JPH10511543A

JPH10511543A - ハチのブラコン・ヘベター由来毒素

Info

Publication number: JPH10511543A
Application number: JP8516675A
Authority: JP
Inventors: ウィンダス，ジョン・デイヴィッド; ダンカン，レイチェル・エリザベス; バウル，ヴァレリー・ジェイン; クリスチャン，ピーター・ダニエル
Original assignee: ゼネカ・リミテッド; コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガナイゼーション
Priority date: 1994-11-22
Filing date: 1995-11-21
Publication date: 1998-11-10
Also published as: EP0792361A1; US6156536A; TW342413B; WO1996016171A1; CA2204524A1; AP9700991A0; IL116071A0; BR9509744A; CN1172503A; HUT77119A; AU713922B2; AR001321A1; MX9703764A; TR199501465A2; AU3877795A

Abstract

(57)【要約】ブラコン・ヘベター（Bracon hebetor）から入手可能な新規昆虫毒素であって、それをコードするＤＮＡ配列を含む該昆虫毒素、該毒素をコードする少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物、および該組換えＤＮＡ構築物を含む生物的防除剤。

Description

【発明の詳細な説明】ハチのブラコン・ヘベター由来毒素本発明は、新規な昆虫毒素、昆虫に対して有毒であるタンパク質をコードしているＤＮＡ配列、昆虫に対して有毒であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物、および該昆虫毒素、ＤＮＡ配列または組換えＤＮＡ構築物を含む生物的防除剤に関する。多数の群居バチの毒液は広く研究されており、強力な多数の生物学的活性アミン、痛みを生じる神経ペプチド、アレルゲンおよび神経毒を含むことが知られている（ピエク（Piek）（1991）Toxicon,29,139-149）。ほとんど理解されていないのは、単独性バチ、特に、寄生生活をするものの毒液である。多数の単独性寄生バチは昆虫を捕食し、そして２５０を越える種は、それらの宿主を麻痺させることが観察された（論評に関しては、ピエクおよびスパンジャ（Spanjer）（198 6）Venoms of Hymenoptera，Ｔ．ピエク（監修）アカデミック・プレス（Academ ic Press），ロンドン 161-307 頁を参照されたい）。これらの種の多くは、コマユバチ（Braconidae）科である。コマユバチの大部分は一次寄生者である。成虫は、ほとんど他の昆虫の体内にまたはに対してだけ産卵し、そして孵化した後、ハチ幼虫はそれらの宿主を餌にする。注意を引いた一つのコマユバチ種は、ブラコン・ヘベター（Bracon hebetor）（ブラコン＝ミクロブラコン（Microbraco n）＝ハブロブラコン（Habrobracon））である。ブラコン・ヘベター（Ｂ．ヘベター）は、隠蔽的なまたは繭を作る生活様式を有する鱗翅類（Lepidoptera）幼虫の小型の（３ｍｍ）寄生虫である。成虫雌バチは、宿主幼虫の体外に産卵すると同時に、麻痺性毒液を注入する。何分かの内に、宿主幼虫は協調運動しなくなり、ついには完全な麻痺状態に陥る。直ちに致命的ではないが、この麻痺は永続し、そしてハチ幼虫が出てきてそれらの宿主を餌にするまでその昆虫を動かなくする。Ｂ．ヘベターの毒液は、極めて強力な麻痺活性を有する。更に大型のハチミツガであるガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）（Ｇ．メロネラ）の幼虫において、完全なおよび永続的な痲痺は、宿主血リンパ２００，０００，０００部に対して毒液１部の濃度で起こると推定された（ビアド（Beard）（1952）Conn. Agric.Exp.Stn.New Haven Bulletin,562,27）。更に、毒液は、昆虫に対しておよび昆虫目間に選択的毒性をを示す。クモ、ザリガニ、カエル、ラットおよびモルモット神経筋標品はいずれも、毒液に対して感受性でないと考えられる（ラスメーヤー（Rathmayer）およびウォルター（Walther）（1976）Animal,Plant and Microbial Toxins,2，プレナム・プレス（Plenum Press），ニューヨーク，299 -307；デイトマー（Deitmer）（1973）Die Wirkung des Griffes der Schlupf-w espe Habrobracon Say auf die neuromuskulare Ubertragung am sartoriusmusk el des Frosches，卒業論文，ボン大学）。Ｂ．ヘベター毒液の痲痺性成分は、おそらくは、シナプス小胞の放出を阻害することにより、神経筋接合部での刺激性グルタミン作動性伝達をシナプス前に遮断することによって作用すると考えられる（ウォルターおよびライネッケ（Rein ecke）（1983）Neuroscience,9,213-224；ピエクおよびマンテル（Mantel）（19 70）Comp.Gen.Pharmcol,1,87-92；ピエク（1966）J.Insect Physiol.,12,561-56 8）。昆虫を捕食する多数の節足動物からの毒液は、昆虫に対して選択的に作用する毒素を含有することが判った。このような昆虫選択的神経毒は、昆虫神経生理学を研究するのに重要な分子手段でありうる。Ｂ．ヘベター毒素の作用および昆虫選択性の様式は、鱗翅類における神経筋伝達の研究においておよび鱗翅類神経筋接合部での小胞放出の研究においてそれが有用でありうることを予想させる。このような昆虫選択性は、害虫の防除において極めて好都合であることも理解されるであろう。しかしながら、Ｂ．ヘベターからのタンパク質性毒素についての公表された情報は、多数の毒素が存在しうることを示唆しているので、まず第一に、鱗翅類幼虫に対して高い神経毒活性を有する毒素を精製し且つ特性決定することが必要であった。本発明者は、ここで、２種類の神経毒性タンパク質を精製し且つ特性決定し、単にそれらを簡単に表示するために、ブラコン毒素１および２（以下、ＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２）と称した。したがって、本発明の一つの態様により、４種類のポリペプチドサブユニットを含む昆虫毒素であって、該ポリペプチドサブユニットが配列番号１、２、３および４で示されたＮ末端アミノ酸配列を有する上記昆虫毒素を提供する。この昆虫毒素は、ＢｒｈＴＸ−１に該当する。本発明のもう一つの態様により、本明細書中に定義のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定される約３４，０００Ｄａ、約２１，０００Ｄａ、約１８，５００Ｄａおよび約１７，０００Ｄａの推定分子量を有する、寄生バチから得られる昆虫毒素を提供する。この昆虫毒素は、ＢｒｈＴＸ−２と称する毒素に該当する。本発明者は、更に、少なくともＢｒｈＴＸ−１のポリペプチドサブユニットを単離し且つ特性決定した。したがって、本発明のもう一つの態様により、配列番号１９で示される核酸配列；配列番号１９で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号１９で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号１９で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む単離ＤＮＡを提供する。本発明の更にもう一つの態様により、配列番号４６で示される核酸配列；配列番号４６で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号４６で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号４６で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む単離ＤＮＡを提供する。本発明のもう一つの態様により、配列番号５７で示される核酸配列；配列番号５７で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号５７で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号５７で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む単離ＤＮＡを提供する。本発明の更にもう一つの態様により、配列番号３６で示される核酸配列；配列番号３６で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号３６で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号３６で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む単離ＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡであってよい。上述のように、本発明は、本発明のＤＮＡ配列に対して６０％またはそれ以上の相同性を示すＤＮＡを包含する。好ましくは、＞６５％、更に好ましくは＞７０％、より一層好ましくは＞７５％または＞８０％のヌクレオチドが一般的である。特に好ましいのは、８５％、９０％、９５％、または９９％若しくはそれ以上の相同性を示す配列である。本発明は、更に、本発明のＤＮＡに対してハイブリッド形成するＤＮＡを包含する。好ましくは、このようなハイブリダイゼーションは、低および高緊縮条件でまたはその間で起こる。一般用語で、低緊縮条件は、ほぼ周囲温度〜約６５℃ で３ｘＳＣＣと定義することができるし、そして高緊縮条件は約６５℃で０．１ｘＳＣＣと定義することができる。ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムの緩衝液の名称である。３ｘＳＳＣは、ＳＳＣの３倍程度の強度等である。本発明は、更に、本発明のＤＮＡに対して遺伝コードの結果として縮重したＤＮＡを包含する。本発明のもう一つの態様により、昆虫毒素であり且つ通常はそれが結合している他のタンパク質を実質的に含まない、そして本発明のＤＮＡのいずれかによってコードされるポリペプチドを提供する。本発明の更にもう一つの態様により、配列番号２０、４７、５８または３７の、それらの誘導体を含めたいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。好ましくは、前記アミノ酸誘導体は、好ましくは８０％またはそれ以上の共通のアミノ酸、更に好ましくは９０％またはそれ以上の共通のアミノ酸を有する同族変異体である。好ましくは、いずれの変化も同類アミノ酸変化である。同類アミノ酸変化によって、本発明者は、アミノ酸群、すなわち、疎水性、極性、酸性または塩基性の内の一つからのアミノ酸を同群中からのアミノ酸によって置き換えることを意味している。このような変化の一例は、メチオニンによるバリンの置換およびその逆である。本発明は、更に、同族体遺伝子それぞれに由来する転写一次産物の別のスプラライシング経路から生じるｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを包含する。本発明は、更に、本発明のポリペプチドの翻訳後修飾によって生じるポリペプチドを包含する。このような翻訳後修飾としては、ペプチド切断、補欠分子族の付加、グリコシル化またはマルチサブユニット構造の形成がある。本発明のｃＤＮＡは、本発明の昆虫毒素を形成するポリペプチドをコードする。本発明のポリペプチドは、本発明の昆虫毒素のサブユニットに該当する。更に、本発明のそれぞれのｃＤＮＡ配列は、昆虫に対して有毒である作用を個々に提供しうるポリペプチドをコードする。