JPH07196688A - 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】新規な生理活性ポリペプチドを提供する。 【構成】アミノ酸配列が配列（１）或いは配列（２）で
示される生理活性ポリペプチド及びその製造法並びにそ
れを有効成分とする抗菌性組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な生理活性ポリペ
プチド及びその製造法に関する。更に抗菌剤としての用
途に関する。

【０００２】より詳細にはカブトムシ（Allomyrina dic
hotoma）幼虫より分離精製された新規な生理活性ポリペ
プチド及び該生理活性ポリペプチドをコードする遺伝子
を組み込んだ形質転換体、及び該形質転換体を培養する
ことによる該生理活性ポリペプチドの製造方法に関す
る。

【０００３】

【従来の技術】細菌や異種の血球を、昆虫に接種したり
単に体表に傷をつけるといった刺激を与えると体液中に
数々の蛋白が誘導されることが知られている。これらの
物質は、抗体産生能を持たない動物の生体防御にとって
重要な係わりがあるものと考えられる。

【０００４】これらのうちで、例えばセンチニクバエ
（Sarcophaga peregrina）幼虫体液中に誘導される活性
蛋白として、血球凝集作用をもつ蛋白〔J. Biol. Che
m., 255巻, 2919−2924頁（1980）〕、抗菌活性を持つ
蛋白〔Biochem. J., 211巻, 727−734頁（1983）〕など
が同定されている。

【０００５】前者のレクチン様蛋白は、ザルコファルガ
（Sarcophaga）レクチンと命名され、マウスの骨髄細胞
やマクロファージの真菌殺能を増強させる、ヒトＴ細胞
よりのγ−インターフェロンの産生を導く、生体防御等
の作用が研究されている。

【０００６】また後者の抗菌活性を持つ蛋白としては、
例えばザルコトキシン（Sarcotoxin）Ｉと命名されてそ
の理化学的性質も明らかにされている（特開昭59-1373
0）蛋白、ザルコトキシンIIと命名されてその理化学的
性質も明らかにされている（特開昭63-35599）蛋白、お
よび同じくセンチニクバエの幼虫体液から得られ、ザー
ペシン（Sapecin）と命名され、単離されてそのアミノ
酸配列が決定されている（特開昭63-185997）蛋白等が
知られている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】これらのポリペプチド
は広い抗菌スペクトルを有しており、可食性の抗菌剤と
して期待されている。しかしながら、これらの蛋白以外
についても新規な抗菌剤の開発が絶えず強く望まれてお
り、上記に述べられた以外の起源による新規な生理活性
ポリペプチドの発見及びその大量生産技術の開発も望ま
れていた。

【０００８】本発明は、カブトムシ幼虫由来の新規な生
理活性ポリペプチド、その製造法及びその用途を提供す
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は配列番号１或い
は配列番号２に示される新規な生理活性ポリペプチドで
あり、またカブトムシ幼虫より配列番号：１或いは配列
番号：２に示されるアミノ酸配列に示される生理活性ポ
リペプチドを取得することを特徴とする生理活性ポリペ
プチドの製造法、更に配列番号：１或いは配列番号：２
に示されるアミノ酸配列を含有する生理活性ポリペプチ
ドをコードする塩基配列を複製可能な発現ベクターに連
結して該塩基配列と複製可能な発現ベクターとを含有す
る複製可能な組換えＤＮＡを得、該組換えＤＮＡで微生
物を形質転換し形質転換体を得、該形質転換体を培養す
ることよりなる配列番号：１或いは配列番号：２に示さ
れるアミノ酸配列を含有する生理活性ポリペプチドの製
造方法、及び配列番号：１及び／又は配列番号：２に示
されるアミノ酸配列に示される生理活性ポリペプチドを
有効成分とする抗菌性組成物である。

【００１０】本発明で提供される生理活性ポリペプチド
はカブトムシ幼虫の体液から得られ、配列番号：１或い
は配列番号：２に示されるアミノ酸配列で示される。

【００１１】また、本発明の生理活性ポリペプチドの製
造方法については、カブトムシ幼虫の体表を傷つけたの
ち飼育し、カブトムシ幼虫をすり潰した後に実施例１に
記載するような方法を用いて抽出精製することができ
る。

【００１２】このように天然に存在するカブトムシから
大量にアロミシンを得ることは大変困難であり、組換え
ＤＮＡ技術を生かして、微生物（大腸菌、放線菌、酵母
や糸状菌など）や昆虫（バキュロウイルス）あるいは動
物細胞で大量にアロミシンを製造することができる。

【００１３】このようにして得られた生理活性ポリペプ
チドはその目的に応じて様々な形態で使用されうる。そ
の一例として、抗菌性組成物の有効成分として利用され
る。即ち、当該生理活性ポリペプチドはそれ単独で又は
適当な賦形剤と組み合わせた形態で抗菌剤組成物を形成
することができ、他の薬剤と併用することもできる。

【００１４】例えば、各種の抗菌力を期待する洗浄剤
（コンタクトレンズ用等）、軟膏剤、石鹸、シャンプ
ー、医療用殺菌・消毒剤、食品用殺菌・防腐剤、ペット
フード、口腔組成物等に使用されうる。

【００１５】また、本発明の生理活性ポリペプチドは細
菌性疾患の予防治療薬としても用いることができる。こ
の場合はその投与量及び投与方法は疾患の種類や症状に
応じて任意に選択することができる。

【００１６】本発明の生理活性ポリペプチドを医薬品と
して用いる場合には経口、非経口によって投与すること
ができ、錠剤、散剤、丸剤、カプセル剤、注射剤などい
ずれの形態によっても使用することができる。また、医
薬上許容される各種の賦形剤、着色剤、調味剤、安定化
剤、等張剤、緩衝剤などを配合することも可能である。

【００１７】本発明の生理活性ポリペプチドを抗菌剤組
成物として使用する場合の配合量に特に制限はないが、
0.001〜80％配合が好適に使用される。

【００１８】本発明の生理活性ポリペプチドを有効成分
とする抗菌性組成物は、それ自体が蛋白質であることよ
り経口投与の場合にはその毒性は問題とならないと考え
られる。従って、本発明の抗菌性組成物は食品や試料に
添加することも可能であり、歯磨き等の口腔清浄剤とし
て使用することも可能である。以下に実施例を記載する
が本発明はこれらに限定されるものではない。

