JP3506274B2 - 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 - Google Patents
新規ペプチドおよび免疫賦活剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規ペプチドおよびこの
ペプチドを有効成分とする免疫賦活剤に関する。
ペプチドを有効成分とする免疫賦活剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】ラクトフェリン（ＬＦ）は、乳中に存在
する鉄結合性の蛋白質として知られている。乳以外の種
々の分泌液中にも存在し、関節腔内や血清などにも存在
し、鉄と結合して溶液中の鉄イオンを奪うことで抗菌作
用を示す。またラクトフェリンは抗菌活性の他に、ウイ
ルスに対する結合性や老化防止効果を有するなどの活性
が知られている。またラクトフェリンのアミノ酸配列の
一部分に、鉄結合性と異なる抗菌活性があることが確認
されている（特開平5-78392、特開平5-148296）。この
ようにラクトフェリンには種々の活性が存在している。
ラクトフェリンは、牛乳から大量に調製する方法が開発
されている。たとえば特開昭63-255300号公報にはラク
トフェリンに対して親和性を有する架橋型ポリサッカラ
イドの硫酸エステルを用いて乳からラクトフェリンを回
収する方法が開示されている。このようにして得たラク
トフェリンを用いることによって幾つかの新しい生理作
用や詳細な構造が判明している。このようなラクトフェ
リンの構造と生理活性については島崎らが総説で説明し
ている（島崎敬一他、バイオサイエンスとインダストリ
ー，Vol.51，25-27, 1993)。また特開平5-178759号公報
にはラクトフェリンが末梢血特に好中球の貪食能を活性
化し、免疫を向上させることが記載されている。しかし
ヒトラクトフェリン由来のペプチドがリンパ球のマイト
ージェン活性を誘導し免疫機能を賦活化することは知ら
れていない。
する鉄結合性の蛋白質として知られている。乳以外の種
々の分泌液中にも存在し、関節腔内や血清などにも存在
し、鉄と結合して溶液中の鉄イオンを奪うことで抗菌作
用を示す。またラクトフェリンは抗菌活性の他に、ウイ
ルスに対する結合性や老化防止効果を有するなどの活性
が知られている。またラクトフェリンのアミノ酸配列の
一部分に、鉄結合性と異なる抗菌活性があることが確認
されている（特開平5-78392、特開平5-148296）。この
ようにラクトフェリンには種々の活性が存在している。
ラクトフェリンは、牛乳から大量に調製する方法が開発
されている。たとえば特開昭63-255300号公報にはラク
トフェリンに対して親和性を有する架橋型ポリサッカラ
イドの硫酸エステルを用いて乳からラクトフェリンを回
収する方法が開示されている。このようにして得たラク
トフェリンを用いることによって幾つかの新しい生理作
用や詳細な構造が判明している。このようなラクトフェ
リンの構造と生理活性については島崎らが総説で説明し
ている（島崎敬一他、バイオサイエンスとインダストリ
ー，Vol.51，25-27, 1993)。また特開平5-178759号公報
にはラクトフェリンが末梢血特に好中球の貪食能を活性
化し、免疫を向上させることが記載されている。しかし
ヒトラクトフェリン由来のペプチドがリンパ球のマイト
ージェン活性を誘導し免疫機能を賦活化することは知ら
れていない。
【０００３】本発明者らはラクトフェリンを酵素分解処
理に付すことにより、ラクトフェリンの構造中に存在す
るペプチドの生理活性を検討してきた。ラクトフェリン
の構造中に存在する特定のペプチドが、抗ＨＩＶ活性
や、抗ＨＴＬＶに対して作用し感染を抑制することを確
認し、特願平５−２４０２８４号、特願平６−１５８５
１号として特許出願を行った。さらにラクトフェリンの
酵素分解物について詳細に検討を行った結果、ラクトフ
ェリンのアミノ酸配列中に存在する特定のペプチド構造
を含むペプチドが強いリンパ球のマイトージェン活性を
有していることを見いだしその作用について検討を行っ
た結果、本発明を完成するに至った。
理に付すことにより、ラクトフェリンの構造中に存在す
るペプチドの生理活性を検討してきた。ラクトフェリン
の構造中に存在する特定のペプチドが、抗ＨＩＶ活性
や、抗ＨＴＬＶに対して作用し感染を抑制することを確
認し、特願平５−２４０２８４号、特願平６−１５８５
１号として特許出願を行った。さらにラクトフェリンの
酵素分解物について詳細に検討を行った結果、ラクトフ
ェリンのアミノ酸配列中に存在する特定のペプチド構造
を含むペプチドが強いリンパ球のマイトージェン活性を
有していることを見いだしその作用について検討を行っ
た結果、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ラク
トフェリンの生理活性について検討を行った結果、ラク
トフェリンの酵素分解物中に、強いマイトージェン活性
と、強い抗腫瘍活性を有することを見いだした。ラクト
フェリンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パ
パイン（いずれもシグマ社製）を用いてラクトフェリン
／酵素＝１００／１で37℃、1時間インキュベートし
た。インキュベート後、ペプシン分解物の反応液を中性
に戻し、その他は80℃で5分間加熱することで反応を停
止させた。生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を
