JP2001333776A - ヒト由来プロテインホスファターゼ及びその阻害化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ヒト由来プロテインホスファターゼの提供、上
記プロテインホスファターゼの機能を制御するために有
用な選択的阻害化合物を取得しまた製造する方法、並び
に該方法によって得られるプロテインホスファターゼ阻
害化合物の提供。 【解決手段】(i) プロテインホスファターゼ活性を有
し、(ii) 脱リン酸化するアミノ酸がトレオニン特異的
であり、かつ (iii)脱リン酸化反応に際してＭｎ ²⁺を要
求するプロテインホスファターゼであって、特定なアミ
ノ酸配列を有する蛋白質、又は当該アミノ酸配列におい
て１乃至は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列を有する蛋白質であることを特徴とす
るヒト由来プロテインホスファターゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来プロテイ
ンホスファターゼに関する。さらに本発明は当該プロテ
インホスファターゼに対して阻害活性を有する化合物を
選択的に取得し製造する方法に関する。また本発明はか
かる方法によって得られるヒト由来プロテインホスファ
ターゼ阻害化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞内にはカルシウム結合蛋白質が数多
く存在しているが、中でもカルモジュリンはカルシウム
による細胞内情報伝達系において重要な役割を果たして
いる。また生体内におけるリン酸化反応の調節に関して
も、カルモジュリンはカルシウム／カルモジュリン複合
体として、カルモジュリン依存性リン酸化酵素を介して
重要な機能を果たしていることが知られている（Soderl
ing,T.(1999), The Ca²⁺-calmodulin-dependent protei
n kinase cascade, Trends Biochem. Sci. 24, 232-23
6）。とりわけカルモジュリン依存性リン酸化酵素II
は、１）脳に多量に存在する、２）可溶性と不溶性（顆
粒結合型）がある、３）基質特異性が広い、４）臓器特
異的アイソザイムが存在する、５）自己リン酸化によっ
て活性を制御する、などの際だった特徴を備えており、
また近年より当該酵素が記憶などの高次神経機能の制御
や種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしているこ
とが明らかにされてきている。

【０００３】ところで本酵素の活性化機構については自
己阻害ドメインに存在するアミノ末端から286番目のト
レオニンが自己リン酸化されて活性化されることが明ら
かにされているものの、活性化された後どのような機序
で不活性化されるのかという、所謂スイッチオフ機構に
ついてはこれまであまり研究がなされておらず不明な点
が多いのが実情である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記カルモ
ジュリン依存性リン酸化酵素IIのスイッチオフ機構に関
与し、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの機能調節
機構、ひいては高次神経機能の制御機構を解明する手助
けになり得る脱リン酸化酵素（プロテインホスファター
ゼ）を提供することを目的とするものである。さらに本
発明は、上記プロテインホスファターゼの機能を制御す
るために有用な、該酵素に対して選択的な阻害活性を有
する化合物を取得しまた製造する方法、並びに該方法に
よって得られるプロテインホスファターゼに対する阻害
化合物を提供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
の解決を目指して日夜研究を重ねていてところ、ヒト脳
由来のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅取
得した遺伝子が、ラット由来プロテインホスファターゼ
蛋白質（Ca²⁺/calmodulin-dependent proteinkinase ph
osphatase，ＣａＭＫＰ）をコードする遺伝子（石田、
亀下及び藤澤 (1998), A novel protein phosphatase t
hat dephosphorylates and regulates Ca²⁺/calmodulin
-dependent protein kinase II, J.Biol.Chem., 273, 1
904-1910：木谷、石田、奥野、竹内、亀下及び藤澤、(1
999) Molecular c1oning of Ca²⁺/Calmodulin-dependen
t protein kinase phosphatase, J.Biochem., 125, 102
2-1028；GENBANK accession No.AB023634）と遺伝子の
塩基配列レベルで８２％、蛋白質のアミノ酸配列レベル
で７９％の相同性を有していることに着目した。事実、
その発現産物がプロテインホスファターゼ活性を有して
いることを確認するとともに、当該発現産物がカルモジ
ュリン依存性リン酸化酵素IIのアミノ末端から２８６番
目のトレオニンを特異的に脱リン酸化する活性を有し、
さらに該脱リン酸化反応にはＭｎ²⁺が必須であることを
見出した。また本発明者らは、かかるヒト由来プロテイ
ンホスファターゼを利用することによりヒト由来プロテ
インホスファターゼに対して選択的に阻害活性を有する
化合物を取得することができることを見出し、これらの
ヒト由来プロテインホスファターゼ及びその阻害化合物
がカルモジュリン依存性リン酸化酵素のスイッチオフ機
構の解明、ひいては高次神経機能の制御機構を解明し、
また制御するツールになり得ることを確信して本発明を
完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は下記（１）〜（３）に
掲げるヒト由来プロテインホスファターゼである： （１）(i) プロテインホスファターゼ活性を有し、(ii)
脱リン酸化するアミノ酸がトレオニン特異的であり、
かつ (iii)脱リン酸化反応に際してＭｎ²⁺を要求するプ
ロテインホスファターゼであって、配列番号１に示すア
ミノ酸配列を有する蛋白質、又は当該アミノ酸配列にお
いて１乃至は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を有する蛋白質であることを特徴と
するヒト由来プロテインホスファターゼ。 （２）リン酸化された活性型カルモジュリン依存性リン
酸化酵素IIを脱リン酸化して不活性型に変換することを
特徴とする（１）記載のヒト由来プロテインホスファタ
ーゼ。 （３）脱リン酸化するアミノ酸がカルモジュリン依存性
リン酸化酵素IIのアミノ末端から286番目のトレオニン
である（２）記載のヒト由来プロテインホスファター
ゼ。

【０００７】さらに本発明は下記（４）〜（５）に掲げ
る、上記ヒト由来プロテインホスファターゼに対して阻
害活性を有する化合物の取得ないしは製造方法である： （４）上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のヒト由
来プロテインホスファターゼを反応基質及び被験化合物
の存在下で反応させてプロテインホスファターゼ活性を
測定し、該プロテインホスファターゼ活性が被験化合物
非存在下でのプロテインホスファターゼ活性と対比して
低下している場合の被験化合物を選択することを特徴と
する、上記ヒト由来プロテインホスファターゼに対して
阻害活性を有する化合物のスクリーニング方法。 （５）上記（４）のスクリーニング方法で得られるプロ
テインホスファターゼ阻害剤を化学的、生物学的または
遺伝子工学的方法のいずれかによって製造することから
なる、プロテインホスファターゼに対して阻害活性を有
する化合物の製造方法。

【０００８】また更に本発明は、上記（４）または
（５）記載の方法によって得られる、プロテインホスフ
ァターゼに対して阻害活性を有する化合物であり、また
当該化合物を有効成分とするカルモジュリン依存性リン
酸化酵素IIの不活性化に起因する疾患の治療剤である。

【０００９】なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド及び核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵ
Ｂの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等
の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分
野における慣用記号に従うものとする。

【００１０】

【発明の実施の形態】（１）ヒト由来プロテインホスフ
ァターゼ 本発明のヒト由来プロテインホスファターゼは配列番号
１に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするもので
ある。

