JP2001503616A

JP2001503616A - 新規ランチオニン抗生物質組成物および方法

Info

Publication number: JP2001503616A
Application number: JP51965498A
Authority: JP
Inventors: コーフイールド，ペイジ・ダブリユー; ノバク，ジヤン
Original assignee: ザ・ユーエイビー・リサーチ・フアンデーシヨン
Priority date: 1996-10-23
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 2001-03-21
Also published as: AU735447B2; EP0948535A4; US5872001A; EP0948535A1; AU735447C; AU4998197A; NZ335679A; WO1998017685A1; CA2268744A1

Abstract

(57)【要約】ヒトに固有の所定の細菌は、それ自体の種のメンバーを含む他の細菌を阻害する、バクテリオシンと称される抗菌物質を産生する。ミュータシンはストレプトコックスムュータンス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）により作成される一種の抗生物質である。Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からの新規のランチオニン−含有性ミュータシンペプチドの精製および生物学的特徴決定が開示される。精製されたペプチドはｐＨ−および温度−安定性であり、そしてそのアミノ酸組成によりランチオニンおよびβ−メチルランチオニンの存在が示される。精製されたペプチドを作成および使用する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】新規ランチオニン抗生物質組成物および方法発明の背景関連出願への相互参照本出願は、１９９４年４月２０日に提出された米国特許第０８／２３０，４７３号の一部継続出願である。連邦財政援助の説明（ｆｅｄｅｒａｌＦｕｎｄｉｎｇＬｅｇｅｎｄ）合衆国政府は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）からの助成金ＮＩＤＲ：ＤＥ０９０８２号に準じ、本発明における権利を所有する。発明の分野本発明はポリペプチド抗生物質、および抗生物質の発現に関連する遺伝子座の同定に関する。本発明は特に、精製されたランチオニン−含有抗微生物剤、その蛋白質をコードするＤＮＡ、ならびにその抗生物質を利用する治療のための方法および組成物を記載する。関連する技術の記述ミュータンス連鎖球菌として集合的に知られる表現型上で類似する群の細菌は虫歯の原因となる主な病因物質と考えられ、そして心内膜炎のような他の感染性および伝染性疾患における主な原因物質とみなされてきた。虫歯に最も一般的に関係する種はストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）である。この生物体の齲食原性ポテンシャルに寄与する遺伝子決定基および感染性疾患の作用性物質としてのその来歴を一層良く理解するための試みは、最近になってようやくその一歩を踏み出したところである。例えば分子的研究法は、スクロースの細胞外ポリマーへの代謝性変換の原因となって発症性の塊（ｃｒｉｔｉｃａｌｍａｓｓ）を形成させ、かつ発酵可能な基質を提供する重要な毒性因子である、糖代謝に関与するグルコシルトランスフェラーゼを含む多数の異なる酵素の構造、機能、および調節を詳細に描写するのに用いられてきた（Ｈａｍａｄａら、１９８６）。Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の病原性に関与すると考えられる他の２つの主な因子は、その酸産生性／耐酸性特性（Ｃａｕｆｉｅｌｄら、１９９０Ａ）、およびプラーク内に見いだされる高密度に充填された競合性生物体という環境における持続性コロニー形成に必要とされる選択力を提供することかも知れない、一般的にはミュータシンとして知られる特性決定があまり良くはなされていないバクテリオシン様物質を生産するその能力（Ｂｕｃｈｍａｎら、１９８８）である。集合的に「ミュータシン」と称され、これらの作用物質は同種もしくは密接に関連する種の他の細菌を死滅化させる。ミュータシンは名称および宿主プロデューサーのみが類似しており、なぜならそれらの特性は広域にわたり異なっているためである。Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のプラスミド−含有株に関連するミュータシンはグループ（Ｇｒｏｕｐ）ＩもしくはＩＩ（ミュータシンＩおよびＩＩ）のいずれかとして命名されている。従ってミュータシンの産生は、特に口腔内でコロニー形成しそして維持される能力に寄与するように思われるＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の一つの特性である。これに関してミュータシンは毒性因子と見なしうる。ミュータンス連鎖球菌は集合的にミュータシンと称される幾つかの異なるバクテリオリシン様阻害性物質を産生する。今日まででは大半のものが部分的に特徴決定がなされているに過ぎない（Ｈａｍａｄａら、１９８６；Ｌｏｙｏｌａら、１９９２）。これらの物質の特徴決定に関してはその成功が限られたものとなっている理由は以下のようなものである；（１）それらが少量で作成される；（２）特別な培養条件下においてのみ産生が生じる；（３）液体培地においては産生されない；および（４）これらの「ミュータシン」を培地から単離することが困難である。バクテリオシンは通常は、同一種内もしくは密接に関連する種の細菌に対して致死もしくは殺細菌効果を発揮することが可能な蛋白質性物質として特定される（Ｔａｇｇら、１９７６）。しかしながらグラム−陽性細菌の間ではこの定義はいくぶん正確さを欠き、なぜなら阻害性物質は一層広範囲のスペクトラムの活性を示すためである。それに加え、バクテリオシンは必ずしも蛋白質ではなく、そして例えばコリシンのような、一層研究が進んでいるグラム−陰性バクテリオシンのためにもともとは意図される通常の定義には当てはまらない。中でもナイシン、エピデルミン、ｐｅｐ５、およびズブチリミンを含む幾つかのグラム−陽性細菌の阻害性ポリペプチドの分子上の特徴決定および配列決定を必要とする最近の研究により、リボソームで翻訳されるが、しかし翻訳後にプロセシングを受けるペプチドで、改変されたアミノ酸およびチオエーテル結合を有するものが明らかにされている。集合的にはこれらのポリペプチド抗生物質はランティバイオティクもしくはランチオニン−含有抗生物質と称される（Ａｌｌｅｇａｉｅｒら、１９８６；Ｂｕｃｈｍａｎら、１９８８）。今ではミュータシンＩＩグループはランチオニン−含有ファミリーの抗生物質に属することが明らかである。ある一定のミュータシンの幾つかの特徴が決定されている。「ミュータシン」活性はＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）内の５．６ｋｂのプラスミドの存在に関連すると思われるが；しかしながらミュータンス連鎖球菌のプラスミド− 含有株内でのミュータシン産生はプラスミドにはコードされていない（Ｃａｕｆｉｅｌｄら、１９９０Ａ）。５．６ｋｂプラスミドが潜伏するＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の株の中でも性質が異なるが密接に関連する少なくとも２つのミュータシン産生性／免疫性群が存在する。その結果、努力はミュータシン発現の原因となる染色体遺伝子座の位置決定および性質決定に焦点が当てられてきている。ミュータシン発現の原因となる遺伝子（一つもしくは複数）を同定するための最初の試みは突然変異誘発物質としてトランスポゾンＴｎ９１６を用いる転移性突然変異誘発を利用した（Ｃａｕｆｉｅｌｄら、１９９０Ｂ）。ミュータシン発現に関連する５つの異なる染色体遺伝子座が同定されている。残念なことに、例えばそれらの組成や、どのような条件下でそれらが作成されるかなどは、「ミュータシン」活性を有し、記載がなされている多くの抽出物についてはほとんど知られていない。調査されている組成物は少量で、そしてある一定のほとんど規定されていない条件下でのみ作成されたため、「ミュータシン」を部分的に単離し、そして生化学的に特徴決定する試みにより様々な結果が得られた。主に粗精製の無細胞抽出物を用いる過去の研究により、異なる分子量、ならびにｐＨおよび消化酵素に対する特異的感受性を有するミュータシンの記載がもたらされた（Ｃａｕｆｉｅｌｄら、（１９８５、１９９０Ａ、１９９０Ｂ）、Ｌｏｙｏｌａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９２）、Ｄｅｌｉｓｌｅ（１９８６）、ＰｉｎｔｏＡｌｖｅｓら（１９９２））。これらの結果の妥当性および有用性については、その組成物の純度がよくないことにより特に混乱を引き起こす原因となっている。広域かつ特定されているものの、しかし範囲が限定された微生物に対して有効な抗生物質の開発が必要であると認識されている。ミュータシン−タイプの抗生物質に関する現状での理解により、これらの化合物は、ある種類の抗生物質としての可能性を有する。しかしながら、様々なミュータシンの純度が不十分であり、かつそのような化合物を十分な量取得することが不可能であるため、特定のミュータシンがまだこれから明確に同定され、そして更に進んだ使用のために開発されなければならない。発明の要約本発明はこれらの欠点および、従来の技術における固有の他の欠点を、ヒトを初めとする動物での微生物感染症の治療のための精製されたミュータシン組成物および治療方法を提供することにより克服する道を模索する。ミュータシン抗微生物剤はストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）から単離され、そしてグラム−陽性細菌の内の幾つかの種に対する活性を示す。本発明は更にはミュータシン遺伝子の分子クローニングを提供する。本明細書で用いられる際には「ミュータシン」は、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）から単離することができ、かつ本明細書に記載される特性により特徴付けられる抗微生物剤を表すために用いられる。これらの特性はＨＰＬＣ−サイズ排除クロマトグラフィーにより決定される約２，５００Ｄａの見かけの分子量、最高１００℃までの熱安定性、約４〜１０のｐＨ範囲に対する耐性、＞８．４の等電点、および例えばＣＨＣｌ₃ のような水不混和性の有機溶媒中での不溶性を含む。用語「〜から単離可能」は本明細書で用いられる際には、本明細書に従ってミュータシンが取得されうる様々な源を記載することを意図する。適切な源は実質的には全てのＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）種であると考えられ、Ｔ８およびＵＡ９６が特に好ましく、そして更にはミュータシンを発現するように工学的に作成された組換え宿主でもある。先の刊行物はＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）および関連する種により産生された幾つかのミュータシンを含む不純な組成物を記載していることが認識されている。しかしながらこれらの「ミュータシン」含有性組成物は、その精製の重要な要因に加え、物理学的および生物学的特性を初めとする幾つかの重要な点で本明細書に記載されるミュータシンとは異なる。最初の不一致分野は「ミュータシン」の推定分子量の特徴にある。Ｐａｒｒｏｔら（１９９０）は、透析により測定した際には約３５００Ｄａ〜＜１２，０００Ｄａの範囲のＭｒを有する４つの「ミュータシン抽出物」を記載している一方で、Ｄｅｌｉｓｌｅ（１９８６）はやはり透析により３５００と６０００Ｄａとの間のMrを有する一つのミュータシンを記載し、そしてＬｏｙｏｌａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ（１９９２）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により６５００Ｄａの分子量を示している。ミュータシンの分野における有意な不一致が見られる別の分野は、検査した試料の相対純度に関連する。粗精製の細菌抽出物もしくは上清がＰｉｎｔｏ−Ａｌｖｅｓ（１９９２）、Ｐａｒｒｏｔ（１９９０）、およびＤｅｌｉｓｌｅ（１９８６）により、「ミュータシン」活性を含むとして記載されている。これらの粗精製調製物は特異的にグラム−陽性細菌の成長を阻害するものの、しかしながらこの活性の原因となる厳密な構成成分（一つもしくは複数）は未知である。Ｌｏｙｏｌａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）から一連のクロマトグラフィー段階を通して幾分精製され、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定する際には６５００ＤａのＭｒを有する「ミュータシン」を示している。しかしながら、この比較的精製されたミュータシンは、アクチノミセスエスピー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｓｐ．）、スタフィロコッカスエスピー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、ラクトバチルスエスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｃｉｌｕｓｓｐ．）、もしくはエシェリキアコリ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に対する殺細菌活性は示さなかった。１０年以上前の「ミュータシン」の最初の記載以来、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）からの精製されたミュータシンは産生、精製、および配列決定がなされないままになっている。ミュータシンの幾つかの主な特徴は報告されてはいるものの、本明細書は液体培地中でのストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）のミュータシンを産生する能力を初めて記載する。生化学的特性の特徴決定を可能にするのに十分な量、および当然のことながら蛋白質配列決定にとっても十分な純度でミュータシンを精製する有利な方法も開示される。用語「精製されたミュータシン」は本明細書で用いられる際には、例えばＴ８およびＵＡ９６のようなＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）から単離することができる蛋白質組成物を意味することが意図され、この場合、ミュータシンは天然に取得することができる状態に比較すると有意な程度、すなわちこの場合には細菌抽出物もしくは成長上清と比較すると、かなりの程度にまで精製される。従って、精製されたミュータシンは更には、天然に存在する環境からは有意に遊離されたミュータシンポリペプチドをも意味する。一般的には「精製された」は、幾つかの非抗微生物性成分を除去する目的で分別に供され、そしてその組成物が実質的には殺細菌もしくは静菌活性を保持する組成物を意味するであろう。この意味では「精製された」は通常はミュータシンが、例えばその組成物中の蛋白質の約９０％もしくはそれを上回る割合を構成するような、その組成物の主要構成成分を形成する組成物を意味する。精製されたミュータシンは典型的には約６０−もしくは８４−倍、すなわち総蛋白質のミリグラム当たり約１１０，０００殺細菌単位（ＢＵ／ｍｇ）、もしくは好ましくは約１１０，０００〜１５０，０００ＢＵ／ｍｇの比活性を持ち、そして最も好ましくは約１５０，０００ＢＵ／ｍｇの比活性を持つような程度にまで精製されるであろう。一層高い純度は通常の精製段階に加え、例えばＨＰＬＣのような方法により得ることができる。本発明の単離された抗細菌性ミュータシンポリペプチドは一般的には相当な殺細菌活性を有することを特徴とする。本明細書で用いられる場合には、用語「相当な殺細菌活性」は、多種多様のアッセイの内のいずれか一つにより測定される、ミュータシンが奏する有意な細菌死滅化を記述する。殺細菌活性は、感受性指標としてＳ．ソルビヌス（Ｓ．ｓｏｒｂｉｎｕｓ）ＯＭＺ１７６もしくはＳ．サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）Ｎｙ１０１を用いるトリプティカーゼソイイーストアガー（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅｓｏｙ−ｙｅａｓｔａｇａｒ）（ＴＳＡＹ）上での遅延型拮抗技術（ｄｅｆｅｒｒｅｄａｎｔａｇｏｎｉｓｍｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により有利に調査および定量されうる（Ｐａｒｒｏｔら、１９９０）。液体培養物中に存在する殺細菌活性の単位（ＢＵ）は、くっきりした縁および１０ｍｍを上回る直径を有する、はっきりした阻害の溶解様領域をもたらす最低力価として記述される。Ｃｈｉｋｉｎｄａｓらは、殺細菌活性単位と本質的に同一である活性の任意の単位（ＡＵ）を記載している。ある一定の態様では精製されたミュータシンは例えばクーマシーブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ）もしくは銀染色により検出されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の優勢なバンドであるものとして特徴付けることができる。最も好ましくは精製されたミュータシンが、検出される量に従い、クーマシーブルーもしくは銀染色のいずれかで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出される唯一のバンドとなる。本発明のミュータシンは、サイズ−排除カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーにより決定される約２，５００Ｄａの見かけのＭｒを有する。これは、カラムクロマトグラフィーの日常的に用いられる技術を用いて決定されうる有用な特定用パラメーターである。しかしながら、高度に精製されたミュータシンは用いられる技術に依存して、微妙に異なる厳密な分子量を有することが見いだされる可能性があり、例えばそれは、ｍ／ｚ値（この場合、ｍ／ｚ値１６２３、１０８３、および８１２についてｚは２、３、もしくは４にそれぞれ等しい）から決定されたＴ８−由来のミュータシンについてのイオンスプレー質量分析により決定される３，２４４．６４±１．１５Ｄａの分子量である（図４を参照されたい）。それに加えミュータシンは、例えばアガープラグ（ａｇａｒｐｌｕｇ）を１００℃で４０分間インキュベートし、そして殺細菌活性を定量することにより測定すると熱安定性である。例えば酢酸、リン酸、もしくはグリシン緩衝液のような適切な０．１Ｍ緩衝液中２４時間、室温で、精製されたミュータシンをインキュベートすることにより測定を行い、そして殺細菌作用について検査すると、４〜１０のｐＨ範囲にわたりミュータシンは安定である。ミュータシンは≧８．４の等電点を有し、そして水性緩衝液中では限られた溶解度を有するが、しかし７０％エタノール、８Ｍ尿素（例えば７０％エタノールもしくは８Ｍ尿素）、およびグアニジン−水溶液中ではよりよく溶解する。ミュータシンは分子当たり以下のアミノ酸組成を有する：Ａｒｇ₂、Ａｓｎ₂、Ｇｌｕ₁、Ｇｌｕ₂、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ₃、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ₃、Ｘａａ₂、Ｙａａ、Ｚａａ（この場合、Ｘａａはランチオニンを表し、Ｙａａはβ−メチルランチオニンを表し、そしてＺａａはジヒドロアミノ酸を表す）。本発明のミュータシンは一定の配列の存在によっても特徴づけうる。例えば、Ｎ−末端配列ＡｓｎＡｒｇＴｒｐＴｒｐＧｌｎＧｌｙＶａｌＶａｌ（配列番号１）を含むことによるか、もしくは内部配列ＭｅｔＡｓｎＸａａＴｒｐＧｌｎＨｉｓ（配列番号２）を含むことによる。液体培養物からのミュータシンの精製を可能にする成長培地の開発が本発明の重要な因子である。イーストエキストラクトおよびダイズトリプティカーゼを補足してある化学的に特定された培地（ｖａｎｄｅｒＲｉｊｎら（１９８０））はミュータシン精製に関する使用についての好ましい培地である。従って用語「ポリペプチドを生産する細菌の培養物を成長させる」が用いられる場合には、これは好ましくはイーストエキストラクトおよびダイズトリプティカーゼを補足してある化学的に特定される培地を含む培地中でその細菌を成長もしくは培養することを意味する。本発明のミュータシンポリペプチドは更には、限外濾過および選択的沈殿を利用する方法により単離することができることで特徴付けうる。一層具体的には、ミュータシンポリペプチドは以下の段階を含む過程により単離されてよく、それらの段階は：そのポリペプチドを産生する細菌の培養物を成長させる段階；その培養物を孔性膜フィルターを通して濾過し、そして通過物（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）を回収する段階；その通過物を連続して限外濾過膜に通す段階；最終限外濾過段階の濾液を回収および保持する段階；保持された濾液を例えば、アセトン、ベンゼン、エーテル、クロロホルム、酢酸エチル、塩化メチレン、四塩化炭素、もしくはクロロホルムのような水−不混和性有機溶媒と混合し、そのことにより沈殿物を生じさせる段階；そのようにして形成された沈殿物を洗浄し、そして例えばグアニジン、グアニジウム、もしくは尿素のようなカオトロピック剤を用いてその沈殿物を可溶化させる段階、である。本発明の最も好ましい方法に従って精製されたミュータシンを調製するためには最初にＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｔ８を補足成長培地内で成長させ、そしてその後に多孔性膜、好ましくは０．４５μｍ直径の多孔性膜を通して不溶性細菌破片を分離する。回収した通過物（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）を更には例えば１００−、１０−、および１−ｋＤａの分子量カットオフの膜を通す連続限外濾過に供する。最終限外濾過の保持された濾液を回収し、そしてその最終濾液を水不混和性有機溶媒と混合することにより沈殿物が形成され、そして溶媒を蒸発させる。水不混和性有機溶媒は好ましくはクロロホルである。その後にその沈殿物を、水、もしくは例えばリン酸緩衝化食塩水などのような水性緩衝液で洗浄する。この沈殿物を、例えばグアニジン、グアニジウム、もしくは尿素のようなカオトロピック剤（８Ｍ尿素が最も好ましい）で可溶化する。溶解させたミュータシン−カオトロピック剤混合物は最終的には２０倍容量の水で沈殿させる。十分に精製されたミュータシンポリペプチドは、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種のメンバーに対する殺細菌活性を示すことにより例示されるようにグラム−陽性細菌に対する殺細菌活性を有する。ポリペプチドは更には、メタノール：水（７：３）からなる溶媒で展開させるＴＬＣ−コーティングさせたシリカゲル上での溶媒に基づく薄層クロマトグラフィーにより精製されてもよい。ポリペプチド含有部分は、ＵＶ、および生物学的感受性アッセイを用いて確認されるミュータシン抗菌活性の存在により検出されうる。好ましい態様では、ミュータシンはストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）細菌の上清もしくは細菌抽出物から精製される。一層好ましい態様ではストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）細菌はＵＡ９６もしくはＴ８株のものである。別の態様ではポリペプチドは、ミュータシンをコードする例えば発現ベクターのような、ＤＮＡを取り込む組換え宿主細胞から精製されてよい。この使用のための好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、ｒｅｃＡである大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が一層好ましい。ミュータシンの精製の程度を定量するための様々な方法は、本開示を照らし合わせれば当業者には知られるようになるであろう。これらには例えば、ある活性分画の比活性を決定すること、すなわちＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による、ある分画内のポリペプチドの相対的純度を評定することが含まれる。