凍結乾燥することでラクトフェリンの酵素分解物の粉末
を得た。この酵素分解物を試料として以下の実施例に記
載した方法でリンパ球の幼若化および抗腫瘍活性を測定
したところ、これまで報告のない強い活性を有すること
を見いだした。この活性測定結果を下記の表１及び表２
に示した。
トフェリンの生理活性について検討を行った結果、ラク
トフェリンの酵素分解物中に、強いマイトージェン活性
と、強い抗腫瘍活性を有することを見いだした。ラクト
フェリンをペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パ
パイン（いずれもシグマ社製）を用いてラクトフェリン
／酵素＝１００／１で37℃、1時間インキュベートし
た。インキュベート後、ペプシン分解物の反応液を中性
に戻し、その他は80℃で5分間加熱することで反応を停
止させた。生じた沈殿を遠心分離により除去し、上清を
凍結乾燥することでラクトフェリンの酵素分解物の粉末
を得た。この酵素分解物を試料として以下の実施例に記
載した方法でリンパ球の幼若化および抗腫瘍活性を測定
したところ、これまで報告のない強い活性を有すること
を見いだした。この活性測定結果を下記の表１及び表２
に示した。
【０００５】
【表１】
【０００６】
【表２】
【０００７】このようにラクトフェリンの酵素分解物に
は強い免疫賦活作用と、これによると推測される強い抗
腫瘍効果が存在することが確認できた。本発明者らは、
さらにラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在するペプ
チド構造に関して検討を行った結果、マイトージェン活
性を発揮するに必須の構造を初めて解明した。本発明は
このようなラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在し、
マイトージェン活性を有する新規ペプチドを提供するこ
とを課題とする。またこのようなペプチドを有効成分と
する、免疫賦活剤を提供することを課題とする。さらに
はこのペプチドを有効成分とするサイトメガロウイルス
感染の防御剤を提供することを課題とする。
は強い免疫賦活作用と、これによると推測される強い抗
腫瘍効果が存在することが確認できた。本発明者らは、
さらにラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在するペプ
チド構造に関して検討を行った結果、マイトージェン活
性を発揮するに必須の構造を初めて解明した。本発明は
このようなラクトフェリンのアミノ酸配列中に存在し、
マイトージェン活性を有する新規ペプチドを提供するこ
とを課題とする。またこのようなペプチドを有効成分と
する、免疫賦活剤を提供することを課題とする。さらに
はこのペプチドを有効成分とするサイトメガロウイルス
感染の防御剤を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のマイトージェン
活性を有するペプチドはペプチド配列中に、次のアミノ
酸配列を有することが必要である。即ちヒトラクトフェ
リン由来のペプチドの場合、次の配列〔Ｉ〕を含むペプ
チドである。
活性を有するペプチドはペプチド配列中に、次のアミノ
酸配列を有することが必要である。即ちヒトラクトフェ
リン由来のペプチドの場合、次の配列〔Ｉ〕を含むペプ
チドである。
【０００９】
【００１０】ヒトラクトフェリンの全アミノ酸配列はす
でに決定されている（M.W. Rey,et al.,NucleicAcid Re
s.,Vol.18,5288,1990)。このペプチドはヒトラクトフェ
リンのアミノ酸配列の１−１９番目のアミノ酸配列に相
当しており、この配列からなるペプチドは、本発明に包
含されるものである。以下、ラクトフェリン由来のペプ
チドのアミノ酸配列はこの文献に従い、Glyを１番目と
して、アミノ酸配列の番号で記載する。このペプチドは
Ｎ末端から１〜３残基欠失したものであっても良い。こ
のアミノ酸配列を含むペプチドの例として次の配列〔I
I〕のペプチドが例示出来る。
でに決定されている（M.W. Rey,et al.,NucleicAcid Re
s.,Vol.18,5288,1990)。このペプチドはヒトラクトフェ
リンのアミノ酸配列の１−１９番目のアミノ酸配列に相
当しており、この配列からなるペプチドは、本発明に包
含されるものである。以下、ラクトフェリン由来のペプ
チドのアミノ酸配列はこの文献に従い、Glyを１番目と
して、アミノ酸配列の番号で記載する。このペプチドは
Ｎ末端から１〜３残基欠失したものであっても良い。こ
のアミノ酸配列を含むペプチドの例として次の配列〔I
I〕のペプチドが例示出来る。
【００１１】
【化２】
【００１２】このペプチドはヒトラクトフェリンの１−
５２番目に相当している。またこのペプチドのＳＳ結合
は還元状態のＳＨ基となっていてもよい。配列〔Ｉ〕お
よび配列〔II〕は、Ｎ末端アミノ酸１〜３残基が欠失し
ていてもよい。即ちヒトラクトフェリン２−１９番目、
３−１９番目、４−１９番目、またはヒトラクトフェリ
ン２−５２番目、３−５２番目、４−５２番目のアミノ
酸配列に相当するものであってもよい。
５２番目に相当している。またこのペプチドのＳＳ結合
は還元状態のＳＨ基となっていてもよい。配列〔Ｉ〕お
よび配列〔II〕は、Ｎ末端アミノ酸１〜３残基が欠失し
ていてもよい。即ちヒトラクトフェリン２−１９番目、
３−１９番目、４−１９番目、またはヒトラクトフェリ