【００１１】当該アミノ酸配列を有する蛋白質をコード
する遺伝子は、ヒト未分化myeloidcell line KG-1より
取得された機能未知の遺伝子として従来より配列が公知
の遺伝子であるが（Nomura,N., Miyajima,N., Sazuka,
T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., Sato,S., Nagase,
T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabata,S. "Prediction
of the coding sequences of unidentified human gene
s. I. The coding sequences of 40 new genes (KIAA00
01-KIAA0040) deduced by analysis randomly sampled
cDNA clones from human immature myeloid cell line
KG-1." DNA Res.1(1),27-35 (1994)、 Nomura,N., Miy
ajima,N., Sazuka,T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., S
ato,S., Nagase,T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabat
a,S. "Prediction of the coding sequences of uniden
tified human genes. I. The coding sequences of 40
new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by analysis
randomly sampled cDNA clones from human immature m
yeloid cell line KG-1 (supplement)." DNA Res. 1
(1),47-56 (1994)；GENBANK accession no.D13640、配
列番号２)、本発明において初めて、その遺伝子産物
が、リン酸化された活性型カルモジュリン依存性リン酸
化酵素IIのアミノ末端から268番目のトレオニンを特異
的に脱リン酸化して不活性型に変換するプロテインホス
ファターゼとしての機能を有することが判明したもので
ある。すなわち、本発明は上記配列が公知の遺伝子産物
である蛋白質のプロテインホスファターゼとしての新た
な用途（使用方法）を提供するものである。

【００１２】本発明のプロテインホスファターゼとして
は、トレオニン残基に対して特異的にプロテインホスフ
ァターゼ活性（脱リン酸化活性）を有するもの、また脱
リン酸化反応に際して金属、特にＭｎ²⁺要求性であるも
のを好適に挙げることができる。より好ましくは本発明
のプロテインホスファターゼはカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素、特にカルモジュリン依存性リン酸化酵素II
の脱リン酸化に働くものであり、具体的にはカルモジュ
リン依存性リン酸化酵素IIのアミノ末端から２８６番目
のリン酸化トレオニンの脱リン酸化に特異的に作用する
ものである。

【００１３】本発明のプロテインホスファターゼは、配
列番号１に示すアミノ酸配列に特に限定されることな
く、プロテインホスファターゼ活性を有することを限度
としてそのアミノ酸の１もしくは複数（または数個）が
欠失、置換乃至は付加されたものであってもよい。ここ
で「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれら
の位置等は、改変された蛋白質が、配列番号１で示され
るアミノ酸配列からなる蛋白質と同様の生物学的機能
（少なくともプロテインホスファターゼ活性）を有する
機能的同等物であれば特に制限はない。好ましくはトレ
オニン残基に対して特異的なプロテインホスファターゼ
活性を有するもの、または脱リン酸化反応に際して金
属、特にＭｎ²⁺要求性であるものを挙げることができ
る。特に好ましくはトレオニン残基に特異的なプロテイ
ンホスファターゼ活性を有し、且つ脱リン酸化反応にＭ
ｎ²⁺を必須とする蛋白質である。

【００１４】尚、これらアミノ酸配列の改変（変異）等
は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等に
より生じることもあるが、本発明で開示するプロテイン
ホスファターゼのアミノ酸配列に基づいて人為的に改変
することもできる。本発明は、このような改変・変異の
原因及び手段等を問わず、上記特性を有する全ての改変
蛋白質を包含するものである。上記の人為的手段として
は、遺伝子レベルで、例えばサイトスペシフィック・ミ
ュータゲネシス（Methods in Enzymology, 154: 350, 3
67-382 (1987)；同 100: 468 (1983)；Nucleic Acids R
es., 12: 9441(1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研
究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕等の遺伝子
工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト
法等の化学合成手段（J. Am. Chem. Soc., 89: 4801 (1
967)；同91: 3350 (1969)；Science, 150: 178 (196
8)；Tetrahedron Lett., 22: 1859 (1981)；同24: 245
(1983)）及びそれらの組合せ方法等が例示できる。

【００１５】本発明のプロテインホスファターゼは、配
列番号１に示すアミノ酸配列若しくはそれをコードする
遺伝子配列に基づいて、慣用の化学的合成方法若しくは
遺伝子工学的手法によって調製することができる。な
お、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子
配列として、配列番号２に記載する塩基配列の107〜146
8の領域の配列を挙げることができる。

【００１６】また、本発明のプロテインホスファターゼ
は、該蛋白質の特異抗体を作成する為の免疫抗原として
利用できる。ここで抗原として用いられる蛋白質または
ペプチドは、本発明のプロテインホスファターゼそのも
の或いはその断片でよいが、これら抗原を利用すること
により、所望の抗血清（ポリクローナル抗体）及びモノ
クローナル抗体を取得することができる。当該抗体の製
造方法自体は、当業者によく理解されているところであ
り、本発明においてもこれら常法に従うことができる
（続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学
会編（1986）等参照）。かくして得られる抗体は、本発
明のヒト由来プロテインホスファターゼに特異的に結合
することによって特徴付けられ、これは当該ヒト由来プ
ロテインホスファターゼの精製及びその免疫学的手法に
よる測定、識別及び発現の評価等に有利に利用できる。

【００１７】（２）ヒト由来プロテインホスファターゼ
阻害化合物及びその取得方法 さらに本発明は上記ヒト由来プロテインホスファターゼ
の阻害化合物に関する。当該阻害化合物は、上記プロテ
インホスファターゼ活性の抑制乃至は阻害の有無が測定
できる方法によって選択取得することができ、その限り
において特に制限されない。具体的には、前述するヒト
由来プロテインホスファターゼを反応基質と、被験化合
物の存在下で反応させてプロテインホスファターゼ活性
を測定し、該プロテインホスファターゼ活性が被験化合
物非存在下でのプロテインホスファターゼ活性と対比し
て低下する場合の該被験化合物をプロテインホスファタ
ーゼの阻害化合物として選別取得する方法を例示するこ
とができる。

【００１８】プロテインホスファターゼの活性測定、す
なわちプロテインホスファターゼと反応基質との反応は
特に制限されることなく、従来公知若しくは将来見出さ
れる方法をいずれも使用することができ、一例として例
えば、本明細書の実施例で詳細に説明する、Harderらの
方法を挙げることができる（Harder,KW., Owen,P., Won
g,LK., Aebersold,R., Clark-Lewis,I., Jirik.FR.(199
4) Characterizationand kinetic analysis of the int
racellular domain of human protein tyrosine phosph
atase beta (HPTP beta) using synthetic phosphopept
ides. BiochemJ. 298, pp.395-401）。当該方法によれ
ば、プロテインホスファターゼの活性は基質から脱リン
酸化反応により生成したリン酸を、マラカイトグリーン
とリンモリブデン酸の錯体に基づく６２０ｎｍの吸光度
を指標として検出することによって評価することができ
る。なお、本発明のプロテインホスファターゼの反応
は、金属イオンとしてＭｎ²⁺の存在が必要不可欠であ
る。