【００１９】

【実施例】実施例１ 抗菌蛋白アロミシンのｃＤＮＡクロ−ニング (I) カブトムシからの体液の調製と抗菌物質の分離 予め土の中で飼育してあるカブトムシ（Allomyrina dic
hotoma）の幼虫を取り出し、予め100℃で10分間処理し
た黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus FDA209P、
約２×10⁸ cells/ml）を約10μｌ（２×10⁶cells）体内
に注射し、また土の中に戻し20℃で３日間飼育した。そ
の後、幼虫の足に傷を付けることにより体液を採取し
た。一匹の幼虫から約１〜２mlの体液が回収できた。

【００２０】この体液には一部の組織が含まれるため、
まず、15000回転、10分間、４℃で遠心分離し、上清を
回収した。次に回収した体液は粘性が高いためこの体液
を−80℃に凍結させ室温で融解させた後、更に同じ条件
で遠心分離した上清を精製の出発材料とした。

【００２１】各種の蛋白等を含む体液から抗菌蛋白を分
離する目的で、終濃度0.05％となるようにＴＦＡ（トリ
フルオロ酢酸）加えた上清を、予め0.05％ＴＦＡで平衡
化したカ−トリッジ式の逆相分配カラム［Ｃ18、セップ
パック（ミリポア製）］に流し吸着させた。次にこのカ
ラムを0.05％ＴＦＡを含む５％アセトニトリル溶液で洗
浄した後、0.05％ＴＦＡを含む、10％、30％、60％、10
0％アセトニトリル溶液でそれぞれ順にステップ・ワイ
ズで溶出させ凍結乾燥させた。次にそれぞれの画分を緩
衝液Ａ（130mM NaCl,リン酸緩衝液,pH6.5）に溶解させ
抗菌活性を測定した。

【００２２】抗菌活性は以下に示す組成で37℃で３時間
振盪培養した後の濁度（OD₆₅₀）を測定し、コントロ−
ルと比較することにより増殖阻害活性として表示される
（図１及び図２）。

【００２３】 サンプル（それぞれの分画）あるいは緩衝液Ａのみ 20μｌ 0.02％ＢＳＡを含む緩衝液Ｂ（60mM NaCl, 180μｌ 30mM K-phosphate buffer, pH7.0) 菌液［OD₆₅₀が約0.12のS. aureus FDA209Pを 含むＭ３培地（Difco）］ 200μｌ 計 400μｌ

【００２４】これらの結果、主に30％と60％のアセトニ
トリルで溶出された画分に活性があることが判った。
尚、コントロ−ルとして黄色ブドウ球菌をサスペンドし
た緩衝液Ａのみを接種した幼虫の体液には、全ての溶出
画分で活性が認められないことから、これらの逆相分配
カラムに吸着し30〜60％で溶出される抗菌物質は黄色ブ
ドウ球菌を接種してはじめて体液中に誘導されることが
明かとなった。

【００２５】(II) 抗菌蛋白の精製 (I)で得られた活性画分を集めて、逆相カラムによるＨ
ＰＬＣ（ＨＰＬＣの条件は以下に示した）により、さら
に抗菌物質を分離した。その結果の典型的パタ−ンを図
３に示した。抗菌活性は数種類に分離された。この内、
アセトニトリル約30％で溶出された活性画分をさらに同
じ逆相カラムによるＨＰＬＣを繰り返すことにより、目
的の抗菌蛋白（以下、アロミシンと呼ぶ）を精製した
（図４）。尚、図３と図４では、抗菌活性は下向きの棒
グラフとして表示されている。３匹の幼虫体液約５mlか
ら最終精製アロミシンが約20μg得られる。

【００２６】逆相カラム：シンクロパックＲＰ−Ｐ，Ｃ
₁₈ 溶出液：リニアグラジエント条件（Ａ液中のＢ液が20％
から40％） （Ａ液：0.05％ＴＦＡを含む水、Ｂ液：0.05％ＴＦＡを
含むアセトニトリル）

【００２７】(III) アロミシンのアミノ末端からの部分
的アミノ酸配列 (II)で得られた精製アロミシンのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜（イモビロ
ン、ミリポア）にブロッティングしたアロミシンをアミ
ノ酸配列決定の試料とした。得られた試料をピリジルエ
チル化して気相式シ−ケンサ−（アプライドバイオシス
テムズ社製 476A型）でエドマン分解を行い、得られた
ＰＴＨ−アミノ酸をＰＴＨ−アナライザ−（アプライド
バイオシステムズ社製 120A型）で分析し、アミノ酸配
列を一部決定した。その配列を配列番号：３に示す。

【００２８】(IV) ＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n)法によるｃＤＮＡの増幅とクロ−ニング アロミシンの全アミノ酸配列を決定は、アロミシンのｃ
ＤＮＡをクロ−ニングし得られたクロ−ンの塩基配列か
ら決定した。アロミシンのｃＤＮＡは、ＰＣＲ法［Saik
i, R. F. et al., Science 230巻, 1350頁（1985）、Mu
llis, K. B. and Faloona, F. A., Method in Enzymolo
gy, 155巻,335頁（1987）］によって増幅しクロ−ニン
グした。アロミシンをコ−ドするｃＤＮＡのＰＣＲによ
る増幅は次に記載する４つの段階から成る。

【００２９】第１段階：(III)で得られたアミノ酸配列
の一部分に対応するｃＤＮＡ断片の増幅とクロ−ニング
及び塩基配列の決定 (a) ＰＣＲ法に用いたプライマ−の合成 (III)で得られたアミノ酸配列と既知の抗菌蛋白ザ−ペ
シンを比較すると一部相同性のあるアミノ酸配列が存在
することが判った。その部分のザ−ペシンのｃＤＮＡの
配列を基にしてＰＣＲのプライマ−をデザインし合成し
た（サイクロン、ミリジェン・バイオサ−チ社製）。

【００３０】プライマ−＃１の塩基配列は１番目（Va
l）から７番目（Ser）のアミノ酸配列に対応し、プライ
マ−＃２の塩基配列は20番目（Cys）から25番目（Leu）
のアミノ酸配列に対応している。尚、プライマ−＃２は
アンチセンス配列である。それぞれのプライマーの配列
を以下に示す。

【００３１】プライマ−＃１：5'-GT(AGCT)ACTTGCGATTT
ATTGAGT-3' プライマ−＃２：5'-CAAGCAATGGGCAGCACA-3'

