JPH05508996A

JPH05508996A - 熱帯熱マラリア原虫のロプトリー関連タンパク質のクローニングと発現

Info

Publication number: JPH05508996A
Application number: JP3512707A
Authority: JP
Inventors: サウル，アラン・ジェームズ; クーパー，ジュアン・アントン; アービング，デイビッド・オーウェン
Original assignee: サラマン・プロプライエタリー・リミテッド
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1993-12-16
Also published as: EP0541629A4; IL99034A; WO1992002623A1; EP0541629B1; US5573943A; DE69130675T2; DE69130675D1; CA2088478C; MY107451A; ATE174963T1; ZA916106B; CA2088478A1; EP0541629A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】熱帯熱マラリア原虫のロブトリー関連タンパク質のりＯ−ニングと発現本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ１ａｓｍｏｄｉｕ＋１ｆａｌｃｉｐａｒ＋＊）のロブトリー関連タンパク質をコード化する遺伝子のクローニング、宿主細胞における該遺伝子の発現によって生産される組換えポリペプチド、並びにマラリア寄生虫に対するワクチンにおける該組換えポリペプチドの使用に関する。

世界の多くの地域において、マラリアは、その媒介動物および寄生虫に標的を定めた抑制手段に対して抵抗力を有することがわかっている。分子生物学の進歩は、現存の抑制計画を該寄生虫に対するワクチンによって増強する可能性を開拓した。現在、該寄生虫の生活環のうちの数段階が、そのような推定上のワクチンの標的として極めて綿密な調査の対象となっており、それらにはスポロゾイト（胞子小体）外殻タンパク質、無性赤血球血液段階に認められる種々のタンパク質及び力段階の表面上に存在するタンパク質が含まれる（ミラーら、　１９８６）。

該寄生虫が赤血球に侵入する段階はメロゾイトである。この段階において、該寄生虫の先端には一対の細胞小器官ロブトリー（ｒｈｏｐｔｏｒｙ）が存在し、こられはその侵入過程に関与する。侵入中にロブトリーの内容物が導管を通して排出され、これが発育性の有寄生虫小胞の形成において初期段階の役割を果すと思われる。

ロブトリー内容物中の抗原（複数）は、潜在的ワクチン候補として最初に同定された成分の１つである。フリーマンら（１９８０）は、醤歯目マラリア“プラスモジウム・ヨエリイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ）”のロブトリー中に認められるタンパク質に対するモノクローナル抗体が、プラスモジウム・ヨエリイの元来致死性である株によって攻撃（抗原投与）されたマウスに受動的な防護を付与し得ることを明らかにした。

このモノクローナル抗体の標的は精製され、それが免疫感作時に能動的防護を誘発することが示された（ホルダー及びフリーマン、　１９８０）。

ヒトマラリア寄生虫である熱帯熱マラリア原虫のロブトリーは詳しく研究されており、ロブトリーまたは先端細胞小器官に関連する数多くのタンパク質が発見されている。これらには次のものが含まれる：　２２５ｋＤａ抗原（ロジャーら、１９８８）、約１４０．１３０および１０５ｋＤａのタンパク質からなる複合体（カンプベルら、　１９８４　：ホルダーら、　１９８５　；シブイックら、　１９８６　、クーパーら、　１９８ｇ）、８０および４２ｋＤａタンパク質からなる複合体（ペリジ及びディアル、１９８２；カンプベルら、　１９８４　、ホワードら、　１９８４　、シヨフィールドら、　１９８６　；クラークら、　１９８７　；ブレェルら、　１９８８）、ホスホリパーゼ活性化プロテアーゼ（ブラウン−ブレトンら、１９８８）、並びに約８０ｋＤａ（ペダーリンら、　１９８９　；クリュウサーら、　１９９０）および５５ｋＤａ（スマイスら、　１９８ｇ）の個別のタンパク質。

８０／４０ｋＤａ複合体［シヨフィールドら（１９８６）とブレエルら（１９８８）は、これをＱＦ３と呼んでいる］の成分について報告されているサイズは、８０〜８２ｋＤａおよび４０〜４２ｋＤａの範囲で様々である。いくつかの研究では、８０ｋＤａ種の短寿命前駆体である８３ｋＤａ種、８０ｋＤａ種の一連の分解産物、および４２ｋＤａタンパク質の４３ｋＤａ誘導体が報告されている（ブレエルら。

１９８８）。以下の説明ではこの複合体をＱＦ３と呼ぶが、リドレイら（１９９０ａ）の命名法に従って、その８０ｋＤａ成分をＲＡＰ−１（ロブトリー関連タンパク質１）と呼び、その４２ｋＤａ成分をＲＡＰ−２（ロブトリー関連タンパク質２）と呼ぶことにする。

ＱＦ３複合体が熱帯熱マラリア原虫に対するワクチンの有望な候補であることを示唆する報告かい（つか公表されている。ＱＦ３に対するモノクローナル抗体はインビトロで寄生虫の成長を著しく阻害する（シヨフィールドら、　１９８６）。リドレイら（１９９０ｂ）は、アフィニティー精製されたＲＡＰ−１とＲＡＰ −２の混合物がサイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉ）ザルを免疫化し得ることを発見した。これらのサルはＲＡＰ−１とＲＡＰ−２の両方に対して抗体を発生させ、熱帯熱マラリア原虫で攻撃された時に実質的な防護を示した。またペリジら（１９８５）は、８０ｋＤａと４０ｋＤａのロブトリータンパク質を共に含有する混合物もしくは数種の４０ｋＤａロブトリ一タンパク貫からなる混合物による免疫化の後に、サイミリザルにおける実質的な防護を得た。これらのタンパク質は３種のモノクローナル抗体からなる混合物を用いて精製されたので、上述の結果の解釈は複雑である。現在では、これらはアルドラーゼ（セルタら、　１９８８）、ロブトリー関連プロテアーゼ（ブラウン−ブレトンら、　１９８ｇ）およびＱＦ３を含む数種の異なるタンパク質に対して向けられていると思われる。

最近、リドレイら（１９９０ａ）が８０ｋＤａのＲＡＰ−１タンパク質のクローニングについて記述している。本発明は、４２ｋＤａのＲＡＰ−２タンパク質の遺伝子のクローニングとその配列決定に関する研究、並びに細菌などの宿主細胞中で発現した組換えＲＡＰ−２の特性に関する研究から発生するものである。この研究で得られたデータから、ＲＡＰ−２が、これまでに提唱されていたように熱帯熱マラリア原虫アルドラーゼ（セルタら、　１９８ｇ）やセリンプロテアーゼ（ブラウン−ブレトンら、　１９８８）ではなく、またＲＡＰ−１に関連する（ペリジ及びディアル、　１９８２：リドレイら、　１９９０ａ）ものでもないことが立証された。このタンパク質はマラリア抗原として同定されたタンパク質としては珍しいいくつかの特徴を示す。これは反復要素を伴わない塩基性タンパク質であり、いくつかの単離物間で極微の配列多様性を示す。