【００１９】またプロテインホスファターゼの活性測定
に使用される反応基質としてはホスホトレオニンをアミ
ノ酸残基として一部に含むリン酸化ペプチド及びリン酸
化蛋白質という条件を満たすものであれば特に制限され
ない。その限りにおいて例えば４〜４０アミノ酸残基、
特に５〜２０アミノ酸残基を有するリン酸化ペプチド乃
至はリン酸化蛋白質を挙げることができるが、具体的に
は配列番号３に示すアミノ酸配列を有するペプチドを好
適に例示できる。

【００２０】かくして選択取得されるプロテインホスフ
ァターゼの阻害化合物は、その構造に基づいて、さらに
他の公知方法（化学的合成法、生物学的合成法、遺伝子
学的合成法など）で製造取得されてもよい。本発明は、
上記方法で選別され、特定されたプロテインホスファタ
ーゼ阻害化合物を化学的、生物学的若しくは遺伝子学的
な合成手法によって製造する方法にも関し、さらには、
上記方法によって取得されるプロテインホスファターゼ
阻害化合物に関するものでもある。かかるプロテインホ
スファターゼ阻害化合物として、具体的には後述の実施
例で示すように、ヘパリン、ＮａＦ、ＣｏＣｌ₂、Ｚｎ
Ｃｌ₂を挙げることができる。

【００２１】（３）ヒト由来プロテインホスファターゼ
阻害化合物の用途 前述するように、カルモジュリンはカルモジュリン依存
性リン酸化酵素IIを介して、記憶などの高次神経機能の
制御や種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしてい
ることが知られている。本発明のヒト由来プロテインホ
スファターゼはカルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの
アミノ末端から２８６番目のトレオニンを特異的に脱リ
ン酸化してそれを不活化することにより、上記カルモジ
ュリンの機能の発現を妨げるように働くものである。従
って、当該ヒト由来プロテインホスファターゼの活性を
阻害する化合物によれば、カルモジュリン依存性リン酸
化酵素IIの不活性化を妨げ、ひいてはカルモジュリンの
不活性化に起因する各種の疾患並びに障害を治療ないし
は改善することが可能であると考えられる。

【００２２】かかる観点から本発明は、ヒト由来プロテ
インホスファターゼ阻害化合物の用途の一つとして、該
化合物を有効成分とするカルモジュリン依存性リン酸化
酵素IIの不活性化に起因する疾患の治療剤を提案するも
のである。

【００２３】ここでカルモジュリン依存性リン酸化酵素
IIの不活性化に起因する疾患としては、カルモジュリン
依存性リン酸化酵素IIが不活性化することによって直接
乃至は間接的に生じる疾患（障害を含む）を、将来知ら
れ得るものを含めて広く挙げることができる。具体的に
は、高次神経機能の低下や障害に起因する記憶障害（痴
呆を含む）等を例示することができるが、これらに制限
されない。

【００２４】かかる本発明の治療剤は、前述するヒト由
来プロテインホスファターゼ阻害化合物を含むものであ
ればよく、他に薬学的に許容される担体、並びに緩衝
剤，安定化剤，着色剤，保存剤，香料，風味剤又は甘味
剤等といった各種の添加剤を配合することについて特に
制限するものではない。またこれらの担体や添加剤の種
類並びにその配合量は、本発明の阻害化合物のヒト由来
プロテインホスファターゼに対する阻害活性を妨げるも
のでなければ、特に制限されず、製剤形態に応じて当業
界における常法に従って適宜選択採用される。

【００２５】さらに本発明の治療剤は、対象とする疾患
の種類や程度に応じて、投与時期、投与経路、投与形態
及び投与量などを適宜調整し設計することができ、それ
らに特に制限されない。例えば、投与形態としては経口
投与、非経口投与、局所投与、全身投与などが挙げら
れ、かかる投与形態に応じて、本発明の治療剤は固形
状、半固形状または液体状等のいずれもの形態に調製す
ることができる。例えば固形状製剤としては、錠剤、カ
プセル剤、丸剤、粉末（散剤）又は顆粒剤等が例示さ
れ、また液体状製剤としては、経口用の液剤，懸濁剤，
乳剤、並びに注射剤や点滴剤（懸濁剤，乳剤を含む）等
が例示される。なお、これらの製剤は、この分野で通常
知られた慣用的な製剤方法により製剤化される。

【００２６】本発明の治療剤の投与量は、ヒト由来プロ
テインホスファターゼ阻害化合物によっても、また治療
する疾患の種類や程度、患者の年齢、体重等の種々の要
因によっても異なり一概に定めることができず、ヒト由
来プロテインホスファターゼ阻害化合物の投与量として
１日あたり１０μｇ〜１０ｇの範囲から適宜選択するこ
とができる。

【００２７】なお、本発明には下記の態様が含まれる： （１）配列番号１記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質
のプロテインホスファターゼとしての使用。 （２）配列番号１記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質
の、トレオニン残基に特異的なプロテインホスファター
ゼとしての使用。 （３）配列番号１記載のアミノ酸配列を含有する蛋白質
の、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの脱リン酸化
酵素としての使用。 （４）脱リン酸化するアミノ酸がカルモジュリン依存性
リン酸化酵素IIのアミノ末端から286番目のトレオニン
である上記（３）記載の使用。 （５）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する蛋白質か
らなるヒト由来プロテインホスファターゼを反応基質及
び被験化合物の存在下で反応させてプロテインホスファ
ターゼ活性を測定し、該プロテインホスファターゼ活性
が被験化合物非存在下でのプロテインホスファターゼ活
性と対比して低下する場合の被験化合物を選択すること
を特徴とする上記ヒト由来プロテインホスファターゼに
対する阻害剤のスクリーニング方法。 （６）プロテインホスファターゼ活性の測定が、Ｍｎ²⁺
の存在下で行われる上記（５）記載のスクリーニング方
法。 （７）反応基質として、リン酸化されたトレオニン残基
を一部に含むペプチドを使用する（５）または（６）記
載のスクリーニング方法。 （８）反応基質として、ＭＨＲＱＥＴ(p)ＶＤＣを使用
する（５）乃至（７）のいずれかに記載のスクリーニン
グ方法。 （９）上記スクリーニング方法で得られる、プロテイン
ホスファターゼに対して阻害活性を有する化合物を合成
（化学合成、生物学的合成、遺伝子工学的合成を含む）
することからなるプロテインホスファターゼ阻害化合物
の製造方法。 （１０）上記スクリーニング及び製造方法によって得ら
れるプロテインホスファターゼ阻害化合物。 （１１）ヘパリン、ＮａＦ、ＣｏＣｌ₂またはＺｎＣｌ₂
である（１０）記載のプロテインホスファターゼ阻害
化合物。 （１２）ヘパリン、ＮａＦ、ＣｏＣｌ₂またはＺｎＣｌ₂
の、配列番号１記載のアミノ酸配列を含有するプロテイ
ンホスファターゼに対する選択的阻害化合物としての使
用。