【００３２】(b) 幼虫から全ＲＮＡの調製法 全ＲＮＡは、グアニジュウム／塩化セシュウム法により
調製した。［Glisin,V., et al, Biochemistry, 13巻,
2633頁（1974）;Ullrich, A., et al, Science, 196巻,
1313頁（1977）;Maniatis, T., et al, Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory（1982）］

【００３３】(I)で示した黄色ブドウ球菌を接種して３
日後の幼虫２匹をまず、液体窒素につけて瞬時に凍結さ
せた。次に、すり鉢の中で液体窒素と共にその凍結した
幼虫を粉砕した。得られた粉砕物を40mlの４Ｍグアニジ
ンチオシアネ−ト（フルカ）、200mM酢酸ナトリウム
（和光純薬）、5mM EDTA（ドウジン）を含む溶液に加
え、室温で15分間振盪混合させた。

【００３４】得られた混合物を30mlのコ−ニングチュ−
ブに分配し、10,000回転で15分間の遠心分離（HITACH
I）を行なった。次に予め４mlの５Ｍ塩化セシュウム
（和光純薬）の入った遠心チュ−ブ６本に得られた上清
を６mlづつ重層し、37,000回転で18時間の超遠心分離
（ベックマン）を行なった。

【００３５】その結果、チュ−ブの底に透明な沈殿物を
得た。この沈殿物が目的の全ＲＮＡを含む沈殿物であ
る。この沈殿物を80％エタノ−ルで２回洗浄し、乾燥さ
せ１チュ−ブあたり80μlの10mM Tris-HCl緩衝液（PH7.
6）,10mM EDTA, 0.5％ SDSを含む溶液に溶かした。

【００３６】次に６本分を１本のチュ−ブに集めＴＥ
［10mM Tris-HCl（pH8.0）, 1mM EDTA］（以下、ＴＥと
いう）飽和フェノ−ルとクロロホルムで２回づつ抽出
し、最後に得られた水層に1/10容量の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH5.2）溶液と２倍容量のエタノ−ルを加え、−20
℃に１時間おいた。

【００３７】その後、遠心分離（12,000g, ４℃，15分
間）により沈殿を回収し、沈殿を80％エタノ−ルで洗浄
し、乾燥させた。これを滅菌蒸留水200μlに溶かし以下
の実験に使用した。最終的に得られた全ＲＮＡ量は約37
0μgであった。

【００３８】(c) 全ＲＮＡから poly(A)⁺ＲＮＡの調製
法 (b)で得られた全ＲＮＡ 350μgからファルマシア社の m
RNA Purification Kitを用いて poly(A)⁺ＲＮＡを12μg
回収した。

【００３９】(d) ＰＣＲ法による（III）で得られた一
部のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ断片の増幅 (c)で得られた0.6μgの poly(A)⁺ＲＮＡと３’ＲＡＣＥ
システム（ＢＲＬ社）を用いて、まずＰＣＲの鋳型ＤＮ
Ａを調製し、プライマ−＃１と３’ＲＡＣＥシステムに
含まれる universal amplification primer を用いて以
下に示す条件で１回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応
は、Gene Amp^TM Kit（パ−キンエルマ−ジャパン社製）
を用い、同社のＤＮＡ Thermal Cycler（ＤＮＡ増幅装
置）により行った。

【００４０】次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にし、プラ
イマ−＃１と＃２を用いて同じ条件で２回目のＰＣＲを
行った所、約70bpのＤＮＡ断片が得られた。 ■ 94℃ １分 37℃ ５分 ■ 72℃ １分 30サイクル

【００４１】(e) ＰＣＲ産物の塩基配列の決定 (d)で得られた約70bpのＤＮＡ断片を抽出して、予め制
限酵素SmaIで切断したプラスミドpUC19（TOYOBO社製）
にクロ−ニングし、得られたクロ−ンのインサ−ト部分
に相当する塩基配列を Chemiluminescent DNA Sequenc
ing Kit（TOYOBO社製）を用いて決定した。その配列を
図５に示した。

【００４２】このプライマ−＃１と＃２ではさまれた塩
基配列部分（図５の枠内）から推定されるアミノ酸配列
が(III)で得られたアミノ酸配列の８番目から19番目の
配列に完全に一致することから、このＤＮＡ断片は目的
のアロミシンのｃＤＮＡの断片であることが考えられ
る。そこで、次にアロミシンのｃＤＮＡの特異的塩基配
列（22番目のＴから59番目のＧまで）を利用して、3'側
と5'側のアロミシンのｃＤＮＡを増幅しクロ−ニングす
ることにした。

【００４３】第２段階：第１段階で決定された塩基配列
に基づいたプライマ−とＢＲＬ社の3'ＲＡＣＥシステム
による3'側のｃＤＮＡ断片の増幅とクロ−ニング及び塩
基配列の決定 第１段階の(c)で得られた0.6μgの poly(A)⁺ＲＮＡと3'
ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ社）を用いて、まずＰＣＲの
鋳型ＤＮＡを調製し、第１段階の(d)で決定された塩基
配列に基づいたプライマ−＃３（以下に示す）（図５参
照）と3'ＲＡＣＥシステムに含まれる universal ampli
fication primer を用いて以下に示す条件で１回目のＰ
ＣＲを行った。尚、基本的ＰＣＲ反応組成や増幅装置は
第１段階の(d)と同じである。

【００４４】次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にし、第１
段階の(d)で決定された塩基配列に基づいたプライマ−
＃４（以下に示す）（図５参照）と3'ＲＡＣＥシステム
に含まれる adapter primer の配列に基づいたプライマ
−＃５（以下に示す）を用いて同じ条件で２回目のＰＣ
Ｒを行った所、約200bpのＤＮＡ断片が得られた。

【００４５】 プライマ−＃３：5'-TTTGAAGCTAAGGGTTTTGC-3' プライマ−＃４：5'-GCTAAGGGTTTTGCCGCCAACCAT-3' プライマ−＃５：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

【００４６】■94℃ 45秒 55℃ １分 ■72℃ ２分 30サイクル 得られた約200bpのＤＮＡ断片を第１段階の(e)と同様に
pUC19にサブクロ−ニングして得られたクロ−ンのイン
サ−トＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。その結果を図
６に示した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列
を下段に示した。

【００４７】その結果、(III)で得られたアミノ酸配列
の10番目から30番目の配列が含まれることが明らかとな
ったこと（図６の枠内）及び103番目から105番目の塩基
配列にストップコドン認められ、その下流に典型的なポ
リＡの付加シグナル（AATAAA）が存在し、その下流にポ
リＡが存在することから、このインサ−トＤＮＡは、目
的のアロミシンのｃＤＮＡの3'側のＤＮＡ断片であると
考えられる。

