JPH09157291A - 新規なペプチドおよび活性化酸素阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 小麦グルテンのタンパク質分解酵素の分解液
から、活性化酸素阻害作用を有する新規なヘクサペプチ
ド及びノナペプチドを提供する。 【構成】 小麦グルテンをタンパク質分解酵素等で処理
し、新規な活性化酸素阻害作用を有するヘクサペプチド
及びノナペプチドであり、活性化酸素フリーラジカル消
去作用並びに抗酸化作用を有し、毒性も極めて低い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬として有用性を有
する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプ
チドならびにそれらペプチドを有効成分とする活性化酸
素阻害剤に関する。 Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ （式中、アミノ酸残基を表わす各記号は、アミノ酸化学
において慣用の表示法によるものである。）

【０００２】

【従来の技術】活性化酸素が関与する疾病は、火傷、関
節炎などの炎症、再還流障害、抗癌剤の副作用、放射線
障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫
疾患など幅広く存在する。好中球やマクロファージなど
の活性化によって、発生する大量の活性化酸素が引き起
こす疾患は、すべて対象となる。一般に、酸素には動物
に必須の酸素（三重項酸素分子：^３Ｏ_２）と、特定の条
件あるいは体の不調時に生じるラジカル（活性化酸素）
とが存在する。ラジカルは直接又は間接的（過酸化反応
という形で）に細胞膜、細胞内顆粒膜、あるいはＤＮＡ
をはじめ種々の細胞成分を変質、損傷させたりする。こ
のラジカルは体内で生産され、その種類はスーパーオキ
シドアニオン（⁻Ｏ_２・）、一重項酸素（^１Ｏ_２・）、
水酸化ラジカル（・ＯＨ）等が存在する。このうちスー
パーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）は細胞膜の不飽和脂
肪酸等に作用して過酸化反応を引き起こし、脂質に対す
る酸化力は動物に必須な酸素の数千倍も高いといわれて
いる。活性化酸素阻害剤としてのスーパーオキシドジム
スターゼ（ＳＯＤ；酵素番号ＥＣ１．１５．１．１）
は、１９６９年にマクコルドら［ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．
Ｍ．＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２４４，６０４９（１９６９）］によってその
作用が発見された酵素であり、酸素分子が一電子還元さ
れて生じるスーパーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）を不
均化する ２⁻Ｏ_２・＋２Ｈ^＋→Ｈ_２Ｏ_２＋Ｏ_２ を触媒する。人体が正常な時にはＳＯＤが働いてスーパ
ーオキシドアニオンの発生を抑えている。このＳＯＤ活
性は加齢と共に低下し、すなわち壮年期から老年期にな
ると活性が低下し、ＳＯＤ活性の増減は生体の老化、癌
化のバロメーターとも言われている。このようなＳＯＤ
活性が低下するとラジカルの発生は抑えにくくなりＳＯ
Ｄを摂取補強するか、又はラジカルを捕捉除去する活性
化酸素阻害剤の摂取が必要となってくる。一方、水溶性
の抗酸化剤としてのアミノ酸から蛋白質にいたるポリペ
プチドの活性化酸素阻害作用は、油脂をペプチド類が包
み込むことにより酸素分子と不飽和脂肪酸の接触を阻害
し、脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）の発生を抑制
すると考えられており、ＢＨＡ（ブリルヒドロキシルア
ニソール）及びＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）
の抗酸化作用のように、油脂（Ｌ）の酸化の際に生じる
ラジカル（ＬＯＯ・）に作用して、酸化の連鎖反応を停
止させるラジカル捕捉作用とは区別している。 ＬＯＯ・＋ＡＨ_２→ＬＯＯＨ＋ＡＨ・２ＡＨ・→２ＡＨ
_２＋Ａ 又は ＬＯＯ・＋ＡＨ・→ＬＯＯＨ＋Ａ （ＡＨ_２；抗酸化剤） このような背景のもとに、抗癌、老化防止に対する特効
薬がない今日、環境中からＤＮＡ損傷因子、突然変異因
子、発癌因子、老化因子等を取り除いたり不活性化し、
活性化酸素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を
示す活性化酸素阻害剤に関する研究や検討が進められて
いる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前記従来技術で、活性
化酸素阻害剤としてのＳＯＤはその製造が困難であり又
原料の入手に制限があり、ビタミンＥ、ビタミンＣ、カ
テキン類等は生体を用いた実験では活性化酸素阻害作用
が十分でない等の難点があり、更に強力な作用を有する
活性化酸素阻害剤が要望されている。又、活性化酸素フ
リーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を示す活性化酸
素阻害剤の多くは、その殆んどが化学合成で製造された
ものであり、又たとえ植物や動物からの材料を用いた天
然物由来のものであっても、その製造過程で人体に害を
及ぼす化学物質を用いたり、生成物の一部を化学物質と
反応させて作られた物が多い。水溶性の抗酸化剤とし
て、アミノ酸から蛋白質に至るポリペプチドのアミノ酸
配列と抗酸化力に関する知見は極めて少なく、山口ら
［ニューフードインダストリー，３１巻，１８〜２２頁
（１９８９年）］は、ジペプチドがアミノ酸や蛋白質よ
りも抗酸化力が強いことを示しており、又、最近、拓植
ら［日本農芸学会誌，６５巻，１６３５〜１６４１頁
（１９９１年）］が、ヒスチジンを含む３種の抗酸化ペ
プチドを報告しているのみである。これら活性化酸素フ
リーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有する活性化
酸素阻害剤が、未だ医薬品としての開発が進んでいると
の報告はない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、小麦グルテ
ンのタンパク質分解酵素の分解液から薬理作用を有する
物質を検索し、新規なヘクサペプチド及びノナペプチド
が強い活性化酸素阻害作用を有することを見出した。そ
して、これらペプチドを医薬として実用化するための研
究を鋭意行った。その結果、これらペプチドが活性化酸
素フリーラジカル消去作用並びに抗酸化作用を有し、天
然物由来の活性化酸素阻害剤としての有用性を見い出し
た。本発明は係る知見に基づくものである。以下に、本
発明を詳細に説明する。本発明に係る新規なペプチド
は、次式 Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列を有する新規なヘクサ
ペプチド及びノナペプチドであり、常温における性状は
白色の粉末である。