【００２８】

【実施例】以下、本発明の内容を実施例及び実験例を用
いて具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに何ら
限定されるものではない。実施例１ ヒト由来プロテインホスファターゼ蛋白質の
取得 （１）ヒト由来プロテインホスファターゼ遺伝子の取得
及びその発現 鋳型としてHuman brain cDNA (Human brain quick-clon
e^TM cDNA；CLONTECH社製)を用いた。またプライマーと
して、ラット由来CaMKP遺伝子と高い相同性を有するヒ
ト由来機能未知遺伝子（GENBANK accesion no. D8699
5）のコード領域をカバーし、且つ増幅産生されたＤＮ
Ａが制限酵素BamHIとNdeIの認識配列をもつように下記
の二つのプライマーをデザインして、TaqDNA polymeras
e（TAKARA製）を用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲ条件：
９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で９０秒
間を３０サイクル）。 プライマー１：GGAATTCCATATGTCCTCTGGAGCCCCACA（配列
番号４） プライマー２：CGCGGATCCCCACCTAGCTTCTTGGTGGA（配列
番号５）。

【００２９】得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、１.４k
b付近のゲルを切り出して、抽出したＤＮＡを鋳型とし
て同様にしてＰＣＲを行った。その結果、１.４kb付近
にバンドが認められた。かくして得られたＰＣＲ産物を
ゲルから抽出、精製して、TAcloning vector kit（Invi
trogen社製）を用いて、ＰＣＲ２.１ベクター（Invitro
gen社製）に組み込んだ。次いで、下記に示すＴ７プラ
イマーとＲｅｖプライマーの二つのプライマーとBig Dy
e terminator cycle sequencing FS ready reaction ki
t（PE Biosystems社製）を使用し、ABI PRISM 310（PE
Biosystems社製）ジェネテイックアナライザーを用い
て、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。 Ｔ７プライマー：TAATACGACTCACT(配列番号６) Ｒｅｖプライマー：CAGGAAACAGCTATGAC(配列番号７)。

【００３０】ＰＣＲで得られた遺伝子の塩基配列をヒト
のジーンバンクから検索したところ、GENBANK accessio
n no.D13640として登録されている、ヒト未分化myeloid
cell line KG-1に由来する機能未知の遺伝子の塩基配
列と完全に一致していた（Nomura et al., DNA Res.,
1, pp.27-35 (1994)；Nomura et al., DNA Res., 1, p
p.47-56 (1994)）。かかるＰＣＲ産物の塩基配列を配列
番号２に、及びそれによってコードされるアミノ酸配列
を配列番号１に示す。この遺伝子は塩基レベルで８２
％、アミノ酸レベルで７９％の相同性をもって、ラット
由来プロテインホスファターゼ蛋白質（Ca²⁺/calmoduli
n-dependent protein kinase phosphatase,ラットCaMK
P:GENEBANK accession no.AB023634）と類似しており、
このことから当該遺伝子はラットCaMKPに対応するヒト
型遺伝子である可能性が示唆された。

【００３１】そこでＰＣＲ２.１ベクターに組み込まれ
た該機能未知遺伝子をBamHI及びNdeI（いずれもTAKARA
製）で切断し、大腸菌発現ベクターpET-IIa（TAKARA
製）のBamHIとNdeIの認識サイトに組み込んで、大腸菌B
L21-CodonPlus(DE3)-RIL（Stratagene社製）を形質転換
した。次いで形質転換された大腸菌を、まず０.２ｍｇ
／ｍｌアンピシリンを含むLuria- Bertani's broth（Ｌ
Ｂ培地）で３０℃で一晩、前培養を行い、次いで得られ
た前培養液２ｍｌを１００ｍｌのＭ９ＺＢ培地（培地１
００ｍｌあたり１ｇ ＮＺアミン，０.５ｇ ＮａＣ
ｌ，０.ｌｇ ＮＨ₄Ｃｌ，０.３ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄，１.５
１４ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ及び０.４ｇグルコー
スを含有する。上記の培地を調製・蒸気滅菌しておき、
使用直前にＭｇＳＯ₄を１ｍＭになるように、またアン
ピシリンを０.２ｍｇ／ｍｌになるように添加する。）
に接種して３０℃で振盪培養した。なお、上記機能未知
遺伝子はpET-IIaプラスミド上のT7ファージプロモータ
ーの下流に挿入され、宿主大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-
RILが生産するT7RNAポリメラーゼにより転写される。こ
のT7RNAポリメラーゼ遺伝子は宿主大腸菌染色体ＤＮＡ
に組み込まれており、lacUV5プロモーター下流にあるた
め、ＩＰＴＧ（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosi
de）の添加によりT7RNAポリメラーゼが発現する。そこ
で、培養液の吸光度（ＯＤ_{6 00}）が０.６〜１.０になっ
た時点でＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、
３０℃でさらに培養を行って０.５時間、１時間、１.５
時間、２時間、３時間及び４時間後にそれぞれ大腸菌を
集菌して、ＴＢＳ（５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７.５）
＋０.８５％ＮａＣｌ）で１回洗菌し、得られた菌体ペ
レットを−８０℃で保存した。これを融解し、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)用のサンプルバ
ッファーに懸濁して、５分間超音波処理した後、２分間
煮沸して、その遠心上清を電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後の蛋白質の染色はクーマシー・ブリリアント・ブ
ルーを使用して行った。

【００３２】SDS-PAGEの結果を図１に示す。図１のレー
ン１、２、３、４、５、及び６は、それぞれIPTGによる
誘導を０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、３時
間及び４時間行った大腸菌を用いた結果を、レーン７は
ＩＰＴＧ誘導を行わない大腸菌を用いた結果を示すが、
これらの結果からＩＰＴＧによる誘導時間に伴って、コ
ントロールの大腸菌（レーン７）には認められない分子
量約50,000の蛋白質バンドが濃くなっていることがわか
った。

【００３３】（２）プロテインホスファターゼ活性測定 上記ヒト機能未知遺伝子の発現産生物がプロテインホス
ファターゼ活性を有するか否かを調べるために、下記に
示すように、上記形質転換体（大腸菌）を破砕した破砕
液を使用して、そのプロテインホスファターゼ活性を測
定した。

【００３４】まず、上記においてＩＰＴＧ誘導４時間後
に集菌、洗菌した凍結菌体をホモゲナイズバッファー
（20mM Tris‐HCl（pH7.5）＋1mM EDTA＋1mM EGTA＋lm
M DTT＋1mM PMSF＋10μg/ml アンチパイン＋10μg/ml
キモスタチン＋10μg/ml ペプスタチン＋10μg/ml ロイ
ペプチン）に懸濁し、得られた懸濁液を食塩／氷で冷や
しながらソニケーター（ソニケーター150：大岳製作所
製）で１分間超音波破砕を行った（４回実施）。得られ
た破砕液を30,000ｇで１０分間遠心し、上清をプロテイ
ンホスファターゼの活性測定に使用した。

【００３５】プロテインホスファターゼの活性測定法
は、Harderらの方法に従って、遊離したリン酸をマラカ
イトグリーンを用いて測定する方法で行った（Harder,K
W., Owen,P., Wong,LK., Aebersold,R., Clark-Lewis,
I., Jirik.FR.(1994) Characterization and kinetic a
nalysis of the intracellular domain of human prote
in tyrosine phosphatase beta (HPTP beta) using syn
thetic phosphopeptides.Biochem J. 298, pp.395-40
1）。