本発明は、熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロブトリー関連タンパク質（ＲＡＰ −２）の抗原性を有するポリペプチドまたはその抗原性断片をその発現時にコードするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子を提供する。具体的には、本発明は、添付の図面の図３Ａに記載のヌクレオチド配列の全部または一部に対応するヌクレオチド配列あるいはその縮重アレル変種からなる組換えＤＮＡ分子を提供する。このようなヌクレオチド配列はその発現時に図３Ａのアミノ酸配列の全部または抗原性断片あるいはそのアレル変種に対応するポリペプチドをコードする。また該組換えＤＮＡ分子は、上記配列に機能的に連結した発現制御配列を含有してもよい。

また本発明は、上に概略を記した組換えＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター、並びにそのような組換えＤＮＡ分子または組換えＤＮＡクローニングベクターを含有する宿主細胞にも及ぶ。

さらに本発明は、最終的には、熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロブトリー関連タンパク質の全部または一部の抗原性を示す合成または組換えポリペプチド、並びに、該組換えポリペプチドを含有する組成物であって、熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロブトリー関連タンパク質に対する免疫応答を刺激する組成物に及ぶ。当然のことながら、上記組換えポリペプチドは上述の宿主細胞中での発現によって生産される。

熱帯熱マラリア原虫のＲＡＰ−１およびＲＡＰ−２タンパク質の同定並びにそれらの関係について、文献はかなり混乱した状況にある。その原因は、一部には、ロブトリー中に存在すると報告された約８０ｋＤａまたは４２ｋＤａの大きさのタンパク質の数、いくつかのマラリアタンパク質がタンパク質加水分解的に切断された一連の断片として抽出されやすいという性質、および、ＲＡＰ−１がＲＡＰ−２の約２倍の大きさであるという（偶然の）一致（それゆえにペリジ及びディアル（１９８２）は、ＲＡＰ−１がＲＡＰ−２の二量体であろうと提唱している）にあると思われる。

ＲＡＰ−１タンパク質はほとんど常に、親分子のタンパク質加水分解によって生成したと思われる一連の関連バンドとして単離される（ペリジら、１９８５：ショフィールドら、１９８６．クラークら、　１９８７　ニブシェルら、　１９８ｇ　：リドレイら、　１９９０ａ）。数人の著者が、ＲＡＰ−２もＲＡＰ−１の切断産物であろうと提唱している。例えばリプレイら（１９９０ａ）は精製されたＲＡＰ−１が分解してＲＡＰ−２とほぼ同じ大きさのタンパク質を与えることを発見しており、このことが上の見解を補強したのである。ＲＡＰ−１およびＲＡＰ−２タンパク質は、寄生虫の非イオン性界面活性剤抽出物中でしっかりと結合しているので、ＲＡＰ−１またはＲＡＰ−２に対する抗体は両方のタンパク質を免疫沈降させる。しかし、抗体は、ウェスタンブロッティングによりＲＡＰ− １またはＲＡＰ−２の一方とのみ反応するしくブレエルら、　１９８８）、あるいはＳＤＳで解離させたタンパク質からＲＡＰ−１またはＲＡＰ−２の一方のみを免疫沈降させる（クラークら、　１９８７）。このことは、これら２つのタンノくり質が抗原として異なることを示している。ブレエルら（１９８ｇ）は、ＲＡＰ−１とそのタンパク質加水分解的切断産物がＲＡＰ−２とは無関係であることを明らかにするべく、ペプチドマツピングから得られるデータを提供した。

この結論は、ＲＡＰ−１とＲＡＰ−２が別個の遺伝子によってコードされた異なるタンパク質であることを明らかにする本明細書記載のデータによって確認される。配列を比較することにより、これらのタンパク質が極めて異なることがわかる。これらのＤＮＡ配列またはタンパク質配列の間には有意な相同性は存在しない。ＲＡＰ−２はＲＡＰ−１よりかなり塩基性である。しかし、両方とも中程度の疎水性ドメインをいくつか有しており、おそらくこれが、精製されたＲＡＰ− １、ＲＡＰ−２およびそれらの複合体であるＱＦ３をＳＤＳなどの界面活性剤を含まない溶液中で維持することの困難さく非開示データ）、並びに、ロブトリーから排出されるらしい膜性物質とＱＦ３との結合（ブレエルら、　１９８８）の原因であると思われる。ＲＡＰ−２タンパク質重列とＮＢＲＦデータバンク中のタンパク質配列との間には有意な相同性が認められなかったし、またＧＥＮＢＡＮＫデータベース中の核酸配列を６つの読み枠すべてについて翻訳したものとＲＡＰ−２タンパク質重列を比較した場合にも有意な相同性は認められなかった。

本明細書で使用するＲＡＰ−２はＱＦ３複合体から誘導された。これ自体はＲＡＰ−１に対するモノクローナル抗体７Ｈ８１５０による免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製された。この手法で単離されるＲＡＰ−１のＶ８プロテアーゼ断片から決定したアミノ酸配列は、リドレイら（１９９０ａ）によって決定されたＲＡＰ−１配列内に含まれる。これは、本論文に記述されるＲＡＰ −２タンパク賀とリドレイら（１９９０ａ）が記述したＲＡＰ−１タンパク質がＱＦ３複合体の２つの成分であることを決定的に立証するものである。ＲＡＰ− １とＲＡＰ−２に近似する大きさを有する数種の他のタンパク質がロブトリー内に存在すると記述、されているので、このことは重要である。

ブラウン−ブレトンら（１９８８）は、メロゾイト由来の膜結合性ホスホリパーゼＣ活性化セリンプロテアーゼについて報告した。このタンパク質は８３ｋＤａのタンパク質として合成され、これがプロセシングを受けて７６ｋＤａの成熟タンパク質になる。また上記タンパク質はグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を介して固定されていると報告されている（ブラウン−ブレトンら、ブラウン−ブレトンら、　１９８ｇ中に引用されている）。モノクローナル抗体３１ｃ１３は、このタンパク質と、これより小さい４１ｋＤａタンパク質とを免疫沈降させる。またこのモノクローナル抗体は、ロブトリーに特有の斑点免疫蛍光様式を与える（ディアルら、　１９８６）。この初期の研究では、３１ｃ１３が、８２ｋＤａ、　６９ｋＤａ、４１ｋＤａ（二重線）のタンパク質を、より低存在量の数種の他のタンパク質と共に沈降させることが報告された。公表されたこの免疫沈降様式は、ＱＦ３について報告されたものと区別できない。しかし、ＲＡＰ−１とＲＡＰ−２はどちらもセリンプロテアーゼとの相同性を全く有さす、またどちらも、ＧＰＩ部分を介して固定されている他のマラリアのトリパノゾーマ型タンバグ賀に特有の疎水性Ｃ末端ドメイン（スマイスら、　１９８ｇ）を有さない。これらのデータはＲＡＰ−１と７６ｋＤａプロテアーゼが同じタンパク質でないことを示唆している。３１ｃ１３によって上記プロテアーゼと共に免疫沈降される４１ｋＤａの二重線がＲＡＰ−２である可能性はある。ＲＡＰ −２はＱＦ３複合体中で明らかにＲＡＰ−１と結合しているが、このデータは他のタンパク質と結合する可能性を排除するものではない。しかしもう１つの説明の方がよりあり得そうに思われる。３１Ｃ１３はこの膜プロテアーゼを結合するばかりでなく、やはり４１ｋＤａの大きさを有する熱帯熱マラリア原虫アルドラーゼ（セルツら、　１９８８）をも結合すると報告されている。