【０００５】前記のヘクサペプチド及びノナペプチド
は、化学的に合成する方法または小麦グルテンのタンパ
ク質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げるこ
とができる。本発明に係る新規なこれらペプチドを化学
的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常の
ペプチド合成方法によって行うことができるが、好まし
くは、固相法によってポリマー性の固相支持体へペプチ
ドのＣ末端（カルボキシル末端側）からそのアミノ酸残
基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によっ
て結合して行くのがよい。そして、そのようにして得ら
れた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、
フツ化水素等を用いてポリマー性の固相支持体から切断
した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬ
Ｃと略記する。）等を用いた通常の方法で精製すること
ができる。

【０００６】上記したように、本発明に係る新規なヘク
サペプチド及びノナペプチドは小麦グルテンのタンパク
質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、
その場合には、例えば、以下のようにして行うことがで
きる。上記の新規なペプチドを含有している小麦グルテ
ン部分を取り出し加水分解する。加水分解は常法に従っ
て行う。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加
水分解する場合は、小麦グルテンを必要とあれば更に加
水分解した後、酵素の至適値に調整し、酵素を加えてイ
ンキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素
を失活させて加水分解液を得る。その加水分解液を濾紙
および／またはセライト等を用いて濾過することによっ
て不溶性成分を除去し、得られた濾液をセロファン等の
半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、トリス−塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析
し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶
液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社
製のＤｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出画分
から活性化酸素阻害活性を有する成分を含有する画分を
得、得られた活性化酸素阻害活性画分をゲル濾過（例え
ば，フアルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５
等）によって分画し、得られた活性化酸素阻害活性画分
を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製の
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５等）によって分画
し、得られた活性化酸素阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬ
Ｃによって分画する。

【０００７】この新規なヘクサペプチド及びノナペプチ
ドは、静脈内への繰返し投与を行った場合、抗体産生を
惹起せず、アナフイラキシーショックを起こさない。ま
た、これらペプシドはＬ−アミノ酸のみの配列構造から
なり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解
される為，毒性は極めて低く安全性は極めて高い（ＬＤ
_５０＞５０００ｍｇ／Ｋｇ：ラット径口投与）。本発
明に係る新規なヘクサペプチド及びノナペプチドは、通
常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、
カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。
投与法としては、通常は、ＳＯＤが欠乏している哺乳類
（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あ
るいは経口投与することがあげられる。投与量は、例え
ば、動物体重１ｋｇ当りヘクサペプチド及びノナペプチ
ドを各々０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、
通常、１日〜４回程度であるが、投与経路によって、適
宜、調整することができる。上記の各種製剤において用
いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤の種類は、特に限定さ
れず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプ
セル剤に用いられるものを使用することができる。