したがって、本発明のポリペプチドはそれぞれ、昆虫に対して有毒である作用を提供する。本発明のもう一つの態様により、本発明のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。このような構築物には、目的の細胞を形質転換するのに適当なプラスミドおよびファージなどのクローニングベクターが含まれる。本発明のもう一つの態様により、組換えＤＮＡ構築物は発現ベクターである。本発明は、利用可能であるまたは利用可能になる適当な構築物をいずれも包含する。本発明の更にもう一つの態様により、本発明の組換え構築物を含む形質転換系を提供する。このような形質転換系には、哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物および無脊椎動物細胞、昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。本発明は、更に、細菌、酵母、特に、本発明の組換え構築物によって形質転換された真菌、および本発明のＤＮＡを包含することができるようにゲノムが直接的にまたは間接的に遺伝子操作されたウイルスを包含する。形質転換／遺伝子操作に適当な系は、当業者に知られているであろう。このような組換え構築物／系を製造する方法は、本発明に特に密接な関係があるのではなく、標的に適当な方法はいずれも用いることができ、このような方法は当該技術分野において知られている。本発明のＤＮＡ／毒素／ポリペプチドは、ヒメバチ（Ichneumonidae）上科などの寄生バチから得られる。好ましくは、毒素は、コマユバチ科から得られる。コマユバチ科の例は、アパンテレス（Apanteles）属、ブラコン属、ミクロブラコン属およびステノブラコン（Stenobracon）属中にある。特に好ましい実施態様において、ＤＮＡ／毒素／ポリペプチドはブラコンヘベターから入手する。本発明のＤＮＡ／毒素／ポリペプチドは、その他の源から／異なった経路によって、例えば、慣用的なクローニング技術または合成法を用いて得ることができる。本発明のもう一つの態様において、本発明の昆虫毒素、ポリペプチド、組換えＤＮＡ構築物または形質転換系を含む生物的防除剤を提供する。この場合、生物的防除剤は、好ましくは、農学的に許容しうる固体または液体担体を更に包含する。したがって、生息地において害虫を駆除する方法であって、害虫防除有効量の本発明の昆虫毒素によって害虫または生息地を処置することを含む上記方法を提供する。本発明は、更に、本発明の核酸を含み、該核酸の発現を可能にするプロモーター配列の制御下にあるゲノムを有する生物的防除剤を包含する。したがって、生物的防除剤という用語に包含されるのは、昆虫と共存させた場合に、昆虫に感染し且つその正常な生化学的、生理学的または電気生理学的過程を妨げ、そして最終的に昆虫の死をもたらすことができるウイルス、原核生物または真核生物である。本発明の範囲内の適当な生物的防除剤には、昆虫の細菌性、ウイルス性および真菌性病原体に基くものがある。細菌性病原体としては、例えば、Ｂ．トゥリンギエンシス（thuringiensis）およびＢ．セレウス（cereus）等のようなバチルス属（Bacillus）種がある。昆虫の真菌性病原体としては、例えば、Ｂ．バシアナ（bassiana）などのハクキョウサン病菌属（Beauvaria）がある。或いは、生物的防除剤は、本発明の少なくとも一つの核酸配列を包含するようにゲノムが変更された遺伝子修飾内部寄生性植物でありうる。このような内部寄生性植物をある植物と共存させる場合、核酸によってコードされた毒素はその植物内の内部寄生性植物によって発現され且つその植物を食べるまたはその植物内に住む昆虫に対して毒性作用を及ぼすことができる。もう一つの変形において、生物的防除剤は、植物それ自体、特に、繊維製品の食用に栽培された栽培植物であって、その植物ゲノムが、本発明の少なくとも一つの核酸配列の包含によって修飾された植物でありうる。ここで、本発明の様々な好ましい特徴および実施態様を、添付の図面に関して非制限実施例によって記載するが、ここにおいて、図１は、毒腺抽出物Ｂ−１およびＢ−２並びに精製毒素ＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２の分離のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；図２は、非変性ＰＡＧＥを用いて回収された抽出物を、非イオン交換クロマトグラフィーを用いて更に分離する場合の結果を示す；図３は、Ｂ−１のサイズ分別クロマトグラフィーの結果を示す；図４は、天然Ｂ−１毒素の分子量を計算するのに用いられるグラフを示す；図５は、還元および非還元条件下でＰＡＧＥを用いるＢｒｈＴＸ−１の分別の結果を示す；図６は、ＢｒｈＴＸ−１から得られたサブユニットについてのＮ末端アミノ酸配列情報を示す；図７は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）のＮ末端アミノ酸配列並びにＢＨ（ａ）Ａ、ＢＨ（ａ）ＢおよびＢＨ（ａ）Ｉの対応する縮重したオリゴヌクレオチド設計を示す；図８は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）のｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す；図９は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｄ）のＮ末端アミノ酸配列並びにＢＨ（ｄ）Ａ、ＢＨ（ｄ）ＢおよびＢＨ（ａ）Ｉの対応する縮重したオリゴヌクレオチド設計を示す；図１０は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｄ）のｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す；図１１は、ｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）１のインサートのｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示し、プライマー配列ＢＨ（ｂ）ＣおよびＢＨ（ｂ）Ｄは太字で示され且つ５′−３′方向はくさび形で示される；図１２は、プラスミドＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６からのサブユニットＢｒｈＴＸ −１（ｂ）の推定のｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す；図１３は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）の推定のｃＤＮＡ配列のタンパク質翻訳を示し、成熟タンパク質は下線で示される；図１４は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）の共通ｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す；図１５は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｃ）からのペプチドフラグメントおよびそれらの推定のコーディング配列を示す；図１６は、プライマーＢＨ（ｃ）ＡおよびＢＨ（ｃ）Ｂを用いて得られたサブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｃ）ＰＣＲ増幅生成物の配列を示す；図１７は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｃ）のｃＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す。実施例１−ＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２の単離および特性決定材料および方法（ｉ）昆虫Ｂ．ヘベターの樹立された集団（R T アーボガスト（Arbogast）博士，ＵＳＤＡ−ＡＲＳ，私書箱２２９０９，サバンナ，ジョージア，米国から入手）を、トウモロコシ粉ガ（プロディア・インタープンクテラ（Prodia interpunctella））の幼虫上において２５℃で明１６時間：暗８時間の光周期によって飼養した。Ｐ．インタープンクテラおよびＧ．メロネラの幼虫を、英連邦科学・工業研究協会昆虫部会（the Commonwealth Scientific and Industrial Research Corporat ion,Division of Entomology）で樹立された集団から入手し、そして２５℃において、Ｇ．メロネラに対しては、米粉幼児用セリアル６００ｇ、醸造酵母６０ｇ、ハチミツ１２５ｍｌおよびグリセロール１２５ｍｌから成る、およびＰ．インタープンクテラに対しては、大豆粉１０００ｇ、フスマ５００ｇ、乾燥酵母２５０ｇ、小麦胚芽２５０ｇ、ひき割り小麦５００ｇ、ロールドオート５００ｇおよびグリセロール３７５ｇから成る飼料で飼養した。（ii）毒素活性の生物検定Ｂ．ヘベタータンパク質標品の麻痺活性を、Ｇ．メロネラの幼虫を用いて常套手段によって測定した。生物検定において用いられる幼虫の齢および発育状態は決定されなかったが、しかしながら、体重０．１５ｇ〜０．２ｇの幼虫だけを用いた。生物検定は、腹脚間の血体腔中に用いられるタンパク質試料１０μｌまたは対照緩衝液を注射することによって行われた。幼虫が、刺激しなければ動かないし且つ仰向けに置かれて３０秒後以内に起きられなかった場合に麻痺を評点した。毒素の正確な監視は、活性に関して試験抽出物の連続希釈を検定した端点検定を用いることによって容易にされた。麻痺活性は、ガレリア単位（Galleria U nit）（ＧＵ）の変法を用いて測定された（ドレンス（Drenth）（1974）Toxicon ,12,198-192）。注射された抽出物１０μｌ中のＧＵ数は、注射後約２時間で幼虫の麻痺を引き起こした抽出物希釈度の逆数を得ることによって決定された。次に、この値に１００を乗じて、ＧＵ数／ｍｌ（抽出物）を得た。（iii）毒腺成分の抽出雌バチを４℃で麻酔した後、氷上で保持すると同時に、鋭利な鉗子によって産卵器を静かに引抜くことによって毒腺を摘出した。毒腺５０個のロットを、アジ化ナトリウムによって０．０２％にされ且つプロテイナーゼ阻害剤ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩）（５ｍＭ）、アプロチニン（５ｍＭ）およびペプスタチン（０．１μｇ／ｍｌ）を含有する等浸透プリングル（Pringl e's）食塩水（ＮａＣｌ９ｇ／ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ₂ ０．２ｇ／ｌ、デキストロース４ｇ／ｌ）５０μｌ中に抽出した。プロテイナーゼ阻害剤は、ベーリンガー・マンハイム（Boerhringer-Mannheim）から入手した。ミクロホモジナイザーを用いて手動によって腺をホモジナイズし、そしてエッペンドルフ（Eppendorf）ミクロ遠心分離機中において１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって不溶性材料をペレットにした。次に、毒素を含有する上澄みを、０．２２μｍウルトラフリーｍＣフィルター（ミリポア（Millipore），ベッドフォード，ＭＡ）を介して濾過した。（iv）タンパク質測定および濃縮タンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標準として用いて、バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）から入手したタンパク質検定キットによって測定された。タンパク質試料を、製造者の提示にしたがってウルトラフリー−ＭＣ濃縮装置（ミリポア）を用いて濃縮した。（ｖ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動および陰イオン交換クロマトグラフィーポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥ）装置および試薬、ＰＡＧＥおよびゲル濾過標準タンパク質配合物、並びに銀染色試薬はいずれも、バイオ・ラド・ラボラトリーズから購入した。