熱帯熱マラリア原虫アルドラーゼに対する一連のモノクローナル抗体に関して得られた免疫蛍光様式に基づいて、ペリンら（１９８５）とセルツら（１９１１１８）は、該アルドラーゼがやはりロブトリー内に存在することを示唆しており、このことがＲＡＰ−２が該アルドラーゼであるという推論を導いている。通常アルドラーゼは細胞の細胞質中に認められるので、ロブトリーに位置することは意外なことである。

他のロブトリータンパク質とは異なり該アルドラーゼはシグナルペプチドを有さないので、これがいかにしてロブトリー中に組み込まれるかは明らかでない。ロブトリーに位置するというこの報告は、アルドラーゼが寄生虫細胞質中に存在すると報告したナツプら（１９９０）の報告とは対照的である。

本研究により得られた配列データは、ＲＡＰ−２がアルドラーゼでないことを明確に示している。該寄生虫アルドラーゼはＲＡＰ−２に対する有意な相同性を示さないが、それらが偶然に共通のエピトープを持っているという可能性はまだ残っている。他のマラリアタンパク質では交差反応性が頻繁に観測されており（サウルら、　１９８９）、共通のエピトープの基礎を形成し得る両配列に共通の数種のトリペプチドが存在する。

ＲＡＰ−２タンパク質の同定は、公表されたサイミリザルにおけるワクチン研究を解釈する上で重要である。ベクタら（１９８５）は、アルドラーゼに対するモノクローナル抗体２８ｃｌｌ、８２ｋＤａプロテアーゼとアルドラーゼの両方に対するモノクローナル抗体３１ｃ１３並びにロブトリー内に位置しＱＦ３であるど思われる８２／４１ｋＤａ二重線を免疫沈降させるモノクローナル抗体５０ｃｌｌで精製したタンパク質の混合物を使用した。１つのサル群にはこれらのモノクローナル抗体によって認識されるすべてのタンパク質を与えた。第２群には４１ｋＤａタンパク質のみの混合物を与えた。両サル群は共に有意な防護を示したが、全混合物を与えた群のほうがより低い最高寄生虫血症を有した。上記４１ｋＤａ混合物の主要成分はアルドラーゼであった。モノクローナル抗体２８ＣＩ２は寄生虫の成長をインビトロで阻害したが（ベクタら、　１９８１）、その後の実験で、組換えアルドラーゼは防護的免疫をサイミリザルに誘導する効果を有さなかった（ヘレラら、　１９９０）。したがって、ＲＡＰ−２が上記４１ｋＤａ混合物の有効成分であったと思われる。

リドレイら（１９９０ｂ）は、ＲＡＰ−１とＲＡＰ−２の混合物を用いてサルを予防接種した。これらのサルは抗原投与時に有意な防護を示した。これらのサルから得られる抗原投与前の血清はＲＡＰ−１とＲＡＰ−２の両方をウェスタンプロットし、両タンパク質が免疫原性であったことを示した。リドレイら（１９９０ａ）はＲＡＰ−２がＲＡＰ−１のタンパク賃加水分解的分解産物であると考え、それゆえに彼らのデータを、ＲＡＰ−１の防護効果の証拠であると解釈した。

本明細書に開示するデータを考慮すれば、これを再評価する必要がある。

リドレイら（１９９０ａ）によるＲＡＰ−１のクローニングと、組換えＲＡＰ− ’ｌのクローニングと発現に関する本研究は、２つの主要なロブトリータンパク質の配列を確立するものである。またこれらの研究は、これらのタンパク質が熱帯熱マラリア原虫に対する防護的免疫をヒトにおいて誘発する際に果たすであろう役割を決定的に調べるための材料を調製するための基礎をも提供する。ＲＡＰ −２をコードする遺伝子の配列多形性の欠如に反映されるように、ＭＡｂによって認められる抗原性に多様性がないことは、他のマラリアワクチン候補が直面する主要な障害の１つがこのタンパク質にとっては重要でないであろうことを示唆している。

以下の実施例および添付の図面に、本発明のさらなる特徴、具体的には４２ｋＤａロブトリー関連タンパク質（ＲＡＰ−２）をコード化する遺伝子のクローニングおよび発現、について記述する。ＲＡＰ−２遺伝子のクローニングおよび組換えＲＡＰ−２の発現に関する特定の一例をこの実施例に記述するが、本明細書の開示によりＲＡＰ−２遺伝子の構造がわかってしまえば、当該技術分野でよく知られた異なるベクターと宿主細胞を用いる多くの異なる技術によって、この遺伝子のクローニングと発現を行い得ることを当業者は理解するであろう。したがって、単に例示のために本明細書の記述する特定の技術、ベクター、宿主細胞などに本発明が限定されないことは理解されるであろう。

図面について図１はＲＡＰ−２遺伝子の制限地図とクローニング法を表す。ここに示した制限部位は実験的に確認したものである。棒線は各クローン中にコード化されている領域を表し、濃い線は配列決定した領域を示す。ＲＡＰ−２／３．４．５は逆ＰＣＲから生成したものであり、これらのクローンは非連続的な領域を含有する。

これらのクローン中のスプライス部位を点線で示す。

図２は組換えＲＡＰ−２の発現を示す。ステニーバーら（１９９０）が記述したように、形質転換された細菌細胞をトリプトン大豆ブロス中でＡｓｓ。が９゜８〜１．０になるまで生育し、２ｍＩＭβ−イソプロピルチオガラクトンドで誘導した。５％β−メルカプトエタノールの存在下で煮沸した後、ＤＩＯシゾントの抽出物もしくはＲＡＰ−２組換えプラスミドまたは発現プラスミド単独でトランスフェクトされた誘導細菌細胞から得られるＳＤＳ可溶可溶化タンパ金賞２％ポリアクリルアミドゲルによる５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを、（Ａ）クーマシー・ブルーで染色するか、もしくは（Ｂ）過去に記述されているようにして（ブレェルら、　１９８８）、ニトロセルロースに転写してＭＡｂ　３Ａ９／４８でプローブした。

ＲＡＰ−２の位置を示す　この１２にゲル系ではＲＡＰ−２は３５ｋＤａの見掛は上の大きさを有する。約４０ｋＤａという過去の見積もりは７．５％ポリアクリルアミドゲルに基づくものであった。

図３は、（Ａ）ＲＡＰ−２クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列、並びに（Ｂ）Ｄｌｏ、３Ｄ７、ＨＢ３およびパｏ−アルドＣＰａ１ｏ　Ａｌｔｏ）系列のＲＡＰ−２配列中に検出されるヌクレオチド配列と翻訳したアミノ酸配列に関する多形性を示す。