ミュータシン分画の純度を評価するための一つの好ましい方法は、その分画の比活性を計算すること、もともとの細菌抽出物の比活性とそれとを比較すること、およびそのようにして、本明細書では「〜倍精製数」として評価される純度の程度を算出することである。量阻害活性（ａｍｏｕｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙ）を表すために用いられる実際の単位は当然のことながら、精製法の後に行うように選択される特定のアッセイ技術に依存する。遅延型拮抗技術に基づくアッセイが好ましい。本明細書に用いられるアッセイにおける活性の一単位は、明確な縁を有し、そして直径１０ｍｍを上回る阻止の溶解−用領域をもたらす活性の最低力価として特定される。しかしながら他のアッセイを用いると、活性の単位の定義は当然のことながら異なるであろう。当該技術分野では一般的に知られるように、比活性を決定するためには総蛋白質のミリグラム当たりの活性の単位数を算出する。その精製過程では、出発物質、すなわち細菌抽出物の比活性は天然の状態におけるミュータシンの比活性を表す。各段階では、ミュータシンの比活性は一般的には先の値以上に増加することが期待され、なぜならミュータシンは天然の状態と比較すると精製されているためである。「倍精製」の使用は有利であり、なぜなら活性もしくは比活性の実際の単位中に存在することがあってよいいずれかの違いにもかかわらず、抗菌性分画の純度をこのようにすれば別のものと比較することができるためである。本発明の抗菌性ミュータシンは好ましくは約１００，０００もしくは１１０，０００ＢＵ／ｍｇの比活性を示すであろうし、そして最高では総蛋白質の約１５０，１８７ＢＵ／ｍｇのレベルにまで精製されうることが企図される。一層好ましくはミュータシンは、出発組成物に関して約６０−倍精製と約８４−倍精製との間であるものとして特徴づけられる。ミュータシンを精製するための最も好ましい方法は濾過および有機溶媒沈殿のものであるが、しかしながら蛋白質精製における使用に適する様々な技術が当業者にはよく知られている。これらは、例えば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、および抗体等での、もしくは熱変性およびその後の遠心分離による沈殿：例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、および親和性クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電収束法；ゲル電気泳動；ならびにそのような技術および他の技術の組み合わせ法を含む。本明細書中これまでに開示される好ましい精製方法は幾つかの段階を含み、そして、実質的に精製されたミュータシンを調製するための本発明者により現在知られる最良の形態を表す。この方法は現在では好ましく、なぜならこの方法は遅延型拮抗により評価されミュータシンの実質的精製をもたらすためであり；その収率は更に進んだ特徴決定および使用に十分である。ミュータシンポリペプチド精製のこの好ましい様式は、本明細書に記載される順での所定の精製段階の実行を必要とする。しかしながら当該技術分野では一般的に知られるように、様々な精製段階を実施する順序は変更されてよい、もしくは所定の段階は省略されてよく、そしてそれでも実質的に精製された抗菌性ミュータシンポリペプチドの調製のための適切な方法がもたらされると考えられる。先に記載されるように、ある一定の態様における使用に好ましいものの、ミュータシンがその最高の精製状態で常に提供されることの一般的必要性は存在しない。実際に、あまり十分には精製されてはいないミュータシンでありながらその天然の状態と比較すると抗菌活性が実質には強化されているミュータシンがある一定の態様では有用性を有するであろうことが企図されている。これらの態様は、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）亜型のための診断検査としてのミュータシンの使用を含む。ミュータシンに対して開発された血清学的試薬も、ミュータシンのサブタイプを迅速に同定および特定するのに用いられてもよい。このような態様における使用のための部分精製されたミュータシンポリペプチド分画は、細菌抽出物を、これまでに記載される一つの段階もしくは複数段階の組み合わせ物に供することにより取得されてよい。この精製手法を用いることで本発明者はＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の２つの株：Ｔ８およびＵＡ９６からミュータシンを産生および精製している。例えば分子量、熱およびｐＨに対する耐性、ならびに水不混和性有機溶媒中での溶解度のようなそれらの基本的特徴は類似しているものの、ミュータシンにおける主要ではない違いがこれら２つの密接に関連する種の間で記載されている。例えばこれらのミュータシンはＴＬＣでは異なる遊走パターンを示す。アミノ末端に相補的な縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドを用いることでミュータシン蛋白質多形性がサザンハイブリダイゼーションパターンで明らかになる。これらの主要でない違いは更には、任意のプライマー−ＰＣＲフィンガープリンティングを用いることでも明らかになる。最終的にはＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｔ８株から取得されたミュータシンは、質量分析および蛋白質配列決定による分子量の決定を可能にする精製法に基づいて処理されることが多かった。自然なこととして、直前にに記載された一般的特性を有するにもかかわらずそのような変異物を有するミュータシン自体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の更に別の組成物は、薬理学的に許容される担体内に分散される実質的に精製されたミュータシンポリペプチドを含む薬剤学的組成物を含む。この混合物は、薬理学的に許容される担体内にミュータシンポリペプチドの治療学的有効量を本質的に含んでなる。これらの担体は賦形剤と共に組み込まれ、そして例えば本明細書に開示される口内洗浄剤、歯磨き剤、同化性食用担体、錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エレキシル剤、ウエファー剤、懸濁剤、およびシロップ剤などの形態で、そして当業者によく知られる手法により用いられてよい。ミュータシンはまた、静脈内、筋肉内、および皮下注射に用いられる例えば懸濁剤のような非経口用輸送のための薬理学的に許容される担体内に組み込まれてもよい。成句「薬理学的に許容される」は、ヒトに投与する際にはアレルギー反応もしくは類似の都合の悪い反応を生じない分子的存在物および組成物を意味する。有効成分としてミュータシンを含む水性組成物の調製は本開示を鑑みれば当業者にはよく理解されるであろう。典型的にはこのような組成物は、液性水剤もしくは懸濁剤のいずれかである注射用剤として調製されてよく；注射前に液体中に含ませる水剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎ）もしくは懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｉｎ）に適する固形形態でも調製することができる。この調製物は乳化させることもできる。水性水剤での非経口投与のためには例えば、その水剤は必要であらば適切に緩衝化されるべきであり、そして液体稀釈剤はまず十分な食塩水もしくはグルコースで等張にするべきである。これらの水性水剤は特に静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に適する。これに関係して、利用することができる滅菌水性培地は本開示を鑑みれば当業者には知られるようになるであろう。例えば、一用量は、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され、そして１０００ｍＬの皮下注入液に添加するか、もしくは注入がもくろまれる部位に注射されるかのいずれかとなるであろう（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ１０３５−１０３８および１５７０−１５８０、を参照されたい）。用量における幾つかの改変は、治療される被検体の症状に依存して必然的に生じるようになるであろう。投与の責任者はいかなる事態であるにせよ、個々の被検体の適切な用量を決定するであろう。今日の蛋白質生産の当業者によりしばしば利用される技術は、その蛋白質のいわゆる「組換え」版を取得すること、組換え細胞内でそれを発現させること、およびそのような細胞から蛋白質を取得することである。これらの技術はＤＮＡライブラリーからの、その蛋白質をコードするＤＮＡ分子の「クローニング」、すなわちＤＮＡの別の部分とは異なる特異的ＤＮＡ分子を取得することに基づく。このことは例えば、ＤＮＡ分子をクローニングすること、もしくはゲノム−様ＤＮＡ分子をクローニングすることにより達成することができる。これらのもののような技術は当然のことながら本発明に従うミュータシンポリペプチドの産生にも適する。このようなクローニング手順の内の最初の段階は、例えば本件ではＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）−由来のライブラリーのような適切なＤＮＡライブラリーのスクリーニングである。スクリーニング手順は、その蛋白質に対する抗体、もしくは活性アッセイを利用する発現スクリーニングプロトコールであってよい。別法ではスクリーニングは、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションか、またはその蛋白質のアミノ酸配列の部分の考慮からか、もしくは関連する蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列から設計されるプライマーを用いるＰＣＲ増幅に基づいてよい。特に適切な別のクローニングアプローチは、クローン化することが所望される構造遺伝子に遺伝子的に関連することが知られる遺伝子、例えばその構造遺伝子と同一のオペロン内に含まれる遺伝子に対するプローブもしくはプライマーの使用である。例えばミュータシンの場合には、ランチオニン抗生物質遺伝子に関連する保存ＡＢＣトランスポーター遺伝子に対するプライマーを用いることが所望されてよい。先に記載される手法の内のいずれかもしくは一つの組み合わせ物により適切なＤＮＡ分子を同定した後には、そのＤＮＡをその後に、当該技術分野で現在知られる多くのベクターの内のいずれか一つの中に挿入し、そしてその蛋白質のいわゆる「組換え」版の発現および産生が指令されるであろう原核生物もしくは真核生物宿主細胞に移す。組換え宿主細胞は、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレビサエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）、ラクトコッキエスピー（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉｓｐ．）、エンテロコッキエスピー（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｓｐ．）、もしくはサルモネラエスピー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐ．）からなる群より選択されてよい。所定の好ましい態様では、組換え宿主細胞はＲｅｃＡ ^-表現型を有するであろう。組換えミュータシンは所定の意味では天然に生産されるミュータシンとは異なってよい。特に例えばグリコシル化およびリン酸化、もしくは脱水、ならびにチオエーテル架橋の転移のような翻訳後の改変の程度は、組換えミュータシンと、例えばＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｔ８もしくはＵＡ９６のような天然の源から精製されるミュータシンポリペプチドとの間では異なってよい。更に別の態様では本開示はミュータシンポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングするための方法を提供する。当業者によく知られるクローニングのための方法を用いることで、本発明の精製されたＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ミュータシンをコードするＤＮＡが単離および精製されてよい。例えば、ペプチド配列（配列番号１および２）に相補的なヌクレオチドを含む縮重オリゴヌクレオチドを設計することにより、ミュータシンをコードするＤＮＡをＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ゲノムライブラリーからクローン化することができる。本発明により開示されるＤＮＡ配列は、本抗生物質をコードし、ｍｕｔＡと称されるＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）配列の調製を可能にする。用語「ｍｕｔＡ」は本明細書で用いられる際にはミュータシン構造遺伝子をコードする遺伝子座を記載することを意味する。これらの態様では適切な長さの核酸プローブが調製される。このようなプローブは典型的には、精製されたミュータシンの特定されるアミノ酸配列の考慮に基づいて調製される。このような核酸プローブがＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ｍｕｔＡ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力により、多種多様な態様における特別な利用法がそれらのプローブに付与される。例えばこれらのプローブは、ある試料、例えば口腔からの唾液試料中のＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）生物体の存在を検出するための多種多様の診断用アッセイにおいて用いられてよい。しかしながら、ミュータシンに関連する類似のポリペプチドもしくは突然変異体ポリペプチドをコードするｍｕｔＡ遺伝子配列の同定および単離を初めとする他の使用も構想される。他の使用は、突然変異種プライマー、すなわち他の遺伝子構築物を調製するためのプライマーの使用を含む。更に別の態様では、本発明のミュータシンをコードするＤＮＡはミュータシンポリペプチドの大量産生および単離を考慮する。これは適切な発現ベクター内にミュータシンポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングすることによってミュータシンポリペプチドの発現を指令することにより達成することができる。このような発現ベクターをその後には、ミュータシン蛋白質を産生することができる宿主細胞内に形質転換させてよい。その後にこのミュータシン蛋白質を、例えば本開示中に提供される手法により精製し、そして生物学的活性形態て利用してよい。生物学的に活性でない組換えミュータシンは、例えば抗−ミュータシン抗体を調製するための免疫原としての利用法を有してもよい。ミュータシンの産生の原因となる遺伝子（一つもしくは複数）を同定するに至る別のアプローチは、ミュータシン構造遺伝子に近接することが知られる遺伝子の位置を決定することである。配列決定がなされたランティバイオティック遺伝子座から、幾つかのプロセシングおよび輸送酵素がランティバイオティックプロデューサー間ではかなり保存されており、そして共通配列の領域を共有することが明らかである。例えば、全ての既知のランティバイオティックプロデューサーは、ミュータシン輸送に関連する蛋白質を作る原因となるいわゆるＡＢＣトランスポーター遺伝子を有する。保存された配列に相補的な一連のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応に用いて介在配列を増幅することができ、この増幅はＡＢＣトランスポーター遺伝子を同定するためのプローブとして用いることができる（ＰＣＲ技術は米国特許第４，６０３，１０２号に記載される）。このＡＢＣトランスポーター遺伝子はこれまでに記載された全ての既知のランティバイオティック遺伝子座の部分であるため、ミュータシンのための構造遺伝子はその付近に存在するはずであり、そしていわゆる「染色体ウォーキング」により容易に同定されるはずである。本発明の方法的態様は、グラム−陽性細菌をミュータシンポリペプチドと接触させ、そしてそのことによりその細菌を死滅化させるための方法を含む。用語「グラム−陽性細菌を接触させる」は本明細書で用いられる場合には実質的に殺細菌性の構成成分を有するミュータシンの量の輸送を包含することを意味する。この「接触」過程は、このことによりミュータシンポリペプチドがその標的細胞と直接並列するようになる過程である。用語「標的細胞」は本明細書で用いられる場合には、本ミュータシンが実質的殺細菌活性を示す細菌細胞である。ミュータシンポリペプチドを、ミュータシン含有性組成物と共に標的細胞に接触させるためには、単にそのポリペプチドもしくは組成物を潜在的細菌標的にインビトロで添加してよい。別法ではミュータシンポリペプチドもしくは組成物の薬理学的に許容される形態の生物学的有効量を、それが生物学的液体内の標的細胞にインビボで接触するであろう動物に投与してよい。この文脈では「接触」は単にその組成物を動物に投与することにより達成される。事実上、いずれかの薬剤学的ポリペプチド製剤を用いてよく、制約されるわけではないがそれには、例えば静脈内、筋肉内、および皮下投与のための非経口投与のための製剤；吸入剤、エアロゾル剤、および噴霧用製剤；例えばクリーム剤、軟膏剤、歯磨き剤、粉末剤、およびゲル剤のような局所使用のためのペプチドの製剤；徐放出用に設計された生物適合性コーティング内に取り込まれた活性ペプチドを含むミセルもしくはリポソーム、および薬剤放出用カプセル中に被包されたポリペプチド；ならびに口腔洗浄剤および他の洗浄剤を含む。他の好ましい態様では、本開示のミュータシン蛋白質を含む薬理学的組成物は虫歯の治療に用いられてよい。この治療は、薬理学的に許容される担体中のミュータシンポリペプチドの治療学的有効量を経口投与することを含む。他の態様ではこのポリペプチドは局所投与される。ミュータシンポリペプチドは、薬理学的に許容される担体中にミュータシンポリペプチドを含む組成物の治療学的有効量を、虫歯を有するもしくは虫歯になりやすい個体に投与することにより虫歯の進展を予防もしくは阻害するのに用いてよい。ミュータシン産生の原因となる遺伝子を口腔内フローラの別のメンバー内に取り込ませ、そして発現させてよい。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の部分を形成し、そして本発明の所定の態様を更に詳しく記述するために含まれる。本発明は、本明細書に記載される具体的な態様の詳細な記述と組み合わせてこれらの図面の内の一つもしくは複数を参照することによりよりよく理解されてよい。図１は、Ｔ８（レーン２）、ＵＡ１４０（レーン３）、およびＵＡ９６（レーン４）の制限長多形である。総ＤＮＡを単離し、そしてＨａｅＩＩＩで切断し、レーン１はラムダ（ｌａｍｂｄａ）／ＨｉｎｄＩＩＩサイズ標準である。図２は、様々な制限エンドヌクレアーゼ（２および３ＨａｅＩＩＩ；４および５ＰｓｔＩ；６および７ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）で切断したＴ８（レーン２、４、６）およびＵＡ９６（レーン３、５、７）のサザンハイブリダイゼーションである。レーン１はラムダ／ＨｉｎｄＩＩＩサイズ標準である。５’末端でビオチニル化したミュータシンＴ８のＮ−末端アミノ酸配列に従って設計した縮重１７量体オリゴヌクレオチドをプローブとして用い、そして増感化学ルミネセンスにより現像した。図３は、ミュータシンＴ８（レーン１）およびミュータシンＵＡ９６（レーン２）のＴＬＣ分析を示す。分離後にはＴＬＣプレートに指示薬染色液を重層し、そして１４時間、嫌気性条件下でインキュベートした。「Ａ」と記した領域はＴ８中の主な活性領域であり（これは更にＭＳにより確認されている）、領域「Ｂ」はＵＡ９６中の活性領域である。図４は、ミュータシンＴ８のイオン噴霧質量分析を示す。記録された多荷イオンは、３，２４４．６４±１．１５ＤａのＭＷ推定値と一致する。図５Ａは、精製されたミュータシンＴ８を１０〜２０％の直線勾配トリシンゲル上で分離したことを示す。１〜１００ｋＤａの範囲内でのトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離物およびバンドをクーマシーブルー染色により検出した。レーン１の試料はローディング用緩衝液と共に４０℃でインキュベートし、そしてレーン２は１００℃でインキュベートし、冷まし、そしてローディングした。図５Ｂは、図５Ａの試料をローディング緩衝液と共に４０℃で３０分間、および１００℃でそれぞれインキュベートし、そして室温にまで冷ましてからゲルの充填を行ったことを示す。生物学的活性は指示薬用染色液としてのＳ．サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）Ｎｙ１０１での重層により検出した。図６は、ミュータシンＩＩｍｕｔ遺伝子座を含む領域の一本鎖ＤＮＡ配列および演鐸されるアミノ酸配列を示す。潜在的リボソーム結合部位（ＲＢＳ）および停止コドンに下線を施してある。ヌクレオチド配列の下にある水平の断続線の矢印は逆方向反復を示す。図７は、ミュータシンＩＩに対する類似物とランティバイオティクのリーダーおよびプロ−ペプチドのアラインメントを示す。保存される残基には下線を施し、そしてプロセシング部位は矢印により示す。共通残基を下段に示す。図８は、遅延型拮抗技術によりアッセイしたミュータシン産生におけるｍｕｔＡおよびｍｕｔＭの挿入不活化の効果を示す。陽性および陰性対照を突然変異体と共にＴＳＢＹアガー内に差し込み、そして２４時間成長させた。熱不活化の後にはそのプレートに、指標用株Ｓ．サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）Ｎｙ１０１を含むソフトアガーを重層した。最上部−陽性対照（Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｔ８）、中段−ｍｕｔＡ破壊（１−３）、第二列目−ｍｕｔＭ破壊（４−７）、最下段−陰性対照（Ｓ．サングイス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）Ｎｙ１０１）。本発明の詳細な記述ランティバイオティクおよび他のバクテリオシン−様物質に関する刊行物は２つの主な主題を支持する。第一には、種が存在するのと同じほど多くの抗生物質が存在するように思える。同一種内でさえあっても幾つかの異なる抗生物質を識別することができる。これらの物質の内の多くのものが類似する特性（表現型）を呈するとしても、それらの遺伝子構成成分（遺伝子型）は異なってよい。第二に、そのようなところまで遺伝子的に特徴決定がなされた全てのランティバイオティック系内においては例外なく、各遺伝子座は連続するコーディング配列として配置される複数の遺伝子からできており、そして多くの場合、総合的調節を受けている。ミュータシン発現に関与する遺伝子およびそれらの産物は、一つのクラスター内に存在するようであり、そして同定および非プロデューサー株へのその系全体の移行を可能にしている。本出願は、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）のヒト由来株からのランチオニン−含有性抗生物質（ランティバイオティク）の単離および特徴決定を記載する。ランティバイオティクは、他のミュータシン−様抗生物質は様々なストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）株に関連するという理解を踏まえ、本明細書では「ミュータシン」として引用される。ランティバイオティクは幾つかの鎖内スルフィド架橋を有し、チオエーテルアミノ酸ランチオニンおよびβ−メチルランチオニンでできている多環式ペプチドである（Ｊｕｎｇ，１９９１）。それに加え、ランティバイオティックは、セリンおよびスレオニン残基の脱水を介して翻訳後に改変を受ける、例えばジデヒドロアラニンおよびジデヒドロアミノブチル酸のようなβ−不飽和アミノ酸を含む（Ｄｏｄｄら、１９９０）。脱水を受けた不飽和セリンもしくはスレオニン残基はそのままの状態で居続けることができるか、もしくは近接するシステインとチオエーテル架橋を形成することができる。恐らく最もよく研究され、そして明らかに最古のものである既知のポリペプチド抗生物質はナイシンであろう（Ｈｕｒｓｔ，１９８１）。ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）により産生され、ナイシンは食品保存料として欧州諸国では広く用いられている。