【００４８】第３段階：第１段階で決定された塩基配列
に基づいたプライマ−とＢＲＬ社の5'ＲＡＣＥシステム
による5'側のｃＤＮＡ断片の増幅とクロ−ニング及び塩
基配列の決定 第１段階の(c)で得られた0.6μgの poly(A)⁺ＲＮＡと第
１段階の(d)で決定された塩基配列に基づいたプライマ
−＃６（以下に示す）（図４参照）と5'ＲＡＣＥシステ
ム（ＢＲＬ社）を用いて、まずＰＣＲの鋳型ＤＮＡを調
製し、5'ＲＡＣＥシステムに含まれる anchor primerと
第１段階の(d)で決定された塩基配列に基づいたプライ
マ−＃７（以下に示す）（図５参照）を用いて以下に示
す条件で１回目のＰＣＲを行った。尚、基本的ＰＣＲ反
応組成や増幅装置は第１段階の(d)と同じである。

【００４９】次に得られたＰＣＲ産物を鋳型にし、第１
段階の(d)で決定された塩基配列に基づいたプライマ−
＃７（以下に示す）と第２段階のプライマ−＃５を用い
て第２段階で示した条件で２回目のＰＣＲを行った所、
約210bpのＤＮＡ断片が得られた。

【００５０】 プライマ−＃６：5'-CATAGACTATGGTTGGCG-3' プライマ−＃７：5'-ATGGTTGGCGGCAAAACCCTTAGC-3' ■ 94℃ 45秒 57℃ 25秒 ■ 72℃ ２分 35サイクル

【００５１】得られた約210bpのＤＮＡ断片を第１段階
の(e)と同様にpUC19にクロ−ニングして得られたクロ−
ンのインサ−トＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。その
結果を図７に示した。この塩基配列から推定されるアミ
ノ酸配列（33〜35番目に対応するメチオニンを１番目と
する）を下段に示した。

【００５２】その結果、そのアミノ酸配列の中に（II
I）で得られたアミノ酸配列の内、１番目のバリンから1
7番目のヒスチジンが含まれることが明らかとなったこ
とから、このインサ−トＤＮＡは目的のアロミシンのｃ
ＤＮＡの5'側のＤＮＡ断片であることが考えられる。

【００５３】第４段階：第２段階と第３段階で決定され
た塩基配列に基づいたプライマ−による目的のアロミシ
ン全体をコ−ドするｃＤＮＡの増幅とクロ−ニング及び
塩基配列の決定 第１段階の(c)で得られた0.6μgの poly(A)⁺ＲＮＡと3'
ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ社）を用いて、まずＰＣＲの
鋳型ＤＮＡを調製し、第２段階と第３段階で決定された
塩基配列に基づいたプライマ−＃８（図６参照）と＃９
（図７参照）（以下に示す）を用いて第２段階で示した
条件でＰＣＲを行った。尚、基本的ＰＣＲ反応組成や増
幅装置は第１段階の(d)と同じである。

【００５４】 プライマ−＃８：5'-TCTATCTTCTGCATATACAAACACC-3' プライマ−＃９：5'-TGCATTCAATAAATCACCGAAC-3'

【００５５】その結果得られた約270bpのＤＮＡ断片を
第１段階の(e)と同様にpUC19にクロ−ニングした。得ら
れたクロ−ンの内、７コのクロ−ンを制限酵素Bpu1102I
で切断し解析した結果、それぞれのインサ−トＤＮＡ部
分に２つの切断部位をもつクロ−ン（Allo−Ａ）と１つ
の切断部位をもつクロ−ン（Allo−Ｂ）の２種類に分類
されることが判った。そこで、それぞれの代表的クロ−
ンの塩基配列を決定した。その結果を図８と図９に示し
た。

【００５６】図８（Allo−Ａ）と図９（Allo−Ｂ）の塩
基配列の下段には塩基配列から予想される、33番目から
35番目の開始コドンであるATGから始まり終止コドンで
ある270番目から272番目のTAGで終了する最も長いオ−
プンリ−ディングフレ−ムを示してある。

【００５７】(III)で得られたアロミシン蛋白のＮ末端
から決定されたアミノ酸配列は全てAllo−Ａの塩基配列
から予想されるオ−プンリ−ディングフレ−ム内に存在
すること（図８の枠内）が明らかとなった。

【００５８】したがって、アロミシン蛋白は、79個のア
ミノ酸から成る前駆体として翻訳されると考えられる。
図８に示したアミノ酸配列部分のうち１番目のメチオニ
ンから約20個のアミノ酸は比較的疎水性に富んだアミノ
酸が並んでいることから、分泌蛋白質に一般的に見られ
るシグナル配列（図８の下線）と考えられる。

【００５９】アロミシン蛋白のアミノ末端のアミノ酸は
バリンであり、その前には２つの塩基性アミノ酸（Lys-
Arg）が存在している（図８の波線）。このアミノ酸配
列は、アロミシン前駆体から成熟体（アロミシン蛋白）
へのプロセッシングに必要な配列と考えられる。

【００６０】アロミシン蛋白側から得られた配列と、得
られたｃＤＮＡ（Allo−Ａ）から予想されるアミノ酸配
列とを総合して考えると、(II)で得られた、アセトニト
リル約30％で溶出され精製されたアロミシンの一次構造
は、37番目のバリンから79番目のアルギニンまで43個の
アミノ酸より成ると考えられる。

【００６１】さて、図８と図９で示したオ−プンリ−デ
ィングフレ−ムのアミノ酸配列を比較するとサイズは全
く同じであり、違いのあるアミノ酸は62番目のバリン
（図８の丸印）と72番目のグリシンのみである。図８と
図９の枠内で示したアミノ酸配列部分にその違うアミノ
酸が存在する。

【００６２】図９の枠内のアミノ酸配列は、上記したア
ロミシンの一次構造と95％の相同性をもつことから、Al
lo−ＢのｃＤＮＡは、アロミシン類似蛋白のｃＤＮＡで
あることが考えられる。したがって、図９の枠内のアミ
ノ酸配列より成るアロミシン類似蛋白はアロミシンと同
様に抗菌活性をもつ蛋白であることが考えられる。