ン２−５２番目、３−５２番目、４−５２番目のアミノ
酸配列に相当するものであってもよい。
【００１３】こ
れらのペプチドはもとの蛋白質と比べて
低分子であり、投与にあたって抗原性は低くなってい
る。
低分子であり、投与にあたって抗原性は低くなってい
る。
【００１４】
本発明のペプチドを調製するには、通常の
ペプチド合成方法が採用できる。ペプチド合成方法とし
ては固相合成方法が一般的であるが、この固相合成方法
は「泉谷他著、ペプチド合成の基礎と実験(1985年丸善
刊)194〜233頁」などに開示された方法を挙げることが
できる。またこれ以外の方法であっても良い。また、ヒ
トラクトフェリンをプロテアーゼによって酵素分解し、
クロマトグラフィーにより分取することもできる。また
酵素分解に付するためのラクトフェリンは、ヒトの乳か
ら容易に回収することができる。例えば上述した特開昭
63-255300号公報に開示されたラクトフェリンに対して
親和性を有する架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル
を用いて、乳から回収することができる。ラクトフェリ
ンの酵素分解に用いる酵素としては、通常蛋白質の酵素
分解に用いる酵素であれば、いずれも使用可能である。
このような酵素としてはペプシン、トリプシン、キモト
リプシン、パパインなどを例示することができる。また
これ以外の酵素であっても使用することができる。この
ようにして得られた酵素分解物から常法によりクロマト
処理することによってこれらのペプチドを採取すること
ができる。また、通常のペプチド製造法に従って製造し
てもよい。
ペプチド合成方法が採用できる。ペプチド合成方法とし
ては固相合成方法が一般的であるが、この固相合成方法
は「泉谷他著、ペプチド合成の基礎と実験(1985年丸善
刊)194〜233頁」などに開示された方法を挙げることが
できる。またこれ以外の方法であっても良い。また、ヒ
トラクトフェリンをプロテアーゼによって酵素分解し、
クロマトグラフィーにより分取することもできる。また
酵素分解に付するためのラクトフェリンは、ヒトの乳か
ら容易に回収することができる。例えば上述した特開昭
63-255300号公報に開示されたラクトフェリンに対して
親和性を有する架橋型ポリサッカライドの硫酸エステル
を用いて、乳から回収することができる。ラクトフェリ
ンの酵素分解に用いる酵素としては、通常蛋白質の酵素
分解に用いる酵素であれば、いずれも使用可能である。
このような酵素としてはペプシン、トリプシン、キモト
リプシン、パパインなどを例示することができる。また
これ以外の酵素であっても使用することができる。この
ようにして得られた酵素分解物から常法によりクロマト
処理することによってこれらのペプチドを採取すること
ができる。また、通常のペプチド製造法に従って製造し
てもよい。
【００１５】
本発明のペプチドはリンパ球の幼若化を誘
導し、抗ウイルス作用特にサイトメガロウイルスに対し
て感染防御効果を示す。本発明のペプチドは単独で投与
することができるし、または、安定剤、賦形剤などの製
剤化に用いる添加剤を使用して製剤化することもでき
る。本発明のペプチドは、食品や家畜飼料に添加して投
与することができるし、医薬品、化粧品などの用途に使
用することもできる。医薬品として用いる場合には経
口、注射、座剤などの投与形態で用いることができ、通
常成人１日当たり0.1〜5ｇ程度を投与することで、免疫
賦活作用や、ウイルス感染防御効果を期待できるもので
ある。また本発明ペプチドは、経口投与においては毒性
を示さないし、また経静脈投与においても、物理的に投
与可能最大投与において死亡動物が出現しない安全な物
質である。
導し、抗ウイルス作用特にサイトメガロウイルスに対し
て感染防御効果を示す。本発明のペプチドは単独で投与
することができるし、または、安定剤、賦形剤などの製
剤化に用いる添加剤を使用して製剤化することもでき
る。本発明のペプチドは、食品や家畜飼料に添加して投
与することができるし、医薬品、化粧品などの用途に使
用することもできる。医薬品として用いる場合には経
口、注射、座剤などの投与形態で用いることができ、通
常成人１日当たり0.1〜5ｇ程度を投与することで、免疫
賦活作用や、ウイルス感染防御効果を期待できるもので
ある。また本発明ペプチドは、経口投与においては毒性
を示さないし、また経静脈投与においても、物理的に投
与可能最大投与において死亡動物が出現しない安全な物
質である。
【００１６】
以下に実施例を示し、さらに本発明を詳細
に説明する。
に説明する。
【実施例１】（ラクトフェリン（以下ＬＦと記す）の酵
素分解物の調製とマイトージェン活性ペプチドの単離） 特開昭63-255300号公報に記載の方法で母乳から調製し
たＬＦを原料としてペプシン（シグマ社製）酵素分解処
理を行った。ＬＦ／酵素＝１００／１の比率で、37℃、
1時間インキュベートした。インキュベート後ペプシン
分解物は反応液を中性に戻し、その他は80℃で５分間加
熱することで反応を停止させた。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、上清を凍結乾燥してＬＦの酵素分解物の
粉末を得た。この分解組成物をＴＳＫゲルＧ300ＳＷカ
ラム（21.5mm×300mm：東ソー製）２本を直列につない
だカラムを装着したＨＰＬＣに付し、分離を行った。溶
出は0.015M NaClを含む1mMリン酸緩衝液（pH7.4）を溶
出液とし、214nmの吸収を測定した。