【００３６】(2-1) 基質として、カルモジュリン依存性
リン酸化酵素IIのアミノ末端から２８１〜２８９番目に
相当するリン酸化ペプチド（アミノ末端から286番目の
トレオニンがリン酸化されたペプチド、ペプチド281-28
9Thr(p)：MHRQET(p)VDC：配列番号３）を使用した。

【００３７】具体的には反応液１２０μｌ（50mM Tris
‐HCl(pH7.5)＋2mM MnCl₂＋0.1mM EGTA＋0.01% Tween20
＋10μg/ml Poly(Lys)（平均分子量87000）＋40μM リ
ン酸化ペプチド）を３０℃で２分間プレインキュベーシ
ョンし、これに上記破砕懸濁液を添加し、１５分おきに
２５μｌずつ４回サンプリングした。サンプリングした
サンプルは直ちに５０μｌのマラカイトグリーン／Twee
n20溶液と混和して、２５℃に１０分間放置した。次に
８.５μｌの３４％（ｗ/ｖ）クエン酸ナトリウム水溶液
を添加して混和し、室温にて３０分間放置した後、分光
光度計で６２０ｎｍの吸収を測定して、遊離リン酸量を
測定した。

【００３８】また上記反応液において、２ｍＭ ＭｎＣ
ｌ₂の代わりに２ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む反応液、または
２ｍＭ ＭｎＣｌ₂に代えて０．１７ｍＭのＥＤＴＡを
含む反応液を用いて同様にして実験を行い、６２０ｎｍ
の吸収を測定した。結果を図２に示す。なお比較対照実
験として、pET-11aプラスミドだけを導入した大腸菌を
破砕した破砕液、及びラットCaMKPを組み込んだpET-11a
プラスミドを発現させた大腸菌を破砕した破砕液につい
て同様に実験した結果も併せて図２に示す。その結果、
Ｍｎ²⁺存在下でのみ、ヒト機能未知遺伝子（ヒトCaMK
P）またはラットCaMKP遺伝子を導入した大腸菌において
プロテインホスファターゼの活性が認められた。なお、
ＩＰＴＧによる誘導を行わなかった大腸菌ではいずれの
場合も活性は認められなかった。これらのことから、本
発明で得られた上記機能未知遺伝子の発現産物はヒト由
来プロテインホスファターゼであって、その酵素の活性
発現にはＭｎ²⁺が必要であることが判明した。ところで
ラットＣａＭＫＰに関して、その反応に二価金属イオン
としてＭｎ²⁺が要求されることが知られている。このこ
とから、本発明の酵素はラットＣａＭＫＰのヒト型に相
当するものであることが確認された。

【００３９】(2-2) 基質としてリン酸化アミノ酸を上記
トレオニンに代えてセリンまたはチロシンに置換したペ
プチド（ペプチド281-289Ser(p)：ＭＨＲＱＥＳ(p)ＶＤ
Ｃ（配列番号８）、ペプチド281-289Tyr(p)：ＭＨＲＱ
ＥＹ(p)ＶＤＣ（配列番号９））を使用し、また２ｍＭ
ＭｎＣｌ₂を含む上記反応液を使用して、同様にプロ
テインホスファターゼ活性を測定した。結果を図３に示
す。図３からわかるように、ペプチド281-289Ser(p)で
はきわめて弱い脱リン酸化反応が認められたが、ペプチ
ド281-289Tyr(p)では全く脱リン酸化活性が認められな
かった。このことから、本酵素はトレオニンがリン酸化
されたアミノ酸残基を有するペプチドに対して特異性が
高いことが判明した。

【００４０】（３）プロテインホスファターゼ阻害化合
物のスクリーニング ヘパリン、NaF、CoCl₂、ZnCl₂、NiCl₂を被験化合物とし
て用いて、本発明のプロテインホスファターゼに対する
影響を調べた。具体的には、反応基質として上記のペプ
チド281-289Thr(p)（MHRQET(p)VDC：配列番号３）を用
いて、上記(2-1)に記載した反応系に上記被験化合物が
それぞれヘパリン(100 μg/ml), NaF(100mM), CoCl₂(50
μM), ZnCl₂(50 μM)またはNiCl₂(50 μM)の割合で含
まれるにように添加して、反応させてプロテインホスフ
ァターゼ活性を測定した。結果を図４に示す。なお、図
中コントロールとは被験化合物非存在下で反応させたも
のである。

【００４１】その結果、上記被験化合物のうち、ヘパリ
ン、NaF、CoCl₂、ZnCl₂が本発明のプロテインホスファ
ターゼに対して阻害活性を示すことが判明した。以上の
ことから、本発明で得られたヒトプロテインホスファタ
ーゼとそのアッセイ系を使用することにより、本発明の
ヒトプロテインホスファターゼ阻害化合物をスクリーニ
ングして得ることが可能であり、少なくともヘパリン、
NaF、CoCl₂、ZnCl₂が当該阻害物質として位置づけられ
ることが判明した。