変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、レムリ（Laemmli）（1970 ）Nature,222,680-685 によって記載のように、１５％スラブゲル（１１ｃｍｘ１４ｃｍｘ０．０７５ｃｍ）を４％濃縮用ゲルと一緒に用いて行われた。タンパク質試料は、０．１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．２５％β−メルカプトエタノール、０．０２５％ブロモフェノールブルーを用いて製造され、そして９５〜１００℃で５分間加熱された後にゲル上に充填された。ブロモフェノールブルー追跡用色素がゲルの基部に達するまで（約４５分間）、タンパク質を２００ボルトで分別した。タンパク質は、クーマシーブルー染料（グラディポア（Gradipore ）から入手された）によって２時間染色した後に蒸留水中で一晩中脱染するかまたは銀染料によって染色することによって検出された。タンパク質の分子量は、以下の標準的なタンパク質の分子量、すなわち、ウサギ筋ホスホリラーゼｂ（９７，４００Ｄａ）；ウシ血清アルブミン（６６，２００Ｄａ）；オボアルブミン（４５，０００Ｄａ）；ウシカルボニックアンヒドラス（３１，０００Ｄａ）；ダイズトリプシン阻害剤（２１，５００Ｄａ）；リゾチーム（１４，４００Ｄａ）との比較によって推定された。変性されていない未変性ＰＡＧＥは、７．５％ポリアクリルアミドスラブゲル（１１ｃｍｘ１４ｃｍｘ０．０７５ｃｍ）上で４％濃縮用ゲルを用いて行われた。未変性ゲルは、ＳＤＳをゲルに対してまたはランニング緩衝液に対して加えなかったこと以外はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと同様に調製された。試料は、０．１２５ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール中で製造され、ゲル上に充填する前に加熱されなかった。電気泳動は、４℃において２００ボルトで１．５時間行われた。可溶性毒腺タンパク質の最初の分離は、未変性ＰＡＧＥを用いて達成された。毒腺６００個の抽出物をそれぞれのゲル上に充填した。電気泳動後、ゲルを水平に切断して４ｍｍストリップにし、そして５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］６００μｌ中において４℃で１６時間静かに撹拌しながらタンパク質をゲルスライスから受動的に溶離した。それぞれの溶離液のアリコートを５０ｍＭトリス −ＨＣｌ［ｐＨ８．０］によって５０倍に希釈し、そしてＧ．メロネラにおける麻痺活性について上記のように検定した。麻痺活性は、陰イオン交換カラム、すなわち、ミニ（Mini）Ｑ（ＰＣ，３．２ｍｍｘ３ｃｍ，ファーマシア（Pharmacia））上で、SMART クロマトグラフィーシステム（ファーマシア）を用いて更に精製された。麻痺活性を有する未変性ＰＡＧＥ溶離液を０．２２μｍフィルター（ミリポア）に通過させた後にカラム上に充填した。カラムは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］によって平衡させ、そして０〜１ＭＮａＣｌの直線勾配を用いてタンパク質を流速２００μｌ／分で溶離した。カラムから溶離したタンパク質は、溶離液の吸光度を２８０ｎｍで監視することによって検出された。２００μｌのフラクションを集め、そして麻痺活性について検定した。麻痺活性を有するフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって更に分析した。（vi）ゲル濾過クロマトグラフィー天然麻痺性毒素の分子質量を推定するために、麻痺活性を有する未変性ＰＡＧＥ溶離液５０μｌを、以下の標準タンパク質、すなわち、チログロブリン（６７０，０００Ｄａ）；γグロブリン（１５８，０００Ｄａ）；オボアルブミン（４４，４００Ｄａ）；ミオグロブリン（１７，０００Ｄａ）；ビタミンＢ１２（１，３５０Ｄａ）によって予め検量されたゲル濾過カラム、すなわち、スーパーローズ（Superose）１２（ＰＣ，３．２ｍｍｘ３０ｃｍ，ファーマシア）に対して加えた。カラムは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭＮａＣｌによって予め平衡され、そしてタンパク質は同緩衝液中で流速４０μｌ／分で溶離された。カラムから溶離したタンパク質は、溶離液の吸光度を２８０ｎｍで監視することによって検出された。４０μｌのフラクションを集め、そして５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］によって２０倍に希釈した後、麻痺活性について検定した。結果（ｉ）出発物質の選択成虫Ｂ．ヘベターの小さい寸法（２〜３ｍｍ）および対応する毒腺の微小寸法のために、本発明者は、最初に、ハチ全体または単離毒腺が、神経毒の単離に最も適当な出発物質を提供するかどうかを調べた。２５の雌全体または単離毒腺の内３標品のタンパク質含量および麻痺活性（ＧＵ）について分析した。結果は、下記の表１で示されるように、双方の標品が同様の毒素活性（約２５，０００ＧＵ）を有するが、雌バチ全体の抽出物は、単離毒腺の抽出物よりも１０倍高い可溶性タンパク質濃度を有することを示す。これは、二つの重要な点を実証し、すなわち、観察された神経毒活性は可溶性毒腺成分と関係している；そして毒腺抽出物は神経毒の１０倍濃縮を提供する。腺は、神経毒の標品のための出発物質として用いられた。（ii）ポリアクリルアミドゲル電気泳動および陰イオン交換クロマトグラフィー可溶性毒腺抽出物を、最初に未変性ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動後、ゲルを水平に切断して４ｍｍスライスにし、そしてそれぞれのスライスを緩衝液中に入れて、タンパク質を受動溶離によって回収した。神経毒活性は、概して、極めて拡散性であり、ゲルの広い部分で見られた。しかしながら、端点分析は、２時間の電気泳動時間後に、活性が主としてゲルの最初の２〜３ｃｍに位置したことを示した。ゲルのこの部分から回収された毒素を、引き続きＢ−１と称した。毒素活性は、３〜４時間の延長された電気泳動時間後でさえもほとんど泳動しなかった。回収された毒素を注射されたＧ．メロネラの幼虫は、神経筋麻痺と一致する中毒症状を示した。骨格筋活性は観察されなかったが、しかしながら、口腔部は目視によって活性であり且つ排出物を放出した。時々、引き続きＢ−２と称する第二麻痺活性が観察されたが、それはＢ−１よりも僅かに速く泳動した。二つの活性はしばしば隣接していないゲルスライス中で見出され且つ完全に分離され得たので、それらは異なった且つ別個の活性であると考えられた。未変性ＰＡＧＥ分別は、下記の表２で示されるように、ハチ全体から９０倍濃縮のＢ−１神経毒活性および毒素活性の全回収率４１％を提供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる毒腺抽出物Ｂ−１およびＢ−２の分離を、図１で示す。図１において、列１は毒腺抽出物に該当し；列２は未変性ＰＡＧＥ精製Ｂ− １；列３は未変性Ｐａｇｅ精製Ｂ−２；列４は陰イオン交換精製ＢｒｈＴＸ−１（約１μｇ）；列５は陰イオン交換精製ＢｒｈＴＸ−２（約３μｇ）；および列６は分子量マーカーに該当する。タンパク質プロフィールはなお複雑であるが、約２２，０００Ｄａ、１８，０００Ｄａ、１７，０００Ｄａおよび１６，０００Ｄａの分子量を有するポリペプチドバンドの特異的濃縮が見られる。最終精製工程において、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてＢ−１およびＢ−２を更に分別した。カラムに対して別々に通過させた場合、それぞれの活性は約２００ｍＭＮａＣｌで溶離し、そしてカラム上に充填されたＢ−１含有未変性ＰＡＧＥ溶離液（４００μｌ）のクロマトグラフを示す図２においてＢ− １に関して示されたように、一つの明瞭なクロマトグラフィーピークと相関した一つのフラクションに限定された。麻痺活性は全てフラクション番号９で見られた。集められたフラクションの生物検定は、Ｂ−１およびＢ−２両方の測定可能な麻痺活性が全てこの一つのフラクション中に存在したことを示した。未変性ＰＡＧＥおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組合わせは、出発毒素活性の全回収率７％と共に、ハチ全体から１２６倍のＢ−１活性を精製した。還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いる陰イオン交換精製Ｂ−１およびＢ−２の分析は、両方の活性が同様に現れ、そして両方とも、以下、Ｂ−１のサブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｂ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｃ）およびＢｒｈＴＸ −１（ｄ）、並びにＢ−２のサブユニットＢｒｈＴＸ−２（ｅ）、ＢｒｈＴＸ− ２（ｆ）、ＢｒｈＴＸ−２（ｇ）およびＢｒｈＴＸ−２（ｈ）と称する４種類のポリペプチドに分離することを示す。精製毒素は、ブラコン毒素−１（ＢｒｈＴＸ−１）およびブラコン毒素−２（ＢｒｈＴＸ−２）と称された。精製のこの段階において、ＢｒｈＴＸ−１は、毒腺抽出物からの可溶性タンパク質の約０．５％に該当した。更に詳しくは、これらの技法は、ＢｒｈＴＸ−１のポリペプチドＢｒｈＴＸ−１（ａ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｂ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｃ）およびＢｒｈＴＸ−１（ｄ）は、それぞれ１５，０００Ｄａ、１７，０００Ｄａ、２，１０００Ｄａおよび３４，０００Ｄａの推定分子量を有することを示す。ＢｒｈＴＸ−２のポリペプチドＢｒｈＴＸ−２（ｅ）、ＢｒｈＴＸ−２（ｆ）、ＢｒｈＴＸ−２（ｇ）およびＢｒｈＴＸ−２（ｈ）は、それぞれ１７，０００Ｄａ、１８，５００Ｄａ、２，１０００Ｄａおよび３４，０００Ｄａの推定分子量を有する（iii）ゲル濾過クロマトグラフィーＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離された４種類のポリペプチドから計算されたＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２の推定分子量は、それぞれ８７，０００Ｄａおよび９０，５００Ｄａであった。ＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２の天然分子質量を測定するために、未変性ＰＡＧＥフラクションを、スーパーローズ１２ゲル濾過カラムで分離した。毒素活性の大部分は、クロマトグラム上の一つの主要ピークに該当した二つのフラクション中に溶離した。ＢｒｈＴＸ−１の結果は、ＢｒｈＴＸ−１のサイズ分別クロマトグラフィーを示す図３で示され、影付きのピークは麻痺活性含有フラクションを表す。カラムを検量するのに用いられたタンパク質標準に由来する標準曲線を用いると、図４で示されるように、ＢｒｈＴＸ−１の天然毒素は約８１，０００Ｄａの分子量を有すると計算された。更に詳しくは、各標準のＫ_avを計算し且つタンパク質の分子量に対してプロットした。毒素活性のＫ_av並びに標準の回帰線（ｒ²＝０．９８）の勾配および切片を用いて、麻痺活性の分子量を計算した。ＢｒｈＴＸ−２もまた、約８１，０００Ｄａであると計算された。（iv）ＢｒｈＴＸ−１の二次構造の分析ＢｒｈＴＸ−１の二次構造を、非還元および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて研究した。結果を図５で示すが、列１は、還元剤の不存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分別されたＢｒｈＴＸ−１に該当し；そして列２は、３％β−メルカプトエタノールに対して暴露された列１上の同一試料試験に該当する。図５で示されるように、ポリペプチド（ａ）および（ｂ）の泳動は、還元剤の存在または不存在によってほとんど影響されないが、非還元条件下において、ポリペプチド（ｂ）は二重線として存在するように見える。