JPH09104698A - カウレン合成酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 配列表に示すアミノ酸配列（アミノ酸番
号１〜789)及び該配列に１個若しくは２個以上のアミノ
酸残基が挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸配列を有
するポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードする
DNA 。 【効果】 該ポリペプチドはコパリルピロリン酸からen
t-カウレンへの変換を触媒する酵素作用を有しており、
植物成長の調節に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なカウレン合成
酵素及び該酵素をコードするDNA に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ent-カウレンは、ジベレリン(GA)生合成
における重要な中間体であり、ゲラニルゲラニルピロリ
ン酸(GGPP)からコパリルピロリン酸(CPP) を経て合成さ
れる。これらのステップはそれぞれent-カウレン合成酵
素A (KSA) 及びent-カウレン合成酵素B (KSB) により触
媒される（Coolbaugh, R.C., The Biochemistry and Ph
ysiology of Gibberellins, Vol.1, Pracger Publisher
s, New York, pp.53-98,1983)。カロチノイド類、キサ
ントフィル及びフィトールのような他のテルペン類もゲ
ラニルゲラニルピロリン酸を前駆体として生合成され、
一方、コパリルピロリン酸は大環状ジテルペン類の前駆
体として用いられる。従って、ent-カウレン合成酵素A
及びB は、ジベレリン生合成の初期段階において重要な
酵素である（上掲 Coolbaughの他、Chung C.H. et al.,
Plant Physiol, 80, pp.544-548,1986; 及び Graebe,
J.E., Annu. Rev. Plant. Physiol., 38, pp.419-465,
1987)。

【０００３】ダンカンら(Duncan, J.D. and West C.A.,
Plant Physiol., 68, pp.1128-1134, 1981)は QAEカラ
ムを用いて野性種キュウリ (Marah macrocarpus L.) か
らent-カウレン合成酵素A 及びB を分離し、ゲラニルゲ
ラニルピロリン酸のent-カウレンへの転化が２つの異な
る酵素によって触媒されることを示唆した。この刊行物
には、ent-カウレン合成酵素A 及びB がent-カウレン合
成の間に互いに密接な関係を持つこと、及びent-カウレ
ン合成酵素B は外部から加えられたコパリルピロリン酸
よりもent-カウレン合成酵素A によって作られた内生コ
パリルピロリン酸を優先的に用いることが示されてい
る。

【０００４】すなわち、以下のスキームにしめされるよ
うに、ent-カウレン合成酵素A はゲラニルゲラニルピロ
リン酸(GGPP)からコパリルピロリン酸(CPP) への転化を
触媒しており、次いでコパリルピロリン酸がent-カウレ
ン合成酵素B によってent-カウレンに転化される。

【化１】

【０００５】この数年来、ジベレリン生合成酵素の cDN
A クローニングが報告されている。Arabidopsis の GA1
座がゲノミックサブトラクションによって単離され (Su
n, T.P., et al., Plant Cell, 4, pp.119-128, 1992)
、対応する cDNA クローンがent-カウレン合成酵素A
をコードしていることが大腸菌における過剰発現系を用
いて確認された(Sun T.P. and Kamiya, Y., Plant Cel
l, 6, pp.1509-1518, 1994)。また、トウモロコシの An
1座がトランスポゾンタッギング法によってクローニン
グされており、cDNAからの推定アミノ酸配列は Arabido
psis由来のent-カウレン合成酵素A と有意の相同性を示
したが、その発現蛋白の作用は未知である (Bensen, R.
J., et al., Plant Cell, 7, pp.75-84, 1995)。ジベレ
リン生合成における3bヒドロキシラーゼと推定される酵
素も Arabidopsis GA4変異体を用いたT-DNAタッギング
法によりクローニングされた (Chiang, H.-h., et al.,
PlantCell, 7, pp.195-201, 1995) 。

【０００６】一方、ent-カウレン合成酵素B について
は、トウゴマ (Ricinus communis) から部分精製された
(Spickett, C.M., et al., Phytochem., 37, pp.971-9
73, 1994) 。トウゴマは、カウレン及び関連ジテルペン
類、ベイアレン、トラキロバン及びサンダラコピマラジ
エンを生合成しており、これらの化合物は、共通の中間
体であるコパリルピロリン酸の選択的環化によって形成
されている。ent-カウレン合成酵素B 遺伝子のクローニ
ングの試みについての報告はあるが（15th Internation
al Conference on Plant Growth Substance, 1995 年７
月14日〜18日、ミネアポリス、米国、Kamiya, Y., et a
l., 演題番号 040：及び Saito, T., et al., 演題番号
110)、完全なcDNAの配列及び該酵素のアミノ酸配列につ
いての報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、精製された
ent-カウレン合成酵素B を提供することを課題としてお
り、また別な課題は、該酵素のアミノ酸配列及び該酵素
をコードするDNA を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、カボチャ
(Cucurbita maxima L.) 種子の内胚乳からent-カウレン
合成酵素B を精製することに成功し、そのアミノ酸配列
（部分配列）を明らかにするとともに、そのアミノ酸配
列の情報を用いてent-カウレン合成酵素B をコードする
遺伝子をクローニングすることに成功した。

【０００９】すなわち本発明は、配列表の配列番号１に
示すアミノ酸配列（アミノ酸番号１〜789 、アミノ酸配
列はIU PACの一文字表記法で示す）により特定されるポ
リペプチドを提供するものである。このポリペプチド
は、コパリルピロリン酸からent-カウレンへの変換を触
媒する酵素（本明細書中で、ent-カウレン合成酵素B 又
は単にKSB という場合がある）として作用を有するもの
である。また、本発明の別の態様により、上記ポリペプ
チドをコードするDNA ；及び、その好ましい態様とし
て、配列表の配列番号２に示す核酸配列の核酸番号 138
〜2507（終始コドンを含む）で特定されるDNA が提供さ
れる。

【００１０】本発明により提供されるポリペプチドに
は、上記のカボチャ由来の天然型ent-カウレン合成酵素
B の他、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におい
て１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が挿入、欠失若
しくは置換したアミノ酸配列を有し、コパリルピロリン
酸からent-カウレンへの変換を触媒する作用を有するポ
リペプチドが全て包含される。本発明のポリペプチドの
うち、カボチャ、トウモロコシ、イネ、大豆などの生体
内で発現されている天然型のent-カウレン合成酵素は、
特に好ましい態様である。

【００１１】本明細書の実施例には、本発明のポリペプ
チドの好ましい態様であるカボチャ由来の天然型ent-カ
ウレン合成酵素B について、その酵素作用を検定する方
法が詳細に記載されているので、該酵素のアミノ酸配列
の構成アミノ酸残基に挿入、欠失若しくは置換を伴う変
異ポリペプチドが上記所望の作用を有するか否かは、当
業者が容易に検定可能である。

【００１２】本発明の別の態様によれば、カボチャ由来
の天然型ent-カウレン合成酵素B であるポリペプチドま
たはその変異ポリペプチドのアミノ酸配列を分子中に含
み、かつ、コパリルピロリン酸からent-カウレンへの変
換を触媒する活性を有するポリペプチドが提供される。
これらのポリペプチドは、上記ポリペプチドの全長をそ
の一部として含むことを特徴としている。

【００１３】さらに別の態様によれば、カボチャ由来の
天然型ent-カウレン合成酵素B であるポリペプチドまた
はその変異ポリペプチドのアミノ酸配列のうち、コパリ
ルピロリン酸からent-カウレンへの変換を触媒する活性
を有する部分配列（いわゆる活性ドメイン）をその一部
または全部とし、コパリルピロリン酸からent-カウレン
への変換を触媒する作用を有するポリペプチドが提供さ
れる。このようなポリペプチドは、上記活性ドメインの
みからなる場合と、活性ドメインをその一部として含む
場合がある。