【００４２】

【配列表】 <110> DIRECTOR-GENERAL OF AGENCY OF INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY <110> SUNTORY LIMITED <120> Human Protein Phosphatase and its inhibitor <130> 3449JP <160> 9 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <301> Nomura,N., Miyajima,N., Sazuka,T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., Sa to,S., Nagase,T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabata,S. <302> Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I . The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by an alysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1 <303> DNA Res. <304> 1 <305> 1 <306> 27-35 <307> 1994 <308> <300> <301> Nomura,N., Miyajima,N., Sazuka,T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., Sa to,S., Nagase,T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabata,S. <302> Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I . The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by an alysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1 (supplement) <303> DNA Res. <304> 1 <305> 1 <306> 47-56 <307> 1994 <308> <400> 1 Met Ser Ser Gly Ala Pro Gln Lys Ser Ser Pro Met Ala Ser Gly Ala 5 10 15 Glu Glu Thr Pro Gly Phe Leu Asp Thr Leu Leu Gln Asp Phe Pro Ala 20 25 30 Leu Leu Asn Pro Glu Asp Pro Leu Pro Trp Lys Ala Pro Gly Thr Val 35 40 45 Leu Ser Gln Glu Glu Val Glu Gly Glu Leu Ala Glu Leu Ala Met Gly 50 55 60 Phe Leu Gly Ser Arg Lys Ala Pro Pro Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala 65 70 75 80 His Glu Ala Val Ser Gln Leu Leu Gln Thr Asp Leu Ser Glu Phe Arg 85 90 95 Lys Leu Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Glu 100 105 110 Glu Lys Ala Pro Val Thr Leu Leu Asp Ala Gln Ser Leu Ala Gln Ser 115 120 125 Phe Phe Asn Arg Leu Trp Glu Val Ala Gly Gln Trp Gln Lys Gln Val 130 135 140 Pro Leu Ala Ala Arg Ala Ser Gln Arg Gln Trp Leu Val Ser Ile His 145 150 155 160 Ala Ile Arg Asn Thr Arg Arg Lys Met Glu Asp Arg His Val Ser Leu 165 170 175 Pro Ser Phe Asn Gln Leu Phe Gly Leu Ser Asp Pro Val Asn Arg Ala 180 185 190 Tyr Phe Ala Val Phe Asp Gly His Gly Gly Val Asp Ala Ala Arg Tyr 195 200 205 Ala Ala Val His Val His Thr Asn Ala Ala Arg Gln Pro Glu Leu Pro 205 215 220 Thr Asp Pro Glu Gly Ala Leu Arg Glu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Gln 225 230 235 240 Met Phe Leu Arg Lys Ala Lys Arg Glu Arg Leu Gln Ser Gly Thr Thr 245 250 255 Gly Val Cys Ala Leu Ile Ala Gly Ala Thr Leu His Val Ala Trp Leu 260 265 270 Gly Asp Ser Gln Val Ile Leu Val Gln Gln Gly Gln Val Val Lys Leu 275 280 285 Met Glu Pro His Arg Pro Glu Arg Gln Asp Glu Lys Ala Arg Ile Glu 290 295 300 Ala Leu Gly Gly Phe Val Ser His Met Asp Cys Trp Arg Val Asn Gly 305 310 315 320 Thr Leu Ala Val Ser Arg Ala Ile Gly Asp Val Phe Gln Lys Pro Tyr 325 330 335 Val Ser Gly Glu Ala Asp Ala Ala Ser Arg Ala Leu Thr Gly Ser Glu 340 345 350 Asp Tyr Leu Leu Leu Ala Cys Asp Gly Phe Phe Asp Val Val Pro His 355 360 365 Gln Glu Val Val Gly Leu Val Gln Ser His Leu Thr Arg Gln Gln Gly 370 375 380 Ser Gly Leu Arg Val Ala Glu Glu Leu Val Ala Ala Ala Arg Glu Arg 385 390 395 400 Gly Ser His Asp Asn Ile Thr Val Met Val Val Phe Leu Arg Asp Pro 405 410 415 Gln Glu Leu Leu Glu Gly Gly Asn Gln Gly Glu Gly Asp Pro Gln Ala 420 425 430 Glu Gly Arg Arg Gln Asp Leu Pro Ser Ser Leu Pro Glu Pro Glu Thr 435 440 445 Gln Ala Pro Pro Arg Ser 450 <210> 2 <211> 5134 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (107)...(1468) <300> <301> Nomura,N., Miyajima,N., Sazuka,T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., Sa to,S., Nagase,T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabata,S. <302> Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I . The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by an alysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1 <303> DNA Res. <304> 1 <305> 1 <306> 27-35 <307> 1994 <308> <300> <301> Nomura,N., Miyajima,N., Sazuka,T., Tanaka,A., Kawarabayasi,Y., Sa to,S., Nagase,T., Seki,N., Ishikawa,K. and Tabata,S. <302> Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. I . The coding sequences of 40 new genes (KIAA0001-KIAA0040) deduced by an alysis of randomly sampled cDNA clones from human immature myeloid cell line KG-1 (supplement) <303> DNA Res. <304> 1 <305> 1 <306> 47-56 <307> 1994 <308> <400> 2 ggacacggag ccgcgaggag acagctgagg cccgcggaga ccagggggtg aagcctggag 60 accctcttgc cctggcctag ctgcaggccc ccgggatgct ttgggc 106 atg tcc tct gga gcc cca cag aag agc agc cca atg gcc agt gga gct 154 Met Ser Ser Gly Ala Pro Gln Lys Ser Ser Pro Met Ala Ser Gly Ala 1 5 10 15 gag gag acc cca ggc ttc ctg gac acg ctc ctg caa gac ttc cca gcc 202 Glu Glu Thr Pro Gly Phe Leu Asp Thr Leu Leu Gln Asp Phe Pro Ala 20 25 30 ctg ctg aac cca gag gac cct ctg cca tgg aag gcc cca ggg acg gtg 250 Leu Leu Asn Pro Glu Asp Pro Leu Pro Trp Lys Ala Pro Gly Thr Val 35 40 45 ctc agc cag gag gag gtg gag ggc gag ctg gct gag ctg gcc atg ggc 298 Leu Ser Gln Glu Glu Val Glu Gly Glu Leu Ala Glu Leu Ala Met Gly 50 55 60 ttt ctg ggc agc agg aag gcc ccg cca cca ctt gct gct gct ctg gcc 346 Phe Leu Gly Ser Arg Lys Ala Pro Pro Pro Leu Ala Ala Ala Leu Ala 65 70 75 80 cac gaa gca gtt tca cag ctg cta cag aca gac ctt tcc gaa ttc agg 394 His Glu Ala Val Ser Gln Leu Leu Gln Thr Asp Leu Ser Glu Phe Arg 85 90 95 aag ttg ccc agg gag gaa gaa gaa gag gag gag gac gat gac gag gag 442 Lys Leu Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Glu 100 105 110 gaa aag gcc cct gtg acc ttg ctg gat gcc caa agc ctg gca cag agt 490 Glu Lys Ala Pro Val Thr Leu Leu Asp Ala Gln Ser Leu Ala Gln Ser 115 120 125 ttc ttt aac cgc ctt tgg gaa gtc gcc ggc cag tgg cag aag cag gtg 538 Phe Phe Asn Arg Leu Trp Glu Val Ala Gly Gln Trp Gln Lys Gln Val 130 135 140 cca ttg gct gcc cgg gcc tca cag cgg cag tgg ctg gtc tcc atc cac 586 Pro Leu Ala Ala Arg Ala Ser Gln Arg Gln Trp Leu Val Ser Ile His 145 150 155 160 gcc atc cgg aac act cgc cgc aag atg gag gac cgg cac gtg tcc ctc 634 Ala Ile Arg Asn Thr Arg Arg Lys Met Glu Asp Arg His Val Ser Leu 165 170 175 cct tcc ttc aac cag ctc ttc ggc ttg tct gac cct gtg aac cgc gcc 682 Pro Ser Phe Asn Gln Leu Phe Gly Leu Ser Asp Pro Val Asn Arg Ala 180 185 190 tac ttt gct gtg ttt gat ggt cac gga ggc gtg gat gct gcg agg tac 730 Tyr Phe Ala Val Phe Asp Gly His Gly Gly Val Asp Ala Ala Arg Tyr 195 200 205 gcc gct gtc cac gtg cac acc aac gct gcc cgc cag cca gag ctg ccc 778 Ala Ala Val His Val His Thr Asn Ala Ala Arg Gln Pro Glu Leu Pro 205 215 220 aca gac cct gag gga gcc ctc aga gaa gcc ttc cgg cgc acc gac cag 826 Thr Asp Pro Glu Gly Ala Leu Arg Glu Ala Phe Arg Arg Thr Asp Gln 225 230 235 240 atg ttt ctc agg aaa gcc aag cga gag cgg ctg cag agc ggc acc aca 874 Met Phe Leu Arg Lys Ala Lys Arg Glu Arg Leu Gln Ser Gly Thr Thr 245 250 255 ggt gtg tgt gcg ctc att gca gga gcg acc ctg cac gtc gcc tgg ctc 922 Gly Val