素分解物の調製とマイトージェン活性ペプチドの単離） 特開昭63-255300号公報に記載の方法で母乳から調製し
たＬＦを原料としてペプシン（シグマ社製）酵素分解処
理を行った。ＬＦ／酵素＝１００／１の比率で、37℃、
1時間インキュベートした。インキュベート後ペプシン
分解物は反応液を中性に戻し、その他は80℃で５分間加
熱することで反応を停止させた。生じた沈殿を遠心分離
により除去し、上清を凍結乾燥してＬＦの酵素分解物の
粉末を得た。この分解組成物をＴＳＫゲルＧ300ＳＷカ
ラム（21.5mm×300mm：東ソー製）２本を直列につない
だカラムを装着したＨＰＬＣに付し、分離を行った。溶
出は0.015M NaClを含む1mMリン酸緩衝液（pH7.4）を溶
出液とし、214nmの吸収を測定した。
【００１７】
分離した各フラクションのリンパ球幼若化
活性を以下の方法により測定した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウ
ス脾臓細胞を採取し洗浄した後、牛胎児血清10％を含む
ＲＰＭＩ1640培地に浮遊させた。脾臓細胞を5×10５／
ウエルになるよう96穴マイクロプレートに分注し、これ
に試料を最終濃度がそれぞれ1μg/ml、10μg/ml、100μ
g/mlとなるよう添加した。対照ウエルにはコンカナバリ
ンＡ（最終濃度1μg/ml）、リポポリサッカライド（最
終濃度100μg/ml）を加え37℃48時間５％ＣＯ２条件下
で培養した。培養後、３−（４，５−ジメチル−２−チ
アゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブ
ロマイド（以下ＭＴＴと略記）液10μl を添加し、更に
３時間培養後、生じたＭＴＴフォルマザンをＥＬＩＳＡ
リーダーを用い、562-595ｎｍで吸光度を測定した（以
上の方法はMed. Immunol., 12, 411 (1986)に開示され
た方法に準じた）。結果は10ウエルの平均値とし、マイ
トジェン活性比（S.I.）は、次の式に基づいて計算し
た。
活性を以下の方法により測定した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウ
ス脾臓細胞を採取し洗浄した後、牛胎児血清10％を含む
ＲＰＭＩ1640培地に浮遊させた。脾臓細胞を5×10５／
ウエルになるよう96穴マイクロプレートに分注し、これ
に試料を最終濃度がそれぞれ1μg/ml、10μg/ml、100μ
g/mlとなるよう添加した。対照ウエルにはコンカナバリ
ンＡ（最終濃度1μg/ml）、リポポリサッカライド（最
終濃度100μg/ml）を加え37℃48時間５％ＣＯ２条件下
で培養した。培養後、３−（４，５−ジメチル−２−チ
アゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウムブ
ロマイド（以下ＭＴＴと略記）液10μl を添加し、更に
３時間培養後、生じたＭＴＴフォルマザンをＥＬＩＳＡ
リーダーを用い、562-595ｎｍで吸光度を測定した（以
上の方法はMed. Immunol., 12, 411 (1986)に開示され
た方法に準じた）。結果は10ウエルの平均値とし、マイ
トジェン活性比（S.I.）は、次の式に基づいて計算し
た。
【００１８】
S.I.＝（試料ウエルの平均吸光度）／（対
照ウエルの平均吸光度）×100
照ウエルの平均吸光度）×100
【００１９】
各フラクションの内、活性の高いフラクシ
ョンについて再度ＨＰＬＣによりその溶出位置を測定
し、以下に示した合成ペプチドと比較した結果、このフ
ラクションの溶出時間はヒトＬＦ１−１９と一致した。
またこのフラクションのアミノ酸配列を分析したとこ
ろ、ヒトＬＦ１−１９の配列を有することが確認でき
た。
ョンについて再度ＨＰＬＣによりその溶出位置を測定
し、以下に示した合成ペプチドと比較した結果、このフ
ラクションの溶出時間はヒトＬＦ１−１９と一致した。
またこのフラクションのアミノ酸配列を分析したとこ
ろ、ヒトＬＦ１−１９の配列を有することが確認でき
た。
【００２０】
【実施例２】（活性ペプチドの化学合成）
実施例１で確認したペプチドおよびそのアミノ酸配列を
含むペプチドの合成を行った。本実施例ではヒトＬＦ１
−１９、ヒトＬＦ１−５２の合成例を示した。本明細書
に記載したこれ以外のペプチドの合成も、本実施例に準
じて合成した。 （１）ヒトＬＦ１−１９の合成 ペプチドシンセサイザー431Ａ（ＡＢＩ社）により、パ
ラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（Ｈ
ＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基として0.25
mmolスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られた
ＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド1455ｍｇをフェノール、
１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂
からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃
縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプ
チドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を