より最近のことではナイシンはビーグル犬における抗−プラーク剤（ａｎｔｉ−ｐｌａｑｕｅａｇｅｎｔ）として検査されている（Ｈｏｗｅｌｌら、１９９３）。ナイシンは、中でも大半の連鎖球菌、ブドウ球菌、Ｃ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）を含むクロストリディウム属、およびミコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含む主にグラム−陽性細菌に対するかなり狭いスペクトラムの活性を示す。ナイシンは大半のグラム−陰性細菌（ナイセリアは例外である）、真菌類、もしくはイーストに対しては効力を示さない（Ｈｕｒｓｔ，１９８１）。独特な環式チオエーテル環構造および小さなサイズのためナイシン分子は極度に熱に安定であり、この特性によりナイシンの食品産業に対する適性が高いものとなっている。例えばトリプシンおよびキモトリプシンのような膵臓酵素に対して感受性を示すものの、しかしながらナイシンは摂取される際には容易に不活化される。ナイシンおよび他のランティバイオティクのタイプＡは細胞膜と相互作用することによりその殺細菌活性を示し、膜のポテンシャル勾配を減少させ、その結果、膜の脱分極、破壊、および破裂をもたらし、そして不可逆的細胞溶解をもたらす（Ｓａｈｌ，１９９１）。この理由のため、ランティバイオティックは殺細菌性となる。高度に荷電するカチオン性ペプチドとしてランティバイオティックの膜活性構成成分は両親媒性アミノ酸組成物に属し、疎水性ドメインと親水性ドメインの両方の中に配置される。タイプＢランティオバイオティクは酵素阻害剤である。それに加え、ランティバイオティクの前にはα−ヘリックス構造として配置され、その両親媒性特性およびエスコート／プロセシング「ハンドル」としての仮想的機能に寄与するリーダー配列が存在する。ナイシンの翻訳後改変、開裂、および輸送に必要な他の遺伝子産物が知られており；それらの位置、遺伝子的決定基、およびそれらの調節の幾つかの側面が最近報告されている（ＫａｌｅｔｔａａｎｄＥｎｔｉａｎ，１９８９；ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒら、１９９３）。ナイシン構造遺伝子のコーディング配列は２および５ｋｂの間程度の一層大きな転写物の部分であり、このことによりナイシン遺伝子はポリシストロン性クラスターの部分であることが示される（Ｓｔｅｅｎ，１９９１）。その２〜５ｋｂの転写物の範囲内のいずれかにおける例えばＴｎ９１６のようなトランスポゾンの挿入によりナイシン遺伝子の不活化がもたらされるように思われ、そしてナイシン陰性表現型がもたらされる。その遺伝子の特徴決定以前にはナイシンは非リボソーマル的に合成されると考えられており、なぜなら中でもランチオニンおよびβ−メチルランチオニンを含む非蛋白質アミノ酸を含むためである。そのＤＮＡ配列から得られたアミノ酸配列を実際のアミノ酸配列と比較した後に完全な理解が引き出された。予想されたセリンとスレオニンの位置はランチオニンおよびβ−メチルランチオニンであり；他の残基は明らかに脱水されており、そのため成熟したナイシン分子は翻訳後改変の結果であることが明らかになり、このことにより他の点では未知であるこれらのプロセシング酵素についての研究の開始が促された。ナイシンクラスターからの遺伝子産物に帰する機能は：ｎｉｓＡ、ナイシンの前駆体をコードする構造遺伝子；ｎｉｓＢ、プロセシングにかかわり、膜に位置する酵素；ｎｉｓＴ、その機能がペプチドの輸送を含むＡＢＣ−トランスロケーター；ｎｉｓＣ、そのポリペプチドの翻訳後改変；ｎｉｓＩ、免疫性に関わるリポ蛋白質；ｎｉｓＰ、膜に位置するセリンプロテアーゼ；およびｎｉｓＲ、ナイシン発現の調節に関わるＤＮＡ結合性蛋白質、を含む（ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒら、１９９３）。ナイシン遺伝子の大半のものに対するアナログはズブチリミン遺伝子座（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９２）、およびエピデルミン遺伝子座（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９２）の範囲内に存在する。Ｅ．ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）からのＢａｃ／Ｈｌｙもランティバイオティクファミリーのメンバーであってよく、なぜならそのＡ因子はその輸送直前にＢａｃ分子を活性化するのみならず、他のＢａｃ−産生細胞からの移入Ｂａｃの蛋白質開裂により「免疫性」因子としても作用することができるプロテアーゼであるためである。Ａ構成成分についてのこの二重の役割は現在では独特なものであるように思われるが、しかし他のランティバイオティクプロデューサーでは共通の主題であることが判明するようになってよい。Ｈｌｙ遺伝子座のポリシストロン性特性は、最近ＢｏｏｔｈとＧｉｌｍｏｒｅ（１９９３）により示されるようにナイシンクラスターを思い起こさせるものである（１９９３）。ランチオニン抗生物質の内の少なくとも幾つかのものの全遺伝子座をひとまとめにして非プロデューサー株に移行することができる。これはナイシン（Ｈｏｒｎら、１９９１）、ズブチリミン（ｓｕｂｔｉｌｉｎ）（ＬｉｕａｎｄＨａｎｓｅｎ、１９９１）、およびエピデルミン（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９２）についても言えることである。事実、プラスミド由来のエピデルミン遺伝子座（１４ｋｂ）が最近、種を越えて発現された（Ａｕｇｕｓｔｉｎら、１９９２）。ナイシンの場合には、移行は自然に生じることは疑いもなく、なぜならコーディングイ配列が大きなプラスミドと染色体部位の両方においてみいだされたためである。ナイシン遺伝子座はスクロース代謝遺伝子座ｓａｃに沿うトランスポゾンＴｎ５３０１（Ｈｏｒｎら、１９９１）の部分であった（Ｔｎ５２７６）。ナイシンとスクロース異化のための遺伝子座との間の関係は興味深い。Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）とミュータシンには平行関係が存在するか否かは、特にスクロースの代謝がミュータンス連鎖球菌における主要毒性因子であることを考慮すると、分からないままである。液体培養物からのミュータシンの精製を可能にする成長培地の開発はこの蛋白質の精製における重要な因子であった。限外濾過および選択的沈殿を利用する追加段階はこの精製過程にとって欠くことができなかった。２，５００のＭｒを有する単一で生物学的に活性な蛋白質は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより測定すると最終産物であった。本精製ミュータシンの他の際立った特徴は、サイズ排除ＨＰＬＣおよびイオン噴霧質量分析により決定される分子量、トリプシン、ｐＨ、および温度に対する感受性、水溶性溶媒中への可溶性、ならびにＴＬＣにおける遊走パターンである。精製されたミュータシンについて見いだされた温度耐性、サイズ、および生物学的活性は、アガープレートにおいてインサイチューで、そして薄層クロマトグラフィーにより測定された他のミュータシンについての以前に報告された特性とは異なっている（Ｐａｒｒｏｔら、１９９０、および表１にまとめてあるとおり）。そのアミノ酸組成および等電点に基づくと、ミュータシンは塩基性蛋白質の特徴を呈する。このことは感受性の高い指示薬染色をゲルに重層することにより検出されるアガーゲル内でのその移動度と一致する。本ポリペプチドはランチオニンを含み、そして関連するアミノ酸β−メチルランチオニンを含んでいそうである確立がかなり高い。この新規のグループＩＩミュータシンはランチオニン−含有性ポリペプチドファミリーの内の一つのメンバーである。グラム−陽性種により産生される他のランチオニン−含有性ペプチドは、ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）からのナイシン、スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からのエピデルミン、およびバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのズブチリミンを含む（Ａｌｌｇａｉｅｒら、１９８５；ＧｒｏｓｓａｎｄＫｉｌｔｚ、１９７３；ＧｒｏｓｓａｎｄＭｏｒｅｌｌ、１９７１）。エドマン（Ｅｄｏｍａｎ）分解により決定されるミュータシンのＮ−末端アミノ酸配列（ＡｓｎＡｒｇＴｒｐＴｒｐＧｌｎＧｌｙＶａｌＶａｌ）（配列番号１）を蛋白質データベース内の既知の配列と比較し、そして独特であることが見いだされた。追加サイクルによってはいずれかのＰＴＨ−アミノ酸誘導体は見いだされなかった。ランチオニンとメチルランチオニンの両方がエドマン（Ｅｄｏｍａｎ）過程での蛋白質からの開裂に適すると予想される。しかしながらそれらはビス−ＰＴＨ誘導体としては検出されず、それは明らかにモノアミノ酸誘導体と比較するとそれらの溶解度が低いためである。ランチオニンもしくはメチルランチオニンに寄与する一つの残基のエドマン（Ｅｄｏｍａｎ）開裂はブランクサイクルをもたらすことが予期されるが、しかし配列決定は連続して継続させるべきである。ミュータシンの追加的改変は更に進んでアミノ酸を除去することができないことを説明してよい。Ｎ−末端のメチオニンが非存在であることにより、ミュータシンが前駆体形態からプロセシングされてくることが示唆され、これは他のランティバイオティクについても報告されている（Ｂｕｃｈｍａｎら、１９８８；Ｋａｌｅｔｔａら、１９８９；ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒら、１９９３）。生物学的機能の等価性改変および変更が本発明のミュータシン組成物の構造において作成されてよく、そしてそれでも似たようなもしくはそうでなければ所望される特徴を有する分子が取得される。例えば、所定のアミノ酸を、例えば、細菌、および免疫系の構成成分などのような構造との相互結合能をはっきりと分かる程度に喪失するさせることなく蛋白質構造内の他のアミノ酸に置換してよい。ある蛋白質の生物学的機能性活性を特定するのはその蛋白質の相互作用能および特性であるため、所定のアミノ酸配列置換を、ある蛋白質配列（もしくは当然のことながら、その根本となるＤＮＡコーディング配列）内で作成することができ、そしてそれにもかかわらず類似もしくは対抗さえする特性（例えば、拮抗的対作動的）を有する蛋白質を作ることができる。様々な変更をミュータシン蛋白質もしくはペプチド（もしくはその根本となるＤＮＡ）が、それらの生物学的有用性もしくは活性を、はっきりと分かる程度に損なうことなく作成されてよい。生物学的機能が等価な蛋白質もしくはペプチドの定義においては固有のことであるが、分子の特定された部分内に作成されてよく、そしてそれでも等価な生物学的活性の許容されるレベルを有する分子をもたらす変更の数には限度が存在するという概念は当業者にはよく知られてもいる。従って生物学的機能が等価なペプチドは本明細書では、所定の、大半ではあるが全てではないアミノ酸が置換されてよいペプチドとして特定される。特に、ミュータシンポリペプチドが問題となる場合には、約１〜３のみ、もしくは一層好ましくは１もしくは２のアミノ酸が所定のペプチド内で変更されてよいことが企図される。当然のことながら異なる置換基を有する複数の別の蛋白質／ペプチドが本発明に従って簡単に作られそして用いられてよい。所定の残基が、ある蛋白質もしくはペプチドの生物学的もしくは構造的特性にとって特に重要であることが示される場合、例えば活性部位内の残基である場合には、そのような残基は一般的には交換されなくてよい。本発明では例えば、この種類の抗生物質に特に特徴的であるランチオニンもしくはβ−メチルランチオニン残基を変更するようには恐らく選択されないであろう。そのような変更を作成する際には、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮されてよい。ある蛋白質に相互作用性生物学的機能を付与する際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性が一般的に当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。一定のアミノ酸を、一層小さめのヒドロパシー指数もしくはスコアを有する別のアミノ酸に置換してよく、そしてそれでも類似の生物学的活性を有する蛋白質がもたらされる。各アミノ酸にはそれぞれの疎水性および荷電特性に基づいて一つのヒドロパシー指数が割り当てられており、それらは；イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）：ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）：およびアルギニン（−４．５）、である。アミノ酸の相対的ヒドロパシー的特性が、得られる蛋白質の二次構造を決定し、そしてそれが次には、基質、レセプター、および例えば細菌のような細胞性実在物を初めとする他の分子とのその蛋白質の相互作用を特定するものと考えられている。アミノ酸は類似のヒドロパシー指数を有する別のアミノ酸により置換されてよく、そしてそれでも生物学的機能の点では等価な蛋白質が取得されることは当該技術分野では知られている。このような変更の場合には、ヒドロパシー指数が−２以内のアミノ酸の置換が好ましく、それが−１以内のものが特に好ましく、そしてそれが−０．５以内のものが更に一層特別に好ましい。類似のアミノ酸の置換も親水性にも基づいて作成され、特にこれは、免疫学的態様における使用のために生物学的機能が等価な蛋白質もしくはペプチドがそのような置換により作成されることが意図される場合である。米国特許第４，５５４，１０１号は、ある蛋白質の最大局所平均親水性はその近接するアミノ酸の親水性により左右され、そしてその免疫原性および抗原性、すなわちその蛋白質の生物学的特性に相関すると記載している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細が記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り振られている；アルギニン（＋０．３）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０＿１）；グルタミン酸（＋３．０＿１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５＿１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（− １．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（− ２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のものと置換することができ、そしてそれでも生物学的に等価でそして特に免疫学的に等価な蛋白質が取得される。このような変更の場合には、親水性値が〜２以内のアミノ酸の置換が好ましく、それが〜１以内のものが特に好ましく、そしてそれが〜０．５以内のものが更に一層特別に好ましい。先に概略が記載されるように、従って、アミノ酸置換は一般的にはアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づき、それは例えばそれら置換基の疎水性、親水性、荷電、およびサイズなどである。既述の特徴の内の様々なものを考慮に入れる例示的置換は当業者にはよく知られており、そしてそれらは；アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；そしてバリン、ロイシン、とイソロイシン、を含む。論議の焦点はアミノ酸変更から生じる機能的に等価なポリペプチドに絞られているものの、これらの変更は、更には遺伝子コードが縮重し、そして２つもしくはそれを上回る数のコドンが同一のアミノ酸をコードしてよいことを考慮した上で、コーディングＤＮＡの変更によりもたらされてよいことが理解されるであろう。エピトープコア領域米国特許第４，５５４，１０１号（Ｈｏｐｐ）は更に、親水性を基にする一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。Ｈｏｐｐに開示される方法を通し、当業者は、本明細書に開示されるミュータシン配列、および本明細書の方法に従うクローニングにより取得される配列のようなアミノ酸配列の範囲内からエピトープを同定することができるであろう。そのようにして同定された配列の領域は「エピトープコア領域」としても引用される。多くの科学的刊行物が、アミノ酸配列の分析からのエピトープの二次構造の予測およびその同定に費やされている（Ｃｈｏｕ＆Ｆａｓｍａｎ，１９７４ａ，ｂ；１９７８ａ，ｂ，１９７９）。米国特許第４，５５４，１０１号におけるＨｏｐｐの教示を補足するためには、所望される場合にはこれらの内のいずれかが用いられてよい。それに加え、蛋白質の抗原性部分およびエピトープコア領域を予想する手助けのためには、コンピュータープログラムを現在では利用することができる。その例は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析に基づくプログラム（Ｊａｍｅｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ１９８８；Ｗｏｌｆら、１９８８）、および更には蛋白質の三次構造予測のための新規のプログラム（Ｆｅｔｒｏｗ＆Ｂｒｙａｎｔ，１９９３）を含む。核酸ハイブリダイゼーション本明細書に開示されるＮ−末端アミノ酸配列（配列番号１）に由来するＤＮＡ配列およびその機能的等価物は、核酸ハイブリダイゼーション態様におけるプローブおよびプライマーとしての特別の利用性を有する。約１０ヌクレオチドと約２０ヌクレオチドとの間のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のためのそのような配列に対応するオリゴヌクレオチド断片についてはそれ自体特別な利用性が見いだされるであろう。別の１０もしくは２０程度のヌクレオチド長の配列を有するオリゴヌクレオチドで、配列番号１および配列番号２におけるアミノ酸配列に対応するものは従って特別な利用性を有する。ミュータシンをコードする配列に特異的にハイブリダイズするそのような核酸プローブの能力により、例えば所定の試料における相補的配列の存在を検出する際などにはそれらは大変有用なものとなるであろう。例えば、ミュータシンをコードする遺伝子を本明細書に開示される相補的ヌクレオチドプローブを用いてクローン化および配列決定してよい。更にはミュータシンのための構造遺伝子を直に取り巻く領域の特徴決定を行って、調節領域、ならびにミュータシンポリペプチドの調節、産生、及びプロセシングに関連する他の遺伝子が同定されてよい。しかしながら、突然変異体種プライマーもしくは他の遺伝子構築物を調製する際の使用のためのプライマーの調製のための配列情報の使用を含む他の使用が構想される。これは、本明細書に記載されるとうり、第二世代のミュータシン産物の調製の際には特に重要となる。本明細書に開示されるアミノ酸配列の考慮から設計される１０、１５、もしくは２０程度のヌクレオチドからなるストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を有する核酸分子は、他の生物体および様々な細菌株におけるミュータシン−様構造遺伝子もしくは調節遺伝子の分析と関連するサザンおよびノザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとしての利用性を有する。断片の合計サイズ、ならびに相補性ストレッチ（一つもしくは複数）のサイズは結局のところ特別な核酸セグメントの意図される使用もしくは適用法に依存するであろう。一般的には一層小さめの断片がそのようなハイブリダイゼーション態様において使用されるようになるであろう。長さが約１０ヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブの使用により、安定かつ選択的の両方である二本鎖分子（ｄｕｐｌｅｘｍｏｌｅｃｕｌｅ）の形成が可能になる。それでも、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、そしてそのことにより、得られる特異的ハイブリッド分子の質および度合いを改善する目的ではストレッチと比較して１０塩基を上回る塩基数の長さ分大きい相補配列を有する分子が一般的には好ましい。一般的には、１５〜２０ヌクレオチドもしくは所望される場合にはもっと長めの遺伝子−相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが好ましいであろう。このような断片は、例えば化学的手法によるその断片の直接合成によるか、一例では米国特許第４，６０３，１０２号のＰＣＲ技術のような核酸再生技術の適用によるか、もしくは組換え産生のための組換えベクター内に選択的配列を組み込ませることにより容易に調製される。従って、本発明のヌクレオチド配列はミュータシン遺伝子もしくはｃＤＮＡの相補的ストレッチと共に二本鎖分子を選択的に形成するそれらの能力について用いられてよい。構想される適用法に依存して、標的配列へのプローブの選択性の度合いを変化させることを達成するために様々な条件のハイブリダイゼーションを利用することが所望されるであろう。高い選択性を必要とする適用法のためには、例えば一例では０．０２Ｍ−０．１５ＭＮａＣｌで５０℃〜７０℃の温度により提供されるもののような比較的低い塩および／または高温条件が選択されるであろうように、ハイブリッドを形成するためには比較的緊縮性の高い条件を利用することが典型的には所望されであろう。このような選択的条件は、プローブと鋳型もしくは標的鎖との間のミスマッチがたとえあるにせよそれをほとんど許容せず、そしてミュータシン遺伝子を単離するのに特に適するであろう。単一特異的プライマーＰＣＲは一つの可能な方法であり；逆ＰＣＲは、あるアミノ酸配列が既知の場合には別の可能な方法となる。当然のことながら、例えば工学的に作成された、すなわち知能的に設計された第二世代のミュータシン産物を例えば部位特異的突然変異誘発により調製することが所望される場合や、または関連する種、もしくは機能的等価物などからミュータシンをコードする配列を同定する方法を模索する場合のような幾つかの適用法のためには、ヘテロ二本鎖の形成を可能にする目的ではあまり緊縮的でないハイブリダイゼーション条件が典型的に必要とされるであろう。これらの条件下では、例えば０．１５Ｍ〜０．９Ｍの塩で２０℃〜５５℃の範囲の温度での条件を利用することが所望されてよい。これにより、ハイブリダイゼーションを制御することに関してはクロス−ハイブリダイゼーション種がハイブリダイゼーション陽性シグナルとして容易に同定され得る。いずれの場合でも、増加量のホルムアミド（これは増加温度と同じ様式でハイブリッド二本鎖を不安定化させるように作用する）の添加により条件を一層緊縮状態にすることができることは一般的に理解されている。従って、ミュータシン−ハイブリダイゼーション条件は、所望される結果に従って容易に操作することができる。所定の態様では、ハイブリダイゼーションを決定するためには例えばラベルのような適切な手法と組み合わせて本発明の核酸配列を利用することが有利であろう。多種多様の適切な指示薬の手法が当該技術分野では知られており、これには検出可能なシグナルを与えることが可能な蛍光、放射活性、酵素、もしくは例えばアビジン／ビオチンのような他のリガンドが含まれる。好ましい態様では、放射活性試薬もしくは他の環境的に好ましくない試薬の代わりに、蛍光ラベル、または例えばウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、もしくはパーオキシダーゼのような酵素タグを利用することが所望される可能性があるであろう。酵素タグの場合には、相補的核酸含有性試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するためにはヒトの目もしくは分光測光法で可視化できる手段を提供するために利用することができる比色指示薬−基質が知られている。一般的には、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダイゼーションにおける試薬として、そして固相を利用する態様での試薬としての両方に有用となろうことが構想される。固相を利用する態様では、検査用ＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）は選択されたマトリックスもしくは表面に吸着、もしくはそうでない場合には付着する。この固定された一本鎖核酸はその後には、所望される条件下での選択されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに供される。