図４はＲＡＰ−２タンパク質の疎水性特性図を表す。

実施例実験法寄生虫培養熱帯熱マラリア原虫系列をヒト赤血球および１０％血清中インビトロで生育した（トラガー及びジエンセン、　１９７５）。免疫蛍光研究に使用した系列は次の通りである：　ＦＣＱ−２７／ＰＮＧのＤ１０クローン（アンダースら、　１９８３）　；　ＮＦ　５４のクローン３Ｄ７、ＨｌのクローンＨＢ３．３Ｄ７とＨＢ３の交配から得られるクローンＸＣＬ１０（ウォリカーら、　１９８７）　；パロ・アルド（チャンクら、　１９８ｇ）、マラヤン・キー？ンブ（Ｍａｌａｙａｎ　Ｃａｍｐ）（リーチら、　１９８４）　：インドシナ１およびＦＶＯ（スタンレイら、１９８５）：クローンＩＴＧ２（マツティら、１９８ｇ）　：　ＰＣＲ３（ハトレイら。

１９８３）　：ウェルカムーリバプール（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ−Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）（ホルダー及びフリーマン。

１９８２）　；クローン７Ｇ８（ブルーツトら、　１９８４）、Ｋ　１（タイトング及びビール、　１９８１）、Ｖｌ（スタールら、　１９８５）、クローンＴ９／９４（タイトングら、　１９８４）。Ｄｌｏ、３Ｄ７、ＨＢ３およびパロ・アルドから得たＤＮＡをＲＡＰ−２遺伝子の配列決定に使用した。

モノクローナル抗体および免疫蛍光検定この研究で使用した５種類のＭＡｂは、３Ａ９／４８．３Ｄ９１５０．７ＨＢ１５０．３Ｅ６／６４、および３Ｈ７／６４であり、これらのイソタイプはそれぞれＩｇＧ、、Ｉ　ｇＧ３、ＩｇＧ２．、ＩｇＧ２．、およびＩｇＧ、、であった。３Ｅ４／６４と３Ｈ７／６４はアフィニティー精製したＱＦ３をグルタルアルデヒドで牛血清アルブミンに架橋したもので免疫化したマウスから得、他のＭＡｂはグルタルアルデヒドで固定したＦＣＱ−２７／ＰＮＧ単離体のシゾントで免疫化したマウスから得た。非還元寄生虫の免疫プロットでは、３Ａ９／４８．３Ｄ９１５０．３　Ｅ　６／６４および３Ｈ７／６４がＲＡＰ−２を認識する。３Ａ９／４８と３Ｄ９１５０は還元プロット上の抗原を認識した。７Ｈ８１５０はＲＡＰ−１を認識した。免疫蛍光検定を、過去に記述されているように（ブレエルら、　１９８ｇ）アセトン／メタノール（９０：１０　ｖ／ｖ）中−２０℃で１０分間固定した寄生虫の薄膜上で行った。

タンパク質精製およびＮ末端配列決定７Ｈ８１５０を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーと調製用電気泳動によってＱＦ３を精製した後、過去に記述されているように（ブレェルら、　１９８９）スタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼで切断した。無傷のＱＦ３複合体または個々のＶ８切断ペプチドを、モースら（１９８ｇ）の非連続的ＳＤＳポリアクリルアミド系を用いて電気泳動した。電気泳動後、タンパク質をポリビニルジフルオライド腹に電気泳動的に転写し、５０％メタノール中の０．１％クーマシー・ブルーＲ２５０で５分間染色し、５０％メタノール中で１０分間脱色し、水で洗浄した。染色されたバンドを切り出した後、アプライド・バイオシステムズ・モデル４７０シークエンサーで配列決定した。

りＯ−ニングおよびＤＮＡ配列決定パーキン・エルマー・シータス・ジーン・アンプ・キットを使用し、製造者の指示に従うことによって、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてＲＡＰ−２遺伝予断片を増幅した。モデル３８１オリゴヌクレオチド合成装置（アプライド・バイオシステムズ）を用いて順方向プライ？−［ＰＲＩＦ：　ｃｇａａｔ　ｔｃＡＡＡＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＣＣＮＧＡ（小文字は付加した制限部位を示す）］と逆方向プライ７−　［ＰＲＩＲ：　ｇｃａａｇｃ　ｔ　ｔ（Ａ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｔ）ＧＴ（Ａ／Ｇ）ＴＧＮＧＣ（Ａ／Ｇ）ＴＡ］を合成し、これらを用いて６９ｂｐの断片（５４ｂ　ｐのマラリア配列と１５ｂｐのリンカ−）を増幅した。第１回の増幅後、そのＤＮＡを４％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ（米国メイン州））での電気泳動にかけ、予期される大きさに対応するバンドを切り出し、再度増幅し、Ｍ１３ｍｐ１８中にクローン化した。その配列を、標準的な技術を用いて［３’Ｓ］ｄＡＴＰとクレノー・ポリメラーゼによるジデオキシ鎖終結法で決定した。

このクローンを用いて、消化したＤＮＡのサザンプロットをプローブすることにより、制限地図を作成した。この地図では、クローン化した配列が１．２ｋｂのＤｒａＩ断片内に含まれた。アニールした二本鎖合成オリゴマーＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（Ｍ１３ｘニバーサルプライマー配列）を、ＤｒａＩで制限切断したＤＩＯＤＮＡに連結し、連結したＤＮＡを１％アガロースゲル上でサイズ分画することによって過剰のオリゴマーを除去した後、このＤＮＡを、Ｍ１３シークエンジングプライマーと、ＲＡＰ−２／１．１中の独特の配列から誘導したプライ７−ＰＲ２Ｆ　：　ｇｇｇａａｔ　ｔｃＡＡＡＴＴｃＴＴＴＧＡｃＴＧＧＴＴとを用いるＰＣＲで増幅することによって、ＲＡＰ２／１．１クローンからこのＤｒａＩ断片の３°末端側への配列を増幅した。ＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡをＥｃｏＲＩ／３ｍａＩで消化したＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９　ＤＮＡ中にクローン化しようとした最初の試みは失敗したが、増幅したＤＮＡ −ｔ−Ｍ１３シークエンジングプライマー内で切断するＨａｅｍで消化した後に成功してＭ１３ｍｐ１８（ＲＡＰ２／２．１）とＭ１３ｍｐ１９（ＲＡＰ２．２／２）を得た。ヘニコフ（１９８４）のエキソヌクレアーゼ■法を用いて、−組の入れ子状欠失体を作成した。複製型ＲＡＰ２／２．１を調製し、ＢａｍＨＩとＰｓｔｌで消化した。ＲＡＰ−２配列内には１つのＰｓｔＩ部位が存在するが、 −組の欠失クローンを作成するには十分なりＮＡが無傷のまま残った。ｔａｑポリメラーゼとＡＢＩ　３７０ＤＮＡシークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用い、製造者の実験室に従って、これらのクローンを配列決定した。ＤｒａＩで切断し、連結し、次いで５ｓｐＩで切断したＤＮＡと、ＲＡＰ２／２．１の５゛領域と３′領域に由来する２つのプライマー（それぞれＰＲ３Ｒ：　ｇｇｇａａｔ　ｔｃＡＡｃＡＴＧＴＧｃＡＧＴＧＴＧとＰＲ３Ｆ：　ｇｇｇａａｔｔｃＣＡＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣ）とを用いて逆ＰＣＲ（トリグリアら、　１９８９）で増幅した後、］）ｒａＩ断片の５゛末端をＭ１３ｍｐ１８中にクローン化し、配列決定した。さらなる逆ＰＣＲ反応でＲＡＰ−２遺伝子の５′及び３′末端並びに隣接領域の両方をクローン化し、配列決定した。ＤＮＡをＲｓａＩで消化し、再連結した。５′配列については、このＤＮＡを５ａｕ３Ａで消化した後、上記プライｖ−ＰＲ３ＲとＰＲ５Ｆ　：　ｇｇｇａａｔ　ｔＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＧＣＡＧを用いて増幅した。３′配列については、上記ＤＮＡを５ｓｐＩで消化し、上記プライ７−ＰＲ３ＦとＰＲ６Ｒ：　ｇｇｇａａ　ｔｔＣＧＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣを用いて増幅した。増幅したＤＮＡ断片の両方をＥｃｏＲＩで消化し、Ｍ１３ｍｐ１８中にクローン化して、配列決定を行った。