対照的に、非還元条件下において、ポリペプチド（ｃ）および（ｄ）は目視できないし、そして約４５，０００Ｄａの顕著な新規ポリペプチドが現れる。逆に、このバンドは、還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて再度分別された場合、３４，０００Ｄａおよび２１，０００Ｄａの二つのポリペプチドに分離する（データは示されていない）。これは、ポリペプチド（ｃ）および（ｄ）が、分子内または間ジスルフィド結合によって架橋していることを示唆する。これは、ビサー（Visser）ら、（1983 ）Comp.Biochem.Physiol.,B75B,523-538 のような初期の研究が、Ｂ．ヘベター麻痺活性は毒液が還元剤ＤＴＴおよびＢＭＥに対して暴露された場合に失われることを示しているので特に興味深い。考察２５の毒腺および２５の雌バチ全体の抽出物の定量実験は、それぞれが、平均して１３，５００単位の麻痺活性（ＧＵ）を含んでいたことを示した。これは、Ｇ．メロネラ生物検定において確認された毒素活性が、可溶性毒腺内容物と関係しているという仮定を支持する。麻痺性物質を精製するために、毒腺抽出物を、最初に未変性ＰＡＧＥを用いて分別した。毒素活性は、用いられた電気泳動条件下で速やかに泳動しなかった。未変性ＰＡＧＥは電荷によっても寸法によっても分離するので、これは、毒素活性が全体的基本電荷および／かまたは高分子量を有することを示唆する。分子量が僅か３，５００Ｄａだけ異なると考えられる二つの異なった活性（Ｂ−１およびＢ−２）の分離は、電荷が毒素の泳動速度に対する主な寄与因子であることを示す。Ｂ−１の陰イオン交換クロマトグラフィーは、１種類のタンパク質を生じた。この精製された標品（ＢｒｈＴＸ−１）は、毒腺およびおそらくは雌バチ全体の抽出物中に存在する出発麻痺活性の７％並びに可溶性毒腺タンパク質の０．５％であった。毒素活性の全体的濃縮は１２７倍であり且つ毒素活性３．３３３単位／μｇ（タンパク質）の比活性を有する標品を生じる。ここで報告されたデータは、本発明者が、未変性ＰＡＧＥまたは温和なクロマトグラフィー条件下で解離しない２種類のオリゴマー毒素ＢｒｈＴＸ−１およびＢｒｈＴＸ−２を精製したという証拠を提供する。毒素は両方とも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離することができる４種類のポリペプチドから成る。更に、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるＢｒｈＴＸ−１の分離は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｃ）およびＢｒｈＴＸ−１（ｄ）の二つがジスルフィド結合によって保持されていることを示唆する。実施例２−ＢｒｈＴＸ−１の配列分析（ｉ）タンパク質精製４５，０００の腺を、未変性ＰＡＧＥおよび SMART システムでの陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製して、ＢｒｈＴＸ−１を３００μｇ生成した。毒素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて銀染色を用いて分析される場合に本質的に均一にされ、そして４種類のポリペプチドＢｒｈＴＸ−１（ａ）、ＢｒｈＴＸ− １（ｂ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｃ）およびＢｒｈＴＸ−１（ｄ）から成った。最終標品の比活性は、３，２５０，０００ＧＵ／ｍｇ（タンパク質）であった。更に、このデータを用いると、精製毒素０．３ｎｇは、体重０．２ｇのＧ．メロネラ幼虫を完全に麻痺させることができると推定することができる。比活性の値はまた、ムギワラビゼンダニ（ピエモテス・トリティシ（Pyemotes tritici））からの毒素に対する毒素の比較を可能にする。ムギワラビゼンダニ毒素の報告された麻痺用量は、３３０〜５５０μｇ／ｋｇ（Ｇ．メロネラ幼虫）である。ＢｒｈＴＸ−１の麻痺用量は、約２μｇ／ｋｇ（Ｇ．メロネラ幼虫）である。ＢｒｈＴＸ−１は、４℃で極めて安定であることが判ったが、数週間を越えた後もなお、９０％の活性が存在した。（ii）配列分析ＢｒｈＴＸ−１毒素約２００μｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、１０ｍＭキャプス（Caps）（双性イオン緩衝液）［ｐＨ１１．０］／１０％メタノール中で室温において６０ｍＡｍｐで１時間の電気転移を用いてそのサブユニットに分離した。分離されたサブユニットを、ＰＶＤＦ（ポリビニリジンフッ素）膜上にエレクトロブロッティングした。転移後、ブロットをミリ（Milli）−Ｑ水中で１時間洗浄した後、真空下で乾燥させた。タンパク質バンドを、３０％メタノール／０．２％酢酸中０．０００５％スルホローダミンＢ（シグマ（Sigma）ら入手可能）中で約３０秒間染色した後、水中で脱染することによって可視化された。少量の毒素、約１０μｇを最初に用いて、ブロッティング条件を最適化した後、毒素１５０μｇを配列分析用に調製した。配列決定は、ＡＢＩ４７７Ａタンパク質配列決定システム（アプライド・バイシステムズ（Applied Biosystems））を用いて行われた。ＢｒｈＴＸ−１（ａ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｂ）およびＢｒｈＴＸ−１（ｃ）の配列決定の際に、特に、２回目または３回目のサイクル後に、アミノ酸分析器から明らかに検出可能なシグナルが消失したと考えられる問題に遭遇し、配列決定工程中に多量のタンパク質が膜から除去されたことが示された。この問題は、より大きい濃度のタンパク質を膜に対して与えることによって克服された。４種類のサブユニット全部のアミノ末端配列が、図６で示されたように得られた（^*は、アミノ酸配列の同一性に若干のアンビギュイティーが存在した場合のアミノ酸残基を示す）。この配列情報は、更に、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）に対する配列番号１；サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）に対する配列番号２；サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｃ）に対する配列番号３；およびサブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｄ）に対する配列番号４で示される。（iii）サブユニット構造研究毒素活性は、トリトンＸ−１００含有未変性ＰＡＧＥを用いて単離された１４，０００Ｄａ〜１８，０００ＤａのＢｒｈＴＸ−１からの小型のポリペプチドに関係していることが判った。このようなゲルから、本発明者は、充填された全部で約３０，０００から約１，５００ＧＵを回収した。これは、ゲル上に充填された全活性の僅か約５％であるが、実質的な量のその活性は、ゲル中に僅かだけ泳動する。これらの結果は、サブユニットが実質的な活性を有することを例証する。（iv）ウェスタンブロット分析上記の直接タンパク質配列決定によって利用可能にされたＮ末端配列（図６およびそれぞれ配列番号１、３および４）を用いることによって、ＢｒｈＴＸ−１（ａ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｃ）、ＢｒｈＴＸ−１（ｄ）サブユニットに対して抗体を生じさせた。これらの抗体は、以下に概説されるカイロン・ミミトプス（Ch iron Mimitopes）（クレイトン，ビクトリア）によって商業的に生じた。合成ペプチドを、利用可能な配列に対合するように生じさせ且つジフテリア毒素キャリヤーに対して結合させた。次に、これらの結合体を用いて、３頭の別個のニュージーランドホワイトウサギを免疫感作した。ウサギは、フロインド完全アジュバント中のペプチド０．３９ｍｇによって筋肉内に免疫感作された。最初の免疫感作完了後、カニューレを用いてウサギの耳静脈から採血した後、１４日、３５日および４２日目に再度採血した。血清は、血液を３７℃で３０分間インュベートした後、低速遠心分離によって細胞材料を除去する前に氷上で１５時間冷却することによって調製された。血清は−２０℃で貯蔵された。粗抗血清は全て、エリザにおいて免疫性ペプチドのビオチニル化誘導体、ジフテリア毒素およびアビジンに対して滴定した。これらの滴定実験において、エリザプレートはアビジンによって被覆され、それに対して、試験されるビオチニル化ペプチドおよび抗体を逐次的に結合させた。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに対して結合した抗ウサギＩｇＧ血清を用いて抗体の定量化を達成した。サブユニットそれぞれに対する最高力価の血清を用いて、前に記載のようにＳＤＳ− ＰＡＧＥによってその成分サブユニットに分離された精製ＢｒｈＴＸ−１に対してウェスタンブロットを行った。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース（バイオラド，ヘラクレス，Ｃａ）に転移させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された精製ＢｒｈＴＸ−１を１０μｌ（約８μ ｇ）用いて、試験された３種類の血清全部の適切なサブユニットに対して特異的反応を得た。（ｖ）ペプチド／消化配列決定ＢｒｈＴＸ−１約８００μｇを、前に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってその成分サブユニットに分離した。電気泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色することによってサブユニットをゲル中で可視化した。次に、サブユニットそれぞれに該当するバンドをゲルから切取り、そして０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、０．０２％トゥイーン−２０含有緩衝液中で２回洗浄することによってＳＤＳをゲルから溶離した。次に、配列決定等級トリプシン（プロメガ（Pr omega），マディソン，ＷＩ）０．５μｇを加え、そして０．２Ｍ重炭酸アンモニウム約２０μｌの添加によってゲルを充分に再水和した。次に、ゲルスライスをミクロ遠心管中に移し且つ０．２Ｍ重炭酸アンモニウム、０．０２％トゥイーン−２０によって被覆し、そして３０℃で一晩中インキュベートした。１０分の１容量の１０％ｗ／ｖトリフルオロ酢酸の添加によって反応を停止した。消化後、得られたペプチドは、６０％アセトニトリル中の０．１％ｗ／ｖトリフルオロ酢酸１００μｌ中において３０℃で４０分間の抽出によってゲルから溶離された。次に、得られた上澄みを、ロータリーエバポレーション（ヘトバク（ Hetovac）（Heto）スカンジナビア）によって最終容量２０μｌまで減少させた。次に、ペプチドを、μＲＰＣＣ２／Ｃ１８ＳＣ２．１１／１０カラムを用いて SMART システムでの逆相クロマトグラフィーによって分離した。このカラムでの勾配は、４０％アセトニトリル中に０．０６５％トリフルオロ酢酸および０．０５％トリフルオロ酢酸の緩衝液を用いることによって形成された。フラクションは、「ピーク分別」機能を用いてを集められた。次に、このクロマトグラフィー工程からの個々のピークに、質量分光分析法（ Tofspec，フィソンズ・インスツルメンツ（Fisons Instruments））を施して、回収されたペプチドの寸法を確認した。次に、Procise-HT シークエンサー（アプライド・バイオシステムズ）を用いてピークを配列決定した。ＢｒｈＴＸ−１のサブユニットから得られたトリプシンフラグメント配列の概要を、以下の表３に与える。実施例３−ＢｒｈＴＸ−１のサブユニットのクローニングｃＤＮＡライブラリーの作成およびライブラリープレーティング全ＲＮＡを、新たに生まれた雌Ｂ．ヘベターから単離し、液体窒素中で凍結し且つ−７０℃で貯蔵した。全ＲＮＡを単離するために、冷凍したハチ約１ｇを液体窒素中で粉砕して粉末にした。その粉末を、更に、取手付きホモジナイサー中において８Ｍ塩化グアニジウム２０ｍｌ中にホモジナイズした。不溶性材料の大型フラグメントを１０，０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって除去し、そして全ＲＮＡを３２％ｖ／ｖエタノールの存在下で沈殿させた。