【００６３】(II)で見つけられた約３０％アセトニトリ
ルで溶出されたアロミシン以外の抗菌活性の溶出画分の
１つに相当する物質である可能性もある。

【００６４】図８の枠内のアミノ酸配列より成るアロミ
シンをアロミシンＡ、図９の枠内のアミノ酸配列より成
るアロミシンをアロミシンＢと呼ぶことにする。配列番
号：１にアロミシンＡと配列番号：２にアロミシンＢの
アミノ酸配列を示した。

【００６５】実施例２ 実施例１で得られたＤＮＡを導
入した大腸菌における組換えアロミシンの発現とその組
換え体からアロミシンの分離精製法 アロミシンは抗菌タンパクであることから、大腸菌で発
現させるためには大腸菌内でアロミシンが抗菌活性を発
現しにくい方法がより適当であり、融合タンパクとして
発現させるベクターが選択される。市販の各種融合タン
パク発現ベクター、例えばpMalベクター（BioLabs
社）、pGEXベクター（ファルマシア社）等が挙げられ
る。以下にpMalベクターを用いた場合のアロミシンの発
現例を示す。

【００６６】(a) アロミシンの成熟体をコードするＤＮ
Ａ断片の調製とそのＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
の構築 アロミシンＡあるいはアロミシンＢの成熟体をコート゛する
ＤＮＡ断片はＰＣＲ法により調製した。以下に示すプラ
イマー＃10と実施例１の(IV)の第４段階で示したプライ
マー＃８を用い、テンプレートはAllo−ＡあるいはAllo
−ＢのｃＤＮＡクローンを用いて実施例１の(IV)の第２
段階で示した条件でＰＣＲを行った。

【００６７】その結果得られた、それぞれのＤＮＡ断片
を抽出し、予め制限酵素StuIで切断し抽出してあったpM
al-cベクター（BioLabs社）に結合させ、それぞれのＤ
ＮＡ断片が組み込まれたプラスミドpMal-AあるいはpMal
-Bを得た。図10にプラスミド構築の概略を示した。ま
た、図11にはpMal-cベクターの結合部位の塩基配列とそ
の下にその配列から予測される融合タンパクの結合部位
を示した。

【００６８】pMal-cベクターの融合タンパク（マルトー
ス結合蛋白と目的蛋白）の切断部位はプロテアーゼ、Fa
ctor Xaの切断認識部位としてデザインされている。し
かし、Factor Xaは反応性が低いことから、融合蛋白の
切断にはトロンビンなどの反応性の高いプロテアーゼが
望まれる。そこで予め、ＰＣＲ産物を調製する際に、ト
ロンビンの認識部位であるPro-Argに相当する延期配列
が組み込まれるようにプライマー＃10をデザインした。

【００６９】 プライマー＃10：5'-CCGCGTGTAACGTGCGATCTTTTAAGT-3' 大腸菌で外来遺伝子を高発現させるためには、強いプロ
モーターを使用し転写効率を上げたり、いくつかのＳＤ
配列を含む遺伝子をタンデムに繋いで翻訳効率を上げた
りすることができる。

【００７０】そこでアロミシンの発現に際して、ＳＤ配
列を含む遺伝子をタンデムに繋いで翻訳効率を上げるた
めに、プラスミドpMal-AあるいはpMal-Bのそれぞれの
「ＳＤ配列を含むマルトース結合蛋白とアロミシンをコ
ードするＤＮＡ断片」部分をＰＣＲほうで増幅して得ら
れたＤＮＡ断片を、予め制限酵素XbalとHindIIIで切断
しておいたプラスミドpMal-AあるいはpMal-Bにそれぞれ
導入し、それぞれの遺伝子が２つずつ翻訳される様にデ
ザインされたプラスミドpMAL-A2あるいはpMal-B2を構築
した。略図を図12に示した。遺伝子の個数は拡張が可能
である。

【００７１】(b) プラスミドpMal-A2あるいはpMal-B2を
含む形質転換株の取得と融合蛋白の発現 プラスミドpMal-A2あるいはpMal-B2を宿主大腸菌である
TB1（DH1でもよい）に導入し、それぞれのプラスミドを
持つ形質転換株A2とB2を得た。この形質転換株A2とB2を
培地Ｍで30℃で培養し、対数増殖期の培養菌体に対して
終濃度１mMとなるようにIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド）を加えて３〜４時間後の菌体
を回収した。

【００７２】この菌体をＳＤＳを含む緩衝液で溶かし、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で解析したとこ
ろ、それぞれ約46KDaの融合蛋白が0.4g/Lの発現量で誘
導されることが判った。以下に示すアロミシンの分離精
製方法はアロミシンＡとＢは同じであることからアロミ
シンＡあるいはＢと限定しない。

【００７３】(c) 発現した融合蛋白の回収とアロミシンの分離精製 (b)で得られた菌体を１mg/mlのリゾチームを含む緩衝液
にサスペンドし、氷上で30から40分間処理後、超音波処
理で菌体を破砕し、遠心分離により上清を回収した。こ
の上清に90％以上の融合蛋白が回収された。

【００７４】次にこの上清からアミロース・レジン（Ｄ
ＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーでも良い）により
アフィニティークロマトグラフィーで融合蛋白のみを精
製した。融合蛋白の回収率は70％であった。

【００７５】次にこの融合蛋白を含む溶出液に終濃度10
mM還元型グルタチオンと１mM酸化型グルタチオン（ある
いは４mMシステインと0.4mMシスチン）を加えて穏やか
に攪拌しながら４℃で12時間処理した後、トロンビンを
２〜４ユニット/mlとなるように加えて更に２〜３日間
反応させた。

【００７６】この処理による融合蛋白のマルトース結合
蛋白とアロミシンの切断効率は90％以上であった。次に
このトロンビン処理溶液をＣＭイオン交換クロマトグラ
フィーによりアロミシンとマルトース結合蛋白を分離
し、得られた溶出画分を更に逆相カラムによるHPLCを行
うことにより95％以上の精製度を持つアロミシンが得ら
れた。結果、融合蛋白から精製工程を考慮したアロミシ
ンの回収率は約80から90％であり、培養液当たりのアロ
ミシンの回収は約25から35mg/lであった。

【００７７】また、この大腸菌で得られた組換え型アロ
ミシンは、実施例１で得られた天然型アロミシンと被検
菌として黄色ブドウ球菌を用いた抗菌アッセイで同じ比
活性を示した。