【００１４】例えば、本発明の好ましい態様であるカボ
チャ由来の天然型ent-カウレン合成酵素B は、発現後に
細胞内に貯留される場合がある。この酵素の全アミノ酸
配列から膜結合ドメイン（疎水性ドメイン）を選択的に
除去し、残部である活性ドメインを含むポリペプチドを
シグナルペプチドを結合させることにより、細胞外分泌
型の可溶化酵素を製造することが可能である。疎水性ド
メインの決定方法としては、例えば、カイトらの方法(K
yte, J. et al., J. Mol. Biol., 157, pp.105-132, 19
82) や、Hopp & Woods法などの周知の方法を採用するこ
とができる。

【００１５】本発明の別の態様によれば、上記のポリペ
プチドのいずれかをコードするDNAが提供される。例え
ば、本発明のDNA には、上記のカボチャ由来の天然型en
t-カウレン合成酵素B をコードする任意のDNA ；その好
ましい例として、配列表の配列番号３に示す核酸配列の
核酸番号 138〜2507（終始コドンを含む）で特定される
DNA が包含される。

【００１６】また、カボチャ由来の天然型ent-カウレン
合成酵素B のアミノ酸配列の構成アミノ酸残基に挿入、
欠失若しくは置換を伴う変異ポリペプチドであって、コ
パリルピロリン酸からent-カウレンへの変換を触媒する
作用を有するポリペプチドをコードする任意のDNA ；並
びに、配列表の配列番号３に示す核酸配列の核酸番号13
8〜2507（終始コドンを含む）で特定されるDNA におい
て１個若しくは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置
換されたDNA 配列であって、コパリルピロリン酸からen
t-カウレンへの変換を触媒する作用を有するポリペプチ
ドをコードする任意のDNA なども本発明に包含される。

【００１７】また、このようなセンスDNA を含む遺伝子
に対して、アンチセンスDNA として作用するDNA も本発
明の範囲に包含される。例えば、配列表の配列番号３に
示す核酸配列の核酸番号 138〜2507（終始コドンを含
む）で特定されるDNA の相補的配列を有するDNA におい
て１個若しくは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置
換されたDNA であって、上記のポリペプチドのいずれか
をコードするDNA を含むent-カウレンB 合成酵素遺伝子
に対してアンチセンスDNA として作用するDNA などを例
示することができる。

【００１８】本発明のDNA のうち、カボチャ由来の天然
型ent-カウレン合成酵素B をコードするDNA について
は、実施例中に詳細に単離方法を記載した。従って、実
施例に記載された方法に従って、あるいはその記述を参
照しつつ、それらの方法に適宜に改変や修飾を加えるこ
とによって、カボチャおよびそれ以外の植物由来のent-
カウレン合成酵素をコードするDNA は当業者に容易に調
製可能である。なお、上記のDNA をその一部といて含む
DNA も本発明の範囲に包含されることはいうまでもな
い。

【００１９】本発明のDNA 及びそのアンチセンスDNA
は、植物の成長や種子成長などにおいて重要な作用を有
するent-カウレン合成酵素B の植物中での発現を調節す
るために有用である。例えば、本発明のDNA を組み込ん
だトランスジェニック植物は、植物の背丈が高められ、
成長促進が期待できる。また、アンチセンスDNA を組み
込んだトランスジェニック植物は、種子や果実の量を維
持したまま、植物の背丈が抑制されるので、風水害など
に強い作物の育種が可能になる。

【００２０】さらに本発明により、上記のDNA を含む組
換えベクター、該組換えベクターにより形質転換された
形質転換体である細胞が提供される。ベクターの種類は
当業者に利用可能なものであれば特に限定されず、形質
転換すべき宿主細胞との組み合わせで適宜選択すべきで
ある。宿主細胞の種類も特に限定されず、大腸菌等の微
生物細胞（原核細胞）や動物若しくは植物細胞（真核細
胞）などの任意の細胞を用いることが可能である。

【００２１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定される
ことはない。 例１：ent-カウレン合成酵素B(KSB)の精製 (1) 材料と方法 (A) 植物材料及び試薬 カボチャ(Cucurbita maxima L.) 、“リーゼンメローネ
・ゲルプ・フェルネツト(Riesenmelone gelb vernetz
t)”の種子は、ファン・ヴァフェレン・フランツェンツ
ヒト (van Waveren Pflanzenzucht)、ロスドルフ、ドイ
ツ国からヤン・グラーベ (Jan Graebe) 教授を通して入
手した。植物を埼玉県の農場で栽培し、子葉がその最終
的長さの約半分に成長した時点の未成熟の実を1992年の
６月中旬及び７月初旬の間に収穫した。

【００２２】ゲラニルゲラニオールはクラレ株式会社の
滝川博士より寄贈されたものを用いた。コーパル酸 (Na
kano, T. and Djerassi C., J. Org. Chem., 26, pp.16
7-173, 1961)及びコーパル酸を含有する天然樹脂“ブラ
ジル・コパール”は、ベネズエラ国立科学研究所（カラ
カス、ベネズエラ）の中野教授及び日本大学のイチノヘ
教授と坂巻博士からそれぞれ寄贈されたものを用いた。
[³H]ホウ水素化ナトリウム (296 GBq mmol^-1) はアマシ
ャム社（イギリス）から購入し、[1-³H]ゲラニルゲラニ
オール(74 GBq mmol^-1) 及び [15-³H]コーパロール(74
GBq mmol^-1) は、ゲラニルゲラニアール及びコーパラー
ルを[³H]ホウ水素化ナトリウムで還元することにより製
造した (Bensen, R.J. and Zeevaart, J.A., J. Plant
Growth Rgul., 9, pp.237-242, 1990)。

【００２３】トリチウムラベルしたゲラニルゲラニルピ
ロリン酸(GGPP)及びコパリルピロリン酸(CPP) は、塩素
化とそれに次ぐピロリン酸化を経て製造した (Davisso
n, V.J., et al., J. Org. Chem., 51, pp.4768-4779,
1986)。ピロリン酸塩類はボンド−エラット C₁₈カート
リッジ (1 mL、バリアン、ハーバー・シティ、カリフォ
ルニア州）で20、30、50及び 70% (v/v)メタノール水溶
液を用いた段階的溶出による逆相クロマトグラフィーに
よって精製した。光学的に純粋なユニコナゾール(Izum
i, K., et al., Plant Cell Physiol, 26, pp.821-827,
1985)は（株）住友化学株式会社から入手した。

【００２４】(B) 酵素アッセイ及び蛋白アッセイ KSB 活性は、グリセロール(10%、v/v)、ジチオスレイト
ール (DTT)(2 mM)、MgCl₂ (5 mM)、ユニコナゾール (20
μM; Izumi, K., et al., Plant Cell Physiol., 26, p
p.821-827, 1985)及び[15-³H]CPP (1.0 kBq)を含む KPi
バッファー(50mM、pH 8.0、100 μL)に酵素を含むイン
キュベーション溶液中で測定した。KSAB活性（ゲラニル
ゲラニルピロリン酸(GGPP)からent-カウレンへの転化）
を測定する場合は、[1-³H]GGPP(1.0 kBq) を基質に用い
た。