引き続き、サムブルック（Sambrook）ら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual，コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Habor Press）で記載のように、全ＲＮＡの精製を行った。ｍＲＮＡは、ファーマシア・バイオテク（Pharmacia Biotech）（ウプサラ，スウェーデン）から入手したオリゴ（ｄＴ）−セルローススピンカラムを用いて製造者の指示によって全ＲＮＡから単離された。ｍＲＮＡ約５μｇをｃＤＮＡ合成に用いた。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩリンカーを、ブラント末端付き二本鎖ｃＤＮＡに対して連結し、ＥｃｏＲＩ消化λｇｔ１１ＤＮＡ中に連結し、そして商業的に入手可能な大腸菌（E coli）Ｙ１０９０中に形質転換した後、標準的な技法を用いて増幅させた。滴定は、標準法（サムブルック 1989）によるライブラリーのスクリーニングの前に、商業的に入手可能な大腸菌ＬＥ３９２菌株から製造された平板培養細胞を用いて行われた。ライブラリーの力価は１．２５ｘ１０⁹ｐｆｕ／ｍｌであった。スクリーニングのために、５００，０００ｐｆｕを１４０ｍｍペトリ皿１０枚でプラーク約５０，０００個／皿によって培養した（plated-out）。プラークリフト（lifts）は、標準法（サムブルック 1989）を用いて三重反復試験において Hybond-N 膜（アマーシャム・インターナショナル（Amersham International ））に対して行われた。実施例４−ＢｒｈＴＸ−１のサブユニット（ａ）のクローニング（ｉ）プローブの生成ＢｒｈＴＸ−１（ａ）のＮ末端配列の少なくとも一部分をコードする、ＢＨ（ａ）Ａ、ＢＨ（ａ）ＢおよびＢＨ（ａ）Ｉと称される縮重したオリゴヌクレオチドの３プールを設計した。「Ｉ」で表されるイノシンは、完全な縮重が存在したところで用いられた。これらのオリゴヌクレオチドは、図７で並びに配列番号５、６および７（イノシンは「Ｎ」で表されている）でも示される。オリゴヌクレオチドは、標準法によってアプライド・バイオシステムズ３８０ＢＤＮＡ合成機で合成された。それぞれのオリゴヌクレオチドを５５℃で１６時間脱保護した後、３本のねじ込キャップ付きポリプロピレンミクロ遠心管に分配し且つ真空乾燥させた。各オリゴヌクレオチドの３分の１をＨ₂Ｏ１００μｌ中に溶解させ、そして１ＯＤ₂₆₀／ｍｌが２５μｇ／ｍｌに相当するＵＶ分光分析法によって定量した。（ii）ライブラリーのスクリーニングおよびクローンの単離フィルターセットをそれぞれ、オリゴヌクレオチドＢＨ（ａ）Ａか、ＢＨ（ａ）ＢかまたはＢＨ（ａ）Ｉの一つによってプローブした。各オリゴヌクレオチド２５ｎｇを、標準法（サムブルック 1989）を用いて³²Ｐ−ＡＴＰ（アマーシャム・インターナショナル）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ノーサンブリア・バイオロジカルズ・リミテッド（Northumbria Biologicals Ltd））を用いる５′リン酸化によって標識した。インキュベーションは３７℃で３０分間であった。フィルターは、５ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ：３．６ＭＮａＣｌ，０．２ＭＮａＨ₂ＰＯ₄，０．０２ＭＥＤＴＡ［ｐＨ７．７］）、５ｘデンハート試薬［５０ｘデンハート試薬：フィコール（４００型，ファーマシア）５ｇ，ポリビニルピロリドン５ｇ，ウシ血清アルブミン（フラクションＶ，シグマ）５ｇ］、０．５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中において４５℃で２時間プレハイブリッド形成された。ハイブリダイゼーションは、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート試薬、０．５％ＳＤＳおよび標識プローブ中において４５℃で１６時間行われた。フィルターを６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において４５℃で４ｘ１５分間洗浄した後、コダック（Kodak）Ｘ−ＡＲフィルムに対して増感スクリーンを用いて−８０℃で感光させた。３個のプラークはＢＨ（ａ）ＡおよびＢＨ（ａ）Ｉ両方に対してハイブリッド形成し、１個のプラークはＢＨ（ａ）ＢおよびＢＨ（ａ）Ｉ両方に対してハイブリッド形成した。３種類のプローブ全部に対してハイブリッド形成したプラークはなかった。３回の連続したプラーク精製後、４個のプラークの内３個は均一になるまで精製され且つＢＨ（ａ）Ｉに対するハイブリダイゼーションを示し続けた。ファージプラークを、ＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，０．１ＭＮａＣｌ，０．２％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）１ｍｌおよびクロロホルム１０μｌ中に取った。（iii）クローンの特性決定プラーク精製ファージを、ｃＤＮＡインサートの存在および寸法についてポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ）分析によってスクリーニングした。下記で並びに配列番号８および９でそれぞれ示される２種類のオリゴヌクレオチド、λｇｔ１１前進およびλｇｔ１１復帰を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、λ ｇｔ１１に特異的であり且つＥｃｏＲＩクローニング部位に隣接している。ＰＣＲ反応は、０．５ｍｌポリプロピレンミクロ遠心管中において、それぞれ２５モルの濃縮プライマー、ファージ原液０．５μｌ、それぞれ１．２３ｍＭの Ultrapure ｄＮＴＰ（ファーマシア）８μｌ、５００ｍＭＫＣｌ２．５μ ｌ、１００ｍＭトリス［ｐＨ８．４］、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１（ｗ／ｖ）ゼラチンおよび（１Ｕ）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス（Perkin/Elmer Cetus）０．２μｌを用いて行われた。軽鉱油（シグマ）を１滴加えた。試験管を、Techne PHC-1 Programmable Dri−ブロック中に入れ、下記の温度管理を施した。９４℃で５秒間９４℃で１秒間；４０℃で２秒間；７２℃で３秒間（３５サイクル）続いて、７２℃で７秒間の最終インキュベーション時間各反応１０μｌを、アガロースゲル電気泳動によって分析した。３種類のファージ原液全部が、下記のｃＤＮＡインサート寸法を示すＰＣＲ増幅フラグメントを生じた。 λＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．１−約６００塩基対（ｂｐ）； λＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．２−約６２０ｂｐ； λＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．３−約５９０ｂｐ。（iv）サブクローニングおよびクローンの配列決定ファージＤＮＡ製造は、グロスバーガー（Grossberger）Ｄ（1987）Nucleic A cid Research,15(10),6737 の方法を用いて行われた。ｃＤＮＡインサートを、 λＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．１およびλＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．２からＥｃｏＲＩ消化によって放出させた。λＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．３からのインサートは放出されなかったが、それは、元のライブラリー構築の際にＥｃｏＲＩ部位が再生されなかったことを示すと考えられる。２種類の放出されたインサートはそれぞれ、適当な緩衝液条件（サムブルック 1989）においてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＩ消化されホスファターゼ処理されたプラスミドｐＵＣ１９中に連結された。その連結反応混合物を用いて、標準条件下において（サムブルック 1989）適格な商業的に入手可能な大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。ｐＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．１およびｐＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．２と称される形質転換細胞は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天平板上で選択された。クローンｐＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．１のインサートは、シークエナーゼキット（ＵＳＢ，クリーブランド，オハイオ）並びに下記でおよび配列番号１０〜１８で示される９種類の合成オリゴプライマーを用いて配列決定された。プライマーの内、ＰＵＣ４およびＰＵＣ１の二つは、ｍｃｓに隣接するｐＵＣ１９の部分にハイブリッド形成する。他のプライマーは、最初のＰＵＣ４およびＰＵＣ１配列決定実験によって生じた配列データを用いて設計された。得られたヌクレオチド配列は、配列番号１９で示される。ヌクレオチド配列の翻訳は、１２５アミノ酸の読み取り枠（以下、ＯＲＦ）を与えた。この推定のアミノ酸配列は、配列番号２０で与えられる。アミノ酸１７〜３６は、配列番号１で示されるサブユニット（ａ）のＮ末端配列に該当する。アミノ酸１〜１６は、タンパク質輸出のシグナル配列の特徴を有する。この核酸配列および対応するアミノ酸配列は図８でも示される。（ｖ）クローンの分析ペプチド消化／配列決定 −ｃＤＮＡからの推定のアミノ酸翻訳に対してペプチド消化法を用いて得られた配列の直線列を下記に示す。第二列における顕著な異常は、システインの検出が信頼できないということによって説明されうる。ゲノムサザンブロット −ゲノムＤＮＡは、雄および雌のＢ．ヘベター成虫から下記の方法によって製造された。冷凍バチ約０．１ｇを、リフトン（Lifton）溶液（０．２Ｍスクロース，０．０５ＭＥＤＴＡ，０．５ＭＳＤＳ，０．１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ９．０）５００μｌ中で静かにホモジナイズする。材料の大部分が破壊された時点で、リフトン溶液を更に５００μｌ加え、そして組織が凝集しなくなるまでホモジネートを撹拌する。次に、ホモジネートを６５℃で３０分間インキュベートした後、０．６Ｍ酢酸２５０μｌを加える。次に、この溶液を静かに混合し且つ氷上に１時間放置する。次に、大型粒状物質を、卓上遠心分離機中で４℃において１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去する。次に、上澄みを等容量のフェノール（ＴＥによって飽和した）、フェノール／クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）（ＩＡＣ）によって逐次的に抽出した後、ＩＡＣ．ＲＮアーゼＡを最終濃度１０μｇ／ｍｌまで加え、そして３７℃で１５分間インキュベートする。次に、２容量のエタノールを溶液に対して加え、そして卓上遠心分離機中で室温において８，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によってＤＮＡを沈殿させる。沈殿したＤＮＡを８０％エタノールによって洗浄し且つ乾燥させた後、ＤＮＡをＴＥ５０μｌ中に再懸濁させ、そしてＤＮＡ濃度を分光測光法によって推定する。精製ＤＮＡを以下の制限酵素、ＰｓｔＩ、ＢｃｌＩ、ＡｃｃＩによって消化し、そしてそのフラグメントを、ＴＡＥ緩衝液中０．