【００７８】実施例３ 実施例１で得られたＤＮＡを導
入した酵母における組換えアロミシンの発現とその組換
え体からのアロミシンの分離精製法 (a) アロミシンＡあるいはＢ遺伝子断片の調製 実施例１で得られたＤＮＡ断片Allo−ＡあるいはAllo−
Ｂのうちアロミシン成熟タンパク部分（配列番号：１或
い配列番号：２に示す）の遺伝子をＰＣＲ法により増幅
した。プライマーとしてはプライマー＃11及びプライマ
ー＃12を用いた。 プライマー＃11：5'-GGTAAGCTTGGATAAAAGAGTAACGTGCGAT
CTTTTAAG プライマー＃12：5'-CGGAATTCTTATCTTCTGCATATACAAACAC
CA 以下はアロミシンＡとＢは同じであることからアロミシ
ンＡあるいはＢと限定しない。以後代表してアロミシン
Ａについて示す。

【００７９】プライマー＃11にはα因子のシグナルペプ
チドの塩基配列の一部（HindIIIサイトを含む）が含ま
れている。又、プライマー＃12にはストップコドンとEc
oRIサイトが含まれている。

【００８０】ＰＣＲ法の反応はGene Amp^TM kit〔パーキ
ンエルマージャパン社製〕を用いDNA Thermal Cycler
〔パーキンエルマージャパン社製〕により行った。反応
液の組成は該キットに添付されている説明書に記載され
ている方法に従った。反応液の入ったチューブをDNA Th
ermal Cyclerにセットし、以下の条件で反応した。

【００８１】95℃ １分 40℃ ２分 72℃ ３分 35サイクル

【００８２】その後、さらに72℃で７分間インキュベー
トした。反応後に反応液を取り出しこれをクロロホルム
にて抽出した。次にこれを1.5％アガロースゲルにて電
気泳動し増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した。そ
の結果、約160bpのＤＮＡ断片が約0.2μg得られた。

【００８３】この160bpのバンドを含むゲルを取り出し
て、MERMAID Kit（Bio 101社製）を用いてキットに添付
されている説明書に従ってＤＮＡを抽出し回収した。さ
らに回収したＤＮＡを制限酵素EcoRI（ＴＯＹＯＢＯ社
製）とHindIII（ＴＯＹＯＢＯ社製）にて消化し、アガ
ロース電気泳動を行ない約160bpのアロミシンＡ遺伝子
断片をMERMAID Kitを用いて回収した。

【００８４】(b) アロミシンＡ遺伝子への酵母分泌シグ
ナル、転写ターミネーターの付加 得られたアロミシンＡ遺伝子断片を発現させるために、
酵母において分泌発現が可能なように分泌発現に必要な
シグナルペプチドの塩基配列と、転写の終結に必要な塩
基配列（ターミネーター）をアロミシンＡ遺伝子断片に
結合した。

【００８５】より具体的に説明すると、まず酵母α因子
のシグナルペプチド部分の塩基配列を前述のＰＣＲ法を
用いて増幅し単離した。すなわち、酵母のゲノムＤＮＡ
（Clontecより購入）を鋳型ＤＮＡとし、プライマー＃1
3及びプライマー＃14を用いてα因子のシグナルペプチ
ド部分の塩基配列を増幅した。 プライマー＃13：5'-GCCTCGAGTTTCATACACAATATAAACGACC
AAA プライマー＃14：5'-GGAAGCTTACCCCTTCTTCTTTAGCAGCAAT
GCT 増幅後、前述したように反応液をアガロース電気泳動し
て増幅したＤＮＡ断片を確認して、これをMERMAID Kit
を用いて抽出し回収した。その結果、約0.5μgの約300b
pのＤＮＡ断片を得た。

【００８６】ここで、プライマー＃13は制限酵素XhoIの
サイトを、プライマー＃14は制限酵素HindIIIのサイト
をそれぞれ含んでいるので、得られたＤＮＡ断片をXhoI
とHindIIIで消化することによりα因子のシグナルペプ
チドの塩基配列を含んだＤＮＡ断片の両末端にそれぞれ
XhoIサイトとHindIIIサイトを導入できる。

【００８７】上記で得られたα因子のシグナルペプチド
の塩基配列を含んだＤＮＡ断片をXhoIとHindIII（共に
ＴＯＹＯＢＯ社製）で消化してブルースクリプトｋｓ^-
（Stratagene社製）をXhoI、HindIIIで消化したラージ
フラグメントとライゲーションした。ライゲーション反
応はライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、キ
ットに添付されている説明書に従って行った。

【００８８】ライゲーション後、反応液で大腸菌DH5
（ＴＯＹＯＢＯ社製）を形質転換した。形質転換はコン
ピテントセルDH5（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて既知の
方法、例えば〔モレキュラー クローニング（Molecula
r Cloning）（1989）〕に記載されている方法により行
った。

【００８９】形質転換の結果、得られたアンピシリン耐
性の菌株よりプラスミドＤＮＡを既知の方法、例えば
〔モレキュラー クローニング（Molecular Cloning）
（1989）〕に記載されている方法により調製した。この
プラスミドをpBαと命名した。

【００９０】次にこのプラスミドpBαをHindIIIとEcoRI
（共にＴＯＹＯＢＯ社製）で切断して得られたラージフ
ラグメントと前述のアロミシンＡ遺伝子をHindIIIとEco
RIで切断したフラグメントをライゲーションした。

【００９１】ライゲーション後、前述同様にこれを用い
て大腸菌DH5を形質転換した。得られた形質転換体より
前述の如くプラスミド（以下、プラスミドpBAαとい
う）を調製し、以下の実験に用いた。

【００９２】次にプラスミドpBAαのアロミシンＡ遺伝
子の下流に酵母PGK遺伝子のターミネーター配列を組み
込んだ。

【００９３】まず、酵母ゲノムＤＮＡよりPGK遺伝子の
ターミネーター配列を増幅し単離した。即ち、鋳型ＤＮ
Ａとしては酵母ゲノムＤＮＡを、プライマーとしてはプ
ライマー＃15及びプライマー＃16を用いてＰＣＲ法によ
り増幅した。 プライマー＃15：5'-CCGAATTCATTGAATTGAATTGAAATCGATA
GA プライマー＃16：5'-CCGGATCCGATATCGGTTTTTCGAAACGCAG
AATTTTCGA 反応液をアガロース電気泳動して、増幅したＤＮＡ断片
を確認し、これをMERMAID Kitを用いて抽出し回収し
た。その結果、約0.3μgの約310bpのＤＮＡ断片を得
た。