選択された条件は、必要とされる特別な基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の源、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに依存する）に基づく特別な条件に依存するであろう。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためのハイブリダイズさせた表面の洗浄の後には、特異的ハイブリダイゼーションをラベルの手法により検出もしくは定量さえする。長めのＤＮＡはミュータシンおよびミュータシンペプチドの組換え産生における特別な利用法があることが見いだされることがしばしばであろう。本発明の核酸セグメントはコーディング配列自体の長さには関係なく、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的制限酵素部位、多重クローニング部位、および他のコーディングセグメントなどのような他のＤＮＡ配列と組み合わせ、その結果それぞれの全長はかなり異なってよい。ほぼ全ての長さのミュータシンをコードする核酸断片もしくはミュータシンペプチドをコードする核酸断片が利用されてよく、全長は意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の容易さにより制限されることが好ましい。例えば、長さが最高１０，０００塩基対である核酸断片が本発明に従って調製されてよく、５，０００もしくは３，０００のセグメントが好ましく、そして約１，０００塩基対の長さのセグメントが特に好ましい。先に論議されるように、本発明は配列番号１〜２の特別な核酸およびアミノ酸配列には限定されないことが理解されるであろう。従って、本発明に従って調製されるＤＮＡセグメントは変異アミノ酸配列を有する生物学的機能の上で等価な蛋白質もしくはペプチドをもコードしてよい。このような配列は、核酸配列および従ってコードされる蛋白質内で天然に生じることが知られているコドン重複および機能の等価性の結果として生じてよい。別法では、第二世代のミュータシン変異物を含むミュータシン蛋白質もしくはペプチドは組換えＤＮＡ技術の適用を通して作成されてよく、その組換えＤＮＡ技術では蛋白質構造における変化は、交換されるアミノ酸の特性の考慮に基づいて工学的に作成される。ミュータシン遺伝子をコードするＤＮＡセグメントは組換え宿主細胞内に導入され、そしてミュータシン蛋白質もしくはペプチドを発現させるために利用されてよい。別法では、遺伝子工学技術の適用を通して、選択されたミュータシン遺伝子の小部分（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）もしくは誘導体が利用されてよい。同様に、例えば、得られる蛋白質の抗生物質作用に改善を導入するため、もしくは分子レベルでの構造−機能関係を調査する目的でそのような突然変異体を検査するためには、コーディング配列を変化させるために部位特異的突然変異誘発の適用を通して、本発明のＤＮＡセグメントを工学的に作成し直してよい。所望される場合には、例えばミュータシンコーディング領域が、例えば免疫検出目的のための所望される機能を有する他の蛋白質もしくはペプチドと同一の発現ユニット内で整列される融合ペプチドが調製されてよい（例えば、酵素ラベルコーディング領域）。薬剤学的組成物および製剤開示されるミュータシンを含む薬剤学的組成物は、例えば、不活性稀釈剤と共に、もしくは同化性食用担体と共に経口的に投与されてよいか、あるいはそれらは硬ゼラチンカプセルもしくは軟ゼラチンカプセル内に被包されてよいか、あるいはそれらは錠剤に圧縮されてよいか、または治療食の食品と共に直接取り込まれてよい。本明細書に用いられる場合には「薬剤学的に許容される担体」は、いずれかおよび全ての溶剤、分散用媒質、コーティング剤、抗生物質および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。薬剤学的活性物質のためのこのような媒質および作用試薬の使用は当該技術分野でよく知られている。いずれかの通常の媒質もしくは作用試薬が有効成分と不適合である限りを除外して、治療学的組成物におけるその使用が企図される。補足的有効成分もその組成物内に取り込まれ得る。経口予防薬のためには、そのペプチドは賦形剤と共に取り込まれ、そして摂取不可能な口腔洗浄剤および歯磨き剤の形態で用いられてよい。口腔洗浄剤は、例えば硼酸ナトリウム溶液（ドーベル溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））のような適切な溶剤内に、必要とされる量の有効成分を取り込ませて調製されてよい。別法では有効成分は、硼酸ナトリウム、グリセリン、および重炭酸カリウムを含む消毒洗浄液内に取り込ませてよい。更には有効成分を：ゲル、ペースト、粉末、およびスラリーを初めとする歯磨き剤内に分散させてよい。有効成分は治療学的有効量で、水、結合剤、研磨剤、矯味・矯臭剤、発泡剤、および保水剤を含んでよいペースト錠歯磨き剤に添加されてよい。活性化合物は、例えば不活性稀釈剤と共に、もしくは同化性食用担体と共に経口投与されてよく、あるいはそれらは硬ゼラチンカプセルもしくは軟ゼラチンカプセル内に被包されてよいか、あるいはそれらは錠剤に圧縮されてよいか、または治療食の食品と共に直接取り込まれてよい。経口治療投与のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、そして摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エレキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、およびウエファー剤などの形態で用いられてよい。このような組成物および調製物は少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージは当然のことながら変化してよく、そして都合よくは約２〜約６０％の単位の重量の間であってよい。そのような治療学的に有用な組成物内の活性化合物の量は適切な用量をもたらす。錠剤、トローチ剤、ピル剤、およびカプセル剤なども以下のものを含んでよく：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモのスターチ、およびアルギン酸などのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ならびに例えばスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンのような甘味料が添加されてよく、あるいは例えばペパーミンント、冬緑油、もしくはチェリーフレーバーのような矯味・矯臭剤が添加されてよい。単位用量形態がカプセル剤である場合には、それは先の種類の物質に加え、液体担体を含んでよい。他の様々な物質がコーティング剤として存在してよく、あるいは別の方法でその用量単位の物理的形態を改変するための他の様々な物質が存在してよい。例えば、錠剤、ピル剤、もしくはカプセル剤はシェラック、糖、もしくはその両方でコーティングされてよい。エレキシル剤のシロップは、活性化合物、甘味料としてのスクロース、および保存料としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、例えばチェリーもしくはオレンジフレーバーのような染料および矯味・矯臭剤を含んでよい。当然のことながら、いずれかの用量単位形態を調製する際に用いられるいずれかの物質は薬剤学的に純粋であり、かつ利用される量では実質的に無毒性であるべきである。それに加え、活性化合物は徐放性調製物および製剤内へと取り込まれてよい。活性化合物は更には、例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下注射用に調剤されるように、非経口投与されてよい。遊離塩基もしくは薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、例えばヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油状物中で調製することができる。通常の保存および使用条件下ではこれらの調製物は、微生物の成長を妨げるために保存料を含む。注射用使用に適する薬剤学的形態は、滅菌水剤もしくは分散剤、および滅菌注射用水剤もしくは分散剤の即時調製のための滅菌粉末剤を含む。全ての場合においてその形態は滅菌されなければならず、そして容易な注射針通過性が存在する程度にまで流動的である必要がある。その形態は製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして例えば細菌および真菌類のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（一例ではグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む溶剤もしくは分散用媒質であり得る。適切な流動性は、例えば一例ではレシチンのようなコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤により成し遂げることができる。多くの場合において、例えば、糖もしくは塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用試薬の、その組成物中での使用により成し遂げることができる。滅菌注射用水剤は、必要である場合には先に列挙された様々な他の成分と共に適切な溶剤中に、必要とされる量の活性化合物を取り込ませ、その後に滅菌濾過することにより調製される。一般的には分散剤は、様々な滅菌有効成分を、基本的な分散用媒質および先に列挙されるものの内の必要とされる他の成分を含む滅菌賦形剤内に取り込ませることにより調製される。滅菌注射用水剤の調製のための滅菌粉末剤の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらの技術により有効成分に、追加的な所望される成分を予め滅菌濾過した溶液として添加してある粉末剤がもたらされる。以下の実施例は本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下に続く実施例中に開示される技術は本発明の実施の際によく機能させるための本発明者により発見された技術であり、そしてそのためその実施のための好ましい形態を構成することが当業者により理解されるべきである。しかしながら本開示を鑑みれば、開示される特別な態様においては多くの変更物を作成することができ、そしてそれでも本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様もしくは類似する結果を取得することができることを当業者は理解すべきである。実施例１ミュータシン(mutacin)の精製補充された液体培地中でのミュータシン産生ミュータンス連鎖球菌の培養は、液体培養物からのミュータシンの回収での重要な段階であった。改良された結果を酵母抽出物およびダイズトリプティカーゼ(trypticase)で補充された化学的合成培地で得た。タンパク質性抗生物質を、ナイシン(nisin)の単離処置で使用されたもの（セヴァグ(Sevag)ら、1938）に類似の様式のクロロホルム抽出により単離した。これはむしろ驚くべきことであった。なぜならナイシンポリペプチドの一次配列は非常に異なる（カレッタ(K aletta)ら、1989）からである。実施例１でのように得られたミュータシンタンパク質を精製し、そしてその組成および特性を決定した。細菌株、プラスミドおよび培地使用された細菌株およびプラスミドを表２に示す。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)Ｔ８およびＵＡ９６はグループIIのミュータシン（ＢａｃＮ^II+）を作り出す。タイプＡのランティビオティック(lantibio tic)（ミュータシンIIポリペプチドはこの群に最も類似である）およびそれらを産生する細菌種を表３に示す。液体培養物からミュータシンを単離する目的上、産生体(producer)を酵母抽出物（ＹＥ；ディフコ(Difco)、メリーランド州コッキースヴィル）およびトリプティカーゼダイズ培地（ＴＳＢ；ディフコ(Difco)）で補足された化学的合成培地（ＣＤＭ；(40)）中で成長させた。予備的活性アッセは、３％ＹＥで補充されたＣＤＭおよびＴＳＢの１：１混合物（ｖ／ｖ）が液体培養物からのミュータシンの至適の回収をもたらしたことを示した。全ての株を、30％グリセロールを含むトッド・ヒューイット(Todd-Hewitt)培地中で−70℃で凍結して保存した。Ｔｎ９１６含有株は、テトラサイクリン（５mg/ml）で補充されたトッド・ヒューイット(Todd-Hewitt)アガー上で成長させた。ミュータシンアッセイミュータシンの産生を、感受性の指標としてＳ．ソブリヌス(S．sobrinus)ＯＭＺ１７６、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)１０４４９もしくはサングイス連鎖球菌(S．sanguis)Ｎｙ１０１を使用して、トリプティカーゼダイズ−酵母アガー（ＴＳＡＹ）上で遅延拮抗作用技術により検出した（パロット(Parrot)ら、1990）。液体培養物中に存在するミュータシンを、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中のミュータシンの２倍希釈物25mlを、記述されたように、指標株で覆われたＴＳＡＹの表面上にスポットすることにより定量した。スポットを１時間乾燥させ、その後プレートを嫌気的に24時間インキュベーションした。明瞭な縁を有する阻止帯を生じる最低力価を１バクテリオシン単位（ BU）と定義した。ミュータシンの精製株Ｔ８もしくはＵＡ９６の一夜培養物10ミリリットルを使用して、３％ＹＥ培地で補充されたＣＤＭおよびＳＢＴの２１に接種し、そして２Ｌフラスコ中で攪拌なしに48時間嫌気的にインキュベーションした。培養物をその後、以下のような一連の濾過および限外濾過の段階にかけた。すなわち１）細胞を最初に0.45mm 膜を用いて培地から除去した；２）濾液をその後、それぞれ100、10および１kDa の分子量カットオフをもつ一連の限外濾過膜（ミニタン(Minitan)、ミリポア(Mi llipore)、マサチューセッツ州ベッドフォード）を通過させた。等しい体積のクロロホルムを１kDaの保持物に添加した。水層とクロロホルム層との間で形成された乳濁液を乾燥しかつＰＢＳで洗浄した。タンパク質を８Ｍ尿素中で可溶化し、そして20体積の水の添加により沈殿させた。表４は、単離の多様な段階での精製処置の間の比活性、収率、精製度および総活性を示す。ミュータシンの最終調製物は84倍以上精製され、かつ、90％以上純粋（アミノ酸分析を基礎として）であった。実施例２ミュータシンの特徴づけ至適化された培地中に産生されたミュータシンは10kDaの限外濾過物および１k Daの保持物中に回収され、10,000と1,000との間のＭ_rを示した。ミュータシンのさらなる特徴づけをＨＰＬＣにより成し遂げた（ミラー(Miller)ら、1991）。ＨＰＬＣのサンプルを、0.5Mグアニジン、50mMトリス塩酸、pH7.0に溶解し、そして縦列に配置されたバイオシル(Bio-Sil)ＳＥＣ１２５カラム（バイオラッドラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)、ニューヨーク州メルヴィル）でクロマトグラフィー分離した。カラム流出物を220nmでモニターし、そして溶出時間を標準品のペプチドマーカーの組の溶出時間と比較した。精製されたミュータシンは、標準品タンパク質の溶出パターンと比較した場合に、約2,500のＭ_rをもつ単一ピークを示した。ｐＨ安定性およびトリプシンに対する感受性精製されたミュータシンをｐＨ４〜11の範囲の多様な0.1M緩衝液（酢酸ナトリウムｐＨ４〜６；リン酸ナトリウムｐＨ７〜８；グリシン−水酸化ナトリウムｐＨ８〜11）と混合した。室温での１もしくは24時間のインキュベーション後、残余のミュータシン活性を上述されたスポット試験を使用してアッセイした。ｐＨ11でのインキュベーション後のミュータシンの残余活性は約50％活性に低下した。トリプシン（シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)、ミズーリ州セントルイス）に対する感受性を、製造元の推奨に従って50mlの50mMリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ7.5中の精製されたミュータシン（4096BU）を室温でトリプシン（２mg）とともにインキュベーションすることにより測定した。サンプルを多様な時間間隔で残余のミュータシン活性について分析した。ミュータシンはトリプシンに感受性であった。このプロテアーゼとの10分のインキュベーション後にはサンプル中の活性は検出されなかった。トリプシンを含まない対照サンプルは同一条件下でそれらの完全な活性を保持した。ミュータシンは、80℃で30分間のインキュベーション後の残余活性、および負荷緩衝液中で 100℃でインキュベーションすることにより分析されるように熱安定性であった。アミノ酸分析および配列決定精製されたミュータシンを６N塩酸中で加水分解し、そして結果として生じるアミノ酸を疎水性蛍光試薬（ミラー(Miller)ら、1990）でのカラム前誘導体化後に逆相ＨＰＬＣにより分析した。ランチオニン(lanth ionine)（シグマケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)、ミズーリ州セントルイス）を、普遍的アミノ酸に加えて標準的アッセイに包含した。脱塩されたミュータシンの配列決定を、気相微小配列決定システム（モデルＰＩ２０９０Ｅ、ポートンインストゥルメントインク(Porton Instrument Inc.)、カリフォルニア州タルザナ）での自動化エドマン分解により行った。このシステムはオンラインＰＴＨアミノ酸分析機を装備した。タンパク質データベース（非冗長(n on-redundant)スイスプロット(Swiss Prot)+ＰＩＲ＋ジェンペプト(Gen Pept)＋ＧＰアップデイト(GPUpdate)）中の既知の配列とのミュータシンのＮ末端アミノ酸配列の比較を、ウィスコンシンジェネティクスコンピュータグループ(G enetics Computer Group)プログラム(1991)を使用して行った。ミュータシンの配列決定ミュータシンペプチドの配列決定は以下のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）すなわちＡｓｎＡｒｇＴｒｐＴｒｐＧｌｎＧｌｙＶａｌＶａｌを示した。付加的な配列は後に続く周期で検出されなかった。タンパク質データベース中の既知のアミノ酸配列との得られたＮ末端配列の比較は、何らかの意味のある相同性を示すことを失敗した。ミュータシンのトリプシン消化からの断片の配列決定はＮ末端を確かめ、そしてまた以下のような追加の内部アミノ酸配列（配列番号２）すなわちＮ−ＭｅｔＡｓｎＸＴｒｐＧｌｎＨｉｓＶａｌ、ここでＸはランチオニンもしくはβ−メチルランチオニン残基の存在と矛盾しない空白の周期を表す、の決定も可能にした。アミノ酸組成ミュータシンのアミノ酸組成を上に示した。分析に使用された方法はトリプトファンの検出を可能にしなかった。２個の独特のピークが分析で明らかであった。クロマトグラフフィーでの位置は、ランチオニンおよびβ−メチルランチオニンからのそれらの潜在的派生を示した。ピークの一方を、その後、標準的試薬で誘導体化された真正のランチオニンの溶出位置との比較によりランチオニンと同定した。他方のピークのクロマトグラフィーでの位置はβ−メチルランチオニンとしてのその同定と矛盾しなかった。なぜなら、後者のアミノ酸はランチオニンよりわずかにより疎水性であるとみられたからである。生物学的活性ミュータシンは、表５に示される、また、トリプティカーゼダイズ−酵母アガープレート上での遅延拮抗作用アッセイにより測定されるように、数種の微生物に対する強い生物学的活性を表した。生物学的活性は、指標株での重塁(overlay ing)薄層クロマトグラフィーもしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってもまた測定しうる。薄層クロマトグラフィーミュータシンＴ８を、ＵＶ指示薬を含むＴＬＣ被覆シリカゲル(TLC-coated Si licagel)を使用する溶媒を基礎とする薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってもまた精製した。クロマトグラフィーを展開するのに使用された溶媒は７：３メタノール・水の混合物を含む溶媒であった。ポリペプチド部分は、ＵＶ、および図３に示されるような生物学的活性アッセイを使用して確認される抗細菌活性の存在により検出しうる。質量分析法イオンスプレー質量分光学もしくは質量分析法を、示されたように粗細菌抽出物および精製されたミュータシンで実施した（図４は精製された調製物を示す）。イオンスプレー質量ヒストグラムは、1083および812のｍ／ｚに有意のピークを伴い1623で最高のｍ／ｚ値を示し、それぞれ２、３および４のｚ値に対応する。精製されたミュータシンＴ８の分子量は従っておよそ3,245と算出される。部分的ＭＳ−ＭＳ配列分析は、エドマン配列決定により見出されたＮ末端配列と相互に関連した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動本発明で精製されたミュータシンの純度をさらに定量するため、β−メルカプトエタノールもしくはジチオスレイトールのような還元剤の非存在下でのＳＤＳ／ＰＡＧＥにより決定されるような見かけの分子量を測定した。2500ダルトンのおよその分子量が、クマシーブルー染色により可視化されるような図５Ａに立証されるようなβ−メルカプトエタノールの存在下でのＳＤＳ／ＰＡＧＥにより決定されるように観察されたようであった。精製されたミュータシンＴ８を10〜20 ％直線濃度勾配トリシン(tricin)ゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてクマシーブルー染色により検出した。生物学的活性を、指標株としてサングイス連鎖球菌(S．sanguis)Ｎｙ１０１での重塁により検出した（図５Ｂ）。しかしながら、ポリペプチドの移動はＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件（カパルディ(C apaldi)ら、1977）および異なる分粒(sizing)カラムで変動し得ることが当業者により一般に理解される。異なる電気泳動およびクロマトグラフィーの条件下では、上で引用された分子量の割り当てが変動しうる。ポリペプチドのあるものは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの分析で通常使用されるようなクマシーブリリアントブルー染色もしくは銀染色の処置の検出限界より下の量で存在しうることがさらに理解されることができる。本発明の慣例の実務に必要でないとは言え、他の検出技術が成長因子内に存在するポリペプチドのそれぞれの可視化で有利に使用されうる。酵素的に、放射標識で、金でもしくは蛍光的に標識された二次抗体を使用するウェスタンブロッティングのような免疫学的に基礎とする技術は、この点でとりわけ使用すべきであると考えられる。ミュータシン活性の検出の代替手段は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離されたミュータシンのようなサンプルを指標株サングイス連鎖球菌(S．sanguis)Ｎｙ１０１で覆うこと、インキュベーション、および阻止帯の測定である。実施例３ミュータシンの分子クローニング本発明に開示されるＤＮＡ配列は、適切な長さの核酸プローブを調製することによる、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の遺伝子配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有する比較的短いＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）配列の調製を見込む。こうしたプローブは、典型的には、ミュータシン遺伝子の定義された遺伝子配列の考慮を基礎として調製されるか、もしくはこの遺伝子の隣接する領域から生じられる。ＤＮＡ分析およびオリゴヌクレオチドプローブの設計ＤＮＡの単離、制限エンドヌクレアーゼ分析、サザン法および形質転換での使用に適する条件は、コーフィールド(Caufield)ら(1990B)に記述され、また、例えばサンブルック(Sambrook，J.)らMolecularCloni ng:A Laboratory Manualに記述されるようである。