行った。得られた直鎖粗ペプチド500mgは、ＨＰＬＣ
〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（21.5×150mm，東ソー
社），溶出：0.1％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルに
てグラジエント溶出〕により精製し、直鎖精製ペプチド
410mgを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬ
Ｃによる分析の結果93％であった。
含むペプチドの合成を行った。本実施例ではヒトＬＦ１
−１９、ヒトＬＦ１−５２の合成例を示した。本明細書
に記載したこれ以外のペプチドの合成も、本実施例に準
じて合成した。 （１）ヒトＬＦ１−１９の合成 ペプチドシンセサイザー431Ａ（ＡＢＩ社）により、パ
ラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（Ｈ
ＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基として0.25
mmolスケールで直鎖保護ペプチドを合成した。得られた
ＨＭＰ樹脂結合保護ペプチド1455ｍｇをフェノール、
１，２−エタンジチオール、チオアニソール存在下、ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりペプチドのＨＭＰ樹脂
からの切り離しと保護基の除去を同時に行った。減圧濃
縮によりＴＦＡを除去した後、エチルエーテルで粗ペプ
チドを結晶化させ、これを５％酢酸に溶解し凍結乾燥を
行った。得られた直鎖粗ペプチド500mgは、ＨＰＬＣ
〔カラム：オクタデシル４ＰＷ（21.5×150mm，東ソー
社），溶出：0.1％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルに
てグラジエント溶出〕により精製し、直鎖精製ペプチド
410mgを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬ
Ｃによる分析の結果93％であった。
【００２１】
（２）ヒトＬＦ１−５２〔２０Cys(Acm),
３７Cys(Acm) 〕、ヒトＬＦ１−５２および〔１０CysS
H,２０Cys(Acm),３７Cys(Acm),４６CysSH 〕ヒトＬＦ１
−５２の合成 ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、
２０Cys および３７Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル
（Ａｃｍ）基で保護して0.25mmolスケールで直鎖保護ペ
プチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチ
ド2337ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、
チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に
よりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除
去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した
後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを
５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペ
プチド970ｍｇは、ＨＰＬＣ（カラム：オクタデシル４
ＰＷ（21.5×150mm，東ソー社），溶出：0.1％ＴＦＡを
含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出）により
精製し直鎖精製ペプチド〔１０CysSH,２０Cys(Acm),
３７Cys(Acm),４６CysSH 〕ヒトＬＦ（１−５２）607ｍ
ｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣに
よる分析の結果96％であった。このペプチドをフェリシ
アン化カリウム存在下空気酸化により１０Cys,４６Cys
にＳ−Ｓ結合を形成させ、さらにＨＰＬＣにて精製する
ことで、純度90％の〔２０Cys(Acm),３７Cys(Acm)〕ヒ
トＬＦ（１−５２）450ｍｇを得た。さらにこのペプチ
ドをヨウ素処理しＡｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結合の形成を
同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでヒトＬＦ（１−
５２）120ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分析の結果、こ
のペプチドの純度は89％であった。
３７Cys(Acm) 〕、ヒトＬＦ１−５２および〔１０CysS
H,２０Cys(Acm),３７Cys(Acm),４６CysSH 〕ヒトＬＦ１
−５２の合成 ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（ＡＢＩ社）により、
パラヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン
（ＨＭＰ）樹脂を用い、９−フルオレニルメチルオキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基をアミノ末端の保護基とし、
２０Cys および３７Cys のＳＨ基をアセトアミドメチル
（Ａｃｍ）基で保護して0.25mmolスケールで直鎖保護ペ
プチドを合成した。得られたＨＭＰ樹脂結合保護ペプチ
ド2337ｍｇをフェノール、１，２−エタンジチオール、
チオアニソール存在下、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に
よりペプチドのＨＭＰ樹脂からの切り離しと保護基の除
去を同時に行った。減圧濃縮によりＴＦＡを除去した
後、エチルエーテルで粗ペプチドを結晶化させ、これを
５％酢酸に溶解し凍結乾燥を行った。得られた直鎖粗ペ
プチド970ｍｇは、ＨＰＬＣ（カラム：オクタデシル４
ＰＷ（21.5×150mm，東ソー社），溶出：0.1％ＴＦＡを
含む水−アセトニトリルにてグラジエント溶出）により
精製し直鎖精製ペプチド〔１０CysSH,２０Cys(Acm),
３７Cys(Acm),４６CysSH 〕ヒトＬＦ（１−５２）607ｍ
ｇを得た。得られた精製ペプチドの純度は、ＨＰＬＣに
よる分析の結果96％であった。このペプチドをフェリシ
アン化カリウム存在下空気酸化により１０Cys,４６Cys
にＳ−Ｓ結合を形成させ、さらにＨＰＬＣにて精製する
ことで、純度90％の〔２０Cys(Acm),３７Cys(Acm)〕ヒ
トＬＦ（１−５２）450ｍｇを得た。さらにこのペプチ
ドをヨウ素処理しＡｃｍ基の除去とＳ−Ｓ結合の形成を
同時に行い、ＨＰＬＣで精製することでヒトＬＦ（１−
５２）120ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分析の結果、こ
のペプチドの純度は89％であった。
【００２２】
【実施例３】（合
成ペプチドのリンパ球幼若化活性の測
定） 実施例２で得られた合成ペプチドのリンパ球幼若化作用
を測定した。測定は実施例１に示した方法に従った。測
定結果を下記の表３に示した。各合成ペプチドはいずれ
も強いＳ．Ｉ．活性を有していた。
定） 実施例２で得られた合成ペプチドのリンパ球幼若化作用
を測定した。測定は実施例１に示した方法に従った。測
定結果を下記の表３に示した。各合成ペプチドはいずれ
も強いＳ．Ｉ．活性を有していた。
【００２３】
【表３】
【００２４】
【実施例４】（合成ペプチドの抗腫瘍効果の測定）
実施例２で得られた合成ペプチドの免疫賦活効果を確認
するため、腹水型腫瘍の増殖抑制効果を指標として実験
を行い、免疫マーカーの変化を観察した。ＢＡＬＢ／ｃ
雄マウス（１群10匹）に10５〜10６個の腹水型腫瘍細胞
（MethA細胞）を腹腔内に移植した。腫瘍移植当日よ
り、隔日に5回にわたり合成ペプチドを腹腔内に投与し
た。またポジティブコントロールとしてムラミルジペプ
チド（ＭＤＰ）３ｍｇ／ｋｇを同様に投与し、さらにネ
ガティブコントロールとしてカラギーナンを同様に投与
した。腫瘍移植から20日後のマウスの生存率を表４に示
した。サンプルについては0.005ｇ／体重ｋｇ以上の投
与量で腫瘍増殖抑制効果が認められ、特に合成ペプチド
投与群において0.05ｇ／体重ｋｇの投与ではマウスの死
亡は全く認められなかった。またペプチド投与動物のＮ
Ｋ細胞が活性化されていることが確認された。ＮＫ細胞
活性化の測定は、マウスの脾臓細胞をエフェクター細胞
として、標的細胞に５１Ｃｒをラベルした腫瘍細胞（Ｙ
ＡＣ−１）を用い、100:1の割合で混合し、遊離した
５１Ｃｒの量からＮＫ活性値を測定した。本発明物質投
与動物のＮＫ活性値は、コントロールと比べて有意に高
値を示していた。
するため、腹水型腫瘍の増殖抑制効果を指標として実験
を行い、免疫マーカーの変化を観察した。ＢＡＬＢ／ｃ
雄マウス（１群10匹）に10５〜10６個の腹水型腫瘍細胞
（MethA細胞）を腹腔内に移植した。腫瘍移植当日よ
り、隔日に5回にわたり合成ペプチドを腹腔内に投与し
た。またポジティブコントロールとしてムラミルジペプ
チド（ＭＤＰ）３ｍｇ／ｋｇを同様に投与し、さらにネ
ガティブコントロールとしてカラギーナンを同様に投与
した。腫瘍移植から20日後のマウスの生存率を表４に示
した。サンプルについては0.005ｇ／体重ｋｇ以上の投
与量で腫瘍増殖抑制効果が認められ、特に合成ペプチド
投与群において0.05ｇ／体重ｋｇの投与ではマウスの死
亡は全く認められなかった。またペプチド投与動物のＮ
Ｋ細胞が活性化されていることが確認された。ＮＫ細胞
活性化の測定は、マウスの脾臓細胞をエフェクター細胞
として、標的細胞に５１Ｃｒをラベルした腫瘍細胞（Ｙ
ＡＣ−１）を用い、100:1の割合で混合し、遊離した
５１Ｃｒの量からＮＫ活性値を測定した。本発明物質投
与動物のＮＫ活性値は、コントロールと比べて有意に高
値を示していた。
【００２５】
【表４】
【００２６】
【実施例５】（合成ペプチドによるサイトメガロウイル
ス感染防御効果） ヒトＬＦの各種合成ペプチドを調製し、このペプチドの
サイトメガロウイルス感染防御効果を確認した。実験動
物として、ＳＰＦ−ＢＡＬＢ／ｃＡ雄、4週齢を1群5匹
として用いた。このマウスに、マウスサイトメガロウイ
ルス（ＭＣＭＶ）Smith株のマウス唾液腺を10回以上通
過したものを感染させて、その延命率を求めて判定を行
った。ウイルスの感染は1×10６ＰＦＵ／マウスの濃度
で腹腔内に接種して行い、感染と同時に各ペプチドのＰ
ＢＳ溶液を腹腔内に0.25、0.125、0.025、0.005g/k g