７％アガロースゲル中での電気泳動によって分離した。ＤＮＡを Hybond C⁺（アマーシャム・インターナショナル）ニトロセルロース膜上に、２０ｘ２ｘＳＳＣ勾配中でブロッティングし、そして８０℃で４時間焼くことによって膜に結合させた。³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブは、ＰＣＲによって、プライマーＢＨ（ａ）Ｒ１およびＢＨ（ａ）Ｒ３並びに標的ＤＮＡとしてプラスミドクローンｐＢｒｈＴＸ−１（ａ）１．１を用いて合成された。プローブは、下記のＰＣＲ条件を用いて生成された。９５℃で５分間；続いて９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて７２℃で５分間。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、下記の条件下で行われた。プレハイブリダイゼーション−６ｘＳＳＣ、５ｘデンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアルデヒド、０．１％ピロリン酸ナトリウムおよびサケ精子ＤＮＡ（加える前に音波処理し且つ沸騰させた）１００μｇ／ｍｌを含有するプレハイブリッド形成溶液中において４２℃で２時間。ハイブリダイゼーション−³²Ｐ標識プローブが加えられたプレハイブリッド形成溶液中において４２℃で一晩中。プローブは、フィルターおよびプレハイブリッド形成溶液に対して加える前に、沸騰させた後、氷上で急冷した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において４２℃で４回洗浄した。洗浄はそれぞれ１５分間行われた。洗浄後、フィルターをブロッティングし、密着フィルムで包み、そしてフジ（Fuji）医療用フィルムに感光させた。結果は、配列の単コピーだけがゲノム中に存在することを示し、（１）ＰｓｔＩを用いたゲノムＤＮＡの消化物は、約３０４０ｂｐの一つのハイブリッド形成フラグメントを与え；（２）ＢｃｌＩを用いた消化物は、１４００ｂｐの一つのハイブリッド形成フラグメントを与え（プローブハイブリッド形成配列直後のｃＤＮＡ配列中に存在するＢｃｌＩ部位が存在する）；そして（３）ＡｃｃＩを用いた消化物は、ｃＤＮＡ配列中の３５７ｂｐのＡｃｃＩ部位の存在と一致する二つのハイブリッド形成フラグメントを与えた（図８を参照されたい）。実施例５−ＢｒｈＴＸ−１のサブユニット（ｄ）のクローニング（ｉ）プローブの生成縮重したオリゴヌクレオチドの３プールは、ＢＨ（ｄ）Ａ、ＢＨ（ｄ）ＢおよびＢＨ（ｄ）Ｉと称された。完全な縮重が存在したところでイノシンを用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、図９で並びに配列番号２１、２２および２３で示された通りである。これらのオリゴヌクレオチドは、標準法によってアプライド・バイオシステムズ３８０ＢＤＮＡ合成機で合成された。それぞれのオリゴヌクレオチドを５５℃で１６時間脱保護した後、２本のねじ込キャップ付きポリプロピレンミクロ遠心管に分配し且つ真空乾燥させた。各オリゴヌクレオチドの２分の１を水１００μｌ中に溶解させ、そして１ＯＤ₂₆₀／ｍｌが２５μｇ／ｍｌに相当するＵＶ分光分析法によって定量した。（ii）ライブラリーのスクリーニングおよびクローンの単離ライブラリーは、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）について上記に記載のプロトコルを用いてスクリーニングされた。７個のプラークはＢＨ（ｄ）Ｉに対してハイブリッド形成した。３回の連続したプラーク精製後、６個のプラークは均一になるまで精製され且つＢＨ（ｄ）Ｉに対するハイブリダイゼーションを示し続けた。ファージプラークを、ＳＭ緩衝液１ｍｌおよびクロロホルム１０μｌ中に取った。（iii）クローンの特性決定プラーク精製ファージを、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）について上記に記載のプロトコルを用いてスクリーニングし且つ分析した。６種類のファージ原液の内５種類は、下記のｃＤＮＡインサート寸法（同様の元のプラークのレプリカも挙げる）を示すＰＣＲ増幅フラグメントを生じた。 λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）１．１−約１２００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）１．２−約１２００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）２．１−約１２００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．１−約１８００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．２−約１８００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．３−約１８００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．４−約１８００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）４．１−約１２００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）４．２−約１２００ｂｐ；λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）４．３−約１２００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）５．１−約７００ｂｐ。（iv）サブクローニングおよびクローンの配列決定サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）の場合と同様に、ファージＤＮＡ製造は、グロスバーガーＤ（1987）の方法を用いて行われた。ｃＤＮＡインサートを、λ ＢｒｈＴＸ−１（ｄ）１．２、λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．１、λＢｒｈＴＸ− １（ｄ）３．３、λＢｒｈＴＸ−１（ｄ）３．４およびλＢｒｈＴＸ−１（ｄ）４．３からＥｃｏＲＩ消化によって放出させた。他のインサートは放出されなかったが、それは、元のライブラリー構築の際にＥｃｏＲＩ部位が再生されなかったことを示すと考えられる。放出されたインサートを、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した後、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）について記載のように大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。クローンｐＢｒｈＴＸ−１（ｄ）１．２のインサートは、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）について記載のように、プライマーＰＵＣ４およびＰＵＣ１（上記で並びに配列番号１０および１１で与えられた）を含めた１４種類の合成オリゴプライマーを用いて配列決定された。他の１２種類のプライマーは、最初のＰＵＣ４およびＰＵＣ１配列決定実験によって生じた配列データを用いて設計されており、下記および配列番号２４〜３５で示される。得られたヌクレオチド配列は、配列番号３６で示される。ヌクレオチド配列の翻訳は、２７５アミノ酸のＯＲＦを与えた。アミノ酸２３〜３５は、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｄ）のＮ末端配列に該当する。アミノ酸１〜２２は、候補シグナル配列を含む。ｃＤＮＡによってコードされた成熟タンパク質の推定分子量は２８．２ｋＤａである。推定のアミノ酸配列は配列番号３７で与えられる。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は図１０でも示される。（ｖ）クローンの分析ペプチド消化／配列決定 −プロトコルは、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）について上記に記載の通りである。推定のアミノ酸翻訳に対して得られた配列の直線列を下記に示す。これらの誤対合は、人工物を配列決定したためでありうる。ゲノムサザンブロット −ゲノムＤＮＡは、実施例４で前に記載のように製造された。雄および雌ＤＮＡのアリコートを、ＢｃｌＩ、ＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩを用いて消化し、そしてその消化されたＤＮＡを、ＴＡＥ緩衝液中０．７％アガロースゲル中での電気泳動によって分離した。ＤＮＡを、ニトロセルロース膜（HybondC⁺；アマーシャムＵＫ）上に２−２０ｘＳＳＣ勾配中でブロッティングし、そして８０℃で４時間焼くことによって膜に結合させた。 ³²Ｐ標識プローブは、ＰＣＲによって、プライマーＢＨ（ｄ）Ｆ４およびＢＨ（ｄ）Ｒ７並びに標的ＤＮＡとしてｐＢｒｈＴＸ−１（ｄ）１．２プラスミドを用いて下記の条件下で合成された。９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；４３℃で１．５分間；８２℃で１分間（３５サイクル）；続いて７２℃で５分間。雄および雌ＤＮＡの結果は一致した。ＢｃｌＩ消化物は、１０．０ｋｂｐのものおよび９．１ｋｂｐのもの二つのハイブリッド形成フラグメントを生じた。この結果は、ｃＤＮＡ配列のプローブハイブリダイゼーション部分におけるＮｄｅＩ部位の存在と一致した。ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩ消化物は、それぞれ１８．５ｋｂｐおよび２２．１ｋｂｐの一つのハイブリッド形成フラグメントを生じたが、それらは、ｃＤＮＡのプローブハイブリッド形成部分におけるこれらの部位両方の不存在と一致する。実施例６−ＢｒｈＴＸ−１のサブユニット（ｂ）のクローニング（ｉ）プローブの生成配列番号２で与えられたＮ末端配列から、２種類の多種プライマーを設計した。これらのプローブは下記で並びに配列番号３８および３９で示される。これらのプライマーはＰＣＲ実験で用いられて、前記のように雌ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡからＰＣＲ生成物を生じた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．２μｌ／反応５０μｌのＰＣＲ反応条件は下記の通りであった。９５℃で５分間；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５５℃で１．５分間；７２℃で１分間（３０サイクル）；続いて７２℃で５分間。ＰＣＲ生成物は、ＴＢＥ緩衝液中１５％ゲル中のＰＡＧＥによって推定される約５４ｂｐである。増幅生成物は、臭化エチジウムを用いて染色することによってゲル中で可視化された。次に、フラグメントを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてチミン残基を尾部に付けた（Ｔ−テーリング）商業的に入手可能なプラスミド pBluescript SK- のＥｃｏＲＶ部位中にクローン化した。以下の条件をＴ−テーリングに用いた。５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ８．３］、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭＴＴＰ、７０℃で２時間。クローン化されたＰＣＲ生成物は、アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッドセから入手可能な下記の色素プライマーを用いて配列決定された。配列決定は、ＡＢＩ３７０ＡＤＮＡ分析システム（アプライド・バイオシステムズ）を用いて行われた。ＰＣＲ生成物の配列は、配列番号４０でおよび下記で与えられる。（ii）ライブラリーのスクリーニングおよびクローンの単離ライブラリープレーティングは、プラークリフトを二重反復試験で、１３７ｍｍ、０．