【００２５】混合液を 30 ℃で 30 分間インキュベート
し、アセトン (200 μL)及び水 (100 μL)を加えて酵素
反応を停止した。この混合液をn-ヘキサン (400 μL)で
抽出し、抽出液のうち 300μL を減圧濃縮してシリカゲ
ルプレートにのせた。n-ヘキサンで展開した後、ent-カ
ウレン領域 (Rf 0.6-1.0) のシリカゲルの放射能活性を
測定した。１ユニットのカウレン合成酵素は１分間当た
り 1 pmol のent-カウレンを産生する酵素量と定義し
た。蛋白濃度は BSAを標準に用いてバイオラド（リッチ
モンド、カリフォルニア州）マイクロアッセイで測定し
た (Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72, pp.248-24
5, 1976) 。

【００２６】(C) KSB の精製 全ての処理は 0〜4 ℃の範囲で行った。以下のバッファ
ーを使用した：バッファーA ：2 mM DTTを含む 50 mM K
Piバッファー(pH 8.0)；バッファーB: 10%グリセロール
を含むバッファーA ；バッファーC: 10%グリセロールを
含む 20 mM Tris-HCl バッファー(pH 7.4); バッファー
D: 20%グリセロール、2 mM DTT及び 5 mM MgCl₂ を含む
1 mM KPi バッファー (pH 6.0) 。

【００２７】粗酵素抽出液 (1 L)をグラーベらの方法
(Graebe, J.E., et al., Pytochem.,13, pp.1433-1440,
1974)により調製した。ブチル−トヨパール 650S ゲル
（東ソー株式会社）をガラスカラム(AP-1, 10 mm×100
mm、ウォーターズ、ミリポアコーポレーション、米国）
に充填し、1.7 M (NH₄)₂SO₄ を含むバッファーA でカラ
ムを平衡化した。粗酵素溶液 (77 mL)に硫酸アンモニウ
ムを最終濃度が 1.7 Mになるように加えて、10分間攪拌
した。この酵素溶液を 2,000 gで 10 分間超遠心し、上
清を流速 3.0 mL/min でカラムにのせた。このカラムを
30分間で1.7 から 0 Mの (NH₄)₂SO₄リニアグラジエン
ト、次いでバッファーB で45分間溶出した。１フラクシ
ョンあたり6 mLを採取し、各フラクションから 5μL を
アッセイした。

【００２８】主要な活性フラクション (No.32-37) を限
外濾過 (YM-10 フィルター、アミコン社、米国）により
濃縮し、同様の操作を数回行って得られた活性フラクシ
ョンをプールした (53 mL)。バッファーC で平衡化した
ブチル精製酵素溶液 (8.4 mL) を DEAE-8HR カラム(10
mm×100 mm、ウォーターズ社、米国）にのせた。このカ
ラムをバッファーC 中に0 から 500 mM の NaCl を含む
リニアグラジエント(50 分間）で溶出した。流速を 1.0
mL/min として、１フラクションあたり 2.0 mL を採取
した。

【００２９】活性フラクション (No. 33-38)をプール
し、限外濾過 (YM-10)により濃縮した。この DEAE 精製
酵素溶液 (7.9 mL) に対して、最終濃度が 1.7 Mになる
ように硫酸アンモニウムを加えた。この酵素溶液を、1.
7 M (NH₄)₂SO₄ を含むバッファーB で平衡化した TSKフ
ェニル-5PWカラム (7.5 mm×75 mm 、東ソー株式会社）
にのせた。このカラムを60分間で1.7 から 0 Mの (NH₄)
₂SO₄リニアグラジエント、次いでバッファーB で30分間
溶出した。流速を 1.0 mL/min とし、１フラクションあ
たり2.0 mLを採取した。主要な KSB活性は、フラクショ
ン No.37-41 に認められた。二回目の DEAE イオン交換
クロマトグラフィーとして、フェニル精製酵素溶液 (2.
0 mL) を DEAE カラムにのせ、上記のように溶出した。

【００３０】KSB 活性の大部分を含むフラクション(No.
36-38)を限外濾過（セントリコン30、アミコン社）によ
り 300μL に濃縮した。この溶液をバッファーD で平衡
化したハイドロキシアパタイトカラム (TONEN TAPS-050
805 HG、8.0 mm×50 mm 、トーネン株式会社）にのせ
た。カラムを 1〜500 mMのリン酸リニアグラジエント
（60分間）で溶出した。流速を 1.0 mL/min とし、１フ
ラクションあたり1.0 mLを採取した。主要な KSB活性フ
ラクション (No.23-25) を限外濾過 (セントリコン30)
により濃縮して-80 ℃で保存した (70μg 、673 ユニッ
ト）。

【００３１】(D) ゲル濾過クロマトグラフィー フェニル精製酵素溶液を、200 mM NaCl を含むバッファ
ーB で予め平衡化したゲル濾過用カラム（TSK G3000SWx
1 、7.8 mm×300 mm、東ソー株式会社）にのせた。この
カラムを同じバッファーで 0.4 mL/min の流速で溶出
し、30秒毎にフラクションを採集した。

【００３２】(E)SDS-PAGE 一連の精製段階の活性酵素フラクションを、7.5% (w/v)
ゲルを用いるSDS-PAGEにより分析した (Laemmli, U.K.,
Nature, 227, pp.680-685, 1970) 。およそ 3μg の全
蛋白を各レーンにのせた。電気泳動の後、蛋白をクマジ
ー・ブリリアント・ブルー R250 (CBB) 染色により可視
化した。オバルブミン (45.0 kD)、BSA(66.2 kD) 、ホ
スホリラーゼ B (97.4 kD)、β−ガラクトシダーゼ (11
6 kD) 及びミオシン (200 kD) を標準蛋白 (BIO-RAD)と
して使用した。

【００３３】(F) KSB の性質 KSB の性質を調べるに際しては、フェニル精製酵素溶液
(全蛋白 0.47 μg ）を酵素溶液として使用した。[1-³
H]CPP の量を 2.2 kBqとして 15 分間インキュベーショ
ン時間を行い、他の条件は酵素アッセイと同様とした。
至適 pH を調べるために、特定の pH に調整した KPiバ
ッファー (50 mM)を使用した。K _m 値を調べるために、
フェニル精製酵素溶液 (全蛋白 1.2μg)を使用し、[1-³
H]CPP の濃度は 7〜480 nMの範囲とした。ent-カウレン
の産生量を算出し、K _m 値をラインウィーバー・バーク
・プロットから決定した。

【００３４】(G) N-末端アミノ酸及び内部ペプチド配列
分析 最終精製の終わった酵素溶液 (14.5μg)を 7.5% (w/v)
ポリアクリルアミドゲル上で精製した。蛋白をポリビニ
リデンジフルオリドメンブレンにエレクトロブロッティ
ングして可視化した (Matsudaira, P., J. Biol. Che
m., 262, pp.10035-10038, 1987)。メンブレン上の 81
kDバンドを切り出し、蛋白のアミノ酸配列をプロテイン
・シーケンサー（477Aプロテイン・シーケンサー、アプ
ライド・バイオシステムズ社、米国）により分析した。

【００３５】内部ペプチド配列分析については、 81 kD
蛋白をアクロモバクター(Acromobacter)プロテアーゼI
（茨城大学、正木博士より寄贈）でin situ 切断した
(Kawasaki, H., et al., Anal. Biochem., 191, pp.332
-336, 1990)。できたペプチド断片をゲルから抽出し、
スペルスファー RP-セレクト Bカラムを用いる逆相 HPL
C により分離した。0.09% (v/v) TFA 水溶液及び、0.07
5% (v/v) TFAを含む 80%(v/v)アセトニトリルを溶出液
A及びB にそれぞれ用いた。流速を 0.2 mL/minとし、溶
出液 Bの 0〜80% のリニアグラジエント（32分間）を使
用した (1090MHPLCシステム、ヒューレット・パッカー
ド社、米国）。215 、254 、275 及び 290 nm の吸光度
をモニターし、分離したペプチドのアミノ酸配列をプロ
テイン・シーケンサーで分析した。