【００９４】プライマー＃16はEcoRIサイトをプライマ
ー７はBamHIサイトを含んでおり、得られた断片をEcoRI
とBamHI（ＴＯＹＯＢＯ社製）で消化することにより、P
GK遺伝子のターミネーター配列の両端にそれぞれEcoRI
サイトとBamHIサイトを導入することができる。

【００９５】得られたＰＧＫ遺伝子のターミネーター断
片をEcoRIとBamHIで消化しこれと先程のプラスミドpBA
αをEcoRIとBamHIで消化したラージフラグメントを前述
同様にライゲーションし、形質転換を行った。

【００９６】得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラ
スミドＤＮＡを調製しこれをプラスミドpBGAαと命名
し、以下の実験に用いた。

【００９７】得られたプラスミドpBGAαの塩基配列をシ
ーケネースキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて調べ
た。その結果、アロミシンＡの遺伝子の上流にα因子の
シグナルペプチドの塩基配列が、下流にPGK遺伝子のタ
ーミネーター配列が結合している構造をとっていること
が塩基配列レベルで確認された。

【００９８】さらに、α因子のシグナルペプチド部分の
塩基配列とアロミシンＡ遺伝子の上流側のつなぎ目の塩
基配列をより詳細に調べたところ、その塩基配列はデザ
イン通りであって、それは配列番号：４に示すようなも
のであった。

【００９９】この部分がα因子の開始コドンであるメチ
オニンから順次アミノ酸に翻訳されると、グリシン−バ
リン−セリン−ロイシン−アスパラギン酸−リジン−ア
ルギニン−バリン−トレオニン−システイン−アスパラ
ギン酸−ロイシン−ロイシンという配列になる。

【０１００】このうち最初のグリシンから７番目のアル
ギニンまではα因子のアミノ酸配列であり、８番目のバ
リンからはアロミシンＡ成熟体のＮ末端領域のアミノ酸
を示している。この配列中のリジン−アルギニンの配列
はα因子のシグナルペプチドがプロセッシングを受ける
部分であり、この部分でアロミシンＡ成熟タンパクが切
り出され分泌されるものと予想される。

【０１０１】実施例４ アロミシンＡ遺伝子のクローニ
ング プラスミドpBGAαをXhoIとBamHIで消化してアガロース
電気泳動し、約760bpのＤＮＡ断片を確認し、この断片
をMERMAID kitにより回収した。この断片は前述したα
因子のシグナルペプチドの塩基配列を上流に、PGKター
ミネーターを下流に持ったアロミシンＡ遺伝子を含む。
このＤＮＡ断片を酵母−大腸菌のシャトルベクターであ
るpAM82Bにクローニングした。

【０１０２】ベクターpAM82BはpAM82のデリバティブで
あり、pAM82のPvuIIサイトにBamHIリンカーを組み込む
ことによりBamHIサイトを導入したものである。pAM82B
のXhoIサイトのすぐ上流には酵母の抑酸性性フォスファ
ターゼ遺伝子PHO5のプロモーターが配置されており、Xh
oIサイト下流に適当な構造を持つ遺伝子を組み込むこと
でその遺伝子の発現を行うことができる。

【０１０３】即ち、pAM82BをXhoIとBamHIで消化したラ
ージフラグメントと、前述の760bpのＤＮＡ断片とをラ
イゲーションし、これを用いて大腸菌DH5を形質転換し
た。得られたアンピシリン耐性の菌株よりプラスミド
（以下、プラスミドpAM82B-Alloという）を約500μg調
製し、以下の実験に供した。

【０１０４】実施例５ プラスミドpAM82B-Alloによる
酵母SHY2の形質転換 前述で得られたプラスミドpAM82B−Alloを用いて酵母SH
Y2（ATCC No.44770）を形質転換した。形質転換の方法
は〔Laboratory Course Manual for Methods In Yeast
Genetics（Cold Spring Harbor Laboratory）〕に記載
されている方法に従って行った。

【０１０５】酵母SHY2の性状は（α,ste-VC9,ura3-52,t
rp1-289,leu-3,leu2-112,his3-1,can1-100）であり、こ
の株はロイシンの存在しない培地では成育できない。こ
の株がプラスミドpAM82Bを保持すれば、プラスミドpAM8
2Bの持つロイシン合成遺伝子の働きによりロイシンが含
まれていない培地でも成育できる株、即ちロイシン非要
求性の株となる。従って、プラスミドpAM82B−Alloによ
る形質転換体の酵母はロイシン非要求性となる。

【０１０６】形質転換を行った結果、10個の形質転換体
を得た。そのうちの１株をＹＡと名付けた形質転換体
（以下、ＹＡという）を以下の実験に供した。

【０１０７】実施例６ ＹＡの培養 得られたＴＡの培養は次のようにして行った。ＹＡを高
リン酸Burkholder minimal培地10mlに接種して一晩30℃
で前培養した。尚、Burkholder minimal培地の組成は下
記に示したとおりである。

【０１０８】 (NH₄)₂SO₄ 2 g/l KH₂PO₄ 1.5 g/l MgSO₄・7H₂O 0.5 g/l CaCl₂・2H₂O 0.33 g/l KI 0.1 mg/l CuSO₄・5H₂O 0.04 mg/l FeSO₄・7H₂O 0.25 mg/l MgSO₄・4H₂O 0.04 mg/l (NH₄)₃PO₄12MoO₃・3H₂O 0.02 mg/l ZnSO₄・7H₂O 0.31 mg/l イノシトール 10 mg/l チアミン 0.2 mg/l ピリドキシン 0.2 mg/l pantotenate（Ca salt） 0.2 mg/l ナイアシン 0.2 mg/l ビオチン 0.002 mg/l アスパラギン 2 g/l ヒスチジン 0.02 mg/l トリプトファン 0.025 mg/l ウラシル 0.020 mg/l グルコース 20 g/l

【０１０９】前培養液１mlを100mlの高リン酸Burkholde
r minimal培地に接種して30℃で振盪培養しOD₆₁₀を経時
的に測定した。

【０１１０】OD₆₁₀が1.5に達した時点で一旦培養をやめ
遠心分離（8000×g，５分）で菌体を回収した。回収し
た菌体を今度は100mlの低リン酸Burkholder minimal培
地（高リン酸Burkholder minimal培地よりKH₂PO₄を除
き、代わりにKClを1.5g/lで加えたもの）に懸濁してさ
らに振盪培養を24時間行った。