４５ミクロンの Nitropure ニトロセルロース膜（マイクロブ・セパレーションズ（Microb Separations），ウエストボロ，ＭＡ，米国）に対して行なったこと以外は上記のように行われた。第一スクリーンにおいて、プラーク３．６ｘ１０⁵個／フィルター（全部で４フィルター）をスクリーニングし、第二および第三スクリーンにおいて、プラーク１００〜２５０個／フィルターをスクリーニングした。 ³²Ｐ標識プローブはＰＣＲによって製造された。ＰＣＲは、配列番号３８および３９で示されたオリゴヌクレオチドＢＨ（ｂ）ＡおよびＢＨ（ｂ）Ｂを用いて³² Ｐ−ｄＡＴＰの存在下で行なわれ、そしてクローン化されたＰＣＲ生成物は、標的として配列番号４０で示された配列を有する。下記のＰＣＲ条件を用いた。Ｔａｑポリメラーゼを加える前に、９５℃で５分間；続いて９５℃で３０秒間、４５℃で１．５分間および７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間、５０℃で１．３０分間および７２℃で１分間（３０サイクル）；続いて７２℃で５分間（１サイクル）。フィルターは、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ａ）のゲノム・サザン・ブロットについて記載されたのと同様のプレハイブリッド形成およびハイブリッド形成条件下において上記の³²Ｐ標識プローブによってプローブされた。このプローブに対してハイブリッド形成する１０個のプラークを最初に識別した。これらの内３個は、均一になるまで２回目および３回目のスクリーニングを通して精製された。プラーク精製ファージを、ＳＭ緩衝液１ｍｌおよびクロロホルム１０μｌ中に取った。（iii）クローンの特性決定プラーク精製ファージを、オリゴヌクレオチドλｇｔ１１前進およびλｇｔ１１復帰を用いるＰＣＲ分析によってＤＮＡインサートの存在および寸法についてスクリーニングした。ＰＣＲのためのλＤＮＡは、原液１０μｌを５分間沸騰させることによって精製原液から製造された後、このＤＮＡ２μｌをＰＣＲ実験で用いた。増幅されたフラグメントは、ＴＡＥ緩衝液中０．８％アガロースゲルによる電気泳動によって寸法で分けられ且つ既知の寸法のマーカーに対して寸法で分けられた。３種類の精製ファージの内、一つのファージから約５００ｂｐのインサートが見出され、そのファージをλＢｒｈＴＸ−１（ｂ）１と称した。他の二つのプラーク精製ファージではインサートを検出することができなかった。（iv）サブクローニングおよびクローンの配列決定ファージＤＮＡは、サムブルックら（1989）で記載のように、ＣｓＣｌ中での等密度遠心法によって精製された。 λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）１からのｃＤＮＡインサートを、ＮｏｔＩによる消化によって除去し、そしてＮｏｔＩによって消化され且つホスファターゼ処理された pBluescript SK- 中に連結した。クローンのインサートは、ＡＢＩ色素−プライマー配列決定用キット（上記）を用いて配列決定された。プラスミドクローンｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）１の配列であるインサートは、配列番号４１および図１１で与えられる。アミノ酸２７−４４は、配列番号２で示されたＮ末端配列のものと対合するが、配列番号４１中の配列によってコードされたＯＲＦの極めて短い顕著な寸法は、クローンが大きく切断されたことを示唆した。したがって、本発明者は、クローンの５′末端のＯＲＦに対する二つのプライマー、すなわち、配列番号４２および４３でそれぞれ示されるＢＨ（ｂ）ＣおよびＢＨ（ｂ）Ｄを設計した。これらのプライマーおよび標的としてｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）１．１を用いて、本発明者は、下記の条件下でのＰＣＲによって³²Ｐ標識プローブを生成した。９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて７２℃で５分間。次に、上記の条件を用いてライブラリーを再度スクリーニングした。６個の強くハイブリッド形成するプラークを、３回のプラーク精製で均一になるまで通して精製した。ｃＤＮＡインサートは、ＮｏｔＩによる消化によってファージから除去され、そしてＮｏｔＩによって消化され且つホスファターゼ処理された pBl uescript SK- 中に連結された。インサートの寸法は、ＮｏｔＩによる消化およびＴＡＥ緩衝液中０．８％アガロースゲルによる制限フラグメントの分離によって推定された。下記のｃＤＮＡインサート寸法が推定された。 λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）２−約５００ｂｐ；およびいずれも約１２００ｂｐの λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）３、λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）４、λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）５およびλＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６。 λＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６と称されるプラスミドは、ＡＢＩ３７０ＡＤＮＡ分析システムおよび前に記載された色素プライマーを用いて配列決定された。配列決定は、ＡＢＩ色素−ターミネーターシステムと一緒に、ＢＨ（ｂ）Ｃ、ＢＨ（ｂ）Ｄ（配列番号４２および４３）プライマーと、下記で並びに配列番号４４および４５で示される二つの追加のプライマーとを用いて完了した。得られたヌクレオチド配列は、配列番号４６で示される。ヌクレオチド配列の翻訳は配列番号４７で示され、そして用いられた開始コドンに応じて１８２かまたは１６５アミノ酸のタンパク質を与える。別のタンパク質は、それぞれ２１かまたは４アミノ酸の疎水性リーダー配列を有し、１６１アミノ酸の成熟ペプチドを与える。サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は図１２でも示され、推定のＯＲＦは太字で示されている。特に、ｃＤＮＡのタンパク質翻訳は図１３で示され、成熟タンパク質は下線で示されている。（ｖ）クローンの分析ペプチド消化／配列決定 −推定のアミノ酸翻訳に対して得られた配列の直線列を下記に示す。末端アミノ酸が誤って配列決定されることは珍しいことではないが、しかしながら、二つの別個の場合での配列決定されたペプチド配列の一方は、特徴的なＧＴアミノ酸対を有する。これらのＧＴ対は、配列決定されたクローンに対して予想されたＯＲＦ中に欠けている。したがって、本発明者は、クローンｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６が配列決定用人工物を含んでいたこと、またはそれを生じたｃＤＮＡがエラーを含んでいた、すなわち、合成／クローニングの際に６ｂｐ欠失が生じたことを推論した。したがって、本発明者は、顕著な「ＧＴ」対／欠失を有する部分をＰＣＲによって再度クローン化した。プライマーＢＨ（ｂ）ＥおよびＢＨ（ｂ）Ｆは、ＰＣＲ実験において標的としてのｃＤＮＡと一緒に用いられて、増幅生成物を生成した。ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーの構築について前に記載されたように（実施例３）、雌Ｂ．ヘベターｍＲＮＡから合成された。次に、増幅生成物を、前記のようにＴ−テーリングされた pBluescript のＥｃｏＲＶ部位中にクローン化した。次に、これらのクローンを配列決定し、そしていずれも、顕著なＧＴ異常に隣接するｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６と同様の配列を有することが判ったが、ＧおよびＴのコドンに対応する追加の６ｂｐ、すなわち、ＧＧＡＡＣＴを有していた。これらのデータから、ＧＴ異常はｃＤＮＡ合成／元のλクローンのクローニングの際に生じたということが明らかであろう。ｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）ｃＤＮＡおよび推定上のＯＲＦの共通配列は、図１４で並びに配列番号４８および４９で示される。このような配列もまた、本発明の範囲内に包含される。ゲノムサザンブロット −ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＡｃｃＩおよびＸｈｏＩによって消化された雄および雌Ｂ．ヘベターゲノムＤＮＡのサザンブロットを、前記のように作成した。³²Ｐ標識プローブは、ＰＣＲによって、下記の条件下でプライマーＢＨ（ｂ）ＣおよびＢＨ（ｂ）Ｄを用いてｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）６クローンの５′部分から生成した。９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて７２℃で５分間。ハイブリダイゼーションは、前記のプローブを用いて行なわれた。結果は、雄および雌ＤＮＡについて一致した。ＰｓｔＩ消化物において、１３．０ｋｂｐおよび４．１ｋｂｐの二つのハイブリッド形成バンドが見られた。この結果は、ｃＤＮＡ配列のプローブハイブリダイゼーション部分におけるＰｓｔＩ部位の存在と一致する。ＥｃｏＲＶ、ＡｃｃＩおよびＸｈｏＩ消化物は、それぞれ３．３ｋｂｐ、１３．０ｋｂｐおよび７．０ｋｂｐの一つのハイブリッド形成バンドを生じた。２回目の実験において、³²Ｐ標識プローブは、下記の条件下でプライマーＢＨ（ｂ）ＥおよびＢＨ（ｂ）Ｆを用いてｐＢｒｈＴＸ−１（ｂ）５クローンの３′ 部分から製造した。９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて７２℃で５分間。これらのプローブは、ＢｃｌＩ、ＮｄｅＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩによって消化された雄および雌ゲノムＤＮＡを用いて前記のように製造されたサザンブロットに対してハイブリッド形成した。結果は、雄および雌ＤＮＡについて一致し、ＢｃｌＩおよびＢｇｌＩＩ消化物について１．７ｋｂｐおよび９．１ｋｂｐの一つのハイブリッド形成バンドを生じた。これらの結果は、プローブハイブリッド形成部分中のこれらの部位両方の存在と完全に一致しない、すなわち、通常は二つのハイブリッド形成バンドが見られると予想されるが、両方の部位は、プローブ部分の末端に対して比較的近いし、そしてハイブリッド形成部分のより小さい部分を有するフラグメントは、この実験で用いられた大型のプローブによる検出を巧みに避けられた。ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ消化物において、２．４ｋｂｐおよび２２．２ｋｂｐの一つのハイブリッド形成バンドが検出された。実施例７−ＢｒｈＴＸ−１のサブユニット（ｃ）のクローニング配列番号３で与えられたＮ末端配列は、それをコードしている遺伝子の単離に対してどのＰＣＲ法を試みるのにも不十分であった。したがって、ペプチドフラグメントを、上記に概説されたペプチド消化法を用いて得た。これらのペプチド配列は、それらの推定のコーディング配列と一緒に、図１５（「？」は、最初のアミノ酸に関する不確定を示し、そして括弧内に示されたアミノ酸は、二つの選択可能性がある場合である）で、並びに配列番号５０および５１で示される。これらの配列から、下記の多種プライマーＢＨ（ｃ）ＡおよびＢＨ（ｃ）Ｂを、下記並びに配列番号５２および５３で示されたように合成した。サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）について上記に記載のように、Ｂ．ヘベターｃＤＮＡに対するＰＣＲを、下記の条件下でこれらのプライマーを用いて行った。９５℃で５分間（１サイクル）続いて９５℃で３０秒間；４０℃で１分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１分間；７２℃で１分間（３０サイクル）；続いて７２℃で５分間（１サイクル）。