染色体位置過去に記述されたようにして（リムバイブーンら、　１９９１）、染色体のサザンプロットを作成した。簡単に述べると、ＤＩｏ、３Ｄ７およびＨＢ３のアガロース包埋ブロックを調製し、溶解し、１％アガロース中でのパルスフィールド勾配ゲル電気泳動（パルス時間：　１００Ｖ１５０〜２７０秒（傾斜性）で２４時間、１００ｖ２７０秒で２０時間、最後に６０Ｖ９９９秒で５２時間）によって染色体を分離した。ＤＮＡをハイボンド−Ｎ膜（アマジャム）に転写した後、ＲＡＰ２／２．１から得た標識挿入物でプローブした。３Ｄ７クローンの移動度が減少する順番に従って染色体に番号を付け、一群の染色体特異的プローブを用いて他の単離体中の染色体の同定を確認した。ＲＡＰ−２遺伝子が位置する染色体５は、ＭＥＳＡ遺伝子の一部を含有するプローブにハイブリッド形成した（コツペルら、　１９８６）。

配列多様性の分析Ｄｌｏ、ＨＢ３．３Ｄ７およびパロ・アルドから得られるＤＮＡを、全長タンパク質のＮ末端とＣ末端に対応する２つのプライマー（ｃａｔｃａｃｇｇａｔｃｃＡＡＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＧとｃｔｃｔａｇａｇｔｃｇａｃＴＴＡＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣ）を用いて増幅した。そのＤＮＡをＢａｇ）ＩＩと５ａｌｌで切断し、ＢａｍＨＩ／５ａｉｌで切断したＭ１３ｍｐ１８およびＭｌ、３ｍｐ１９中にクローン化した。各寄生虫系列から得られる数クローンを配列決定して、対応する遺伝子の５′末端と３°末端を得た。増幅したＤＮＡをＲｓａＩで消化し、Ｍｌ、３ｍｐｌＳ中にクローン化した。各単離体から得た両方向を覆う数クローンを配列決定した。

組換えタンパク質の発現ＤＩＯと３Ｄ７から得たＤＮＡを、成熟タンパク質のＮ末端に対応するブライ７ −Ｃａｔ　ｃａｃｇｇａ　ｔ　ｃｃＧＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＧと、上で使用したＣ末端プライマーを用いて増幅した。適当に消化したＰＣＲ増幅産物を、ヘキサＨｉｓ発現ベクターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩ　１．６ＸＨＩＳ（ステユーノく−ら、１９９０）のＢａｍＨＩ／５ａｌＩ部位中に連結し、次いで、得られた組換え体を大腸菌５Ｇ１３００９（ゴッテスマンら、　１９８１）中に形質転換した。この宿主株は１ａｃＩ保持プラスミドであるｐＵＨＡｌで予め形質転換されていた。形質転換された細菌細胞を既に記述されているようにして生育したところ、組換えタンノ（り質が不溶性封入体として発現した。この細胞を６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中で溶解した後、ニッケルキレートカラムによるアフィニティークロマトグラフィー（ステニーバーら、　１９９０）を行うことにより、これを実質的に精製したく純度、〉８０％）。

結果Ａ、熱帯熱マラリア［虫のＦＩＡＰ−１およびＲＡ　Ｐ−２タン／＜り質のタンｌ＜り質重列モノクローナル抗体７Ｈ８１５０での免疫アフィニティークロマトグラフィーによって単離し、次いで調製用ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離したＱＦ３タンパク質を、Ｎ末端アミノ酸配列決定に付した。ＲＡＰ−１とその主要分解産物は、なんらのＮ末端配列をも与えることができなかった。ＲＡＰ−２からはＤ／ＴＫＸＥＴＥ／Ａという配列が得られたがその収量はわずかであった。ＲＡＰ−１とＲＡＰ−２の両方から誘導したスタフィロコッカス・アウレウスｖ８プロテアーゼ断片を分析することによって長い配列を得た。ＲＡＰ−２の４０ｋＤａのｖ８断片は、ＦＳＫＬＹＰＥＳＮＳＬＴＧＬＩＹＡＨＴＡという配列を与えた。ＲＡＰ −１の４８ｋＤａの断片からは、ＸＭＬＹＮＸＰＮＮＳＮＬＦＤという配列が得られた。これはＲＡＰ４の予想アミノ酸配列の位置３４８〜３６１に対応する。

このことは７Ｈ８１５０によって認識される８０ｋＤａタンパク質がＲＡＰ−１であることを確認するものであるから、本明細書で議論する４２ｋＤａタンパク質はリドレイら（１９９０ａ）が研究したものと同じ複合体の一部である。

ＲＡ　Ｐ−２遺伝子のクローニングアミノ酸配列ＫＬＹＰＥとＹＡＨＴＡに対応するＰＣＲプライマーを構築し、これらを用いて熱帯熱マラリア原虫寄生虫系列ＤＩＯから抽出される５４塩基対長のＤＮＡを増幅した。この断片をクローン化しくクローンＲＡＰ２／１．１）、配列決定した。プライマー配列の間に存在するＤＮＡは、予期されるアミノ酸配列５ＮＳＬＴＧＬＩをコード化していた。サザンブロッティングにより、この配列が１．２ｋｂのＤｒａｌ断片内に含まれることが示された。Ｍ１３ユニバーサルシークエンシングプライマーに対応する合成二本鎖オリゴヌクレオチドを、１〜２ｋｂの大きさで選択したＤｒａｌ切断ＤＩＯＤＮＡに連結した。これを、５４塩基対の最初のＰＣＲ増幅断片から誘導されるプライマーとＭ１３シークエンシングプライマーとを用いるＰＣＲ反応の鋳型として使用することにより、ｌｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。これをＥｃｏＲＩ　／　５ｌｌａ　Ｉで消化したＭ１３ｍｐ１８（ＲＡＰ−２／２．１）とＭ１３ｍｐ１９（ＲＡＰ−２／２．２）中にクローン化した後、配列決定した。図１に示すように、エキソヌクレアーゼ ■（ヘニコフ、　１９８４）を用いて作成した一連の規則正しい欠失変異体を使用することによって、ＲＡＰ−２／２．１を配列決定した。このＤｒａｌ断片の５°末端の配列を逆ＰＣＲ（トリグリア、　１９８８）を用いて完結させた。このＤｒａｌ断片は単一の読取り枠を有したが、開始コドンに特有の最初のＡＴＧコドンを含有していなかった。このクローンの３°末端はＴＡＡコドンで終わっており、これがＤｒａｌ切断部位の一部を形成していた。Ｒｓａｌで切断したＤＮＡを用いるさらなる逆ＰＣＲ反応を使用することにより、隣接領域の配列を得た（図１）。