縮重(degenerate)オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを、単離されたミュータシンのＮ末端アミノ酸配列から普遍的コドン使用頻度を使用して設計する。プローブを、以下の改変を伴い、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（サンブルック(Sambrook)ら、1989）を使用して［ γ−³²Ｐ］ＡＴＰで５’末端で放射標識する。50pmolのオリゴヌクレオチド、10 mCiの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰおよび11単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを反応緩衝液中で１時間インキュベーションし、標識されたプローブをセファデックスＧ−２５スピンカラム上で精製する。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）をハイブリダイゼーションに使用しそして洗浄する（アウスベル(Ausubel) ら、1992）。ナイロン膜上にブロットされた制限酵素切断断片を、15mlの溶液Ａ（5mlの50×デンハルト(Denhardt)溶液、10mg/mlの変性サケ精子ＤＮＡ0.5mlおよび44.5mlの５MＴＭＡＣ）中で42℃で一夜プレハイブリダイゼーションする。標識されたプローブを15mlの溶液Ａと混合し、そして54℃で1.5時間ハイブリダイゼーションする。膜を室温で10分間２回（２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ）、室温で10分間１回（50mMトリス／塩酸、ｐＨ8.0、3ＭＴＭＡＣ、２mMＥＤＴＡ、0.1 ％ＳＤＳ）洗浄し、そして40℃で15分間最終洗浄(50mMトリス／塩酸、ｐＨ8.0、３MＴＭＡＣ、２mMＥＤＴＡ、0.1％ＳＤＳ）する。膜をＸ線フィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、コダック(Kodak)）に−70℃で１〜３日間さらす。あるいは、５’ビオチニル化されたプローブおよびＥＣＬ検出系を使用しうる。こうした分析を図２に示す。オリゴヌクレオチドプローブの設計ミュータシンのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）の知識からＤＮＡプローブを設計しうる。以下の表（表６）は、核酸のコードの縮重、および、それによりアミノ酸配列を基礎とした縮重ヌクレオチド配列が推定されうる手段を記述するために包含される。ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ末端標識縮重オリゴヌクレオチドプローブを使用して、Ｔｎ９１６不活性化ミュータシン陰性（Ｂａｃ^-）突然変異体（コーフィールド(Caufield)ら、1990B）のライブラリーおよびそれらの多様な二次クローン(subclone)中のミュータシンの構造遺伝子についてスクリーニングした。本発明に従ってある利点を提供するためには、ハイブリダイゼーションもしくはアッセイに使用される好ましい核酸配列は、当該アミノ酸配列（配列番号１および２）に相補的な縮重配列の最低10〜40程度のヌクレオチドストレッチ(strech)に相補的である配列を包含する。長さが最低10ヌクレオチドの大きさが、その断片が安定および選択的の双方である二本鎖分子を形成するのに十分な長さのものであることができることを保証するのを助ける。とは言え、長さが10塩基以上の伸長にわたる相補的配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させ、そしてそれにより、得られる特定のハイブリッド分子の質および程度を向上させるために一般に好ましい。かように、望ましい場合は15〜20ヌクレオチドもしくはより長い遺伝子の相補的伸長さえ有する核酸分子を設計することを一般に好むことができる。こうしたヌクレオチド断片は、例えば化学的手段により断片を直接合成すること、米国特許第4,603,102号のＰＣＲ技術のような核酸再生産技術の応用、もしくは組換え体産生のために組換えベクターに選択された配列を導入することにより容易に調製しうる。従って、縮重ヌクレオチド配列は、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)のｍｕｔＡ遺伝子セグメントの相補的伸長と二本鎖分子を選択的に形成するそれらの能力に重要である。予見される応用に依存して、標的配列に対するプローブの選択性の変動する程度を達成するために、変動するハイブリダイゼーション条件を使用することを所望することができる。高度の選択性を必要とする応用のためには、ハイブリッドを形成するための比較的緊縮の条件、すなわち高緊縮の条件を使用することを典型的に所望することができる。例えば、50〜70℃の温度で0.02モル濃度ないし0.15モル濃度の塩化ナトリウムにより提供されるような、比較的低い塩濃度および／もしくは高温の条件を選択することができる。これらの条件はとりわけ選択的であり、かつ、あればプローブと鋳型もしくは標的鎖との間のわずかなミスマッチを許容する。もちろん、例えば根底にある鋳型にハイブリダイゼーションされる突然変異体のプライマー鎖を使用して突然変異体を調製することを所望するいくつかの応用のためには、より低緊縮のハイブリダイゼーション条件がヘテロ二本鎖の形成を可能にするために求められる。これらの状況では、20から55℃までの範囲にわたる温度で0.15モル濃度ないし0.9モル濃度の塩のような条件を使用することを所望するとみられる。いずれの場合でも、条件が、上昇された温度と同一の様式でハイブリッド複合体を不安定化するようはたらくホルムアミドの増大する量の添加によりより緊縮にされ得ることが一般に真価を認められる。かように、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され得、そして従って一般に所望の結果に依存して選択すべき方法となることができる。実施例４ミュータシン遺伝子座の単離および特徴づけミュータシン遺伝子に接近した遺伝子の特徴づけは、ミュータシンの翻訳後修飾、切断および輸出(export)に関与する過程の理解において重要である。遺伝子のこのクラスターの同定は、おそらくポリペプチドのフォールディングでの変化によりプロセシングおよびミュータシンの特性の改変に影響を及ぼすように遺伝子配列の特異的に指向された操作を可能にする。Ｔｎ９１６およびミュータシンの精製を介する逆遺伝的アプローチ(reverse genetic approach)を使用する挿入不活性化の組み合わせは、縮重(degenerativ e)オリゴヌクレオチドを構築するための道を開いた。これはコスミドライブラリーのスクリ-ニングを可能にすることができる。ランティビオティックとしてのミュータシンの同定は、十分に研究された抗菌性ナイシンを包含するその一族の他の構成員に対する構造的および物理的類似性を示唆する。ナイシンと同様、ミュータシンは遺伝子でコードされかつリボソームで転写される。他方、ポリペプチド抗生物質バシトラシンは多酵素複合体により合成される。ミュータシンの翻訳後プロセシングおよび輸出の詳細は今までのところ未同定であるとは言え、必要とされる遺伝子はランティビオティックの構造遺伝子に隣接してクラスター化されるようである。ミュータシンとナイシンとの間の関係についての付加的な間接的支持は、ｂａｃ−１遺伝子座の上流のミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の２３ＳリボソームＲＮＡの核(nucleus)が、ナイシンの生産体ラクトコッカスラクチス(Lactococcus lactis)の２３Ｓのｒｒｎ遺伝子座との90％の水準の顕著な相同性を共有するという観察結果に由来する。 90％の類似性は、ｒＲＮＡは原核生物で高度に保存され、また、連鎖球菌およびラクトコッカス(lactococci)は系統発生的に関連するため、おそらく驚くべきことではない。Ｌ．ラクチス(L．lactis)ＤＬ１１のｒｒｎ遺伝子座は染色体の20 ％内にクラスター化されることが既知であるとは言え、その位置もしくはｒｒｎ遺伝子とナイシンとの間の関係は報告されていないが、しかしｂａｃ−１遺伝子座がミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＵＡ９６の５個のｒｒｎ遺伝子座の１個から５kb未満離れているために興味深いとみられる。さらに、別のＴｎ９１６− ｂａｃ−２コスミドＵＡ３３は２３Ｓのｒｒｎ遺伝子座の別の１個を含有する。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の本来の能力、およびＬ．ラクチス(L．lac tis)とミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の２３Ｓのｒｒｎ遺伝子座の間の90％相同性を基礎とすれば、ミュータシン遺伝子クラスターに隣接するｒｒｎ遺伝子座内の相同的組換えを介したラクトコックス属(Lactococcus)からミュータンス連鎖球菌(S．mutans)への先祖のランティビオティック遺伝子の機械的導入を予見し得る。ミュータシンの遺伝子座に隣接するトランスポゾン要素が見出されない場合（ラクトコックスの場合に真実であるように）、これが、ミュータンス連鎖球菌(S.mutans)のグループIIおよびグループＩの本来能力のある株もまたミュータシンを作る理由を説明しうる。開発のための別の領域は、大腸菌(E．coli)のコリシンおよびｆ１ファージレセプターでなされた（ジェイクス(Jakes)ら、1988）ものに類似の様式で表面抗原認識タンパク質のような別の遺伝子にミュータシン遺伝子を融合させることによるそれの遺伝子操作である。その致死的ドメインをミュータンス連鎖球菌(S． mutans)の認識部分；例えばモノクローナル抗体に融合させることにより、ミュータシンの特異性をさらに指図しうる。ミュータシンの構造遺伝子に隣接するもしくはこれを補足する遺伝子これは、現在クローニングされたｍｕｔＡ配列と直接隣接するＤＮＡの部分を同定するための「染色体歩行」を介して成し遂げられることができる。基礎的な制限酵素切断地図作成および二次クローニングがＤＮＡ配列決定に先行することができる。この最初の地図作成および配列決定は、ミュータシンのプロセシングおよび発現に関連したミュータシン遺伝子クラスター中のコーディング領域の輪郭を描くはずである。加えて、存在する６種の独特のミュータシン陰性のＴｎ９１６不活性化突然変異体のそれぞれは、パルスフィールドゲル電気泳動およびＴｎ９１６由来のプローブを使用するサザンハイブリダイゼーションによりＵＡ９６の染色体上に位置づけられることができる。ゲノムの明確に定義された部分（約20〜30kb）内にクラスター化されるミュータシン陰性のＴｎ９１６挿入物がより詳細な分析のため最初に選択されることができる。ｍｕｔＡに隣接する遺伝子の配列決定配列決定はＰＣＲ産物ならびに二次クローンから直接行うことができる。なぜなら、例えばＴｎ９１６挿入物の場合は、Ｔｎ９１６の末端に対する外側に向けられたプライマーを使用することができ、かようにＬＲ末端の冗長のためのプライマーの二量体形成を避ける。逆ＰＣＲ、もしくはプライマーがＴｎ９１６挿入物（＜２kb）の近位の制限酵素切断部位の端に付加される連結仲介性ＰＣＲ（オフマン(Ochman)ら、1993）を包含するいくつかの技術がＰＣＲ反応を開始するのに使用されうる。ＤＮＡ配列決定は、プライマーもしくはｄＡＴＰのいずれかのビオチンでの非同位元素標識を使用することができる。化学発光検出は、光タイプ(phototype) 検出キット（ニューイングランドバイオラブス(New England Biolabs)、マサチューセッツ州ビヴァリー）を用いて成し遂げる。チェインターミネーター配列決定を、製造元の説明書に従い、シークェナーゼ(Sequenase)バージョン2.0（ユナイテッドステイツバイオケミカル(United State Biochemical)、オハイオ州クリーヴランド）を使用することにより実施する。プラスミドＤＮＡを、塩化セシウム濃度勾配、または、あるいは迅速調製法、例えばインスタプレップ(Insta-prep)、５プライム→ ３プライム(5 Prime->3 Prime)、コロラド州ボルダー、もしくはキア(QIA)プレップスピンプラスミドキット（キアジーン(Quiagene)、カリフォルニア州チャッツワース）のいずれかにより単離する。二本鎖ＤＮＡの変性のためには、アルカリ変性、次いで、37℃で30分間のプライマーとのアニーリングが好ましく使用される一方、熱変性が代替である。直接ブロッティングシークェンサー（ホファーサイエンティフィクインストゥルメンツ(Hoefer Scientific Instruments) 、カリフォルニア州サンフランシスコ）は、オリゴヌクレオチド（配列決定反応からの300ないし500塩基をもつ）の解明およびナイロン膜上へのブロッティングを単一の段階で可能にすることができる。放射活性［γ−³⁵Ｓ］ＡＴＰ配列決定は配列を解明するのに使用される普遍的代替であり、ここででビオチン側鎖の立体障害が読み違いを引き起こしうる。ＤＮＡデータベース中の既知の配列との得られた配列の比較は、配列を詳細な分析のためウィスコンシンジェネティクスコンピュータグループ（ＧＣＧ）プログラムに転送する前に、制限酵素切断部位の地図を作成し、かつ、オーバーラップ、二次構造および他の情報を探すために最初に評価される（ＤＮＡストライダー(DNA Strider)ソフトウェア）。使用されうる他のソフトウェアプログラムは、ジーンコンストラクションキット(Gene Construction Kit)（テクストコ(Textco)；ニューハンプシャー州ウエストレバノン）およびオリゴ(Oligo)4.0（ナショナルバイオサイエンスインク(National Bioscience，Inc.)、メーン州プリマス）を包含する。ｍｕｔＡ遺伝子座に隣接するＤＮＡの比較的大きな部分を同定するためのいくつかの戦略が存在する。染色体歩行の一般的方法は、オーバーラップ配列に関してコスミドもしくはλのライブラリーをスクリーニングすることにより容易に成し遂げられる。染色体ＤＮＡからの適切な大きさの断片の断片ライブラリーは、コスミドクローニング技術を使用して容易に作成し得る。ベクターｐＪＣ７４もしくはｐＪＨ７９中でのＥｃｏＲＩでの部分的消化およびコスミドクローニングもまた使用することができるが；しかしながら、コスミドのパッケージングはしばしば非隣接断片を組込み得るため注意が払われなくてはならず、また、非隣接部分の結合を制限するために末端の細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）処理を使用することを願いうる。挿入物ＤＮＡを含有する大腸菌(E.coli)のライブラリーをその後スクリーニングしうる。隣接する断片を、記述されたように二次クローニングしかつ分析することができる。退屈なサザンハイブリダイゼーションを避ける、隣接するＤＮＡの部分を見出す代替方法は、耐性についてのその表現型がミュータンス連鎖球菌(S.mutans)および大腸菌(E．coli)双方で発現される抗生物質カセットの挿入を必要とする。マーカーのいくつかの候補が存在し（ｃａｔ、ｅｒｍ、ｔｅｔ、ｋａｎ）（表７を参照）、それらは自殺ベクター(suici de vector)内でｍｕｔＡの近位に挿入され得、そしてミュータンス連鎖球菌(S． mutans)に返され得る。ｍｕｔＡに対する隣接する部分から構築されるライブラリーを、その後、コスミドの所望のクローンを同定するプローブへのハイブリダイゼーションの代わりに抗生物質耐性について検査し得る。なぜなら、ノックアウト構築物は個々の遺伝子の特徴づけの一部として企図されるからである。その場合は、この目的上、ＥｃｏＲＩ切断部位に接近した読み取り枠（ＯＲＦ）でＡＢカセットを使用しうる。ＵＡ９６染色体上のＴｎ９１６挿入物の地図作成は、それらが別個のクラスター内に見出されるかどうか、もしくは挿入物のいくつかが推定のｍｕｔＡクラスター以外の位置にあるかどうかをみることを可能にすることができる。残存するＴｎ９１６挿入物が定義されたクラスター内に存するかどうかは未知であり、そしてＤＮＡの非常に大きな部分のパルスフィールド分析を使用することにより決定されることができる。Ｔｎ９１６挿入物のいくつかはクラスター化されないことができる。しかしながら、これはミュータシン関連遺伝子がクラスター化されないことを意味しない。一般的ハウスキーピング遺伝子内の挿入物は、未だミュータシン産生に直接関連しないＢａｃ^-表現型を生じうる。前に述べられたように、全ての既知のランティビオティックは隣接する遺伝子クラスターの産物である。ＰＦＧＥ（パルスフィールドゲル電気泳動）の技術は記述されており、そして、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＧＳ−５の染色体の地図作成の一部としてチューダー(Tudor)および共同研究者により使用されている（チューダー(Tudor) ら 1990）。アガロースブロック中のミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の細胞のインサイチュ溶解がＳｍａＩ、ＮｏｔＩおよび他のような希少塩基切断体(cut ter)での制限された消化に先行する。ほぼ同一のプロトコールが、ラクチス(lac tis)の染色体の地図作成でデイヴィッドソン(Davidson)ら(1991)により、およびスティーン(Steen)とハンセン(Hansen)(1991)により使用されている。ＣＨＥＦ −ＤＲＩＩＩ直交フィールド装置（バイオラッド(Bio-Rad)）を、サザンブロッティングで転写を助長するパターンのその優れた発生のため使用しうる。陽圧ブロッティングを介するニトロセルロース膜への制限酵素切断断片の転写後、断片に対するストラタジーン(Stratagene)ハイブリダイゼーションを、ビオチン標識されたもしくは³²Ｐ−ＡＴＰ^-Ｔｎ９１６のいずれかのプローブを用いて成し遂げる。各Ｂａｃ−突然変異体からの染色体ＤＮＡは、陰性対照（ＵＡ９６）、および陽性対照となることができるＴｎ９１６プローブと一緒に包含することができる。この一連の実験から獲得される情報は、ＵＡ９６の染色体上のＴｎ９１６挿入物突然変異体のそれぞれのおよその位置を示すことができる。より高頻度の切断体での染色体ＤＮＡの二重消化は、コスミドのクローニングのためのいくつかのＴｎ９１６挿入物を含有する断片を生じることを期待される。ｍｕｔＡでのＰＦＧＥ断片のプロービングは、他のＴｎ９１６挿入物に関してその遺伝子座の位置を推定することができる。Ｂａｃ^-のＴｎ９１６挿入物がミュータシン遺伝子座以外の位置に見出されることが期待される。ミュータシン遺伝子の相補物全体を同定することの失敗が存在する場合は、ＰＣＲおよびＴｎ９１６に対するプライマーを同定に使用することができる。ミュータシン産生に関連した遺伝子産物の構造／機能これは、遺伝子クラスターの配列決定、読み取り枠および他の特徴についての配列分析、そして存在するデータバンクを既知の遺伝子との相同性について検索することにより行う。目的の遺伝子を、その後、インビトロでの転写／翻訳分析、大腸菌(E．coli)でのミニ／マキシ細胞(mini/maxi cell)発現を使用して遺伝子産物の決定に適切な発現ベクター上に二次クローニングするか、または、ミュータシン分子の多様な前駆体もしくは成分に対し以前に作成されたポリクローナル抗体の一団と反応させる。ミュータシン産生における各遺伝子の役割を、その後、一連の欠失もしくはマーカー挿入ノックアウトのいずれかの突然変異を構築することにより検査して、非発現の影響を決定することができる。適切な発現ベクター内の目的の遺伝子のコーディング領域全体の以前に構築された二次クローンを、その後、遺伝子量および調節がこうした分析を予め排除しうることに留意しつつ相補性アッセイに使用することができる。ここでの最終目標の一は、ミュータシンクラスター全体が、ナイシン、エピデルミンおよびズブチリシンのランティビオティックのクラスターでなされているように非ミュータシン産生株にひとまとめにして導入されうるように、ミュータシン発現のための最小のコーディング領域の同定を開始することである。遺伝子の推定のミュータシン関連クラスターが同定されれば、もしくは、クラスターが存在しない場合は、コスミド中の個々にクローニングされたＴｎ９１６含有挿入物の収集物、それらの役割にある個々の遺伝子、およびミュータシンの産生を検査する。最初に、ＤＮＡセグメントの多様な部分を、見込みを減らすために突然変異を誘発することができる。一方法は、多様な制限酵素切断部位にＡＢカセットを挿入すること、もしくは、単一交差組込みのためにＤＮＡのより小さな断片を含有するノックアウトもしくは自殺プラスミド、例えばｐＶＡ８９１、ｐＭＣＬ１９（マクリナ(Macrina)ら 1983；ナカノ(Nakano)とクラミツ(Kura mitsu)、1992）で形質転換することである。このアプローチに伴う危険は、プラスミド挿入物の上流の挿入が遺伝子の下流の極性効果をもたらしうることである。他のランティビオティックの多シストロンおよび協調の調節を考えれば、極性は、とりわけｐＶＡ８９１のような転写ターミネーターを含有するプラスミドで期待される。いずれにしても、このアプローチは、個々の遺伝子の役割に関する手掛かりに加えて全体としてミュータシン遺伝子座に関する情報につながることが期待される。ＤＮＡ部分の配列決定を、ミュータシン産生に関連する部分に関する予備情報を基礎として開始する。配列分析は、読み取り枠、ノックアウト突然変異の構築に有用な制限酵素切断部位、他の既知の配列での溶血性、および多くの他の属性と一緒のアミノ酸配列を示すことができる。個々のＴｎ９１６挿入物に隣接するＤＮＡの特徴づけは、最初に、Ｔｎ９１６の右および左端に対する外側に向けられたプライマーならびにいずれかの連結されたプライマーを使用するＰＣＲ、もしくは、Ｔｎ９１６挿入物が隣接する部分内で切断され、そしてその後外側に向けられたプライマーが連結された制限酵素切断部位の結合部を越える産物を生じるように連結される場合は逆ＰＣＲにより実施され得る。ここでの制限は期待されるＰＣＲ産物の長さであるとみられる。長さが５kbに接近するＰＣＲ断片は「ロングＰＣＲ(long PCR)」により産生され得る。２kb未満のより小さな断片はより容易に生じられる。ＰＣＲ断片はクローニングされそして配列決定され得るか、もしくは直接配列決定され得る。ＰＣＲ断片はゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用され得、そしてある形態の逆ＰＣＲは染色体歩行に使用される。ｍＲＮＡのノーザンブロット分析およびプライマー伸長を、ミュータシンオペロンの性質（単および／もしくは多シストロン性、推定のプロモーター、ｍＲＮＡの転写後プロセシング、転写物の安定性、転写物（ミュータシン）の細胞周期における時期）を決定するのに使用することができる。全細胞ｍＲＮＡを野生型ＵＡ９６から得ることができ、そして電気泳動によりアガロースゲル上で大きさにより分離することができる。ｍｕｔＡ遺伝子座および５’から作成されそして³²Ｐ−ＡＴＰで標識される相補的オリゴヌクレオチドプローブを、最初にｍｕｔＡ遺伝子を含有する転写物を同定するのに使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、新たな転写物を確認もしくは同定するためにＯＲＦ内の他の配列に対してもまた作成することができる。野生型ＵＡ９６の細胞を異なる成長期と一致する異なる時間点で収穫することができ、また、全細胞ＲＮＡをミュータシン転写物の存在についてノーザンブロットにより分析することができる。標識プローブとのハイブリダイゼーションの強度は、ミュータシン転写物が作成される相を示すことができる。ミュータシンオペロンの転写物の長さをノーザンブロットから推定することができる。プロモーターの推定の位置を、放射標識されたｍｕｔＡオリゴヌクレオチドプローブ、および、ジデオキシ終止反応を使用する慣習的配列決定もしくはＰＣＲプライマーエクステンション配列決定と結合された逆転写酵素テープを使用するプライマーエクステンションにより成し遂げることができる。この技術は転写物の長さならびにその開始部位を生じることができる。この情報から、推定のプロモーターを配列分析から推定しうる。ミュータシン遺伝子産物をコードするＤＮＡの役割を、欠失もしくは挿入の不活性化配列を導入することにより検査することができる。使用される方法は、ある程度、挿入中の欠失のような便宜的な制限酵素切断部位の存在、および成功裏に作成された突然変異の評価の容易さに依存することができる；すなわち、小さな欠失の検出は選択することが表現型的に困難でありうる一方、抗生物質耐性カセットを使用する挿入は選択かつ確認するのがより容易でありうる。しかしながら、不活性化するＤＮＡの大きな部分を挿入することは、介在配列ならびに下流の遺伝子に影響を及ぼしうる他の要素を導入することに留意することができる。