【００３６】(H) 81 kD 蛋白に対するポリクローナル抗
体 81 kD 蛋白の主要ペプチド断片である ASQIITHPDESVLEN
INSWT(一文字表記にて表す）をクオリティ・コントロー
ルド・バイオケミカルズ社（米国）に依頼して合成させ
た。合成ペプチド (3.1 mg、1.4 nmol) をイムジェット
免疫源 EDC結合キット（ピアース社、米国）の使用説明
書に従い、キーホール・リムペット・ヘモシアニンに結
合させた。結合した蛋白 (1 mg) を２週間おきに３回ウ
サギに注射し、最後の注射の４週間後に血液を超遠心に
かけて抗血清を採集した。免疫グロブリンG をハイトラ
ップ・プロテインG カラム (1 ml; ファルマシア LKBバ
イオテクノロジー社、スウェーデン）を用いて抗血清か
ら精製した。

【００３７】２度目の DEAE-クロマトグラフィーの各フ
ラクションから約 10 μl を２個の7.5% SDS-PAGEゲル
上で解析した。一方のゲルは CBB溶液で染色し、もう一
方のゲル上の蛋白はニトロセルロースメンブレン上にエ
レクトロブロッティングした。このニトロセルロースメ
ンブレンを室温で２時間 IgG処理した後、抗ウサギIgG
の結合したアルカリホスファターゼでさらに２時間、同
温で処理した。メンブレンをニトロブルー塩化テトラゾ
リウム及び5-ブロモ -4-クロロ-3'-インドール−ホスフ
ェート（ピアース社）で処理して蛋白を可視化した。

【００３８】(2) 結果 (A) KSB の精製 金属イオン及びジベレリン類を除去して濃縮するため
に、未熟種子から調製した粗酵素を最初に疎水性相互作
用クロマトグラフィーで精製した。KSB 活性の大部分は
(NH₄)₂SO₄が 0.6-0.1 Mの濃度で溶出されたが、一方 K
SAB 活性の大部分は (NH₄)₂SO₄グラジエントが完了した
後に溶出された（図１）。 0.6-0.1 Mの (NH₄)₂SO₄濃度
に対応するフラクションをブチル精製 KSB溶液として採
取したが、この溶液には KSA活性が幾分含まれていた。

【００３９】ブチル精製 KSB溶液を NaCl グラジエント
による DEAE イオン交換クロマトグラフィーによりさら
に精製した。KSA 及び KSBは両方とも 240-360 mM NaCl
に対応するフラクションに溶出された。 DEAE クロマト
グラフィーではKSA とKSB との分離は達成されなかった
が、KSB の特異活性は増大した（表１）。これらのフラ
クションを採集し、フェニル-5PWカラムを用いた高速疎
水性相互作用クロマトグラフィーでさらに精製した。KS
B 活性分画の大部分は 0.5-0.2 Mの (NH₄)₂SO₄濃度に溶
出され、KSAB活性分画はそれよりも遅く溶出された。

【００４０】フェニル精製酵素溶液の約 40%を同じ DEA
E カラムでさらに精製した。KSB 活性の主要ピークは 2
50-280 mM NaClのフラクションに検出されており（図
２）、この分画を２回目 DEAE 精製酵素溶液として採集
した。この酵素溶液は SDS-PAGE により４種の主要蛋白
を含んでいた。この分画をハイドロキシアパタイトカラ
ムでさらに精製したところ、KSB 活性画分は 90-140 mM
のリン酸濃度で溶出され、KSB 活性のピーク型は 280 n
m の UV-吸収ピーク型に対応していた（図３）。最も純
度の高い KSB溶液は KSAB 活性を示さず、その溶液中に
KSAが存在しないことが確認できた。ent-カウレン合成
酵素B は Cucurbita maxima L.の内胚乳から 291倍に精
製されており（表１）、70μg の精製酵素が得られた。

【００４１】

【表１】 ─────────────────────────────── 酵素溶液 総蛋白 総活性 収量 比活性 精製度 (mg) (units) (%) (units/mg) (倍) ─────────────────────────────── 粗酵素 530 17,500 100 33.0 1 ブチル精製 168 11,000 63.8 65.4 1.98 １回目 DEAE 精製 13.9 5,170 29.6 372 11.3 フェニル精製 4.43 3,340 19.2 754 22.8 ２回目 DEAE 精製 0.407 2,820 16.2 6,930 210 HA 精製 0.070 673 3.87 9,610 291 ───────────────────────────────

【００４２】(B) SDS-PAGE分析及び分子量評価 ハイドロキシアパタイト精製酵素溶液は、見かけ分子量
81 kDに主要なバンドを示した。２回目 DEAE クロマト
グラフィーの各フラクションにおいては、 SDS-PAGE で
認められた81 kD バンドに対応する蛋白量は、KSB 活性
に相関していた。 KSBの分子量を決定するため、ゲル濾
過 HPLC カラムとしてTSK G3000SWx1 を使用した。この
カラムでの KSBの溶出プロフィールはブロードであった
が、23.5分の溶出時間を中心たピークが認められ、この
ピークはおよそ 90 kDの見かけ上の分子量に対応してい
た。

【００４３】(C) KSB の性質 KSB の性質をフェニル精製酵素溶液を用いて検討した。
KSB の至適 pH は 50mM KPiバッファーにおいては 6.8-
7.5であった。[15-³H]CPPの K_m 値は 0.35 μM であっ
た。 KSBは 5 mM Mg²⁺の存在下ではCPP を ent- カウレ
ンに転化することができたが、カチオンの添加なしには
活性を示さなかった。EDTA (1-100 mM)を添加しても KS
B活性に変化が認められなかったので、フェニル精製酵
素溶液には KSB活性に影響を及ぼすカチオンが含まれて
いないことが示唆された。

【００４４】数種の二価カチオン (0.1-50 mM 、塩化物
として）を 5 mM Mg²⁺の代わりにインキュベーション溶
液に加えて KSB活性を測定した。図４に示すように、Mg
²⁺、Co²⁺及び Mn²⁺ は KSB活性を高め、それらの至適濃
度は 10 mM程度であった。Ni²⁺及び Fe²⁺ は KSB活性を
少し高めたが、Cu²⁺、Ca²⁺及び Ba²⁺ は効果を示さなか
った。Cu²⁺、Ca²⁺及び Ba²⁺ を 5 mM Mg²⁺と組み合わせ
てインキュベーション溶液に加えた場合、これら３種は
全て Mg²⁺ によって促進された KSB活性を阻害した。特
に Cu²⁺ は 0.5 mM より高い濃度で 5 mM Mg²⁺によって
促進される転化を完全に阻害した。