Cys Ala Leu Ile Ala Gly Ala Thr Leu His Val Ala Trp Leu 260 265 270 ggg gat tcc cag gtc att ttg gta cag cag gga cag gtg gtg aag ctg 970 Gly Asp Ser Gln Val Ile Leu Val Gln Gln Gly Gln Val Val Lys Leu 275 280 285 atg gag cca cac aga cca gaa cgg cag gat gag aag gcg cgc att gaa 1018 Met Glu Pro His Arg Pro Glu Arg Gln Asp Glu Lys Ala Arg Ile Glu 290 295 300 gca ttg ggt ggc ttt gtg tct cac atg gac tgc tgg aga gtc aac ggg 1066 Ala Leu Gly Gly Phe Val Ser His Met Asp Cys Trp Arg Val Asn Gly 305 310 315 320 acc ctg gcc gtc tcc aga gcc atc ggg gat gtc ttc cag aag ccc tac 1114 Thr Leu Ala Val Ser Arg Ala Ile Gly Asp Val Phe Gln Lys Pro Tyr 325 330 335 gtg tct ggg gag gcc gat gca gct tcc cgg gcg ctg acg ggc tcc gag 1162 Val Ser Gly Glu Ala Asp Ala Ala Ser Arg Ala Leu Thr Gly Ser Glu 340 345 350 gac tac ctg ctg ctt gcc tgt gat ggc ttc ttt gac gtc gta ccc cac 1210 Asp Tyr Leu Leu Leu Ala Cys Asp Gly Phe Phe Asp Val Val Pro His 355 360 365 cag gaa gtt gtt ggc ctg gtc cag agc cac ctg acc agg cag cag ggc 1258 Gln Glu Val Val Gly Leu Val Gln Ser His Leu Thr Arg Gln Gln Gly 370 375 380 agc ggg ctc cgt gtc gcc gag gag ctg gtg gct gcg gcc cgg gag cgg 1306 Ser Gly Leu Arg Val Ala Glu Glu Leu Val Ala Ala Ala Arg Glu Arg 385 390 395 400 ggc tcc cac gac aac atc acg gtc atg gtg gtc ttc ctc agg gac ccc 1354 Gly Ser His Asp Asn Ile Thr Val Met Val Val Phe Leu Arg Asp Pro 405 410 415 caa gag ctg ctg gag ggc ggg aac cag gga gaa ggg gac ccc cag gca 1402 Gln Glu Leu Leu Glu Gly Gly Asn Gln Gly Glu Gly Asp Pro Gln Ala 420 425 430 gaa ggg agg agg cag gac ttg ccc tcc agc ctt cca gaa cct gag acc 1450 Glu Gly Arg Arg Gln Asp Leu Pro Ser Ser Leu Pro Glu Pro Glu Thr 435 440 445 cag gct cca cca aga agc ta ggtggtttcc aggcccctgc cctccccttc 1500 Gln Ala Pro Pro Arg Ser 450 454 ctcccatcct tgtccttctc tccctcagaa gcctcaggac ccaacaggtg gcaggcagtg 1560 gacagggtgc ccgccccaca gtgctttccc cagcacccca gagccagtcg ggacaccccc 1620 cgcagcccgt cctggtggct gtggaactgc actgggtggc gggcagatgg tggaaggcag 1680 cttaggagac ctcaccaaag agaagatgga ccggctcttg ctcccagctc ctattaggcc 1740 cggggtggga ccagaggtca taggtgccca acggcagcca aaccaaagac actggtgtgc 1800 atggggcagc atggttgtgc acgtgggacc ctggggcgga cccaggagcc aaactcttga 1860 agcaccccct gggtcaggcc cagcagcgga gtggccagcc ccagtttccc attgctcctc 1920 tctgcggcca gggccaggtg ggttcatatt tacagatatg cccagccagt cctggtcggc 1980 cacaccagtg tcccaaagag gagagcgcag cagagccagg ggtctgttct gtagcagcca 2040 cccccctgcc cccactccag ggcagccatg atgtgcttgg cccaccaggg ccttccgggc 2100 tgctctcttc cctgagcccg gaaccggcga cgcacatgtg tcttttgttg gtgtgtttgt 2160 ttttttccag ggaggtctaa ttccgaagca gtattccagg ttttctcttt gttttatcag 2220 tgccaagatg acctgttgtg tcatataatt taagcagagc ttagcattta ttttattctt 2280 tagaaaactt aagtatttac ttttttaaag ctatttttca aggaaccttt ttttgcagta 2340 ttattgaatt tattttctaa atcaggattg aaacaggaac ttttccaggt ggtgttaata 2400 agccattcaa gtgccttaca cagctttgaa gaaactagga ctgcagtggg ctcggatagg 2460 cccattgagg tttttagaaa agcaggattt gttttgttag ggaggcatga ttttggtgag 2520 atctttctgg aagagttttc cgcctctttg tgatgctgaa cacccccaag gttctcccct 2580 ccccccgctg cccaggtgac tggcaggagc tgcgactgcc acgtagtgtt gcctgggccc 2640 gacagcgggg ctctgggcat cccgggtgac cttggcccat ctgcctgcat tcccaccccc 2700 ttgggcctgg ctggatccca ggcagaggga ccttgctgct gtgtgattgg aacattccca 2760 aatatcttgt gaatttgtaa tcaaattggt ctcattggga aagactctta attaagaggc 2820 tcaggcaagc acagaggcag cccgtgggtc tctgtctcag tctggaggca gcagggatgc 2880 tgctgggagt ccatggcaca ggccacagcc cctcaccttg ccgcggtggc tggcagcacg 2940 cctgccttgc tctgccccat gccctgaaca ggcatgagag ctccacgtcc cctagtgcac 3000 cctgagaggg ggctcacaag tgaccgatcc tgggtgcctc agggagctca ctgagggcgt 3060 gcaaagttga aagtggcaag gctgggggag ggtgtcgggt agagggaaga gggcaggggg 3120 ctaggggagg actcagaggc catctgcagg gccaagccac aggaagggct gagctggagg 3180 tgggcagggc tgctccaggc aggtcagagc agtgcagggg gaggagagga gaaagggagg 3240 aagctgggct gtgtggtccc catgaaggca ttcagagtcc acctgcagac agcgagagcc 3300 ccaggaaggt ttgcacagct gtgccccaag caccttggcc tcctctcagc tcgccgagga 3360 ggcacgctag agccgccttc ccggtgggag ccctctgtcc cacagggagc ggggagccag 3420 ctttgctggg gccctacctg catgcccagc cttacccctc attctcacag cacagatgag 3480 gttgagacca tgcagtcaat gcattgctta aggtctctta tttacaaaaa aaaaccttaa 3540 acatagtcgc tgtcattcag acattcagag aatggttggc cacaaacaat gaccaagtat 3600 tgcttggctt aacttgaagg cctgctgtct ccttctgggg gtcagggacg cagctccacc 3660 ctcaccacta gcccaccctg cccgtgggca taaccttgac gaagagagag aatgattggc 3720 atctgctttt ctcttttctt tgctaataat tctgttcctg gctgccgaga gtgaagtttc 3780 accatgtgga ggtttggctc ctatcacctg gtggtctgat tcatacccta gcctgaggct 3840 ccactggaag atctcgcagc ctcagtgtat gggaaaccct ttccccaggc ttgtcccagc 3900 actgccgctc cccacccctg agccaggacc ccagaggatg gccatgcccc gtgcctggca 3960 gaggtctggt gccagcactg ggagctgctc cgcccttgcc ttggggccga gggagccctc 4020 gtccacccct gcacagcagc tgggcacaga ggagcgctct tccatcttga ccaggactgc 4080 accaagaagc accaggtgtc ttcagcctcc aacctccggg gcgaccttct cttccagcca 4140 cagtcccatg agggccccta gccagggaca ctggtctgta aattgtaatc ctttctccag 4200 cccagctctc cacttgttcc ttgtgtgagc tgagcaggca gtgcacctct gagtgtccct 4260 tttgtaaggc ccaggggttg cactgagtct gcagaggccg cgacctccta gaacgctgtg 4320 ggtgcaagtg agccggcgtg tcctggggag atgctgccag cacacagggg ccctcctgct 4380 gccagcaggt tggggtggtt aagtcttatt agtgtctatt cttaaaatta agtgggctgg 4440 agaagaatgg agctccacat gccagcaccg tatatggaat acaaaagctg gggaagcagg 4500 gcctgcctta caggtgtggc tgactctgag cccaggcctg caggggtgga gggcagtccc 4560 tcagaatccc agaggcagtc ccagcctcag aacccaggat aggaaatggg tgtgtttagt 4620 ggggaaaggg acggggtgca gacggcaggg ccagtatggg gccccctccc tctcctctcc 4680 tctcctatgg tgagcccagc gtgggcaccg ggccgtctca gccgtgttcc cagggctggg 4740 aggacagctc tggcccttct taggcctagc ctcgtcccaa gctaaatgta agccagttgg 4800 gctgtgttaa aggaagcagt gtttttggtt tgattctgcc tctgtagctc aaggggggca 4860 gcccccagag tcctgtgcat tctgccaagg ctccatagct ttgccaaatg cacggagctc 4920 tgccattccg gtgcagtgca ggccttgcga agggtttatc tgcgttcgtc tcggtgggct 4980 tctcctgcat gggagttgtg ttcctgtgca agggggagct ttgctcagga caggatgact 5040 gtcttcccta ttcttaggga caagtcccaa gatgccagaa aggcagtctc ccaaggaccc 5100 accatgcaga agtgtcaata aaccacaagt tctg 5134 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PHOSPHORYLATION <222> (6) <400> 3 Met His Arg Gln Glu Thr Val Asp Cys 5 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ggaattccat atgtcctctg gagccccaca 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cgcggatccc cacctagctt cttggtgga 29 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 taatacgact cact 14 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 caggaaacag ctatgac 17 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PHOSPHORYLATION <222> (6) <400> 8 Met His Arg Gln Glu Ser Val Asp Cys 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PHOSPHORYLATION <222> (6) <400> 9 Met His Arg Gln Glu Tyr Val Asp Cys 5