ズブチリシン遺伝子座の分析にハンセン(Hansen)（チュング(C hung)とハンセン(Hansen)、1992；リウ(Liu)とハンセン(Hansen)、1992）により使用されたものに類似のアプローチが、欠失および抗生物質の挿入物の組み合わせを使用して使用されうる。基本的には、この技術は、二次クローンが構築されることができかつ抗生物質カセット（ＡＢカセット）が挿入されうるかもしくは部分が欠失されうるように、目的のＤＮＡ配列および遺伝子を知ることを必要とする。突然変異は、Ａｐ^r遺伝子を含まないのみのｐＵＣ１９のような大腸菌(E ．coli)レプリコンプラスミドで実施される。ｐ１５ａ由来のレプリコンおよびｐＡＣＹＣ１８４からのＣｍ^r、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)でのその成功した使用と結合されたｐＵＣ１８ないしｐＵＣ１９からのマルチクローニング部位およびＡＬＣ１−ｚを有する、最近構築された大腸菌(E．coli)の中程度コピー数プラスミドｐＭＣＬ１８および１９（ナカノ(Nakano)とクラミツ(Kuramitsu )、1992）は、この構築物を、ノックアウト突然変異体の作成および飽和突然変異誘発に理想的なベクター送達カセットにする。ｐＭＣＬ１８および１９に対する代替は黄金標準のｐＶＡ８９１（マクリナ(Macrina)ら、1993）を包含し、これもまたｐＡＣＹＣ１８４の部分を含有する。ｐＶＡ８９１はＭＣＳを欠き、そしてこれゆえに組換えプラスミドを構築するための制限された制限酵素切断部位を有する。しかしながら、それにより制限酵素のテイル(tails)が適合性のために事実上いかなる部位にも付加され得るＰＣＲの使用は、この制限をより小さい問題にする。別のベクターはｐＫＩＭ２であり、これはＭＣＳおよび非β−ラクタマーゼ遺伝子を有する。抗生物質カセットは容易に入手可能であり、また、それらの完全な配列が既知である。表７を参照。ＡＢカセットの重要な特徴は、それらが大腸菌(E．coli) およびミュータンス連鎖球菌(S．mutans)双方での翻訳および活性に適切なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびコドンを含有することである。潜在的ＡＢカセットはクロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を包含する。複数のＡＢカセットの利用可能性を有することは、相補性分析および相同的組換えの確認における選択のためのいくつかの異なるマーカーの使用を可能にすることができる。これらのＡＢカセットのいくつかは、若干の成功を伴い多様なランティビオティックを不活性化するのに使用されている（例えばリウ(Liu)とハンセン(Hansen)、1992）。各ＡＢカセットの配列を知れば、配列内の実際上いかなる部位とも適合性の末端を工作し得る。また、適切なリボソーム結合部位、終止コドンもしくは発現を高める他の成分を組込み得る。下流の遺伝子に対する可能な極性効果を予防するために転写ターミネーターを排除することが好ましいことができる。ＡＢカセット挿入ミュータンスを構築するために企図された段階は以下のようである。すなわち、１．目的の遺伝子全体もしくは一部をｐＭＣＬ１９のマルチクローニング部位にクローニングする。２．ＡＢカセットと適合性のクローニングされた挿入物内の、可能である場合は唯一の、制限酵素切断部位の位置を推定する。なぜなら、ＡＢカセットはしばしば大腸菌(E．coli)のベクターのＭＣＳとともに含有されるからである。複数の制限酵素切断部位が利用可能である。普遍的な制限酵素切断部位が見出され得ない場合は、ＡＢカセットを、いずれかの既知の制限酵素切断部位と矛盾しない末尾を含有するプライマーを用いるＰＣＲにより増幅し得る。ＰＣＲ産物をその後単離し得かつ挿入物ＤＮＡ中に連結し得る。成功した組換え体をＡＢカセットの発現により選択し得る。３．挿入物すなわち大腸菌(E．coli)からのＡＢカセットを含有するプラスミドを直鎖状にし、そしてミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＵＡ９６中に形質転換する。相同的組換え、二重交差交換、次いでＡＢの表現型の発現により、ＡＢ挿入物を有する形質転換体を容易に選択し得る（レシピエントあたり10^-6〜10^-7個の形質転換体）。これらをミュータシンの表現型についてスクリーニングし得る。サザンブロットが各挿入物の大きさおよび位置を確認し得る。この基本的アプローチを使用して一連の挿入不活性化突然変異体を構築し得る。加えて、相補性分析のためクローニングされた遺伝子全体を、その配列がｃｉｓに作用するかそれともｔｒａｎｓに作用する可溶性の遺伝子産物であるのかを決定するのに使用することができる。ここでの欠点は、目的の遺伝子が適切な遺伝子量および調節と一緒になって適切な隣接するプロモーターおよびターミネーターを有しなければならないことである。既知のランティビオティックに関連する大部分の遺伝子がそれら自身のプロモーターもしくは転写ターミネーターを有しないことを考えれば、これらは、相補性が予期され得る前に、挿入された連鎖球菌属(Streptococci)のレプリコンに付加されることが必要であることができるとみられる。これは、これらのコーディング配列を有するＰＣＲプライマーを使用することによりなされ得る。相補性は、ベクターｐＶＡ８３８および完全な12kbのｂａｃ−１のＥｃｏＲＩ挿入物を使用して達成されている。各ミュータシン関連遺伝子からの遺伝子産物の組成および大きさがＤＮＡ配列分析から保護され得るとは言え、この遺伝子産物が翻訳後修飾を受けることがナイシンタンパク質との類似性により可能である。従って、インビトロの転写および翻訳の系を使用することができる。この系は直接的であり、インビトロで合成されたタンパク質のマーカーとして³⁵Ｓ−メチオニンもしくはいくつかの他のアミノ酸の１種を使用する。プラスミドＤＮＡおよび直鎖状のＤＮＡ双方の断片が、タンパク質が存在しないもしくはプロセシングされる例でこの系で翻訳され得る。³Ｈ−ロイシンもまた標識を達成するのに使用されうる。反応混合物は、少量もしくは低分子量のタンパク質が期待される場合にはＳＤＳでの処理に先立ち５％ＴＣＡを用いて濃縮し得る。サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離することができ、また、標識されたタンパク質はオートラジオグラフィーにより可視化しうる。このインビトロの方法は単純であり、また、ミニもしくはマキシ細胞系(mini or maxi cell system)より少ない時間もしくは調製を必要とする。また、遺伝子産物はインビトロで発現され、遺伝子産物の致死性もしくは細胞の記憶を伴う問題、およびミュータシンを産生する細胞に対する損傷を少なくする。この転写− 翻訳系はｐＰＣ３１３からの遺伝子産物を検査するのに成功裏に使用されており、従って、少なくともいくつかのミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の遺伝子がこの系で発現されることが明らかである。このアッセイからの結果は、とりわけミュータシン遺伝子が翻訳後にプロセシングされる場合は遺伝子産物の大きさに関して決定的でないかも知れないことに注目することが重要である。翻訳後のプロセシングおよび修飾が予期される。従って、遺伝子産物の比較を、必要なプロセシング酵素を有する連鎖球菌属(Streptococci)の系でのものと行うことができる。ミニもしくはマキシ細胞は遺伝子産物の分析に同様に使用し得る。インビトロで作成されたタンパク質もしくはペプチドをミュータシン産生体によりインシトゥで作成されたものと比較し得る。ポリクローナル抗体を、ウェスタンイムノブロット分析により確認されたポリアクリルアミドゲルから切断されたペプチドもしくはタンパク質に対し作成し得、その後、その後の実験でミュータシンのプロセシングの各遺伝子産物の局在性を同定するのに使用し得る。このアプローチは、ラクトコックスラクチス(Lactococcus lactis)の膜内のｎｉｓＰおよびｎｉｓＲ遺伝子産物の位置を推定するのに成功裏に使用されている（ファン・デル・メール(van der Meer)ら 1993）。多様な細胞画分を変性および非変性双方のポリアクリルアミドゲルの別個のレーンで泳動し得、そして特異的抗血清に対するそれらの反応を観察し得る（ウェスタンブロット）。上の情報は、ミュータシン遺伝子座の非産生体へのひとまとめにしての導入に最小限必要なコーディング配列を定義することを可能にすることができる。ナイシン、エピデミシンおよびズブチリシンの遺伝子座のひとまとめにしての導入が成し遂げられている。前に論考されたように、ＵＡ１３０、ＵＡ１５９およびＧＳ５を包含する、ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)のいくつかの能力のある非ミュータシン産生株が利用可能である。能力のあるグループＩのミュータシンＩ株がミュータシンII株に形質転換され得るかどうかもまた決定されることができる。種のもとでのミュータシン遺伝子座の導入は、とりわけサングイス連鎖球菌(S．sang uis)のような口腔連鎖球菌属(Streptococci)がミュータシンを産生するように変換され得る場合は目的のものとなるとみられる。こうした構築物は、口腔からミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の定着を排除することが可能な、生存可能なエフェクター株(effector strain)を構成しうる。サングイス連鎖球菌(S．sanguis )は９ヶ月で初期体(infant)を定着することが示されている一方、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)は約24ヶ月で定着させる。ミュータシン遺伝子座のプラスミドで運ばれるもしくは染色体の挿入物は、構築物を宿主に導入する能力を考えれば成し遂げられ得る。ミュータシンの遺伝子量および調節は、その構築物が新規宿主中でどのように送達されかつ持続されるとみられるかの決定における一要因であるとみられる。口腔および非口腔の連鎖球菌属(Streptococci)の多くを形質転換するための電気穿孔技術が存在する。例えば、Genetics and Molecular B iology of Streptcocci，Lactococci and Enterococci）1991、ＡＳＭを参照。実施例５抗ミュータシン抗体の産生別の局面において、本発明は本発明のミュータシンポリペプチドと免疫反応性である抗体を企図する。抗体はポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体であり得る。抗体を調製しかつ特徴づけするための手段は当該技術分野で公知である（例えば、Antibodies“A Laboratory Manual ”、ハウエル(E．Howell)とレーン(D．Lane)、コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Sprin g Harbor Laboratory)、1988を参照）。簡潔には、ポリクローナル抗体を、本発明のポリペプチドを含む免疫原で動物を免疫すること、そしてその免疫された動物から抗血清を収集することにより調製する。広範な動物種が抗血清の産生に使用され得る。典型的には、抗血清の産生に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターもしくはモルモットである。ウサギの比較的大きな血液量のため、ウサギはポリクローナル抗体の産生のための好ましい選択である。本発明のミュータシンに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体は慣習的免疫技術を使用して調製することができ、それは当業者に一般に既知であることができるようである。ミュータシンの抗原エピトープを含有する組成物を使用してウサギもしくはマウスのような１種もしくはそれ以上の実験動物を免疫し得、これらはその後、精製されたミュータシンポリペプチドに対する特異的抗体を産生することを続けることができる。ポリクローナル抗血清は、抗体発生のための時間を与えた後に、単に動物から採血しそして全血から血清サンプルを調製することにより得ることができる。モノクローナル抗体を得るためには、最初に、抗原性のミュータシンポリペプチド組成物で実験動物、しばしば好ましくはマウスを免疫することもまたできる。その後、抗体発生を可能にするのに十分な時間の期間の後に、動物から牌もしくはリンパ細胞集団を得ることができる。牌もしくはリンパ細胞をその後、ヒトもしくはマウスの骨髄腫系統のような細胞系と融合させて抗体分泌ハイブリドーマを産生し得る。これらのハイブリドーマを単離して個々のクローンを得ることができ、これをその後、本発明のミュータシンポリペプチドに対する抗体の産生についてスクリ− ニングし得る。免疫後、脾細胞を取り出し、そして、標準的融合プロトコール（例えば、The Cold Spring Harbor Manual for Hybridoma Developmentを参照）を使用してプラスマ細胞腫細胞と融合させて、ミュータシンに対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生させる。選択された抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法のような標準的技術を使用して同定する。モノクローナル抗体の調製およそ３月齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバントとホモジェナイズされたマウスあたり10ないし50mgの精製されたミュータシンポリペプチドで腹腔内に免疫する（第０日）。このマウスに、不完全フロイントアジュバントと混合された抗原の10ないし14日ごとに２ないし５回の連続腹腔内注入を与える。最後の注入のおよそ１ヶ月後にリン酸緩衝生理的食塩水中の抗原の追加免疫接種を尾静脈中に静脈内に与える。追加免疫注入の５ないし７日後に、免疫されたマウスの尾から少量の血液を取り出し、そして酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりミュータシンに対する循環抗体の存在について試験する。部分的に精製された抗原に対する循環抗体の合理的な力価を生じるマウスを殺し、そしてそれらの脾を細胞融合のため無菌的に取り出すことができる。ハイブリダイゼーションに使用すべきであることが提案されるマウス骨髄腫細胞系は、８−アザグアニン耐性マウスのマウス骨髄腫ＳＰ２／０非産生体細胞系である。ＳＰ２／０細胞系は８−アザグアニン耐性について選択されており、そしてヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含有する培地中で生き残らない。細胞を記述されたように（チャン(Chan)ら、1987）融合する。過剰免疫されたマウスから得られた免疫脾細胞（細胞10⁸個）および８−アザグアニン耐性ＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞（細胞10⁷個）を、3 7％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（分子量500〜600、Ｍ．Ａ．バイオプロダクツインク(M.A．Bioproducts，Inc.)）を使用して融合する。融合された細胞をＳＰ２／０細胞により条件を整えられた成長培地中で２日間維持し、そしてその後ＨＡＴを含有する成長培地（選択培地）中、５もしくは６個の96穴マイクロタイタープレート中で培養し、そして間接的ＥＬＩＳＡにより２週の終わりに抗体産生についてスクリーニングする。スクリーニングのため、Ｔ８もしくはＵＡ９６のミュータンス連鎖球菌(Strep tococcus mutans)株から得られた精製されたミュータシンもしくは部分的に精製されたミュータシンを標的抗原として使用し、そして非産生細菌を対照として使用する。標的抗原（ウェルあたり50ng/50μｌ）を、炭酸緩衝液ｐＨ8.8中４℃で一夜インキュベーションすることにより96穴マイクロタイタープレートの底に固定しうる。選択培地中で成長する脾細胞−骨髄腫（ハイブリドーマ）細胞を増殖するウェルからの培養培地を、固定された抗原と反応する分泌抗体についてアッセイしうる。クローニングされたハイブリドーマ細胞クローンにより産生された免疫グロブリン（１種もしくは複数）のアイソタイプもまた、商業的アイソタイプ化(isotyping)キットを使用してＥＬＩＳＡにより決定しうる。ｍＡｂの特異性を、ＥＬＩＳＡにより検査されかつウェスタンブロット分析により確認されるような、多様な抗原とのそれらの反応性により決定しうる。ｍＡｂを特徴づけした後に、それらをマウス腹水の形態で産生させることができ、精製することができ、そして、ミュータシン産生を検出するため、ミュータシンの作用を阻害するため、ウエスタンブロッティング分析、免疫沈降、ミュータシン産生連鎖球菌属(Streptococci)の診断的同定もしくはミュータシンの精製に使用することができる。このアッセイは、再現性のある便宜的かつ迅速なアッセイ法であることが提案される。ハイブリドーマのクローンをその後液体培地中で培養し得、そして培養上清を精製して抗ミュータシン特異的モノクローナル抗体を提供し得る。本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法のような標準的免疫化学的処置、ならびにミュータシンのエピトープに特異的な抗体を利用しうる処置において有用な応用を見出すことができる。加えて、特定のミュータシンに特異的なモノクローナル抗体は他の有用な応用で利用されうる。例えば、免疫吸着プロトコールでのそれらの使用は、他の種もしくはその変異体からの天然のもしくは組換えのミュータシンの精製で有用でありうる。一般に、ミュータシンポリペプチド抗原に対するポリおよびモノクローナル双方の抗体は多様な態様で使用されうる。例えば、それらは他のミュータシンもしくは関連タンパク質をコードするｃＤＮＡもしくは遺伝子を得るための抗体クローニングプロトコールで使用されうる。それらはまた、細胞もしくは動物での連鎖球菌属の(Streptococcal)感染およびミュータシン産生の影響を分析するための阻害研究でも使用されうる。抗ミュータシン抗体はまた、多様な細胞事象の間の細胞内ミュータシンの分布を分析するための、例えば都合のよい成長条件の存在もしくは非存在の間のミュータシンポリペプチドの産生および分布を測定するための免疫位置推定(immunolocalization)研究でも有用であることができる。こうした抗体のとりわけ有用な応用は、例えば抗体アフィニティーカラムを使用する天然のもしくは組換えのミュータシンの精製においてである。全てのこうした免疫学的技術の操作は本発明の開示に照らして当業者に既知であることができる。実施例６そのＤＮＡのコーディング配列を介してミュータシン分子を修飾して抗菌もしくは物理的特性を高めるミュータンス連鎖球菌(S．mutans)のミュータシンポリペプチドの変異体の調製方法は部位特異的突然変異誘発である。この技術は、個々のペプチド、または根底にあるＤＮＡの特異的突然変異誘発により2.5kDaのタンパク質の配列から生じる生物学的に機能的同等のタンパク質もしくはペプチドの調製で有用である。この技術は、さらに、配列の変動を調製しかつ試験する、例えばそのＤＮＡ中に１個もしくはそれ以上のヌクレオチド配列の変化を導入することにより前述の考慮の１個もしくはそれ以上を組込む、準備のできた能力を提供する。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに横断されている欠失結合部の双方の側で安定な二本鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列の複雑さの一次配列を提供するのに十分な隣接ヌクレオチドを使用することにより、突然変異体の産生を可能にする。典型的には、長さが約17〜25ヌクレオチドのプライマーが好ましく、配列の結合部の双方の側の約５〜10残基が変えられる。一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、出版物（エイデルマン(Adelman) ら、1982）により例示されるように当該技術分野で公知である。真価を認められることができるように、この技術は、典型的には、一本鎖および二本鎖双方の形態で存在するファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発で有用な典型的なベクターはＭ１３ファージ（メッシング(Messing)ら、1981）のようなベクターを包含する。これらのファージは容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は一般に当業者に公知である。これに従った部位特異的突然変異誘発を、最初にミュータシンのＤＮＡのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に包含する一本鎖ベクターを得ることにより実施する。所望の突然変異された配列をもつオリゴヌクレオチドプライマーを、例えばクレア(Crea)ら(1978)の方法により一般的には合成で調製する。このプライマーをその後一本鎖ベクターとアニーリングし、そして、突然変異をもつ鎖の合成を完了するために、大腸菌(E．coli)ポリメラーゼＩのクレノウ断片のようなＤＮＡ重合酵素にかける。かようにヘテロ二本鎖が形成され、ここで一本の鎖は元の突然変異されない配列をコードし、そして第二の鎖は所望の突然変異をもつ。このヘテロ二本鎖をその後使用して大腸菌(E．coli)細胞のような適切な細胞を形質転換し、そして突然変異された配列の配置をもつ組換えベクターを包含するクローンを選択する。部位特異的突然変異誘発を使用する選択されたｍｕｔＡのミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の遺伝子の配列分散(sequence variance)の調製は、潜在的に有用かつ改良されたミュータシンポリペプチドの産生手段として提供され、また、制限することを意味されない。なぜなら、ｍｕｔＡ遺伝子の配列分散を得ることができる他の方法が存在するからである。例えば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターを突然変異誘発剤で処理して、ヒドロキシルアミンを使用するプラスミドＤＮＡの突然変異誘発のための配列分散を得ることができる。これは、カセット飽和突然変異誘発およびより精巧に標的を定められた部位特異的突然変異誘発の組み合わせにより成し遂げることができる。しかしながら、突然変異誘発に先立ち、ミュータシン分子の化学的および遺伝子的特性の詳細な理解を得ることができる。ミュータシンのＤＮＡ配列をｍｕｔＡ遺伝子座と比較することができる。ミュータシンＩはわずかに異なる活性範囲をもつ緊密に関連したミュータシンである。配列の差異はより幅広いスペクトルの分子を生じるために配列のどこを改変するかに関しての手掛かりを提供するようである。このポリペプチドのＮＭＲおよび質量分析による化学分析は、修飾されたアミノ酸残基（例えば、ジデヒドロ酪酸もしくはジデヒドロアラニン）、チオエーテル架橋および分子の空間的配置の検出を可能にすることができる。化学分析と組み合わさったＤＮＡ配列データから推定される遺伝子解析は、疎水性／親水性ドメイン、抗原性、両親媒性の配置および電荷の分布についての情報を生じることができる。他の十分に研究されたランティビオティックとの比較と一緒のこの情報は、ミュータシンペプチドの修飾のための部位特異的突然変異誘発の設計で補助することができる。部位特異的突然変異誘発は広く使用されている一方、この技術は突然変異誘発されるはずである標的部位に関するある情報を推定する。かように、ズブチリシンの場合（リウ(Liu)とハンセン(Hansen)、1992）には、位置４の特定のアミノ酸グルタミンがイソロイシンに変えられた。明らかに、グルタミンのカルボキシル基は隣接するジデヒドロアラニンを不安定化してズブチリシン分子の生物学的半減期の短縮を引き起こした。Ｇｌｕの代わりのＩｌｅでの単一の置換はズブチリシンの半減期を57倍増大させた。ズブチリシン分子のこの顕著な強化は、これおよび他のランティビオティックの他の修飾がその分子に高められた抗菌特性を与えうるという可能性を示す。突然変異誘発のアプローチは、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＵＡ９６およびＴ８が本来能力があり、そしてこのペプチド、ミュータシンが比較的小さいため、魅力的に思われる。また、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の染色体に突然変異された配列を導入することが可能であることにより、遺伝子量および調節が、突然変異された産物を産生するのにプラスミドレプリコンを使用することと対照的に、維持される。