熱帯熱マラリア原虫のＤＩＯクローンおよび３Ｄ７クローンから得られるＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヘキサＨｉｓベクターｐＤＳ５６／ＲＢＳＩＩ中にクローン化することにより、理論的にＲＡＰ−２の全成熟型をコードする構築物を得た。

この構築物で形質転換した大腸菌をＩＰＴＧで誘導したところ、１つの４２ｋＤａタンパク質が発現した。この組換えタンｌ＜り質は天然のタンノくり質と類似する大きさを有し、かつ、ＲＡＰ−２に対するＭＡｂ３Ｄ９１５０との免疫プロ・ソテイングによって反応したので、これにより上記クローン化遺伝子がＲＡＰ −２をコードしていることのさらなる証拠が得られた。

ＲＡＰ−２遺伝子の構造Ｄ１０クローンから得られるＲＡＰ−２遺伝子の配列を図３に示す。最初のＡＴＧの前には、他のマラリア遺伝子中に認められる転写開始共通配列（サウル及びバッティステユッタ、　１９９０）に近い配列中で終わっている高ＡＴ含量領域が存在する。コード領域は他のマラリアコード領域のものと類似するコドン使用剤並びに塩基傾向を有した。

パルスフィールド勾配電気泳動によって分離した染色体のサザンブロ・ソト上で、ＲＡＰ−２遺伝子はＤＩＯ１３Ｄ７およびＨＢ３クローンの染色体５にその位置が特定された。これは６塩基制限部位をほとんど伴わない領域中に位置する。

Ｂａ５ＨＩ、Ｈｉｎｄｍ、Ｐｓｔｌ−Ｋｐｎｌ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよび５ａｌＩで得られる制限断片は１％アガロースゲル上で解像するには大きすぎた。Ｄｒａｌ、５ｓｐＩ、Ｐｓｔｌ、５ａｕ３ａＩおよびＲｓａＩを単独で、並びに、組み合わせて用いることにより、制限地図を作成した。これは上記クローン化遺伝子の配列決定によって決定した制限部位の位置と合致した（図１）。

ＲＡＰ−２タンパク質の構造クローン化した配列は３９８アミノ酸からなるタンパク質をコードする。このタンパク質はシグナルペプチドの特徴を有する配列で始まっている。フオルツら（１９８６）の５ＩＧＳＥＱＩプログラムによる予測では、グリシン２１とアスパラギン酸２２の間で切断が起こって、ＤＫＣＥＴＥというＮ末端配列を伴う成熟タンパク質を与える。この配列は単離した天然タンパク質から低存在量で得られた配列（Ｄ／ＴＫＸＥＴＡ／Ｅ）と厳密に合致する。本研究者らは、成熟タンパク質が計算サイズ４４４８７Ｄａの３７７アミノ酸を含有すると結論する。これは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって観測された４２ｋＤａの大きさとよく一致している。多（のマラリアタンパク賀と異なり、この成熟タンパク質は反復要素を含有せず、著しく疎水性のドメインを含有する（図４）（カイト及びトウーリトル、　１９８２）。ただし、これらはいずれも膜貫通（スバニング）ドメインの特徴を有さない（クラインら、　１９８５）。このタンパク質は極めて塩基性であり、８．９の計算ｐ■を有する。ＲＡＰ−１に関するリドレイら（１９９０ａ）の配列データを用いることにより、本研究者らはＲＡＰ−１のｐＩを６．９と計算し、ＱＦ３複合体のｐＩを８．２と計算する。これはこの複合体について観測されたｐＩと合致する（クリュウサーら、　１９９０）。

上記成熟タンパク質は４つのシスティンを含有する。還元剤による処理後にＲＡＰ−２の電気泳動移動度がかなり移動するので（ブレェルら、　１９８ｇ）、これらのうち少な（とも２つはジスルフィド結合している。

ＲＡＰ−２中の配列多様性熱帯熱マラリア原虫クローンＤＩＯ１３Ｄ７、ＨＢ３およびサル適合単離体パロ・アルドから得られるＲＡＰ−２遺伝子に対応するＤＮＡを、シグナル配列の最初の６アミノ酸とＣ末端の５アミノ酸に対応するプライマーを用いるＰＣＲ反応によって増幅した。これらの断片のそれぞれの配列は、ＲＡＰ−２遺伝子が単離体間で配列の変化をほとんど示さないことを明らかにした（図３）。ＨＢ３とパロ・アルドのヌクレオチド配列は同一であった。ＨＢ３と３Ｄ７の間にはＣＴＴコドンをＴＴＡに変える２つの塩基変化があったが、これらは共にロイシンをコードするので、パロ・アルド、３Ｄ７およびＨＢ３の推定アミノ酸配列は同一である。Ｄ１０配列は異なっており、ＨＢ３配列とＤＩＯ配列の間に存在する３塩基変化はすべてアミノ酸置換をもたらす。

この多様性の欠如は、ＲＡＰ−２に対するＭＡｂで検出される抗原性の多様性の欠如と一致している。４つのＭＡｂはすべて、試験した１６寄生虫系列すべてと反応した。熱帯熱マラリア原虫の単離体間のこの保存にもかかわらず、薔歯目マラリア種であるプラスモジウム・チャバカン（Ｐ、　ｃｈａｂａｕｄｉ）、プラスモジウム・ヨエリイ、プラスモジウム・ベルゲイ（Ｐ、　ｂｅｒｇｈｅｉ）、およびプラスモジウム・ヴインケイ（Ｐ、　ｖｉｎｋｅｉ）から得られるＤＮＡのサザンブ口−７トをｌｋｂのＲＡＰ２／２゜１クローンでプローブしたところ、ハイブリッド形成バンドは穏当な厳密度においてさえ認められなかった。

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Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒｏｐ、Ｈｙｇ、　７８　：３３９−３４１゜ブレエル、Ｇ、Ｒ，，イングラム、Ｌ、Ｔ、、　ファルドウリス、Ｃ，Ａ、及びクーパー、ＪＡ、（１９８８）、　１１ｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、２８：１０５−１１２゜カンブベル、Ｇ、Ｈ，，ミラー、Ｌ、Ｈ，、ハドソン、Ｄ、、フランコ、　Ｅ、　Ｌ、及びアントリジアク、　Ｐ、　Ｍ、　（１９８４）、Ａｍ、　Ｊ、　Ｔｒａｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、　３３（６）　：１０５１− １０５４゜セルタ、Ｕ１．ゲルサ、Ｐ２．ドベリ、Ｈ，マチル、Ｈ１，コツカー、Ｈ，Ｐ、、シュリバスタバ、１．に、、シアウ、　Ａ、　Ｒ，及びペリン、　Ｌ、　Ｈ，（１９８８）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０３５−１０３８゜チャンク、ｓ、ｐ、、クライマー、に、Ｊ、、ヤマガ、　Ｋ、　Ｍ、　、　カド −１Ａ、、ケース、Ｓ。