【００４５】(D) ペプチド配列分析 SDS-PAGEからの 81 kD蛋白のN-末端ペプチド配列を分析
したところ、この蛋白のN-末端がブロック化されている
ことが判明した。 81 kD蛋白バンドをポリアクリルアミ
ドゲルから切り出して、リシルエンドヌクレアーゼであ
るアクロモバクター(Acromobacter)プロテアーゼI で処
理した (Masaki, T., et al., Biochem.Biophys. Acta,
660, pp.44-50, 1981)。得られたペプチドを逆相 HPLC
で分離し、主要ペプチドの配列を分析した (Kawasaki,
H., et al., Anal. Biochem.,191, pp.332-336, 199
0)。この結果、回収されたペプチドの配列及びおよその
量は [1] ASQIITHPDESVLENINSWT (74 pmol) 、[2] EAEW
STNK (45 pmol)、[3] RAMESYSGDIVRISK (37 pmol) 、
[4] HGLSSDSVW (24 pmol) 、[5] LQDWSMVMQYARK (17pmo
l) であった。

【００４６】(E) ウェスタンブロット分析及び免疫沈降
実験 ウェスタンブロット分析の結果は、キーホール・リムペ
ット・ヘモシアニンに結合させた合成ペプチド ASQIITH
PDESVLENINSWT に対するポリクローナル抗体が２回目 D
EAE クロマトグラフィーからの各フラクション中の 81
kD蛋白を選択的に認識することを示しており、そのパタ
ーンは KSB活性及び CBB染色のパターンとよく相関して
いた。フェニル精製酵素とポリクローナル抗体を用いた
免疫沈降実験では、使用した抗体の量に関わらず、 81
kD蛋白は上清フラクション中に検出され、沈殿中には検
出されなかった。

【００４７】例２：ent-カウレン合成酵素遺伝子のクロ
ーニング (A)KSB cDNA クローンの単離 ペプチド配列 ([1] ASQIITHPD ESVLENINSWT 、[2] EAEW
STNK、[3] RAMESYSGDIVRISK 、[4] HGLSSDSVW 、[5] LQ
DWS MVMQYQRK) から、正方向及び逆方向（センス及びア
ンチセンス方向）の PCRプライマー用に縮重オリゴヌク
レオチドを合成した。これらの合成オリゴヌクレオオチ
ドをプライマーに用いて、 Cucurbita maxima の未熟子
葉から調製したポリ (A)⁺ RNA から cDNA 断片を増幅す
るために逆転写反応(RT)-PCRを試みた。

【００４８】その結果、配列 [5]の下線部から設計され
た前方向プライマーと [1]の下線部配列からの逆方向プ
ライマーの組み合わせをプライマーセットに用いたPCR
により、472-bpのcDNA断片が増幅された。そのアミノ酸
配列はアラビドプシス (Arabidopsis)の KSAとかなり高
い相同性を示した（同一性 39%、類似性 66%) 。すでに
報告されているトウモロコシ KSAの当該領域のアミノ酸
配列（Bensen, R.J. et al., Plant Cell, 7, pp.75-8
4, 1995) は、アラビドプシス KSAと非常に高い相同性
を有することから、上記のPCR 増幅断片は、KSA をコー
ドする遺伝子の一部ではなく、他のテルペンシクラーゼ
をコードする遺伝子の一部であることが示唆された。

【００４９】この PCR増幅断片をプローブに用いて、同
じ材料から調製したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡに対するＲＮＡ
ブロッティング分析を行い、精製蛋白の分子量 (81 kD)
に相当するサイズである 2.7-kb 転写物を検出した。配
列決定に使用した最終精製酵素フラクション（上記のヒ
ドロキシアパタイト精製画分）が KSA活性を含まずKSB
活性のみを有するという事実を勘案すると、RNA ブロッ
ティング分析の結果から、472-bp PCR増幅断片が KSB c
DNA の一部であることが強く示唆された。

【００５０】全長の KSB cDNA クローンを得るために、
λZAP II をベクターに用いて、Cucurbita maximaの未
熟子葉から調製したポリ (A)⁺ RNA から120 万個の独立
クローンを含むcDNAライブラリーを作成した。ライブラ
リーを増幅した後、 5×10⁵クローンをスクリーニング
し、３回の精製後に９個の独立クローンを単離した。pB
luescriptSK(-)中にサブクローニングした後、インサー
トcDNAのサイズを調べ、2.4-kbのインサートを含み、同
じ制限酵素地図を与える２個のクローン：pKB3及びpKB1
6 を選択した。

【００５１】このcDNAインサートのサイズとノーザン・
ブロットで検出された転写物 (2.7kb) のサイズを比較
したところ、pKB3及び pKB16のインサートが 5'-トラン
ケイテッド DNAであること可能性が示唆された。そこ
で、cDNA末端の高速増幅法を pKB16の5'領域の単離に適
用し(5'-RACE）、5'領域にさらに 263 bp を含む 0.6-k
b cDNA断片を単離した。ヌクレオチド722に位置する Ps
t1 部位を使用して pKB16に融合させることにより、融
合 cDNA を含むプラスミドクローン pKB20を得た。

【００５２】(B) pKB20 の配列分析 pKB20は、プローブとして使用した PCR増幅断片と同等
の配列 (801 から 1269)を含む 2658 ヌクレオチドから
成る cDNA インサートを含んでいた。 cDNA 全長の核酸
配列を配列表の配列番号２に示す。また、cDNAのKSB の
コード領域および対応するKSB のアミノ酸配列を配列表
の配列番号３に示す。また、配列表の配列番号１には、
KSB のアミノ酸配列をIUPAC の一文字表記に従って示し
た。138から 140の位置にある ATGコドンは KSB蛋白に
対する開始コドンであり、2367ヌクレオチドの長い ORF
と、翻訳停止コドンから 103ないし 109ヌクレオチド下
流の位置にポリアデニル化シグナル配列 (AATAAA) が続
いていた。

【００５３】この ORFは 789アミノ酸から成り、プロテ
アーゼ切断した精製蛋白から得られた全ペプチド配列が
検出されたが、[5] LQDWS MVMQYQRKからLQDWD MVMQYQRK
への変異が認められた。最初50個のN-末端アミノ酸配列
はセリン (18%)及びスレオニン (12%)が豊富であり、こ
の領域の評価 pI は 9.8であった。この特徴は、クロロ
プラストを標的とするトランジットペプチドに共通の特
性である (Keegstra,et al., Annu. Rev. Plant Physio
l. Mol. Biol., 40, 471-501,1989)。

【００５４】上記の例１に示したとおり、合成オリゴペ
プチド[1] ASQIITHPDESVLENINSWTに対するポリクローナ
ル抗体をキャリアー蛋白に結合させると、天然の KSB蛋
白を認識しないが、SDS-PAGE上の 81 kD蛋白を認識す
る。この結果は、このペプチド配列が蛋白表面に位置す
るのではなく、相当に折り畳まれた蛋白のコア部分に位
置しており、そのために抗体が変成蛋白しか認識できな
いことを示唆している。上記配列中、抗体の産生に使用
される上記ペプチド配列は N- 末端及び C- 末端領域に
はなく、全配列のほぼ中央（ヌクレオチド 1244 から 1
304 ）に位置しており、例１での実験結果を支持してい
た。

【００５５】(C) 大腸菌におけるKB20蛋白の発現 pKB20が KSBをコードしているかどうかを確認するため
に、クローニングされた cDNA によりコードされる蛋白
を大腸菌中にマルトース結合蛋白 (Guan, et al., Gen
e, 67, 21-30, 1987）との融合蛋白として過剰発現さ
せ、発現蛋白の酵素活性を分析した。融合蛋白 (MBP-K
B) を発現させるためのフラグメント (tacプロモーター
配列-malE-KSB)を含むプラスミドpMAL-KB と、tac-プロ
モーター配列-malE フラグメントを含む対照プラスミド
pMAL (42kD のMBP 発現用）を製造した。