約３００ｂｐのＰＣＲ生成物を生成し、それを、Ｔ−テーリングされた pBlue script SK- 中にクローン化し、そして上記のように配列決定した。このＰＣＲ生成物の配列は、配列番号５４および図１６で与えられる。（ii）ライブラリーのスクリーニングおよびクローンの単離ライブラリープレーティングは、サブユニットＢｒｈＴＸ−１（ｂ）の場合と同様に行われた。³²Ｐ標識プローブは、ＰＣＲによって、プライマーＢＨ（ｃ）ＡおよびＢＨ（ｃ）Ｂ並びに標的ＤＮＡとして配列番号５４で示される配列を有するクローン化ＰＣＲ生成物を用いて合成された。ＰＣＲは下記の条件下で行われた。９５℃で５分間（１サイクル）続いて９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（３０サイクル）続いて７２℃で５分間（１サイクル）。５個のプラークは、３回のプラーク精製によって前記のように均一になるまで通して精製された。（iii）クローンの特性決定ＤＮＡインサートの寸法は、前記のλＧＴ１１前進および復帰プライマーを用いてＰＣＲによって推定された。下記のインサート寸法が推定された。 λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）１−約６９０ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）２−約１，８０００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）３−約６９０ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）４−約７００ｂｐ λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）６−約６９０ｂｐ。（iv）サブクローニングおよびクローンの配列決定ファージＤＮＡは、サムブルックら（1989）によって記載のように、ＣｓＣｌ中での等密度遠心法によって精製された。λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）５からのｃＤＮＡインサートを、ＮｏｔＩによる消化によって放出させ、そして前記の pBlue script SK- のＮｏｔＩ部位中にクローン化した。このプラスミドクローンをｐＢｒｈＴＸ−１（ｃ）５と称する。 λＢｒｈＴＸ−１（ｃ）５中のインサートは、前記のＡＢＩ色素−プライマーおよびＡＢＩ色素−ターミネーター配列決定システムと一緒に下記のプライマーを用いて配列決定された。このプライマーは、配列番号５５および５６でも示される。得られたヌクレオチド配列は、配列番号５７で示される。このｃＤＮＡ配列の推定の翻訳は、１４５アミノ酸のＯＲＦおよび推定分子量１８．８ｋＤａを与えたが、これは配列番号５８で示される。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は図１８でも示される。（ｖ）クローンの分析ペプチド消化／配列決定 −クローン化ｃＤＮＡからの推定のアミノ酸を伴うＢｒｈＴＸ−１（ｃ）サブユニットから直接的に得られたＮ末端タンパク質配列の直線列を下記に示す。直線のタンパク質配列の後半部分の誤対合は、比較的低量の利用可能なタンパク質に由来する配列決定用人工物のためであることがあり、それは欠けているアミノ酸をも説明する（配列決定の場合に解読できないピークを与えた）。ｃＤＮＡからの推定のアミノ酸を伴うトリプシンペプチド配列の直線列を下記に示す。上記に示された配列の末端での不一致／アンビギュイティーは、タンパク質配列決定の場合の人工物のためでありうる。ゲノムサザンブロット −ＢｃｌＩ、ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩによって消化された雄および雌Ｂ．ヘベターゲノムＤＮＡのサザンブロットを、前記のように作成した。³²Ｐ標識プローブは、ＰＣＲによって、下記の条件下でプライマーＢＨ（ｃ）Ｆ１およびＢＨ（ｃ）Ｒ１を用いてｐＢｒｈＴＸ−１（ｃ）５クローンの５ ′部分から生成した。９５℃で５分間；９５℃で３０秒間；４５℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；続いて９５℃で３０秒間；５０℃で１．５分間；７２℃で１分間（５サイクル）；７２℃で５分間。ハイブリダイゼーションは、前記のプローブを用いて行なわれた。結果は、雄および雌ＤＮＡについて一致した。ＢｃｌＩ消化物において、３．３ｋｂｐおよび１．８ｋｂｐの二つのハイブリッド形成バンドが見られた。この結果は、ｃＤＮＡ配列のプローブハイブリダイゼーション部分におけるＢｃｌＩ部位の存在と一致する。ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ消化物は、それぞれ３．１ｋｂｐ、１７．６ｋｂｐの一つのハイブリッド形成バンドを生じた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９５１３２９３．２ (32)優先日 1995年６月29日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダンカン，レイチェル・エリザベスイギリス国バークシャーアールジー１４イーエイ，リーディング，エルドン・ストリート 20 (72)発明者バウル，ヴァレリー・ジェインオーストラリア連邦アクト 2902，カンバー，シパード・プレイス８ (72)発明者クリスチャン，ピーター・ダニエルオーストラリア連邦アクト 2615，マクグレガー，カティー・プレイス４

Claims

【特許請求の範囲】１．単離ＤＮＡであって、配列番号１９で示される核酸配列；配列番号１９で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号１９で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号１９で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む上記単離ＤＮＡ。２．単離ＤＮＡであって、配列番号４６で示される核酸配列；配列番号４６で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号４６で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号４６で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む上記単離ＤＮＡ。３．単離ＤＮＡであって、配列番号４８で示される核酸配列；配列番号４８で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号４８で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号４８で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む上記単離ＤＮＡ。４．単離ＤＮＡであって、配列番号５７で示される核酸配列；配列番号５７で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号５７で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号５７で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む上記単離ＤＮＡ。５．単離ＤＮＡであって、配列番号３６で示される核酸配列；配列番号３６で示される核酸配列と６０％またはそれ以上の相同性を示す配列；配列番号３６で示される核酸配列に対してハイブリッド形成する配列；および配列番号３６で示される核酸に対して遺伝コードの結果として縮重性を有し且つ同様のポリペプチドをコードする配列を含む上記単離ＤＮＡ。６．配列番号１９、４６、４８、５７または３６で示される核酸配列と７０％またはそれ以上の相同性を示す配列を含む請求項１〜５のいずれかに記載の単離ＤＮＡ。７．ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡである請求項１〜６のいずれかに記載の単離ＤＮＡ。８．ゲノムＤＮＡであり且つ請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡがコードするのと同様のポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ。９．請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡによってコードされる、誘導体を含めた単離ポリペプチド。１０．配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、誘導体を含めた単離ポリペプチド。１１．配列番号４７で示されるアミノ酸配列を含む、誘導体を含めた単離ポリペプチド。１２．配列番号４９で示されるアミノ酸配列を含む、誘導体を含めた請求項１１に記載の単離ポリペプチド。１３．配列番号５８で示されるアミノ酸配列を含む、誘導体を含めた単離ポリペプチド。１４．配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含む、誘導体を含めた単離ポリペプチド。１５．請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドの同族変異体であり且つ配列番号２０、４７、４９、５８または３７で示されるアミノ酸配列と８０％またはそれ以上の相同性を示す単離ポリペプチド。１６．配列番号２０、４７、４９、５８または３７で示されるアミノ酸配列と９０％またはそれ以上の相同性を示す請求項１１５に記載の単離ポリペプチド。１７．請求項８に記載のゲノムＤＮＡの転写一次産物の変異スプライシングによって生じる単離ポリペプチド。１８．請求項１〜８のいずれか少なくとも１項に記載のＤＮＡを含む組換えＤＮＡ構築物。１９．クローニングベクターである請求項１８に記載の組換えＤＮＡ構築物。２０．発現ベクターである請求項１８に記載の組換えＤＮＡ構築物。２１．請求項１８に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、形質転換された哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物若しくは無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、細菌または酵母。２２．真菌である請求項２１に記載の形質転換された酵母。２３．請求項１〜８のいずれか少なくとも１項に記載のＤＮＡを含む、遺伝子操作されたウイルス。２４．配列番号１、２、３および４で示されるＮ末端アミノ酸配列を有する４種類のポリペプチドサブユニットを含む昆虫毒素。２５．請求項９に記載の１種類またはそれ以上のポリペプチドを含む昆虫毒素。２６．請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の１種類またはそれ以上のポリペプチドを含む昆虫毒素。２７．本明細書中に定義のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定される約３４，０００Ｄａ、約２１，０００Ｄａ、約１８，５００Ｄａおよび約１７，０００Ｄａの分子量を有する４種類のポリペプチドを含む、寄生バチから得られる昆虫毒素。２８．生物的防除剤であって、（ｉ）請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の昆虫毒素；（ｉｉ）請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド；（ｉｉｉ）請求項１８に記載の組換えＤＮＡ構築物；または（ｉｖ）請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の形質転換系を含む上記生物的防除剤。２９．害虫を駆除する方法であって、害虫防除有効量の請求項２８に記載の生物的防除剤によって害虫またはその生息地を処置することを含む上記方法。