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＰＴＧ（１ｍＭ）によって遺伝子発現が誘導
された大腸菌菌体破砕液のＳＤＳ‐ポリアクリルアミド
電気泳動の結果を示す図である。レーン１，２，３，
４，５及び６はそれぞれＩＰＴＧによる誘導を０．５，
１，１.５，２，３及び４時間行った大腸菌の破砕液の
電気泳動像であり、レーン７はＩＰＴＧ誘導を行わない
大腸菌の破砕液の電気泳動像である。

【図２】ヒト機能未知遺伝子産物（図中、ヒトCaMK
P）、ベクターとして用いたpET-IIaのみを導入した大腸
菌（図中、コントロール大腸菌）、並びにラットＣａＭ
ＫＰ（図中、ラットCaMKP）のプロテインホスファター
ゼ活性を示す図である（基質；peptide281-289Thr
(p)）。各実験ともＥＤＴＡ（０．１７ｍＭ）存在下の
金属イオンを含まない条件、あるいはＭｎ²⁺、Ｍｇ²⁺を
それぞれ（２ｍＭ）の割合で含む条件で行った結果を示
す。

【図３】基質としてペプチド281-289Thr(p)、ペプチド2
81-289Ser(p)及びペプチド281-289Tyr(p)を用いて、ヒ
ト機能未知遺伝子の遺伝子産物のプロテインホスファタ
ーゼ活性を測定した結果を示す図である。

【図４】ヘパリン、NaF、CoCl₂、ZnCl₂、NiCl₂存在下で
ヒト機能未知遺伝子の遺伝子産物のプロテインホスファ
ターゼ活性を測定した結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/42 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 湯元 昇 大阪府池田市緑丘１丁目８番31号 工業技 術院大阪工業技術研究所内 (72)発明者 島本 啓子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内 (72)発明者 安田 好美 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA11 CA04 DA06 EA04 GA19 HA01 4B050 CC04 DD11 LL01 LL10 4B063 QA01 QA18 QQ33 QQ79 QQ89 QR07 QR13 QS02 QS28 QS36 QX01 4B064 AG21 CA19 CC24 DA01 4C084 AA17 NA14 ZA152 ZC192

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(i) プロテインホスファターゼ活性を有
   し、(ii) 脱リン酸化するアミノ酸がトレオニン特異的
   であり、かつ (iii)脱リン酸化反応に際してＭｎ ²⁺を要
   求するプロテインホスファターゼであって、配列番号１
   に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、又は当該アミノ酸
   配列において１乃至は複数のアミノ酸が欠失、置換若し
   くは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質であること
   を特徴とするヒト由来プロテインホスファターゼ。
2. 【請求項２】リン酸化された活性型カルモジュリン依存
   性リン酸化酵素IIを脱リン酸化して不活性型に変換する
   ことを特徴とする請求項１記載のヒト由来プロテインホ
   スファターゼ。
3. 【請求項３】脱リン酸化するアミノ酸がカルモジュリン
   依存性リン酸化酵素IIのアミノ末端から286番目のトレ
   オニンである請求項２記載のヒト由来プロテインホスフ
   ァターゼ。
4. 【請求項４】請求項１乃至３のいずれかに記載のヒト由
   来プロテインホスファターゼを反応基質及び被験化合物
   の存在下で反応させてプロテインホスファターゼ活性を
   測定し、該プロテインホスファターゼ活性が被験化合物
   非存在下でのプロテインホスファターゼ活性と対比して
   低下する場合の被験化合物を選択することを特徴とす
   る、上記ヒト由来プロテインホスファターゼに対する阻
   害活性を有する化合物のスクリーニング方法。
5. 【請求項５】請求項４のスクリーニング方法で得られ
   る、プロテインホスファターゼに対して阻害活性を有す
   る化合物を化学的、生物学的または遺伝子工学的な方法
   のいずれかを用いて製造する方法。
6. 【請求項６】請求項４または５記載の方法によって得ら
   れる、プロテインホスファターゼに対して阻害活性を有
   する化合物。
7. 【請求項７】請求項６に記載の化合物を有効成分とす
   る、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの不活性化に
   起因する疾患の治療剤。