【００５６】この系では、tac プロモータで融合蛋白の
発現が調節されており、融合蛋白の発現はイソプロピル
-b-D- チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導
される。クマジーブルー染色を行った SDS-PAGE 上で
は、融合蛋白(MBP-KB)の予想サイズ (131 kD) のバンド
が IPTG 誘導を行った pMALKB を持つ大腸菌の全蛋白抽
出液中に検出された。 IPTG 誘導による蛋白が合成ペプ
チドに対する抗体に認識されるかどうかを確認するため
にイムノブロット分析を行ったところ、 IPTG 誘導によ
る蛋白に対応するバンドに免疫反応が検出され、KB20蛋
白の分解産物と見られる小さいサイズの他のバンドも検
出された。しかしながら、MBP だけを産生する大腸菌の
蛋白には、IPTGを添加しても免疫染色は観察されなかっ
た。

【００５７】(D) KB20蛋白の作用分析 MBP-KBの酵素活性を分析するために、融合蛋白を産生す
る大腸菌から可溶性蛋白を調製したが、可溶性フラクシ
ョン中にわずかに痕跡量の融合蛋白が認められるだけで
あった。従って、通常の条件下で培養された大腸菌にお
いては、融合蛋白の大部分は細胞内に貯留することが示
唆された。ビシャイら (Bishai, et al., J. Bact. 16
9, pp.5140-5151, 1987) の報告によれば、IPTG誘導の
後に大腸菌を低温で培養すると可溶性蛋白フラクション
に中の過剰発現融合蛋白の比率が増加する。MBP-KBの場
合には、20℃における可溶性フラクション中の MBP-KB
蛋白の比率は 37 ℃で培養した大腸菌に比較して約 10
倍であった。この温度は酵素の起源である植物にとって
の生理的条件であり、大腸菌を低温 (20℃) で培養する
ことが酵素の安定性を担保するものと考えられる。

【００５８】IPTGを添加した後に 20 ℃で成長させた大
腸菌の可溶性蛋白抽出液を用い、上記例１の KSB酵素ア
ッセイ法に従って、 pMALKB 又は pMAL を持つ大腸菌の
抽出液に[³H]CPP を加え、ent-カウレンへの転化を測定
した。Mg²⁺（カボチャの KSBにおけるコファクター）及
びユニコナゾール（ent-カウレン酸化反応の阻害剤）の
存在下で[³H]CPP を大腸菌抽出液とインキュベートした
後、反応混合液を n-ヘキサンで抽出し、次いでシリカ
ゲル薄層クロマトグラフィー (TLC)上で分画化して、en
t-カウレンが含まれるフラクションである LP(低極性）
フラクションを単離した。

【００５９】KSB 活性を "LPフラクション" の放射能活
性 (dpm)とした場合、MBP-KB20を産生する大腸菌の抽出
液は顕著な KSB活性を示したが、MBP のみを発現する細
菌細胞の抽出液には KSB活性が認められなかった。TLC
上の "LPフラクション" の放射能活性が ent- カウリン
に由来するものかどうかを確認するために、ODS-HPLCで
分析したところ、大腸菌抽出液の LP フラクション中の
主要ピークの保持時間は元のカボチャの酵素溶液のもの
と同等であり、また、それらは純正 [¹⁴C]ent-カウレン
の保持時間と同等であった。さらに、大腸菌抽出液の L
P フラクション中の放射能活性が ent- カウレンフラク
ションと同等の主要ピーク (95%)に大部分が由来してい
ることも判明した。従って、MBP-KBを産生する大腸菌の
抽出液は、 CPPを ent- カウレンに転化する酵素活性を
有していると結論できる。

【００６０】ノーザン・ブロッティングの結果による
と、KSB 転写物は試験した全ての器官に検出されてお
り、この事実は本発明の KSBが未熟種子だけでなく栄養
組織にも発現されることを示している。一方、カボチャ
の 20-オキシダーゼのメッセージは未熟種子においての
み検出されるので、KSB とは対照的である(Lange, T.,
etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp.8552-855
6, 1994) 。KSB の発現レベルは若い組織において相対
的に高く、転写物は未熟種子の成長過程の子葉に最も豊
富に認められた。

【００６１】(E) 他のテルペンシクラーゼとの配列比較 KB20の推定アミノ酸配列を、KSA を含む他のテルペンシ
クラーゼ類の配列と比較分析した。KB20の配列は、タバ
コセスキテルペンシクラーゼ (Facchini, P.J., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89, pp.11088-11092, 1992) 、
リモネンシンターゼ (Colby, S.M., J. Biol. Chem., 2
68, pp.23016-23024, 1993) 、トウゴマカスベンシンタ
ーゼ (Colby, S.M., J. Biol. Chem., 268, pp.23016-2
3024, 1993) との相同性が認められ、特に Arabidopsis
KSA (Sun T.P. and Kamiya, Y.,Plant Cell, 6, pp.15
09-1518, 1994) と高い相同性を示した。

【００６２】配列の中央付近（アミノ酸 337-600）は全
てのテルペンシクラーゼにおいてよく保存されていた
(Sun T.P. and Kamiya, Y., Plant Cell, 6, pp.1509-1
518,1994) 。Arabidopsis KSA とKSB20 は配列の最初の
部分（アミノ酸 114-230）で同一のアミノ酸を共有して
いたが（同一性 34.8%）、この KSAと KSBの配列の最終
部分（601 残基から末端まで）には共通のアミノ酸はほ
とんど認められない。しかしながら、KSA を除く他のシ
クラーゼと KSBとは、アミノ酸 603-631の領域において
保存されたアミノ酸を共有していた。