突然変異誘発のどの領域を修飾するかに関する他の手掛かりは、ミュータシンを産生するミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の利用可能な株から生じうる。１個は、活性および物理的特性のわずかに異なるスペクトルをもつグループＩのミュータンス連鎖球菌(S．mutans)により作成される緊密に関連したミュータシンである（コーフィールド(Caufield)ら、1985）。最初に、飽和カセット突然変異誘発と呼ばれるいくぶん無作為の突然変異誘発のアプローチを用いて開始することが提案される（ベッドウェル(Bedwell)とストローベル(Strobel)、1989；ヒル(Hill)ら1987）。リウ(Liu)とハンセン(Hanse n)(1992)のものに類似のアプローチを、以下の改変を伴い使用することができる。修飾するミュータシン遺伝子をクローニングしかつ送達するためのベクターはｐＭＣＬ１９であることができる。プラスミドＭＣＬはＣａｔ遺伝子およびｐＵＣ１９からのＭＣＳを有する。ＥｒｍのＡＢカセットは、正確な配列が既知になれば記述されたようにミュータシンの構造遺伝子中に挿入されることができる。これは相同的交換が起こったかどうかを示すことができる。構造遺伝子ｍｕｔＡもまたｐＭＣＬ１９にクローニングすることができる。加えて、ｔｅｔＯもしくはｋａｎ抗生物質カセットを、ミュータシン抗生物質の活性もしくはプロセシングを変えない部位でミュータシン遺伝子に対し遠位に挿入することができる。ある試行錯誤の挿入がここで必要であるが、しかし、ＰＣＲの補助で、唯一の制限酵素切断部位に合うあつらえの(c ustom)挿入物を作成し得る。相互交換(reciprocal exchange)のための相同領域としてはたらくことができるおよそ50塩基対の下流配列をミュータシン挿入物中に包含することができる。この系は、ｐＭＣＬ１９のキメラを直鎖状にすることにより試験され、そしてＵＡ９６もしくはＴ８を形質転換する。Ｅｒｍ^sＴｅｔ^r についての選択は相同的交換を受けた形質転換体を生じるはずである。ミュータシンについてのスクリーニングは陽性であるはずである。サザンブロットは適切な位置での単一の挿入物を確認するはずである。長さおよそ50ないし100bpのオリゴヌクレオチドを、ｍｕｔＡの配列を基礎として合成することができる。縮重を、各コドンのそれぞれ第一および第二ヌクレオチドに組み込むことができる。野生型のヌクレオチドを、残存する３個の突然変異誘発するヌクレオチドと一緒におよそ33：１ないし１：１の比でオリゴヌクレオチド合成反応に添加することができる。この比の最初の近似は、与えられた縮重オリゴヌクレオチドがただ１個の点突然変異を有することができるようにポアソンの計算(Poissoncal culation)を基礎とする。この比は最終的なｍｕｔＡ配列の長さを基礎として決定することができ、また、その結果は経験的に試験することができる。その配列がおよそ100bpのｍｕｔＡの左および右端由来でありかつ10ないし20bpのオーバーラップを有する、およそ50ないし90bpの２種の変性オリゴヌクレオチドを合成することができる。オーバーラップの領域はクレノウポリメラーゼの準備をするのに使用することができ、また、ｐＭＣＬ送達ベクター中に連結され得る二本鎖ＤＮＡ断片が生じることができる。連結のための部位はｍｕｔＡ遺伝子座の配列データから予め決定することができる。唯一の部位を部位特異的突然変異誘発により不可欠でない配列に工作し得る。ＰＣＲもまた、オーバーラップ配列を伸長させるのに使用し得る。当該オリゴヌクレオチドは、挿入物の方向性クローニングで補助する末端設計認識部位(terminal design recognition site)；例えばＰｓｔＩおよびＨｉｎｄ IIIを有するようにも設計し得る。いくぶん無作為の置換を含有する一連のオリゴヌクレオチド由来の連結された挿入物を、直鎖状にされた自殺ベクターｐＭＣＬ１９により送達することができ、また、Ｔｅｔ^rＥｅｍ^s表現型を有する形質転換体を抗菌活性もしくは他の所望の特性についてスクリーニングすることができる。有望な突然変異のＤＮＡ配列を、特定の表現型、例えば抗菌活性スペクトルの原因であるミュータシン分子の多様な領域の輪郭を描くために得ることができかつ染色体上で位置づけ得る。ｔｅｔもしくはｋａｎのＡＢカセットは、染色体上に配置された突然変異された挿入物の回収を助長することができる。コドン中の治癒力のある変化の確認は配列分析のアミノ酸組成から成ることができる。プロトンＮＭＲスペクトル分析は、ズブチリシン分子中の構造変化の決定で有用と判明した。変えられたミュータシン分子は、野生型ミュータシンの回収に使用されるものに類似の方法により回収され得る。実施例７高められたミュータシン産生天然の起源から単離される抗生物質での問題の一は低収量および長大な精製過程である。以下の実施例は、グラム陽性細菌の細胞を形質転換するのにＤＮＡ構築物を使用する、細菌宿主からミュータシンを過剰発現するための戦略を具体的に説明する。グラム陰性細菌、典型的には大腸菌(E．coli)が一般には発現系として使用される一方、枯草菌(B．subtilis)、Ｌ．ラクチス(L．lactis)もしくはサングイス連鎖球菌(S．sanguis)のようなグラム陰性細菌の外膜を欠く他の株が高められた収率を提供することを期待される。本発明のさらなる局面は新規ミュータシンおよびその変異体をコードするＤＮＡを組込む高発現ベクターを包含する。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)以外の系でのミュータシンの高められた発現を提供するベクターが得られることができることが企図される。大腸菌(E．coli)でのＴ７発現系のような大腸菌(E．col i)の高発現ベクターは、ミュータシンを正しくプロセシングしかつ輸出すると思われない。なぜなら、その外膜をもつグラム陰性細胞はミュータシンプロセシング酵素の多くもしくは全てを欠くようであることができるからである。さらに、大腸菌(E．coli)の系への全てのミュータシンプロセシング遺伝子のひとまとまりにしての導入さえおそらく活性のミュータシンを生じることができない。しかしながら、他のグラム陽性の微生物、とりわけ、例えばズブチリシンを産生するのに使用されている枯草菌(B．subtilis)が適する選択肢であることが期待される。枯草菌(B．subtilis)に加え、発明者は、サングイス連鎖球菌(S．sanguis )もしくはラクトコックス(lactococci)のような他の種の連鎖球菌類が適する発現宿主であることもまた証明することができることを企図する。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)もしくは他の宿主系での大スケール産生もしくは高められた発現のための発現系液体培養物中のその溶解性もしくは発現を増大させる、ミュータシンの物理的特性の改変が求められうる。ミュータシン遺伝子座は、高発現プロモーター、もしくは発現を高めるよう変えられたミュータンス連鎖球菌(S．mutans)系の調節の制御下に置かれうる。 20リットルのタンクから1,000リットルもしくはそれ以上へのスケールアップは、ミュータシン産生の同時の分析（バイオアッセイおよび／もしくは逆相ＨＰＬＣ）、ミュータシン特異的なタンパク質および遺伝子の発現（ノーザンおよびウェスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を基礎とすることができ、また、スケールアップの多様な段階で栄養素レベルと相互に関連することができる。生理学的研究はミュータシン産生のための主要な制御機構を示すはずである。20から1, 000リットルまでのミュータシンの単離および精製は生産範囲に依存するとみられるが、しかし、一般には以下の段階が実施されるとみられる。すなわち、ミュータシンを含有する液体を細胞から分離することができる。濾過（ペリコン(Pel licon)フィルター系、ミリポア(Millipore)、0.45mm膜）もしくは遠心分離を使用し得る。ミュータシンの単離および濃縮。10kDaの限外濾過物および１もしくは２kDaの保持物を使用する２個の限外濾過段階（ペリコン(Pe llicon)フィルター系、ミリポア(Millipore)、限外濾過膜）が十分であるはずである。あるいは、吸着体樹脂上の吸着もしくは陽イオン交換クロマトグラフィーを使用し得る。選択的液体抽出／沈殿法を、最終精製のための逆相ＨＰＬＣの適用前に使用しうる。これは凍結乾燥もしくは化学修飾（活性を変えるもしくは溶解性を増大させるための）が後に続きうる。凍結乾燥。この精製スキームは、臨床および前臨床の検討のための基準、すなわち、99％以上の生成物純度、パイロットスケールで50％を越える全体収率の大量のペプチドを精製しかつ費用効率を達成する能力に合致するべきである。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の培養後の醗酵培地からのタンパク質の単離における醗酵方法は既知である。ペリコン(pellicon)カセット分離器（ミリポア(Millipore)、マサチューセッツ州ベッドフォード）が液体からの細胞の迅速な分離を可能にする（ＨＶＬＰカセット、0.45mm）。ペリコンフィルター分離器の応用は、前に記述されたミニタン(Minitan)分離器（ミリポア(Millipore)、マサチューセッツ州ベッドフォード）による小スケールの単離処置に類似であることができる。10kDaおよび１kDaのペリコン膜の使用は、１kDaの保持物中のミュータシンの収集を可能にすることができる（ペリコン(Pellicon)フィルター系を使用しての最小体積はポンプの型に依存して250〜750mlである）。回転静脈ポンプ(rotary vein pump)を伴うペリコン(Pellicon)フィルター系の可能な濾過速度は１時間あたり1.5ないし150リットルの濾液を得ることを可能にする。ミュータシンは熱安定性であるため、迅速な精製、もしくは分離条件での特別の注意の特別の必要性は存在しない。精製段階での熱変性もまた１個の可能性である。全ての熱に不安定なタンパク質は変性されるはずであり、そして遠心分離後にペレットとして捨てられるべきである。その後、次の段階の限外濾過がより高速で進行しそして純粋な物質を生じるはずである。粗ミュータシンを直接さらに処理することができる。ミュータシンの最終精製は、逆相ＨＰＬＣすなわち99％を越える純度を伴う精製の通常の現代的方法により実施することができる。いくつかの目的上、20倍過剰の水による溶液（例えば８M尿素、70％エタノール）からの選択的沈殿が十分でありうる。精製されたミュータシンおよび修飾されたミュータシンのさらなる分析のため、例えば精製をたどるためにアミノ酸分析と組み合わせられたサイズ排除クロマトグラフィーを使用することが必要でありうる。ミュータシンの産生および精製はまた、異種宿主中でのプロセシングされないプレプロトミュータシン（修飾前のリーダーペプチドを伴うタンパク質）の過剰発現、次いで固定された修飾酵素でのカラム上でのその修飾の組み合わせにより成し遂げられることも企図される。カラム中の流出物は高度に精製された活性物質を含有するとみられる。プレナイシンペプチドと合わせられたナイシンのプロセシング酵素を含有する細胞抽出物は活性のナイシンの産生をもたらした（ファン・デル・メール(van der Meer)、1993）。生理活性代謝物の一次構造を解明するのに使用される分光学的研究は、ＮＭＲおよび質量分析法、ならびに高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）の使用を包含することができる。既知のアミノ酸組成と一緒になったこの知識は、逆相ＨＰＬＣにより単離されたトリプシンペプチドおよび他の切断されたペプチドのＭＳ研究で使用することができる。例えば、臭化シアン消化はミュータシンの一次構造中の１個のメチオニン残基の存在のため２種のペプチドを生じるはずである。この技術はエピデルミンの研究で成功裏に使用されている。代替の可能性はＦＡＢ−ＭＳによる直接のミュータシンの配列決定である。ミュータシンの構造的サブユニットは、新規成分の構造決定での標準的な初期のアプローチであるプロトンＮＭＲおよび¹³ＣＮＭＲにより確立され得る。化学修飾もしくはより短いペプチドの分析および／または重水素ＮＭＲ測定を包含する拡張(extension)ＮＭＲ分析の関与が、溶液中のミュータシンのコンホメーションのＮＭＲ研究への道をひらきうる。実施例８ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)の大スケールのスクリーニング以下の実施例は、２種の異なる機構がはたらき、それによりＴｎ９１６トランスポゾンがミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の本来能力のある株中のレシピエント染色体に挿入することを示す。Ｔｎ９１６を挿入された形質転換体の頻度に対する内在するヘルパープラスミドの影響もまた立証されている。形質転換頻度のこれらの差異は、特定の突然変異が求められかつ多数の形質転換体がスクリーニングに必要とされる場合に決定的に重要になる。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)でのＴｎ９１６を使用する転位突然変異誘発ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＵＡ９６を２種の異なるＴｎ９１６含有プラスミドを使用して形質転換した。プラスミドｐＡＭ１１８はベクターｐＶＡ８３８から構築され、そしてＴｎ９１６に加えてＳ．フェルス(S ．ferrus)ｐＶＡ３８０−１からの連鎖球菌のレプリコンを含有する。プラスミドｐＡＭ６２０は、それが連鎖球菌のレプリコンを欠き、そして従ってミュータンス連鎖球菌(S．mutans)中で複製することが不可能であったことを除いて類似であった。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)ＵＡ９６を最初にこれら２種のＴｎ９１６含有プラスミドで形質転換した場合は、形質転換体の数およびコロニーの形態の差異が観察された。とりわけ、黄色であった、非複製性のｐＡＭ６２０に生じられた野生型（ＷＴ）形質転換体が産し(raise)かつ典型的なミュータンスのコロニーの形態を有した一方、複製性のプラスミドｐＡＭ１１８から生じる形質転換体は小型の白色コロニーであった。一次プレート（５mg/mlテトラサイクリンを含むトッド・ヒューイット(Todd-Hewitt)）上では多様なコロニーのモルフが明瞭でありかつ容易に同定され；数日の成長後の二次単離に際しては、小型の白色コロニーはＷＴの形態となった。ｐＡＭ１１８はｐＡＭ６２０より20倍多い形質転換体を与えたため、この差異を活用し、そうしてより多くの突然変異体を形質転換あたりで生じ得た。新たに調製されたブラスミドＤＮＡは１ヶ月もしくはより古い調製物よりも高い形質転換率を与えた。これはＴｎ９１６中間体のＣＣＣの形態の固有の不安定性の結果のようであった。双方のコロニーの形態からの一次Ｔｅｔ^r形質転換体をその後ＴｅｔおよびＥｒｍ双方に対する耐性についてスクリーニングし；小型の白色物(whites)はＴｅｔ^rＥｒｍ^r双方であった一方、ｐＡＭ６２０からのＷＴはＴｅｔ^rＥｒｍ^sであった。ベクターｐＶＡ８３８はＥｒｍ遺伝子をもつため、小型の白色物はプラスミドｐＶＡ８３８からＥｒｍ^rを獲得していたことが推定された。ｐＶＡ８３８は、ＵＡ９６の染色体それ自身中に組込まれ得たか、もしくはＵＡ９６中で複製するプラスミドを形成するよう再循環され得たかのいずれかであった。プラスミドのスクリーニングは、実際、16.4kbのＴｎ９１６を除いたｐＡＭ１１８と矛盾しないプラスミドが小型の白色の形質転換体に組込まれたことを示した。非複製性のｐＡＭ６２０から生じた形質転換体は、ＣＣＣ中間体による形質転換の結果のようであった。小型の白色物が複製性プラスミドから生じ、また、ＷＴのモルフはＣＣＣ中間体から出現したことを確認するため、直鎖状にされたプラスミドＤＮＡは染色体との相同的組換えもしくは内在するプラスミドとの相同性によるのでない限りミュータンス連鎖球菌(S．mutans)を形質転換し得なかったという事実を利用した。プラスミドｐＡＭ１１８およびｐＡＭ６２０を、Ｔｎ９１６内で一度切断するがしかしベクターｐＶＡ８３８もしくはｐＶＡ８９１内でしない制限酵素ＫｐｎＩ、およびベクター内で切断するがしかしＴｎ９１６内でしないＸｂａＩで直鎖状にした。形質転換する部分が全ての場合でＴｎ９１６中間体であった場合は、ＸｂａＩで切断されたｐＡＭ６２０およびｐＡＭ１１８の形質転換するプラスミド調製物は直鎖状にされないＴｎ９１６を形質転換することができ、また、ＫｐｎＩで切断された調製物(preps)はミュータンス連鎖球菌(S．mutans)を形質転換することができなかった。なぜなら、ＫｐｎＩは中間体内で切断するからである。この実験の結果を表８に示す。ｐＡＭ６２０のような非複製性プラスミドによる形質転換の場合には、Ｔｎ９１６中間体は、形質転換に先立ち、それから調製物が生じられる大腸菌(E．coli )宿主中でＣＣＣ中間体を形成する。それは、Ｔｅｔ^r形質転換体の原因である形質転換する部分であるこの中間体である。これは、形質転換するＤＮＡが中間体およびプラスミドｐＡＭ１１８も同様に直鎖状にするＫｐｎＩで切断される場合の形質転換体の非存在により明らかである。ＸｂａＩでｐＡＭ１１８を切断することはプラスミドｐＡＭ１１８を直鎖状にするが、しかし大腸菌(E．coli)中で形成されるＴｎ９１６中間体を直鎖状にしない。これゆえに、低下された頻度のＷＴ形質転換体が生じる。この実験はまた、ＷＴコロニーがＴｎ９１６中間体から生じた一方、小型の白色物が複製するプラスミドから生じたことも示し、ここで、転位は、Ｔｎ９１６含有の複製性プラスミドｐＡＭ１１８が形質転換されたミュータンス連鎖球菌(S．mutans)中に入りそして確立されたようになった後の二次的事象である。この結果は、（１）ＷＴコロニーの形質転換体がＴｎ９１６中間体から生じた、また、（２）形質転換するプラスミドのいわゆる「接合誘発」の以前の観察結果（ガウロン−ブルケ(Gawron-Burke)とクレウェル(Clewell)、1984）とのその一致のため、２個の機構が必要であったことを示した。これらの２個の相反する仮説は、Ｓ．ゴルドニイ(S．gordonii)およびミュータンス連鎖球菌(S．mutans) の形質転換が、双方が本来の能力により起こり、また、双方が一本鎖ＤＮＡの取り込みを必要とすることにおいて類似であるという観察結果により調和される。これゆえに、プラスミドが確立されたようになるためには、それはいわゆる２衝突の力学(two-hit kinetics)によりＤＮＡの２個の部分的に重なり合うプラスミド分子の進入を必要とする。突然変異体でのプラスミドＤＮＡの形成を安定化もしくは促進することができた何事も、プラスミドＤＮＡが細胞に入りそして確立されたようになった後に起こる二次的な接合的に誘導される事象の結果として、形質転換率もまた増大させることができた。これはプラスミドｐＡＭ１１８の複製物でみられるように小型の白色コロニーの形質転換体をもたらす。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)をその後、ｐＡＭ１１８の親プラスミドｐＶＡ３８で形質転換し、そして生じる株をＴｎ９１６含有プラスミドｐＡＭ６２０およびｐＡＭ１１８で形質転換した。結果を表９に示す。プラスミドｐＡＭ１１８の複製物から生じるＴｅｔ^r形質転換体の数は、非ヘルパーレシピエントのものよりほぼ20倍大きかった。非複製性プラスミドｐＡＭ６２０から生じるＴｅｔ^r形質転換体は非内在性のヘルパー陰性レシピエントに匹敵し、ｐＡＭ１１８およびｐＡＭ６２０についてそれぞれ1.7および3.1であり、Ｔｎ９１６を含有する複製性プラスミドの確立がＴｎ９１６の二次的除去すなわち接合誘導およびミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の染色体への挿入に前もって必要であったことを立証した。小型の白色コロニーの形質転換体はｐＡＭ６２０から生じた。これらの形質転換体は侵入者(income)ｐＡＭ６２０含有ベクターｐＶＡ８９１と内在するｐＶＡ８３８すなわちｐＶＡ８９１の親ベクターとの間の組換えの結果であった。これは、Ｔｅｔ^r形質転換体がミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の染色体へのプラスミドからの二次転位として生じたというさらなる支持であった。これもしくは前の実験でのＤＮＡについてのミュータンス連鎖球菌(S．mutans)形質転換体のスクリーニングでは、最初のｐＡＭ１１８と大きさが矛盾しなかったプラスミドは観察されず、Ｔｎ９１６含有プラスミドがミュータンス連鎖球菌(S．muta ns)中で不安定であることを示した。小型の白色コロニーの形態は、細胞をよりゆっくりと成長させるＴｎ９１６プラスミドの一時的な運送の結果であるようである。おそらく転位が起こった後に生じる小型の白色のモルフの二次クローンはＷＴコロニーの形態に復帰する。競争実験を実施し、それにより異なる量の染色体もしくはプラスミドのＤＮＡをｐＡＭ６２０もしくはｐＡＭ１１８を用いて共形質転換した。ストレプトマィシン耐性マーカーを有する相同的染色体ＤＮＡはＴｎ９１６形質転換体と競争し、染色体ＤＮＡ、Ｔｎ９１６中間体およびＴｎ９１６含有プラスミドが共通の経路によりミュータンス連鎖球菌(S．mutans)に入りかつこれを形質転換することを示した。Ｔｎ９１６中間体、および複製するプラスミドからの二次的転位事象を必要とすることに関する２種の異なる機構のこの観察結果の重要性は、Ｔｎ９１６が不活性化された突然変異体が、最初に観察された10^-5の率に比較して10^-3 ないし10^-4の形質転換体／レシピエントの桁の率で生じられ得ることである。形質転換頻度のこの差異は特定の突然変異体が求められる際に決定的に重要となる。実施例９細菌株の形質転換ある株のミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)は本来能力がない。形質転換効率は、形質転換される株、培養条件および形質転換するＤＮＡの性質に依存する。本実施例では、ミュータンス連鎖球菌(S.mutans)の形質転換率を増大させるために培養条件をどのように操作したかを示す。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の形質転換２種の天然に存在する能力のある血清型Ｃの株の形質転換率を比較した。一方の株は5.6kbのプラスミドをもち（ＵＡ９６）、また、他方はプラスミドを含まなかった（Ｔ８）。これらの株を広く使用される株ＧＳ５と比較した。全３種の株は、ウシ血清アルブミンをウマ血清の代わりにし、かつ化学的合成培地をトッド・ヒューイット(Todd-Hewitt)培地の代わりにした場合に、６と150倍との間の高められた形質転換頻度を表した。全体として、株ＵＡ９６は0.4％ＢＳＡで補充されたＣＤＭ中で最大の形質転換率を表し、プラスミドおよび染色体のＤＮＡについてそれぞれ40ないし152倍の増大を示した。より好都合な形質転換率を保有するＵＡ９６にもかかわらず、Ｔ８をさらなる研究のために選んだ。なぜなら、それはＵＡ９６中に見出される内在するプラスミド5.6kbを欠いたからである。この内在するプラスミドの存在は能力のある細胞に導入される目的のプラスミド構築物の遺伝子的特徴づけを複雑にする。なぜなら、内在するおよびキメラの双方のプラスミドは塩化セシウム濃度勾配遠心分離で共純化されるからである。形質転換する部分としてｐＶＡ８３８を使用する0.4％ＢＳＡで強化されたＣＤＭ中のＴ８のインキュベーション時間、培養密度および形質転換率の間の関係。インキュベーションの１ないし６時間の間の時間間隔は、３時間での至適で、形質転換率により測定されるような能力の鋭い上昇および下降を立証した。最大の形質転換率は誘導期の終わりと同時に起こり、迅速な低下が指数増殖期に先行した。能力の迅速な低下は誘導と指数増殖の曲線の間の結合部に対応した。類似のパターンがＴＳ５およびＵＡ９６双方で起こり、最大の形質転換率が成長の誘導期と相互に関連し、かつ、指数増殖期の開始時に鋭く低下することを示唆する。肺炎連鎖球菌(S．pneumoniae)およびいくつかのグループＨの連鎖球菌は血清もしくはアルブミンを含まない培地中で多様な程度の能力を獲得したとは言え、試験されたミュータンス連鎖球菌は血清由来の成分の存在下でのみ能力を獲得した。血清由来の添加物がどのように能力を増進するのかは明らかでない。0.4％ＢＳＡで強化されたＣＤＭを使用するミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の形質転換を高める能力は、あればどの他の物質がこの生物体での能力の発達に関連するかの決定を可能にすることにおいて付加的な利点を有する。