼럼에 통과시켜 폴리(A)-RNA를 분리하였다.
cDNA 라이브러리를 작성하기 위하여, 5㎍의 폴리(A)-RNA에 17가의 dT가 연결된 올리고-뉴클레오티드 프라이머와 몰로니 류케미아 바이러스의 역전사 효소(reverse transcriptase)를 함께 반응시켜 첫번째 가닥 cDNA를 합성한 다음, RNA 분해효소와 대장균의 DNA 합성효소를 사용하여 두번째 가닥의 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA를 운반체인 벡터에 클로닝하기 위하여, cDNA의 양쪽 말단에 벡터의 양말단과 상보적인 염기 서열을 갖는 제한효소EcoRI의 인지부위를 연결한 다음 제한효소XhoI로 절단하였다. 이 때 cDNA 라이브러리에 포함되는 염기의 길이를 길게 하고 클로닝 효율을 높이기 위하여, 제한효소에 의해 절단된 DNA 조각들과 200bp 이하의 작은 cDNA는 세파크릴 칼럼을 사용하여 제거하였다. 이후 cDNA는 제한효소EcoRI과XhoI으로 절단한 벡터 λZAPII XR(STRATAGENE, U.S.A.)에 연결하고 이를 사용하여 생체외 패키징(in vitro packaging) 방법으로 파아지를 제조하여 인간 태아의 간 조직의 cDNA 라이브러리를 작성하였다.
실 시 예 2 : 부분 염기 서열 결정
각 클론의 부분 염기 서열을 결정하기 위해 대장균 cDNA 라이브러리의 파아지와 ExAssist 헬퍼 파아지(helper phage)를 함께 감염시켜 pBluescript 플라스미드 부분 만을 포함한 f1 파아지를 얻었다. 이 파아지를 다시 대장균에 감염시켜 엠피실린이 포함된 배지를 이용하여 두 가닥의 복제형(replacative form) 플라스미드를 포함한 클론들을 선별하였다. 다시 플라스미드를 포함하는 대장균에 M13 헬퍼파아지를 감염시킨 후, 한 가닥의 M13 DNA 파아지를 추출하여 부분 염기 서열 결정을 위한 주형 DNA로 사용하였다.
염기 서열은 하기 서열 2를 갖는 SK 프라이머와 DNA 중합효소 시쿼네이즈(sequenase)를 이용하여 디데옥시 종결법(dideoxy termination method)으로 결정하였다(Sanger, F.,et al,. PNAS, 74,5463-5467(1977)). 그 결과 하기 서열 3을 갖는 cDNA의 부분 염기 서열을 얻었다.
[서열 2]
5'-CGCTCTAGAACTAGTGGATC-3'
[서열 3]
Figure kpo00002
실 시 예 3 : 염기 서열 및 아미노산 서열의 분석
실시예 1에서 얻은 각 cDNA의 염기 서열 및 아미노산 서열을 검색하기 위하여, 생명공학연구소 내의 근거리 통신망으로 연결된 주컴퓨터를 사용하였다. 핵산 염기 서열의 분석은 BLASTN 프로그램을 사용하여 GenBank 데이타베이스를 검색하였으며, 아미노산 서열의 분석은 BLASTX 프로그램을 사용하여 스위스 포트 프로테인(swiss port protein) 데이타베이스를 검색하였다(Altschul,et al., J. Mol. Biol., 215,403-410(1990)).
[표 1]
cDNA 클론 P05D07의 핵산 염기 서열과 그로부터 예상되는 아미노산 서열을 사용해 데이터 베이스로부터 유사한 유전자를 검색한 결과
Figure kpo00003
실 시 예 4 : 인간 AK2B 유전자의 부분 염기 서열을 가진 클론의 분리 및 전체 염기 서열 결정
인간 AK 유전자의 부분 염기 서열을 가지고 있는 cDNA 클론 P05D07을 선별하여 이 클론에 포함된 AK2 유전자의 DNA 염기 서열을 결정하였다.
데이타 검색에 사용된 cDNA 클론 P05D07은 서열 1의 부분 염기 서열을 가지며, 본 발명의 클론의 핵산 염기 서열에서 예상되는 아미노산 서열과 유사성을 가지는 유전자의 염기 서열은 데이타베이스를 이용하여 검색하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다. 표 1에는 클로닝되어 GenBank에 등록된 AK2 유전자의 등록번호와 유전자의 이름이 기록되어 있고, 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)은 핵산 염기 서열을 3개씩 짝을 이루어 번역할 때 사용된 번역골격을 나타낸다. 하이스코어(high score)는 염기 서열상의 상동성을 표현한 것으로, 비교하는 두 유전자 상에 대응하는 두 염기가 각기 동일한 염기일 경우 +5, 동일한 염기가 아닐 경우는 -4의 값을 주어 계산한 것이다. 따라서 검색한 전체 염기에서 얻어지는 값을 합산한 후 얻어지는 수치가 높을수록 두 유전자 간의 높은 유사성이 있음을 나타내는 것으로 판정할 수 있다. 또한 확률(probability)은 검색한 염기 서열이 데이타베이스의 자료와 일치할 확률을 의미한다.