【００６３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：789 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 MYLSRPTGVARFAASSSSSSSASLFPGVDVDTTTKTGALHFEETKERIKKLFDKVELSVS AYDTAWVAMVPSPNSLNQPLFPECINWVLDSQHADGSWGLLHNDQLLMKANLLSTLACVL TLKRWNIGHDHMSKALDFIKSNIASATDENQRSPVGFDIIFPGMIEYAKDLNLNLPLAPT NVDALVRKKELELRSCRSNSEGGKAYLAYVSEGIGKLQDWDMVMQYQRKNGSLFNSPSTT AAAFMHRNDDGCFDYLRSLLQKFDGSVPTIYPLDIYARLHMVDSLQKFGIARHFKEEIRS VLDETYRCWMQGEENIFLDASTCAMAFRMLRVEGYDVSSDQLTQFSEDIFPNCLGGYLKD FGASLELYKASQIITHPDESVLENINSWTSRFLKHGLSSDSVWSDRTDSVVKQEAVNALE FPYNATLERLISKRAMESYSGDIVRISKSPYACLNFGHQDFLELAVEDFNTLQRIHLKEL EELQRWVVENKLDELKFFRLHLGYCYFAAAATLTDPELHDARIAWAQNGVLTTVVDDFYD GGGSEEELDNLIELVEKWDPDGEVGYCSKDVEIVFLALHSTVCEIGRRALVWQGRSVMRN VIDGWLALLKVMRKEAEWSTNKVVPSMGEYMEQAHVSFALGPIILPMLFFVGPKLSEEMI GSCEYQKLYKLMSTAGRLKNDIRSYDRECKEGKLNILSLWMIDGGGNVTKEEAIEAIKGD FERAIRELLGLVLQENTTIPRACKDLFWKLMSIVNLFYMEDDGYTSNRLMNTVKAMFEQP MDLDALLNK 789 配列番号：２ 配列の長さ：2658 配列の型 ：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GAAAGCGGTA GTTTTCGGCT CTTGGCTGTT TTTGTGTACT GCCTATTCTG TTCTTTATAT GCACTGAATG TGAAAATGCC TCACCAGAGT TTGATGCTGC TTCCGCAATT TCTTTGCATG TCCTAAACAT ACCAGTCATG TATCTTTCCC GACCTACCGG CGTTGCCCGT TTTGCTGCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCA GCTTCCCTAT TCCCTGGAGT GGATGTGGAC ACAACAACTA AAACTGGAGC TTTGCACTTT GAAGAAACAA AAGAAAGAAT TAAGAAATTG TTCGACAAGG TTGAACTTTC AGTTTCTGCA TATGATACTG CATGGGTGGC AATGGTTCCT TCTCCAAACT CTCTCAACCA ACCTCTTTTC CCCGAGTGTA TAAACTGGGT ATTAGATAGT CAACATGCTG ATGGCTCATG GGGCCTACTC CACAACGATC AGTTGCTGAT GAAGGCCAAT CTCTTATCTA CATTAGCATG TGTTCTTACT CTTAAGCGGT GGAATATTGG GCATGATCAT ATGAGCAAGG CCCTTGATTT TATCAAGTCT AATATAGCTT CAGCTACTGA TGAGAACCAA CGTTCTCCGG TGGGATTTGA CATTATTTTC CCTGGCATGA TTGAGTATGC TAAAGACTTG AATTTGAATC TACCCTTGGC ACCGACGAAC GTGGATGCCT TGGTTCGAAA GAAAGAGTTG GAGCTGAGAA GCTGCAGAAG CAACTCTGAA GGTGGAAAAG CCTATTTAGC GTATGTTTCA GAAGGAATTG GAAAGTTACA GGACTGGGAT ATGGTCATGC AATATCAAAG GAAGAATGGA TCACTGTTTA ATTCTCCATC CACTACGGCA GCGGCTTTTA TGCATAGAAA TGATGATGGC TGTTTTGATT ATCTTCGCTC ACTCTTACAA AAGTTTGATG GCTCAGTTCC CACAATATAT CCTCTTGATA TATATGCTCG ATTACACATG GTTGATAGCC TTCAAAAATT CGGAATTGCT CGGCATTTCA AAGAGGAGAT TAGAAGCGTA TTAGATGAAA CTTACAGGTG TTGGATGCAA GGAGAGGAAA ATATATTCTT AGATGCTTCA ACTTGTGCAA TGGCCTTTCG AATGTTACGT GTTGAAGGAT ATGATGTTTC TTCAGACCAG TTGACTCAAT TTTCAGAAGA TATCTTTCCC AATTGCCTTG GAGGATATTT AAAAGACTTC GGTGCCTCGC TGGAGTTATA TAAGGCCTCT CAGATTATCA CGCACCCCGA TGAATCTGTT CTGGAAAATA TAAACTCTTG GACTAGTCGT TTCCTGAAGC ATGGATTATC TAGTGATTCA GTTTGGTCTG ATAGAACCGA TAGTGTTGTT AAACAAGAGG CTGTTAATGC TCTTGAGTTC CCCTATAATG CAACTCTAGA ACGCCTAATA AGTAAGAGGG CAATGGAAAG TTACAGTGGA GACATTGTGA GGATTTCAAA ATCGCCATAT GCCTGCTTAA ATTTTGGCCA TCAAGATTTT CTGGAACTTG CTGTAGAGGA TTTCAATACC CTGCAACGCA TTCATCTTAA AGAACTGGAA GAGCTTCAAA GATGGGTGGT TGAAAACAAA TTGGACGAGT TGAAATTTTT CAGACTGCAC CTAGGGTACT GCTATTTTGC TGCGGCAGCG ACCCTTACTG ATCCTGAACT TCATGATGCT CGCATAGCAT GGGCACAAAA TGGTGTGCTC ACGACCGTGG TTGATGATTT CTATGATGGT GGAGGATCTG AAGAGGAATT GGATAACCTT ATAGAATTGG TGGAAAAGTG GGATCCTGAT GGGGAAGTGG GTTACTGTTC CAAGGACGTT GAGATTGTAT TTCTTGCACT GCACAGCACA GTTTGTGAAA TAGGAAGAAG AGCTTTAGTA TGGCAAGGAC GCAGTGTTAT GAGGAATGTT ATCGATGGTT GGTTGGCTCT GCTGAAGGTG ATGAGAAAGG AAGCTGAATG GTCGACAAAT AAGGTAGTGC CATCAATGGG TGAATATATG GAACAAGCCC ATGTATCATT CGCGTTGGGA CCTATAATCC TTCCAATGCT CTTCTTTGTT GGACCTAAAC TCTCAGAGGA AATGATTGGA AGCTGTGAAT ACCAGAAGTT ATATAAGCTG ATGAGCACTG CTGGTCGCCT TAAGAATGAT ATTCGATCTT ACGATAGAGA ATGCAAAGAG GGAAAGCTGA ATATTCTGTC TCTGTGGATG ATTGATGGCG GTGGTAATGT CACCAAAGAG GAGGCCATTG AAGCAATTAA AGGGGATTTT GAGAGGGCGA TAAGAGAGCT GCTGGGGTTA GTTTTGCAGG AGAACACTAC AATTCCAAGA GCTTGTAAGG ATTTGTTCTG GAAATTGATG TCCATTGTGA ATCTATTTTA CATGGAAGAT GATGGGTACA CTTCAAATAG GTTGATGAAC ACTGTAAAAG CCATGTTTGA ACAACCCATG GATCTGGATG CACTATTGAA CAAATGAACG AACAACAAAC GAAATAAGTT GTAGTGGGAA GCAGACGCCA CCTATTCACT GTCTTCTCTA CTGATCAGAT GTCTATTGCT TTCTCATTGA GGAAATGGCA AATAAAACAT TTTATGGAAA CATTTCATTG TTAAATTGAG ACAGTCTG 配列番号：３ 配列の長さ：2658 配列の型 ：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GAAAGCGGTA GTTTTCGGCT CTTGGCTGTT TTTGTGTACT GCCTATTCTG TTCTTTATAT 60 GCACTGAATG TGAAAATGCC TCACCAGAGT TTGATGCTGC TTCCGCAATT TCTTTGCATG 120 TCCTAAACAT ACCAGTC 137 ATG TAT CTT TCC CGA CCT ACC GGC GTT GCC CGT TTT GCT GCC TCC 182 Met Tyr Leu Ser Arg Pro Thr Gly Val Ala Arg Phe Ala Ala Ser TCC TCC TCC TCC TCC TCA GCT TCC CTA TTC CCT GGA GTG GAT GTG 227 Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Phe Pro Gly Val Asp Val GAC ACA ACA ACT AAA ACT GGA GCT TTG CAC TTT GAA GAA ACA AAA Asp Thr Thr Thr Lys Thr Gly Ala Leu His Phe Glu Glu Thr Lys GAA AGA ATT AAG AAA TTG TTC GAC AAG GTT GAA CTT TCA GTT TCT 317 Glu Arg Ile Lys Lys Leu Phe Asp Lys Val Glu Leu Ser Val Ser GCA TAT GAT ACT GCA TGG GTG GCA ATG GTT CCT TCT CCA AAC TCT Ala Thy Asp Thr Ala Trp Val Ala Met Val Pro Ser Pro Asn Ser CTC AAC CAA CCT CTT TTC CCC GAG TGT ATA AAC TGG GTA TTA GAT 407 Leu Asn Gln Pro Leu Phe Pro Glu Cys Ile Asn Trp Val Leu Asp AGT CAA CAT GCT GAT GGC TCA TGG GGC CTA CTC CAC AAC GAT CAG Ser Gln His Ala Asp Gly Ser Trp Gly Leu Leu His Asn Asp Gln TTG CTG ATG AAG GCC AAT CTC TTA TCT ACA TTA GCA TGT GTT CTT 497 Leu Leu Met Lys Ala Asn Leu Leu Ser Thr Leu Ala Cys Val Leu ACT CTT AAG CGG TGG AAT ATT GGG CAT GAT CAT ATG AGC AAG GCC Thr Leu Lys Arg Trp Asn Ile Gly His Asp His Met Ser Lys Ala CTT GAT TTT ATC AAG TCT AAT ATA GCT TCA GCT ACT GAT GAG AAC 587 Leu Asp Phe Ile Lys Ser Asn Ile Ala Ser Ala Thr Asp Glu Asn CAA CGT TCT CCG GTG GGA TTT GAC ATT ATT TTC CCT GGC ATG ATT Gln Arg Ser Pro Val Gly Phe Asp Ile Ile Phe Pro Gly Met Ile GAG TAT GCT AAA GAC TTG AAT TTG AAT CTA CCC TTG GCA CCG ACG 677 Glu Tyr Ala Lys Asp Leu Asn Leu Asn Leu Pro Leu Ala Pro Thr AAC GTG GAT GCC TTG GTT CGA AAG AAA GAG TTG GAG CTG AGA AGC Asn Val Asp Ala Leu Val Arg Lys Lys Glu Leu Glu Leu Arg Ser TGC AGA AGC AAC TCT GAA GGT GGA AAA GCC TAT TTA GCG TAT GTT 767 Cys Arg Ser Asn Ser Glu Gly Gly Lys Ala Tyr Leu Ala Tyr Val TCA GAA GGA ATT GGA AAG TTA CAG GAC TGG GAT ATG GTC ATG CAA Ser Glu Gly Ile Gly Lys Leu Gln Asp Trp Asp Met Val Met Gln TAT CAA AGG AAG AAT GGA TCA CTG TTT AAT TCT CCA TCC ACT ACG 857 Tyr Gln Arg Lys Asn Gly Ser Leu Phe Asn Ser Pro Ser Thr 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GAA Val Ile Asp Gly Trp Leu Ala Leu Leu Lys Val Met Arg Lys Glu GCT GAA TGG TCG ACA AAT AAG GTA GTG CCA TCA ATG GGT GAA TAT 2027 Ala Glu Trp Ser Thr Asn Lys Val Val Pro Ser Met Gly Glu Tyr ATG GAA CAA GCC CAT GTA TCA TTC GCG TTG GGA CCT ATA ATC CTT Met Glu Gln Ala His Val Ser Phe Ala Leu Gly Pro Ile Ile Leu CCA ATG CTC TTC TTT GTT GGA CCT AAA CTC TCA GAG GAA ATG ATT 2117 Pro Met Leu Phe Phe Val Gly Pro Lys Leu Ser Glu Glu Met Ile GGA AGC TGT GAA TAC CAG AAG TTA TAT AAG CTG ATG AGC ACT GCT Gly Ser Cys Glu Tyr Gln Lys Leu Tyr Lys Leu Met Ser Thr Ala GGT CGC CTT AAG AAT GAT ATT CGA TCT TAC GAT AGA GAA TGC AAA 2207 Gly Arg Leu Lys Asn Asp Ile Arg Ser Tyr Asp Arg Glu Cys Lys GAG GGA AAG CTG AAT ATT CTG TCT CTG TGG ATG ATT GAT GGC GGT Glu Gly Lys Leu Asn Ile Leu Ser Leu Trp Met Ile Asp Gly Gly GGT AAT GTC ACC AAA GAG GAG GCC ATT GAA GCA ATT AAA GGG GAT 2297 Gly Asn Val Thr Lys Glu Glu Ala Ile Glu Ala Ile Lys Gly Asp TTT GAG AGG GCG ATA AGA GAG CTG CTG GGG TTA GTT TTG CAG GAG Phe Glu Arg Ala Ile Arg Glu Leu Leu Gly Leu Val Leu Gln Glu AAC ACT ACA ATT CCA AGA GCT TGT AAG GAT TTG TTC TGG AAA TTG 2387 Asn Thr Thr Ile Pro Arg Ala Cys Lys Asp Leu Phe Trp Lys Leu ATG TCC ATT GTG AAT CTA TTT TAC ATG GAA GAT GAT GGG TAC ACT Met Ser Ile Val Asn Leu Phe Tyr Met Glu Asp Asp Gly Tyr Thr TCA AAT AGG TTG ATG AAC ACT GTA AAA GCC ATG TTT GAA CAA CCC 2477 Ser Asn Arg Leu Met Asn Thr Val Lys Ala Met Phe Glu Gln Pro ATG GAT CTG GAT GCA CTA TTG AAC AAA TGA 2507 Met Asp Leu Asp Ala Leu Leu Asn Lys *** ACGAACAACA AACGAAATAA GTTGTAGTGG GAAGCAGACG CCACCTATTC ACTGTCTTCT 2567 CTACTGATCA GATGTCTATT GCTTTCTCAT TGAGGAAATG GCAAATAAAA CATTTTATGG 2627 AAACATTTCA TTGTTAAATT GAGACAGTCT G 2658