ＴＨのような天然培地と比較してＣＤＭ中での複数のポリペプチドの非存在は別の利点であり、発現されたポリペプチドの単離および精製をずっとより少なく厄介にする。加えて、ＣＤＭの使用はミュータンス連鎖球菌(S．mutans)の本来の能力に関連する細胞外成分のさらなる解明のための道を開く。実施例１０ミュータシン発現に対するｒｅｃＡの影響大腸菌(E．coli)からのコリシンのようなある他のバクテリオシンはｒｅｃＡ依存性である。これは、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)でのミュータシンの発現に対するｒｅｃＡ突然変異体の影響の検討を促した。ｒｅｃＡ遺伝子はｒｅｃＡタンパク質のコーディングの原因である。これは相同的組換えＤＮＡ修復および「ＳＯＳ」経路のタンパク質分解性の活性化の高度に保存された調節体(reg ulator)である。ＰＣＲ増幅を使用するミュータシン株ＵＡ.9６のｒｅｃＡ突然変異を構築した。プライマーは大腸菌(E．coli)および枯草菌(B．sbtilis)からのｒｅｃＡの保存領域に対して直接作成した。当該実験は、ミュータンス連鎖球菌(S．muta ns)でのミュータシン産生および形質転換能力に対するｒｅｃＡ破壊の影響を研究するよう設計した。ミュータシン産生および形質転換に対するｒｅｃＡ突然変異の役割を示すため、大腸菌(E．coli)および枯草菌(B．sbtilis)双方からのｒｅｃＡ遺伝子座の保存領域からのオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使用した。ＥｃｏＲＩの「末尾」を付加し、そしてｒｅｃＡのＰＣＲ内部断片をシャトルプラスミドｐＶＡ８９１（Ｅｒｍ^rＣｍ^r）にクローニングした。このキメラを相同的染色体組換えのための形質転換するＤＮＡとして使用した。ｐＶＡ８９１はミュータンス連鎖球菌(S．mutans)中で複製することが不可能であるため、染色体中に組込むもののみがＥｒｍ^r形質転換体を生じる。形質転換を、ドナーとしてこの構築物を使用して、ＵＡ９６、および5.6kbのプラスミドを欠くその類似株Ｔ８双方で実施した。ＵＶ感受性の大きな差異がその親株と比較してＢａｃ^-突然変異体で観察された。ＵＶ感受性は不完全なＤＮＡ修復の表現型の発現の一である。Ｅｒｍ^r形質転換体は親株よりＵＶ照射に対して４桁より感受性であった。２種の独立に単離されたＥｒｍ^r突然変異体のサザンブロットのためのプローブとして内部ｒｅｃＡを使用することは、挿入が同一の制限酵素切断断片中であったことを確認した。プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ双方の推定のｒｅｃＡ突然変異体での形質転換頻度は10^-7未満で検出より下であった。しかしながら、突然変異体と親株との間でミュータシン産生での差異はみられなかった。集合的に、これらの結果は、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)株ＵＡ９６およびＴ８中のｒｅｃＡ遺伝子が不活性化され、そして、ＵＶ感受性および能力の低下の双方の原因であったことを示した。しかしながら、それはミュータシン産生と関係がない。実施例１１ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans)中でのランティビオティック、ミュータシンIIの生合成に関与するｍｕｔＡおよびｍｕｔＭ遺伝子の特徴づけ本発明は、ミュータシンII生合成オペロンの一部の増幅、クローニング、配列決定および特徴づけもまた開示する。新規アプローチを、ミュータシンペプチドのＮ末端アミノ酸配列に従って設計されたオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲを基礎とする染色体歩行の技術を必要としたランティビオティックの構造遺伝子のクローニングで使用した。細菌株およびＤＮＡの操作ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)Ｔ８、サングイス連鎖球菌(S．sanguis)Ｎｙ１０１ならびに大腸菌(E．coli)の株およびプラスミドをこの検討で使用した。株は必要とされるまで−70℃で凍結して保存し、そして前に記述されたように成長させた。大腸菌(E．coli)および連鎖球菌の染色体およびプラスミドのＤＮＡの単離、制限酵素切断(restriction)、連結ならびに形質転換は、とくに示されない限り出版された方法、シャー(Shah)ら、（1993）Anal．Biochem．214、34 3-346に本質的に従った。抗生物質は所望される場合に培地に添加した（連鎖球菌について：エリスロマイシン20μｇ/mlおよびカナマイシン500μｇ/ml；大腸菌(E．coli)：エリスロマイシン300μｇ/mlおよびカルベニシリン50μｇ/ml）。プライマーの設計ＳＳＰ−ＰＣＲのためのプライマーをミュータシンペプチドのＮ末端アミノ酸配列、すなわちＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌに従って設計した。縮重プライマーを同様に作業し(worked)、また、いくつかのグループIIの株からのペプチドを同様にクローニングした。順および逆双方の向きの非縮重プライマーの設計はミュータンス連鎖球菌(S．mutans)でのコドンの好みを利用した。とりゎけ、ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)からの前にクローニングされた遺伝子の9,985のコドンを分析して、明確なコドンの好みに従うことが見出された。このコドンの好みをミュータシンのＮ末端アミノ酸について全体の％として表現した。すなわち、Ａｓｎ（ＡＡＴ 77.5；ＡＡＣ 22.5 ）；Ａｒｇ（ＡＧＡ 13.4；ＡＧＧ 2.7；ＣＧＣ 23.6；ＣＧＧ 5.1；ＣＧＡ 8.7；ＣＧＴ 46.4）；Ｇｌｎ（ＣＡＡ 82.1；ＧＡＧ 17.9）；Ｇｌｙ（ＧＧＴ 50.4；ＧＧＡ 23.7；ＧＧＣ 17.2；ＧＧＧ 8.7）；Ｖａｌ（ＧＴＡ 1 6.4；ＧＴＴ 52.5；ＧＴＧ 12.2；ＧＴＣ 18.9）。ミュータンス連鎖球菌(S ．mutans)でのコドンの好みを反映する逆（Ｒ）および順（Ｆ）向きの非縮重プライマーを合成した。Ｒの向きのプライマーｏＷＢ００２（５’ＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＴＴ３’）およびｏＷＢＯＯ６（５’ＡＣＡＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＧＴＴ３’）ならびにＦの向きのｏＷＢ００３（５’ＡＡＴＣＧＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＡＧＴ３’）は遺伝子特異的産物を生じた。ミュータシンの構造遺伝子および隣接するＤＮＡのクローニングミュータンス連鎖球菌(S．mutans)Ｔ８からの染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで消化し、そしてｐＵＣ１９もしくはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の対応する部位に連結した。室温での一夜連結の後に、連結混合物はＳＳＰ−ＰＣＲ(18、19)の鋳型としてはたらいた。プライマーｏＷＢ００２（もしくはｏＷＢ００３）を最初の遺伝子特異的プライマーとして使用し、また、普遍的配列決定プライマーＦ−２０は第二のプライマーとしてはたらいた。ＰＣＲ条件：連結混合物の１μｌのアリコートを、ジーンアンプ(GeneAmp)ＰＣＲシステム９６００（パーキンエルマーシータスコーポレーション(Perkin-Elmer Cetus Corp.)で100μｌの総体積中での熱開始(hot-start)ＰＣＲ増幅に使用した。至適化されたＰＣＲ反応混合物は、反応緩衝液（20mMトリス−塩酸pH8.4、50m M塩化カリウム）中に20pmolのプライマーｏＷＢ００２および20pmolのプライマーＦ−２０、200μＭのｄＮＴＰ、2.5mMの塩化マグネシウムを含有した。この混合物を、反応緩衝液中の2.5単位のＴａｑポリメラーゼ（ギブコＢＲL(Gibco B RL)）を固化された蝋層上に添加する前に80℃で５分間プレインキュベーションした。94℃で２分間の初期変性に、35周期の94℃、30秒；58℃、30秒；72℃、1. 5分が続いた。72℃に10分間留まった後、サンプルを使用されるまで４℃で保持した。特定のアンプリコン(amplicon)を、ＴＡクローニングキット（インヴィトロジェン(Invitrogen)）からｐＣＲIIベクターにクローニングしたか、もしくは直接配列決定した。挿入不活性化ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の遺伝子破壊を、ＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位にクローニングされたそれぞれの遺伝子の内部断片を含有する挿入ベクターｐＶＡ８９１（マクリナ(Macrina)ら、（1983）Gene 25、145-150）を用いるミュータシン産生株の形質転換により成し遂げた。結果として生じる形質転換体中の挿入をサザンブロット分析により確かめ、そしてその株をミュータシン産生についてアッセイした。ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)のヒト由来株からの染色体ＤＮＡのＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄIII消化により生じられた制限酵素切断断片を0.7％アガロースゲル上で分離し、そしてサザン(So uthern)の方法に従った変性および中和の後にナイロン膜に転写した。プローブを、ニックトランスレーションを介してビオチニル化11−ｄＵＴＰで標識し、そしてハイブリダイゼーションを高められた化学発光法（ニューイングランドバィオラブス(New England Biolabs)）により可視化した。ミュータシン産生を、指標としてサングイス連鎖球菌(S．sanguis)Ｎｙ１０１を用いる遅延拮抗作用技術によりアッセイした。ＤＮＡ配列決定ＤＮＡ配列決定は、シークェナーゼ(Sequenase)バージョン２ＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢ）、およびＥＣＬ検出（ニューィングランドバイオラブス(N ew England Biolabs)）と結合されたツーステップダイレクトブロッティングシークェンサー(TwoStep Direct Blotting Sequencer)ＴＥ２０００（ホファー(Hoefer)）を用いるチェインターミネーター法、もしくは自動化配列決定（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)３７３ＡＤＮＡシークェンサー）を使用した。オリゴヌクレオチドをＵＳＢの施設で合成した。ＤＮＡ配列をいくつかのクローンからの双方の鎖について得、そしてコンセンサス配列を推定した。ＰＣＲの人工産物から生じる不確定性は、ＰＣＲのアンプリコンの直接配列決定もしくは追加クローンの配列決定により解消した。得られたＤＮＡ配列をＧＣＧパッケージのいくつかのプログラムを使用することにより分析した。ミュータシンIIプレペプチドをコードする構造遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーを、ミュータシンIIの以前に得られたアミノ酸配列に従って設計した。ＳＳＰ−ＰＣＲのアプローチを使用して、遺伝子特異的な非縮重の23mer（順もしくは逆）が、ミュータシン構造遺伝子周辺の遺伝子座の上流（0.7kb）および下流部分（2.1kb）を増幅した。染色体歩行（ＳＳＰ−ＰＣＲ）はミュータシン遺伝子座の下流部分を生じた。ＳＳＰ−ＰＣＲにより得られたＤＮＡ配列の分析は、ミュータシンの構造遺伝子がその生合成オペロンの部分と一緒にクローニングされたことを示した（図６）。遺伝子で設計されたｍｕｔＡは、２個の逆向き反復配列および推定のリボソーム結合部位（ＧＡＧＧ）により先行される。ｍｕｔＡは、プロセシング部位にＧｌｙ^-2−Ｇｌｙ^-1配列をもつ26アミノ酸の両親媒性リーダーペプチドを包含する53アミノ酸のプレペプチドをコードする。このプレペプチドは、ランティビオティック、ラクチシン(lacticin)４８１、バリアシン(variacin)、サリバリシン (salvaricin)およびストレプトコクシン(streptococcin)Ａ−ＦＦ２２との類似性を示した。このリーダーペプチドは荷電し、そしてクラスIIのリーダーペプチドを代表する保存配列、すなわち−13ないし−11のＥＶＳ、−８ないし−６のＥＬＤ、ならびに位置−３および−４の２個の脂肪族残基を共有する。一般に、クラスIIのリーダー配列は、ペジオシン(pediocin)ＦおよびラクチシンＦのようなグラム陽性細菌により産生される非ランティビオティックペプチドのリーダーとのかなりの類似性を示し、Ｇｌｙ^-2がプロセシングされたペプチドのトランスロケーションおよび切断に不可欠である。おそらく、これらのリーダーペプチドは、成熟ペプチドの輸出に関与するＡＢＣ輸送体のＮ末端のペプチダーゼドメインによりプロセシングされる。成熟ミュータシンは3,244.66±1.15Daの分子量を有する。そのＤＮＡ配列から推定されるプロミュータシンIIの分子量は3,315Daである。ミュータシンは４個の修飾されたアミノ酸を有し、ミュータシンIIの測定されたＭ_rと良好な一致にある3,243Daの算出された分子量を生じる。ミュータシンのプロランティビオティック部分はいくつかのタイプＡのランティビオティックの配列との類似性を示す（図７）。位置６のグリシン、ならびにそれぞれ位置19および20のアスパラギンおよびセリン／トレオニン（ミュータシンに従って番号をつけられる）が、ミュータシンII、ラクチシン４８１、サリバリシン、バリアシンおよびストレプトコクシンＡ−ＦＦ２２で保存される。位置10ないし12のモチーフＴＩ／ＶＳ／Ｔ、位置14、15のＥ／ＤＣ、およびＶ／ＬＦ／ＡＴＣＣのＣ末端モチーフもまた保存される。ミュータシンIIは27アミノ酸を含んで成る一方、他の４種のランティビオティックは22から26残基までの範囲にわたる。全４種が分子中の３個のシステイン残基により３個のチオエーテル環を形成することが可能である。配列の分析は、ミュータシンのＮ末端領域（残基１ないし８）は両親媒性のαヘリックスを形成することが独特に可能であるようであることを示した。ｍｕｔＡ遺伝子の下流は、ラクチシン４８１修飾酵素の遺伝子、ＬＣＮＤＲ２との類似性を基礎としてＭｕｔＭのように設計された１個の長いＯＲＦである。潜在的リボソーム結合部位（ＧＧＡＧ）は、調節機能を有しうるｍｕｔＡ遺伝子の３’端のヘアピン構造の部分を含んで成る。推定される898アミノ酸のＭｕｔＭタンパク質は、プログラムＴＯＰＰＲＥＤ IIにより予測されるように５個の推定の膜スパンニングドメインを有する。Ｃ末端近くの３個の配列クラスターがｌａｎＣ遺伝子中で保存される。保存された配列クラスターがＭｕｔＭ中に見出され、また、位置700付近のＮＸＸＸＡＨＧＸＸＧ、位置760付近のＷＣＸＧモチーフ、およびさらに52残基Ｃ末端近くのコンセンサスＣＨＧを伴う。保存されたグリシン残基が構造的特徴を定義しうる一方、他の完全に保存された残基（２個のＨｉｓ、２個のＣｙｓ、１個のＴｒｐ）は触媒作用、ジスルフィド結合形成もしくは金属イオン結合に関与し得る。ミュータシンII遺伝子クラスターの組織はラクチシン４８１のものに似ている。構造遺伝子（ｍｕｔＡ）は、修飾酵素が触媒する脱水およびチオエーテル架橋の形成の原因であると思われる推定のｍｕｔＭ遺伝子に先行する。ｍｕｔＡもしくはｍｕｔＭの挿入不活性化はＭｕｔ^-表現型をもたらす（図８）。免疫は影響を及ぼされなかった。これは、生合成の遺伝子からのミュータシン免疫遺伝子（１個もしくは複数）の別個の調節を示す。ランティビオティック遺伝子クラスターのクローニングに新規技術を使用して、本発明は、口腔細菌ミュータンス連鎖球菌(S．mutans)により産生されるランティビオティック、ミュータシンIIの生合成に関与する生合成オペロンの部分を成功裏に単離した。ミュータシンIIはゼロの正味電荷、分子内チオエーテル環形成残基の間の大きな距離、およびそのそれぞれの「システイン」パートナーのC 末端側に位置された脱水された残基から生じる最低１個のランチオニン環を表す。これはタイプＢのランティビオティックに典型的である。しかしながら、ミュータシンのプロランティビオティック部分はストレプトコクシンＡ−ＦＦ２２を包含するいくつかのタイプＡのランティビオティックの配列との類似性を示す（図７）。ミュータシンの独特の特徴は両親媒性のαヘリックスを形成することが可能なそのＮ末端領域（残基１ないし８）である。これは、ミュータシンIIおよびストレプトコクシンＡ−ＦＦ２２の異なる生物学的活性を説明しうる。ストレプトコクシンＡ−ＦＦ２２は感受性の微生物のアミノ酸同化を妨害する。他方、ミュータシンは、感受性の細胞のエネルギー代謝を妨害する。タイプＡのランティビオティックとの部分的類似性にもかかわらず、ミュータシンIIはタイプＢのランティビオティックにより良好に似ている。本明細書に開示かつ特許請求される組成および方法の全部は本開示に照らして過度の実験なしに作成かつ実行され得る。本発明の組成および方法は好ましい態様に関して記述された一方、変動が、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく、本明細書に記述された組成、方法に、および段階もしくは方法中の段階の連続で適用されうることが当業者に明白であることができる。より具体的には、同一もしくは類似の結果が達成されるとみられる一方で化学的におよび生理学的にの双方で関連するある作用物質が本明細書で記述される作用物質の代わりをすることができることが明白であることができる。当業者に明白な全てのこうした類似の置き換えおよび改変は、付録として付けられる請求の範囲により定義されるように、本発明の技術思想、範囲および概念内にあると思われる。以下の参考文献を本明細書で引用した：本明細書で挙げられたいかなる特許もしくは出版物も、本発明が関する当業者の水準の指標である。これらの特許および出版物は、まるで各個々の出版物が引用により組み込まれることが特別におよび個々に示されたかのように、同一の程度まで引用により本明細書に組み込まれる。当業者は、本発明がその目的を実施し、かつ挙げられた最終目標および利点ならびにその中に固有のものを得るように十分適合されることを容易に真価を認めることができる。本明細書に記述された方法、処置、処理、分子および特定の化合物と一緒の本実施例は、現在のところ好ましい態様の代表であり、例示であり、そして、本発明の範囲に対する制限として意図されない。請求の範囲の範囲により定義されるような本発明の技術思想内に包含されるその中の変更および他の用途が当業者の心に浮かぶことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/30 Ｃ０７Ｋ 14/315 14/315 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の特徴：（ａ）グラム−陽性微生物に対する抗菌活性；（ｂ）サイズ排除ゲルクロマトグラフイーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されると約２，５００のＭｒ；（ｃ）１００℃で３０分間での熱安定性；（ｄ）分子当たりに以下のアミノ酸：Ａｒｇ₂、Ａｓｎ₂、Ｇｌｕ₁、Ｇｌｕ₂、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ₃、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ₃、Ｘａａ₂、Ｙａａ、Ｚａａ；（この場合、Ｘａａはランチオニンを表し、Ｙａａはβ−メチルランチオニンを表し、そしてＺａａはジヒドロアミノ酸を表す）を含むアミノ酸組成物；（ｅ）ｐＨ４〜１０での安定性；（ｆ）＞８．４の等電点；および（ｇ）エタノール、尿素、もしくはグアニジン−水溶液中での可溶性、を有するストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）から取得することができる精製されたポリペプチド。２．ポリペプチドが総蛋白質のミリグラム当たり約１１０，０００殺菌単位の比活性を有する、請求の範囲１のポリペプチド。３．ポリペプチドが総蛋白質のミリグラム当たり約１５０，０００殺菌単位の比活性を有する、請求の範囲２のポリペプチド。４．Ｎ−末端部分がアミノ酸配列ＡｓｎＡｒｇＴｒｐＴｒｐＧｌｎＧｌｙＶａｌＶａｌ（配列番号１）を含んでなる、請求の範囲１のポリペプチド。５．内部アミノ酸配列Ｎ−ＭｅｔＡｓｎＸａａＴｒｐＨｉｓＶａｌ（配列番号２）（この場合、Ｘａａはランチオニンもしくはβ−メチルランチォニンである）を含んでなる、請求の範囲１のポリペプチド。６．ポリペプチドが、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種のメンバーに対する抗菌活性を有する、請求の範囲１のポリペプチド。７．（ａ）ポリペプチドを産生するストレプトコッカスムュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）細菌の培養物を成長させる段階；（ｂ）その培養物を濾過および限外濾過に供し、そして保持される濾液を回収する段階；（ｃ）段階（ｂ）の濾液を水不混和性有機溶媒で沈殿させる段階；および（ｄ）その沈殿物をカオトロピック剤で可溶化する段階、を含む過程により単離することができる、請求の範囲１のポリペプチド。８．（ａ）イーストエキストラクトおよびダイズトリプティカーゼブイヨンを補足してある化学的に特定された培地中でＳ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）Ｔ８細胞を培養する段階；（ｂ）０．４５ｍｍの膜フィルターを通す濾過にその培養物を供し、そしてその後に１００−、１０−、および１−ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を通す限外濾過を行う段階；（ｃ）１−ｋＤａの保持される濾液中の蛋白質をクロロホルムで沈殿させる段階；（ｄ）その沈殿物を水性緩衝液で洗浄する段階；および（ｅ）その沈殿物を８Ｍ尿素で可溶化する段階、を含む過程により単離することができる、請求の範囲１のポリペプチド。９．薬理学的に許容される担体内に分散される請求の範囲１のポリペプチドを含む薬剤学的組成物。１０．非経口投与に適する、請求の範囲９の薬剤学的組成物。１１．口腔洗浄液もしくは歯磨き剤として製剤される、請求の範囲９の薬剤学的組成物。１２．グラム−陽性細菌を、請求の範囲１のポリペプチドを含む組成物の有効量と接触させることを含む、グラム−陽性細菌を死滅化させる方法。１３．グラム−陽性細菌が動物内に位置し、そしてそのペプチドを含む組成物が前記動物に投与される、請求の範囲１２の方法。１４．虫歯を治療もしくは阻害するための、ある個体に、薬理学的に許容される担体中に請求の範囲１のポリペプチドを含む組成物の治療学的有効量を経口的に投与することを含んでなる方法。１５．細菌感染を治療する、微生物感染を患うある個体に、請求の範囲１のポリペプチドを含む薬剤学的組成物の治療学的有効量を投与することを含んでなる方法。１６．ＤＮＡセグメントが配列番号３に示される配列を有する、請求の範囲１に従うポリペプチドをコードする単離および精製されたＤＮＡセグメント。１７．請求の範囲１６のＤＮＡセグメントを含むベクター。１８．請求の範囲１７の組換えベクターを含んでなる組換え宿主細胞。１９．宿主細胞が、Ｓ．ムュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｔｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．ケレビサエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、バチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）、ラクトコッキエスピー（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉｓｐ．）、エンテロコッキエスピー（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉｓｐ．）、もしくはサルモネラエスピー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐ．）である、請求の範囲２０の組換え宿主細胞。２０．ｒｅｃＡ表現型を有する宿主細胞として更に特定される、請求の範囲１９の組換え宿主細胞。