도 1은 본 발명의 인간 AK2B(HAK2B) 유전자의 아미노산 서열과 소의 AK2B(BOVAK2B) 유전자 및 쥐의 AK2(RATAK2) 유전자의 아미노산 서열간의 유사성을 비교하여 나타낸 것이다.
표 1 및 도 1에서 보듯이, cDNA 클론 P05D07의 염기 서열은 검색 과정에서 확인한 유전자의 염기 서열들 중, 특히 소 또는 쥐에서 클로닝된 AK 유전자의 핵산 염기 서열과 높은 상동성이 있음을 알 수 있다.
실 시 예 5 : 인간 AK2B 유전자의 전체 염기 서열 및 아미노산 서열확인
인간 AK2B의 전체 유전자를 포함하는 cDNA 클론을 선별하기 위하여, 인간 태아의 간 조직의 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리다이제이션(plaque hybridization) 방법으로 검색하였다. 이 때 탐침으로는 실시예 4의 P05D07 클론을 사용하였고, 그 결과 5개의 cDNA 클론을 분리하였다. 분리한 클론들로부터 유전자의 전체 염기 서열을 포함하는 핵산 염기 서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 확인하였다. 또한 전체 핵산 염기 서열을 가지고 있는 cDNA 클론을 HAK2B로 명명하였다.
도 2는 인간 아데닐레이트 키나제 2B(AK2B) 유전자를 포함하는 cDNA 클론 HAK2B의 전체 염기 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
cDNA 클론 HAK2B는 2,105 개의 염기로 이루어져 있으며, 696 개의 염기로 구성된 한개의 ORF이 존재한다. 이로부터 첫번째 메티오닌(Met)에서 시작하여 232개의 아미노산으로 번역되며 이의 분자량은 25kDa으로 측정된다.
이 효소 단백질을 소의 AK2B 및 쥐의 AK2 단백질의 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 각각 97%의 유사성(95%의 동일성 및 2%의 유사치환) 및 95%의 유사성(93%의 동일성 및 2%의 유사치환)을 나타내고 생산된 재조합 단백질이 효소 활성을 나타내므로 이들은 동일한 기능을 가진 단백질로 판단할 수 있으며 또한 본 발명의 유전자는 지금까지 전세계적으로 전혀 알려지지 않은 새로운 유전자임을 확인할 수 있었다.
실 시 예 6 : 인간 AK2B 유전자의 mRNA 분석
인간 AK2B 유전자가 실제로 여러 종류의 세포내에서 발현되는 정도를 확인하기 위하여, 인간 태아의 간 조직에서 mRNA를 분리하여 포름알데히드 젤상에서 전기영동하였다. 이를 나일론 막에 옮기고 UV-크로스링커(crossliker)로 mRNA를 고정시켰다. 여기에 상보적 cDNA 클론 HAK2B의 염기 서열중 HAK2B의 ORF 만을 포함하는 DNA 절편을 동위원소32P로 표지한 하이브리다이제이션 탐침을 사용하여 노던 블롯팅(Northern Blotting) 분석하였다(Sambrook, J.,et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd(1989)). 탐침으로 사용한 DNA 절편은 HAK2B의 염기 서열을 주형으로 하여 PCR 반응으로 증폭시켜 얻었으며, 이 때 사용한 프라이머는 AK2B 유전자의 전체 염기 서열을 참조로 하여 ORF의 개시부분과 종결부분을 코딩할 수 있도록 하기 서열 4를 갖는 프라이머 ADK5 및 하기 서열 5를 갖는 프라이머 ADK2b3를 갖도록 화학적으로 합성하여 제작하였다.
[서열 4]
5'-GAAGATCTCCATGGCTCCCAGCGTGC-3'
[서열 5]
5'-GAAGATCTGCAGCTAGGATGTG GCTTTGG-3'
도 3은 인간 태아의 간 조직으로부터 아데닐레이트 키나제의 발현을 노던 블롯팅(Northern Blotting) 분석한 결과로서, A는 인체 AK2의 전사체, B는 인체 AK2B의 전사체, 그리고 C는 인체 AK2A의 전사체이다.
여기에서 보듯이, 인간 AK2B 유전자의 mRNA를 분석한 결과, 각각 약 4.3kb, 3.4kb, 2.1kb 및 1.0kb의 크기를 갖는 각기 다른 전사체가 존재함을 확인하였다. 이는 소의 AK2 유전자의 전사과정에서 보는 바와 같이, 사람의 AK2A 및 AK2B 유전자들의 전사과정에서도 mRNA의 교대 스프라이싱(splicing)이 일어날 가능성이 있음을 제시한다. 이를 확인하기 위하여 AK2A 및 AK2B에 각각 특이적인 탐침을 이용하여 노던 블롯팅 분석한 결과, 1.0kb 전사체는 AK2A이며, 분자량이 큰 다른 전사체들은 AK2B의 염기 서열을 갖고 있음을 알 수 있었다.