（体重）で投与した。また生存動物は解剖を行い、脾臓
を摘出し、脾臓細胞のＮＫ細胞活性を測定した。結果を
表５に示した。
ス感染防御効果） ヒトＬＦの各種合成ペプチドを調製し、このペプチドの
サイトメガロウイルス感染防御効果を確認した。実験動
物として、ＳＰＦ−ＢＡＬＢ／ｃＡ雄、4週齢を1群5匹
として用いた。このマウスに、マウスサイトメガロウイ
ルス（ＭＣＭＶ）Smith株のマウス唾液腺を10回以上通
過したものを感染させて、その延命率を求めて判定を行
った。ウイルスの感染は1×10６ＰＦＵ／マウスの濃度
で腹腔内に接種して行い、感染と同時に各ペプチドのＰ
ＢＳ溶液を腹腔内に0.25、0.125、0.025、0.005g/k g
（体重）で投与した。また生存動物は解剖を行い、脾臓
を摘出し、脾臓細胞のＮＫ細胞活性を測定した。結果を
表５に示した。
【００２７】
【表５】
【００２８】本発明のペプチドはヒトＬＦのＮ末端側に
活性が存在することが確認できた。またこの活性はＮ末
端から３残基まで削除しても、影響がないことが確認で
きた。さらに本発明ペプチドを投与した動物はいずれも
ＮＫ細胞活性が上昇していた。この活性もサイトメガロ
ウイルスの感染防御活性と一致していた。
活性が存在することが確認できた。またこの活性はＮ末
端から３残基まで削除しても、影響がないことが確認で
きた。さらに本発明ペプチドを投与した動物はいずれも
ＮＫ細胞活性が上昇していた。この活性もサイトメガロ
ウイルスの感染防御活性と一致していた。
【００２９】
【実施例６】本実施例は、本発明ペプチドを製剤化した
例を示す。 （１）錠剤 乳糖170ｇ、馬鈴薯澱粉5ｇ、実施例２で合成したヒトＬ
Ｆ１−１９ 20ｇ、ステアリン酸タルク5ｇを混合し、常
法により打錠し、ペプチド100ｍｇを含有する1ｇの錠剤
を200個製造した。 （２）注射剤 100ｍｌ中にマンニトール5ｇ、実施例２で合成したヒト
ＬＦ１−１９ 100ｍｇ、ヒト血清アルブミン100ｍｇ、
カプリル酸ナトリウム2ｍｇを含む水溶液を無菌的に調
製し、1ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封し
た。
例を示す。 （１）錠剤 乳糖170ｇ、馬鈴薯澱粉5ｇ、実施例２で合成したヒトＬ
Ｆ１−１９ 20ｇ、ステアリン酸タルク5ｇを混合し、常
法により打錠し、ペプチド100ｍｇを含有する1ｇの錠剤
を200個製造した。 （２）注射剤 100ｍｌ中にマンニトール5ｇ、実施例２で合成したヒト
ＬＦ１−１９ 100ｍｇ、ヒト血清アルブミン100ｍｇ、
カプリル酸ナトリウム2ｍｇを含む水溶液を無菌的に調
製し、1ｍｌずつバイアルに分注し、凍結乾燥し密封し
た。
【００３０】
【発明の効果】本発明の実施により、新規ペプチド、そ
の製造法、及びこのペプチドを有効成分とする免疫賦活
剤、サイトメガロウイルス感染防御剤が提供される。
の製造法、及びこのペプチドを有効成分とする免疫賦活
剤、サイトメガロウイルス感染防御剤が提供される。
【００３１】
【配列表】配列番号:１
配列の長さ：１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：Ｎ末端部フラグメント
起源：ヒトラクトフェリン
配列の特徴
配列：
【００３２】配列番号: ２
配列の長さ：５２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
フラグメント型：Ｎ末端部フラグメント
起源：ヒトラクトフェリン
配列の特徴
配列：
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/14
Ｃ１２Ｐ 21/06 37/18
(56)参考文献 特開 平２−257892（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−233619（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−48956（ＪＰ，Ａ)
国際公開93／18061（ＷＯ，Ａ１)
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔ
ｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ，1994
年 ３月，Ｖｏｌ．35，Ｎｏ．０，ｐ.
493
Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．,
1989，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．１，ｐ．31−
35
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 1/00 - 41/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列〔Ｉ〕で表されるアミ
ノ酸配列からなるペプチド。 - 【請求項２】 アミノ酸配列〔Ｉ〕のＮ末端のアミノ酸
残基が１〜３残基欠失したものである請求項１記載のペ
プチド。 - 【請求項３】 次のアミノ酸配列〔II〕で表されるアミ
ノ酸配列からなるペプチド。 【化１】 但しＳ−Ｓ結合は還元状態のＳＨ基となっていてもよ
い。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチ
ドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする
免疫賦活剤。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチ
ドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする
サイトメガロウイルス感染防御剤。 - 【請求項６】 ヒトラクトフェリンを、プロテアーゼに
より酵素分解し、酵素分解物から請求項１〜３のいずれ
かに記載のペプチドを採取することを特徴とするペプチ
ドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23202694A JP3506274B2 (ja) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23202694A JP3506274B2 (ja) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003295576A Division JP3561519B2 (ja) | 2003-08-19 | 2003-08-19 | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0873499A JPH0873499A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3506274B2 true JP3506274B2 (ja) | 2004-03-15 |
Family
ID=16932806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23202694A Expired - Fee Related JP3506274B2 (ja) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3506274B2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1059864A (ja) * | 1996-08-15 | 1998-03-03 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 経口がん転移抑制剤 |
| SE9804614A0 (en) | 1998-07-06 | 2000-01-07 | A+ Science Invest Ab | New peptides and use thereof |
| NZ510539A (en) * | 1998-09-15 | 2003-06-30 | Nizo Food Res | A chromatographic process for producing peptides from biological fluids such as milk, whey, blood, egg white and cell culture extracts |
| US6399570B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-06-04 | Agennix, Inc. | Antimicrobial/endotoxin neutralizing polypeptide |
| WO2001034641A2 (en) * | 1999-11-11 | 2001-05-17 | Am-Pharma B.V. | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin |
| US7060677B1 (en) | 1999-11-11 | 2006-06-13 | Am-Pharma B.V. | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin |
| AU4486501A (en) * | 2000-03-27 | 2001-10-08 | Pharming Intellectual Property Bv | High dosage parenteral administration of lactoferrin |
| AU2003298906A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-30 | Agennix Incorporated | Oral lactoferrin in the treatment of sepsis |
| CN101444624B (zh) | 2004-03-19 | 2012-10-10 | 森永乳业株式会社 | 用于癌症治疗的药品 |
-
1994
- 1994-09-01 JP JP23202694A patent/JP3506274B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１，ｐ．３１−３５ |
| Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ ，１９９４年 ３月，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．０，ｐ．４９３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0873499A (ja) | 1996-03-19 |
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