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のent-カウレン合成酵素B を疎水性相
互作用クロマトグラフィーで精製した際のクロマトグラ
ムを示す図である。

【図２】 本発明のent-カウレン合成酵素B を DEAE カ
ラムで精製した際のクロマトグラムを示す図である。

【図３】 本発明のent-カウレン合成酵素B をハイドロ
キシアパタイトカラムで精製した際のクロマトグラムを
示す図である。

【図４】 二価カチオンの存在下における本発明のent-
カウレン合成酵素B の活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   （アミノ酸番号１〜789)により特定されるポリペプチ
   ド。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   （アミノ酸番号１〜789)において１個若しくは２個以上
   のアミノ酸残基が挿入、欠失若しくは置換したアミノ酸
   配列を有し、コパリルピロリン酸からent-カウレンへの
   変換を触媒する作用を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 植物生体内で発現されている天然型酵素
   である請求項２に記載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   のポリペプチドを分子中に含み、かつ、コパリルピロリ
   ン酸からent-カウレンへの変換を触媒する作用を有する
   ポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   のポリペプチドの部分ポリペプチドであってコパリルピ
   ロリン酸からent-カウレンへの変換を触媒する活性ドメ
   インをその一部または全部とするポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
   するDNA 。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号３に示す核酸配列の核
   酸番号 138〜2507（終始コドンを含む）で特定される請
   求項６に記載のDNA 。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のDNA において１個若し
   くは２個以上の核酸が挿入、欠失若しくは置換されたDN
   A であって、コパリルピロリン酸からent-カウレンへの
   変換を触媒する作用を有するポリペプチドをコードする
   DNA 。
9. 【請求項９】 請求項７に記載のDNA の相補的配列を有
   するDNA において１個若しくは２個以上の核酸が挿
   入、欠失若しくは置換されたDNA であって、請求項６に
   記載のDNA を含むent-カウレンB 合成酵素遺伝子に対す
   るアンチセンスDNA。
10. 【請求項１０】 請求項６ないし９のいずれか１項に記
    載のDNA を含む組換えベクター。
11. 【請求項１１】 請求項10に記載の組換えベクターによ
    り形質転換された形質転換体。