실 시 예 7 : 인간 AK2B를 포함하는 발현벡터 제조 및 대장균의 형질전환
인간 AK2B 유전자의 전체 염기 서열을 갖는 클론 HAK2B를 주형으로 하고 상기 실시예 6에서 제조한 프라이머 ADK5 및 프라이머 ADK2b3을 사용하여 PCR 반응으로 전체 오픈 리딩 프레임을 증폭시킨 후 이를 TA 클로닝 벡터(pCRII, 입수처: Invitrogen)에서 클로닝하여 플라스미드 pCR-AK2B을 제조하였다. 이를 제한효소SmaI과PstI으로 절단하여 620bp 크기의 DNA 절편을 분리정제하였다. 이 DNA 절편을 제한효소SmaI과PstI으로 절단하여 분리한 pHT-AK2A 발현벡터와 접합시켜 플라스미드 pHT-AK2B를 제조하였다.
도 4는 본 발명의 아데닐레이트 키나제 2B 유전자를 포함하는 발현벡터 pHT-AK2B의 제작과정을 나타낸 것이다.
상기 pHT-AK2B를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환하였다. 이 형질전환된 대장균 DH5α/HAK2B를 1996년 9월 30일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8762P 호로서 기탁하였다.
실 시 예 8 : 대장균에서 생산한 인간 AK2B 단백질의 효소활성
본 발명의 AK2B 유전자가 대장균에서 효과적으로 발현하고, AK의 활성을 나타내는 지를 확인하기 위하여, 대장균 DH5α를 각각 본 발명의 발현벡터 pHT-AK2B 및 표준 대조군인 플라스미드 pHT121로 형질전환시킨 후 이들을 각각 배양하였다. 이어서 배양세포의 대수적 증식기에 0.5mM IPTG를 가한 다음 진탕배양한 후 균체를 회수하여 초음파로 파쇄하여 얻은 조세포액으로부터 아데닐레이트 키나제의 활성을 조사하였다.
아데닐레이트 키나제의 활성은 연쇄 효소 반응을 이용하여 분광분석법으로 측정하였다(Kim, H. J.,et al., Biochemistry, 29,1107-1111(1990)). 반응혼합액(75mM 트리에탄올아민(pH 7.6), 1.2mM AMP, 1.0mM ATP, 1mM MgSO4, 120mM KCl, 0.2mM NADH, 0.3mM 포스포이놀피루브산, 16.5 단위의 젖산 탈수소효소, 6 단위의 피루브산 키나제)을 25℃에서 10 분간 정치한 다음, 이에 상기 시료를 넣고 분광분석기를 사용하여 파장 340nm에서 시간의 경과에 따라 흡광도의 감소정도를 측정하였다.
도 5는 본 발명의 대장균에서 발현된 인간 AK2B 유전자가 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 활성을 가짐을 나타낸 그래프이다.
여기에서 보듯이, 본 발명의 AK2B 유전자를 포함하는 발현벡터 pHT-AK2B로 형질전환된 대장균에서의 아데닐레이트 키나제의 효소활성은 1350mU/㎎으로, 표준 대조군인 플라스미드 pHT121에 의해 형질전환된 대장균에서의 아데닐레이트 키나제의 효소활성이 550mU/㎎인데 비해 2.5배 정도 더 높은 값이었다.
이와 같이 본 발명에서 유도된 AK2B 유전자는 세포내에서 발현하는 아데닐레이트 키나제의 활성을 측정하는데 표준물질로 사용할 수 있고 용혈성 빈혈 또는 근육질환 등의 진단 및 치료에 이용할 수 있으며, AK2B 단백질의 특성을 깊이 연구할 수 있어 이들과 관련된 질환의 분자병학적 연구에 크게 이바지할 수 있다.
또한 본 AK2B 유전자 및 그의 발현벡터를 이용하여 체내에 소량으로 존재하는 본 효소 단백질을 대량으로 생산할 수 있으며, 이 단백질은 AK 효소에 대한 연구와 구체적인 질병치료 연구의 재료로 활용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 인간 태아의 간 조직으로부터 유래된 하기 서열 1을 갖는 아데닐레이트 키나제 2B 단백질.
    [서열 1]
    Figure kpo00004
  2. 제 1 항의 아미노산 서열을 코드하는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 유전자.
  3. 제 2 항에 있어서,
    하기 서열 6을 갖는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 유전자.
    [서열 6]
    Figure kpo00005
  4. 제 2 항의 유전자를 포함하는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 발현벡터.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 발현벡터는 pHT-AK2B인 발현벡터.
  6. 제 4 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 대장균은 DH5α/HAK2B(KCTC 8762P)인 대장균.
  8. 제 6 항의 대장균을 인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 아데닐레이트 키나제 2B 단백질의 제조방법.
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