Ｅ、及びシブイック、　Ｗ、　Ａ、　（１９８８）、　Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　６７：１−１１゜クラーク、Ｊ、Ｔ、、アナンド、Ｒ１，アコグル、Ｔ、及びマクブライド、　Ｊ　、　Ｓ　、　（１９８７）。

Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　Ｒｅｓ、　７３：４２５−４３４゜クーパー、Ｊ、Ａ、、　イングラム、　Ｌ、　Ｔ、　、ブレェル、Ｇ、Ｒ，，ファルドウリス、ＣＡ、、ステンゼル、Ｄ、、シヨフィールド、Ｌ、及びサウル、　Ａ、　Ｊ　、　（１９８８）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、２９二２５１ −２６０゜クーパー、　Ｒ，Ｌ、、　カルベナー、Ｇ１．ビアンコ、Ａ、Ｅ、、クリュウサー、　Ｐ、　Ｅ、。

ｘ　９−ル、　Ｈ，Ｄ、　、ブ５’７ン、Ｇ、Ｖ、、　７ンタース、Ｒ，Ｆ、及ヒ’ｙンプ、Ｄ、　Ｊ、（１９８６）、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、２０：２６５−２７７クリユウサー、　Ｐ、　Ｅ、、　カルベナー、Ｊ、Ｇ、、ンルバ、Ａ１．クーパー、Ｊ、Ａ、及びアンダース、　Ｒ，Ｆ、　（１９９０）、　ＥＸＩ）、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　７０：１９３−２０６゜７ｒルツ、Ｒ，Ｊ、及びゴートン、　Ｊ　、　Ｉ　、　（１９８７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ａｍ、　P４６：８７０−８７７゜フリーマン、Ｒ，Ｒ，、トレジドシーヴイクス、Ａｊ、及びクロス、　Ｇ、　Ａ、　Ｍ、　（１９８０）。

Ｎａｔｕｒｅ　２８４：３６６−３６８゜ゴッテスマンＳ、、　ハルバーン、Ｅ、及びトリスラー、　Ｐ、　（１９８１）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４８：１６５−２７３゜ハトレイ、Ｔ、Ｊ、、りＯ−／ツ、Ｆ、Ｗ、及びミラー、　Ｌ、　Ｈ，（１９８６）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４０＋４５１−４７７゜ハトレイ、Ｔｊ、、リーチ、Ｊ、Ｈ，、グリーン、Ｔ、Ｊ、、ダニエル、Ｗ、Ａ、、ワルグレン９Ｍ、、ミラー、　Ｌ、　Ｈ，及びホワード、　Ｒ，Ｊ　、　（１９８３）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ。

９：２７１−２７８゜ヘニコフ、　Ｓ、　（１９８４）、　Ｇｅｎｅ　２ｇ＋３５１−３５９゜ヘレラ、Ｓ、、ヘレラ、Ｍ、Ａ、、ベルラザ、Ｂ、Ｌ、、ブルキ、Ｙ、、カスペルス、Ｐ、。

ドベリ、Ｈ０，ロトマン、Ｄ及びセルツ、　Ｕ、　（１９９０）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　８７・４０１７−４０２１ホルダー、Ａ、Ａ、及びフリーマン、　Ｒ，Ｒ，（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　２９４二３６１−３６４゜ホルダー、　Ａ、　Ａ、及びフリーマン、　Ｒ，Ｒ，（１９８２）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５６：１５２８−１５３８゜ホルダー、　Ａ、　Ａ、　、フリーマン、Ｒ，Ｒ，、ユニ、ｓ及びアイカワ、Ｍ、（１９８５）、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、、　１４　：２９２−３０３゜ホワード、Ｒ，Ｆ、、スタンレイ、　Ｈ，Ａ、　、カンプベル、　Ｇ、　Ｈ，及びリーゼ、　Ｒ，Ｔ、　（１９８４）、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　ＴＪｙｇ、　３３（６）　：１０５５−１０５９゜クライン、Ｐ、、カネヒサ９Ｍ、及びデリシ、　Ｃ，（１９８５）、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８１５４６８−４７６゜ナツプ、Ｂ、、フント、Ｅ、及びクツペル、　Ｈ，Ａ、　（１９９０）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　４０：１−１２゜カイト、Ｊ及びドーリトル、　Ｒ，Ｆ、　（１９８２）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５７＋１０５−１３２゜リーチ、Ｊ、Ｈ，、バーンウェルｊ、Ｗ、、ミラー、Ｌ、Ｈ，及びホワード、　Ｒ，Ｊ　、　（１９８４）、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９８：１２５６−１２６４゜リムパイブーン、Ｔ、、シ刀ルイ、　Ｍ、　Ｗ、　、ラング、Ｄ、Ｊ、及びサウル、　Ａ、　（１９９１）。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　（印刷中）マツティ、Ｄｌ、ラングスレイ、Ｇ、、ブラウン−ブレトン、Ｃ１，グイロッテ７Ｍ、。

ドゥブレメント、Ｆ−Ｆ及びメルセリューーピュジロン、　Ｏ，（１９８ｇ）、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　２７：１７１−１８０゜ミラー、Ｌ、Ｈ，、ホワード、Ｒ，Ｊ、、　カルター、Ｒ１，グツド、Ｍ、Ｆ、、ヌセンズバイグ、■、及びヌセンズバイグ、Ｒ，Ｓ、（１９８６）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４＋１３４９−１３５６゜モース、Ｍｏ、ヌグエン、Ｙｊ、及びリウ、　Ｔ、　Ｙ、　（１９８８）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６３：６００５−６００８゜ベリンル、Ｈ９，ラミレズ、Ｅ、、ラムバート、　Ｐ、　Ｈ，及びミーシャー、　Ｐ、　Ａ、　（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　２８９：３０１−３０３゜ペリン、　Ｌ、　Ｈ，及びディアル、　Ｒ，（１９ｇ２）、　Ｉｗｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、　６１：２４５−２６７゜べり：／、Ｌ、Ｈ，、？−４ル、Ｂ、、ガブーｙ、Ｍ、Ｓ、、　ストッカー、Ｊ、Ｗ、、チゾリ一二、Ｃ，及びリチー、　Ｒ，（１９８５）、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７５：１７１８−１７２１゜／＜ターフ　：／、Ｍ、　Ｇ、、　７−ン＋ル、　Ｖ、　Ｍ、、　スマイ入Ｊ、　Ａ、、’）　’Ｊ　ユウｔ　＋、　ｐ。

Ｅ、、リュウ、Ａ１．シルバ、Ａ、、アンダース、Ｒ，Ｆ、及びラング、Ｄ、　Ｊ、（１９８９）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９：３１５１−３１５４゜リドレイ、Ｒ，Ｇ、、タカクス、Ｂ、ラーム、Ｈ０、デルベス、Ｃ，Ｊ、、ゴーマン、Ｍ、。