【０１１１】培養後、菌体を遠心分離（8000×g，５
分）により取り除き、培養上清を回収して以下の実験に
供した。またコントロールとしては、プラスミドpAM82B
で形質転換されたＹ０（以下、Ｙ０とする）を用いて上
記と同様に操作して回収された培養上清を用いた。

【０１１２】実施例７ 培養上清の濃縮 前記の培養上清中に発現したアロミシンＡが含まれてい
るかを調べるために、まずＹＡとＹ０の培養上清をそれ
ぞれ濃縮した。

【０１１３】培養上清の濃縮にはＣＭセルロースカラム
（Whatman CM52使用；ベッドボリューム５ml）を用い
た。まず培養上清100mlを緩衝液Ａにより５倍に希釈し
た。次にＣＭセルロースカラムを50mlの緩衝液Ｂで洗浄
した後、この希釈した培養上清をカラムにアプライし
た。アプライ後、更にカラムを50mlの緩衝液Ｂで洗浄し
た後、500mlの緩衝液Ｃにてカラムに吸着した成分を溶
出し、0.5mlずつフラクションコレクターにより分取し
た。各フラクションのOD₂₈₀を測定して、これらをＣＭ
セルロース吸着画分として以下の実験に供した。尚、緩
衝液Ａ、緩衝液Ｂ及び緩衝液Ｃの組成は下記に示したと
おりである。

【０１１４】緩衝液Ａ NaH₂PO₄ 1.37 g/l Na₂HPO₄ 0.44 g/l 緩衝液Ｂ NaH₂PO₄ 1.37 g/l Na₂HPO₄ 0.44 g/l NaCl 1.46 g/l 緩衝液Ｃ NaH₂PO₄ 1.37 g/l Na₂HPO₄ 0.44 g/l NaCl 30.4 g/l

【０１１５】このＣＭセルロース吸着物の活性測定を行
い、抗菌活性が認められた分画を集め更にＨＰＬＣでア
ロミシンを精製した。また、この酵母で得られた組換え
型アロミシンは、実施例１で得られた天然型アロミシン
と被検菌として黄色ブドウ球菌を用いた抗菌アッセイで
同じ比活性を示した。

【０１１６】

【発明の効果】本発明によれば、新規な生理活性ポリペ
プチドが提供され、また、当該生理活性ポリペプチドは
組換えＤＮＡ技術により微生物（大腸菌、放線菌、酵
母、糸状菌など）で大量に製造することができる。得ら
れた生理活性ポリペプチドは優れた抗菌作用を有し医療
分野や食品分野に広く使用することができる。

【０１１７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala 15 Asn His Ser Leu Cys Ala Ala His Cys Leu Ala Ile Gly Arg Arg 30 Gly Gly Ser Cys Glu Arg Gly Val Cys Ile Cys Arg Arg 43

【０１１８】配列番号：２ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala 15 Asn His Ser Leu Cys Ala Ala His Cys Leu Val Ile Gly Arg Arg 30 Gly Gly Ser Cys Glu Gly Gly Val Cys Ile Cys Arg Arg 43

【０１１９】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 配列 Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Phe Ala Ala 15 Asn His Ser Leu Cys Ala Ala His Cys Leu Ala Ile Gly Arg Arg 30

【０１２０】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 ＧＧＧＧＴＡＡＧＣＴ ＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧ ＡＧＴＡＡＣＧＴＧＣ ３０ ＧＡＴＣＴＴＴＴＡ ３９

【図面の簡単な説明】

【図１】黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を
接種したカブトムシ幼虫の体液の各溶出画分の抗菌活性
を測定した実施例１の結果を示す。

【図２】黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を
接種しないカブトムシ幼虫の体液の各溶出画分の抗菌活
性を測定した実施例１の結果を示す。

【図３】実施例１の逆相カラムによるＨＰＬＣの典型的
パタ−ンを示す。

【図４】実施例１のアセトニトリルで溶出された活性画
分を逆相カラムによるＨＰＬＣによって精製したときの
チャートを示す。

【図５】アロミシン蛋白から得られたアミノ酸配列の１
部分に対応するｃＤＮＡ断片の塩基配列と各プライマー
の方向（矢印）を示す。

【図６】3'側のアロミシンｃＤＮＡ断片の塩基配列とそ
の配列から予想されるアミノ酸配列、及びプライマーの
方向（矢印）を示す。

【図７】5'側のアロミシンｃＤＮＡ断片の塩基配列とそ
の配列から予想されるアミノ酸配列、及びプライマーの
方向（矢印）を示す。

【図８】プレプロ配列を含みアロミシンＡ全体をコード
する塩基配列、及びプライマーの方向（矢印）を示す。

【図９】プレプロ配列を含みアロミシンＢ全体をコード
する塩基配列、及びプライマーの方向（矢印）を示す。

【図１０】ｐＭａｌ−ｃベクターとアロミシンＡ或いは
ＢのｃＤＮＡ断片の結合方法の略図を示す。

【図１１】ｐＭａｌ−ｃベクターとアロミシンＡのｃＤ
ＮＡ断片との結合部位周辺の塩基配列を示す。

【図１２】ｐＭａｌ−ｃベクターとアロミシンＢのｃＤ
ＮＡ断片との結合部位周辺の塩基配列を示す。

【図１３】アロミシンＡ或いはＢのｃＤＮＡを２つ含む
プラスミドｐＭａｌ−Ａ２又はＢ２の略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１或いは配列番号：２に示され
   るアミノ酸配列に示される生理活性ポリペプチド。
2. 【請求項２】カブトムシ（Allomyrina dichotoma）幼虫
   より配列番号：１或いは配列番号：２に示されるアミノ
   酸配列に示される生理活性ポリペプチドを取得すること
   を特徴とする生理活性ポリペプチドの製造法。
3. 【請求項３】配列番号：１或いは配列番号：２に示され
   るアミノ酸配列を含有する生理活性ポリペプチドをコー
   ドする塩基配列を複製可能な発現ベクターに連結して該
   塩基配列と複製可能な発現ベクターとを含有する複製可
   能な組換えＤＮＡを得、該組換えＤＮＡで微生物を形質
   転換し形質転換体を得、該形質転換体を培養することよ
   りなる配列番号：１或いは配列番号：２に示されるアミ
   ノ酸配列を含有する生理活性ポリペプチドの製造方法。
4. 【請求項４】配列番号：１及び／又は配列番号：２に示
   されるアミノ酸配列に示される生理活性ポリペプチドを
   有効成分とする抗菌性組成物。