セルタ、Ｕ、、７チル３Ｈ２，ウーレット、　Ｇ、　Ｒ，及びスカイフェ、　Ｊ　、　Ｇ、　（１９９０ａ）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｗ＋、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　４１：１２５−１３４゜リド１ノイ、　Ｒ，Ｇ、　、タカクス、Ｂ、、エトリンガ−１Ｈ７及びスカイフェ、Ｊ、Ｇ、（１９９０ｂ）、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、１０１：１８７−１９２゜ロジャー、Ｎ、、ドゥブレメッツ、Ｊ、、デフレプレイス、Ｐ、、フ才すター、Ｂ、、トロンチン、　Ｇ、及びベルネス、　Ａ、　（１９８８）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　２７：１３５−１４２゜サウル、Ａ、及びバッティシュテユッタ、Ｄ、　（１９８８）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　２７：３５ −４２゜サウル、Ａ、及びバッティシュテｘ　ツタ、　Ｄ、　（１９９０）、　１ｌｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　４２：５５−６２゜サウル、Ａ１．ロード、Ｒ１，ジョーンズ、Ｇ１．ゲイセン、Ｈ，Ｍ、、ゲイル、Ｊ、及びモラード、Ｒ，（１９８９）、Ｐａｒａｓｉｔｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１：５９３−６０１゜シヨフィールド、Ｌ１．ブシェル、　Ｇ、　Ｒ，、クーパー、Ｊ、Ａ７．サウル、Ａ、Ｊ、、アップクロフト、Ｊ、Ａ、及び千ドソン、　Ｃ，（１９８６）、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、１８　：　１８３−１９５゜シブイック、Ｗ、Ａ、、タム、　Ｌ、　Ｑ、　、カン、Ｓｌ、クレイマー、に、Ｌ、、ケース、Ｓ。

Ｒ９，パル７＋、に、Ｌ、、ヤマが、　Ｋ、　Ｍ、及びヒュイ、Ｇ、Ｓ、Ｎ、（１９８６）、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋＋ｍｕｎ、　５１（１）　：３１４−３１８゜スマイス、Ｊ、Ａ、、コッヘル、Ｒ，Ｌ、、ブラウン、Ｇ３．、　シマ４ｔミー、Ｒｏ、ラング、Ｄ、Ｊ、及びアンダース、　Ｒ，Ｆ、　（１９８ｇ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８５：５１９T− ５１９９゜スタール、　Ｈ，Ｄ、　、　ラング、Ｄ、Ｊ、、クリュウサー、　Ｐ、　Ｅ、、スカンロン、Ｄ、Ｂ、。

ウッドロウ、Ｇｏ、ブラウン、　Ｇ、　Ｖ、、ビアンコ、　Ａ、　Ｅ、、　アンダース、Ｒ，Ｆ、及びコツペル、　Ｒ，Ｌ、　（１９８５）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ニア８３７−７８４６゜スタンレイ、Ｈ，Ａ、、　ホワード、Ｒ，Ｆ、及びリーゼ、　Ｒ，Ｔ、　（１９８５）、　Ｊ、　Ｉｍ＋５ｕｎｏ１．１３４：３４３９−３４４４゜ステニーバー、Ｄ、、　７チル、Ｈ９及びガロ−７タ、Ｇ、　（１９９０）、“ Ｉａ＋ｍｕｎｏｒｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈ。

ｄｓ”（レフコヴイッッ、■、及びペルニス、８０編、アカデミツクプレス、ニューヨーク、箪■ｖ巻、　１２１−１５２頁）。

タイトング、Ｓ、及びビール、　Ｇ　、　Ｈ，（１９８１）、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、　７T　：２７１ −２７３゜タイトング、Ｓ、、ビール、ＧＨ７，フェントン、Ｂ、、マクブライド、Ｊ、、ロサリオ、■１、ウォーカー、Ａ、及びウォリカー、　Ｄ、　（１９８４）、　Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｉｆｙｇ、　７８：２４２−２４５゜トリグリア、Ｔ、、ベダーリン、Ｍ、Ｇ及びランブ、　Ｄ、　Ｊ　、　（１９８８）、　Ｎｕｅｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ。

１６：８１８６、ウォリカー、Ｄ、クアキ、１．Ａ、、　ウエレムス、Ｔ、Ｅ、、マクカッチエン、Ｔ、Ｆ、。

スザルフマン、Ａ、、ロンドン、Ｗ、Ｔ、、コルコラン、Ｌｉ２．、プルコツト、Ｔ、Ｒ。

及びカーター、Ｒ，（１９８７）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：１６６１−１６６６゜アミノ酸要約書熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロブトリー関連タンパク質（ＲＡＰ−２）またはその抗原性断片の抗原性を示す合成または組換えポリペプチド、並びにその発現のための組換えＤＮＡ分子、ベクターおよび宿主細胞。

トラリア連邦クイーンズランド４０５１、アルダ１ノー、ブＩＪマウトリート４０番トラリア連邦ニュー・サウス・ウエールズ２０６６、レーン・コオズボーン・ロード３０番

Claims

【特許請求の範囲】

１．熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロプトリー関連タンパク質（ＲＡＰ−２）の抗原性を有するポリペプチドまたはその抗原性断片を発現時にコード化するヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子。
２．図３Ａに記載のヌクレオチド配列またはその縮重もしくはアレル変種の全部または一部に対応するヌクレオチド配列を含有する請求の範囲第１項の組換えＤＮＡ分子。
３．さらに該ヌクレオチド配列に機能的に連結した発現制御配列を含有する請求の範囲第１項または第２項の組換えＤＮＡ分子。
４．請求の範囲第１項から第３項までのいずれかの組換えＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡクローニングベクター。
５．該ベクターがプラスミドである請求の範囲第４項の組換えＤＮＡクローニングベクター。
６．請求の範囲第１項から第３項までのいずれかの組換えＤＮＡ分子、または請求の範囲第４項または第５項の組換えＤＮＡクローニングベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞。
７．該宿主細胞が大腸菌である請求の範囲第６項の宿主細胞。
８．請求の範囲第６項または第７項の宿主細胞における発現によって生産される合成または組換えポリペプチド。
９．熱帯熱マラリア原虫の４２ｋＤａロプトリー関連タンパク質（ＲＡＰ−２）またはその抗原性断片の抗原性を示す合成または組換えポリペプチド。
１０．図３Ａのアミノ酸配列またはそのアレル変種の全部または抗原性断片に対応するアミノ酸配列を含有する請求の範囲第９項の合成または組換えポリペプチド。
１１．請求の範囲第８項から第１０項までのいずれかの合成または組換えポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含有するワクチン組成物。
１２．さらに佐剤を含有する請求の範囲第１１項のワクチン組成物。
１３．宿主を熱帯熱マラリア原虫に対して能動的に免疫化する方法であって、請求の範囲第８項から第１０項までのいずれかの合成または組換えポリペプチド、もしくは請求の範囲第１１項または第１２項のワクチン組成物を該宿主に投与することからなる方法。