【０００８】錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる
添加剤としては、下記のものをあげることができる。賦
形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール
等の糖アルコール類、でんぷん類、無水リン酸カルシウ
ム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピル
メチルセルロース等；崩壊剤としてはカルボキシメチル
セルロースおよびそのカリウム塩類；滑沢剤としてはス
テアリン酸およびその塩類、タルク、ワツクス類を挙げ
ることができる。また、製剤の調整にあたっては、必要
に応じメントール、クエン酸およびその塩類、香料等の
矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、
常法により、本発明に係る新規なヘクサペプチド及びノ
ナペプチドを、注射用水、生理食塩液およびキシリトー
ルやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレ
ングリコールやポリエチレングリコール等のグリコール
に溶解または懸濁させて注射剤とすることができる。こ
の際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添
加することができる。本発明の新規なヘクサペプチド及
びノナペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品または乾燥
粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水または生
理食塩液にて溶解して用いることもできる。

【０００９】活性化酸素はマクロファージ等の食細胞内
に生じ、食細胞が補食した異物を分解する役割を有して
いるが、活性化酸素が過剰に生産されると細胞の外に分
泌され、他の組織に障害を起こす。本発明に係る新規な
ヘクサペプチド及びノナペプチドは、優れた活性化酸素
阻害作用を有し、活性化酸素フリーラジカル消去作用並
びに抗酸化作用を示すことから、組織障害を引き起こす
過剰な活性酸素を分解して組織を守る作用を持つことか
ら、例えば抗炎症剤として、関節炎やリュウマチなどに
有効であるほか、ベーチュット病、心筋梗塞等に対して
も有用である。

【００１０】

【実施例】以下に実施例として、製造例及び試験例を記
載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ 小麦グルテン３３０ｇに脱イオン水１．６５ｌを加えて
ホモジナイズした。得られた小麦グルテンホモジネイト
にペプシン９．９ｇを加え、ｐＨ２．０に調整して３７
℃で２０時間インキュベイトした。このようにして調製
した小麦グルテンホモジネイトのペプシン分解液をＤｉ
ａｆｌｏｗ膜（アミコン社製、ＹＨ１０型膜、分画分子
量１万）を用いて限外濾過した。得られた濾過液をＤｏ
ｗｅｘ５０ＷＸ４（Ｈ^＋）を充填したカラムを用いてク
ロマトグラフィー処理した。脱イオン水で水洗し、溶出
は２Ｎ−ＮＨ_４ＯＨで行い溶出液を濃縮した。この濃縮
液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムによりカラムク
ロマトグラフィー処理して低分子ペプチド画分（分画番
号２４〜４１番）を分離した。そのカラムクロマトグラ
フを図１に示した。この低分子ペプチド画分を濃縮して
カゼインペプチド液を得た。更にこのペプチド液をＳＰ
−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｈ^＋）カラムによりカ
ラムクロマトグラフィー処理して各ペプチド画分として
ＳＰ−１画分（分画番号１７〜３７番）、ＳＰ−２画分
（分画番号３８〜５９番）およびＳＰ−３画分（分画番
号６０〜８０番）を分離した。そのカラムクロマトグラ
フを図２に示した。これら各ペプチド画分を凍結乾燥し
てペプチドパウダー（以下、小麦グルテンペプチドと称
す。）として、ＳＰ−１画分１８．６ｇ、ＳＰ−２画分
１９．９ｇおよびＳＰ−３画分２３．３ｇを得た。この
ようにして分画した小麦グルテンペプチドの中で、活性
化酸素阻害活性の高いＳＰ−３画分のペプチドパウダー
を脱イオン水５ｍｇ／２５μｌに溶解した後ＨＰＬＣを
行った。条件はカラムとして野村化学（株）製Ｄｅｖｅ
ｌｏｓｉｌＯＤＳ−５（φ４．６ｍｍ ＩＤＸ２５ｃｍ
Ｌ）を使用し、移動相として０．０５％トリフルオロ酢
酸（以下、ＴＦＡと略記する。）から２５％アセトニリ
ル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法により、流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでクロマトグラフィ
ー処理し、溶出時間４８．５分と５６．１分に強い活性
化酸素阻害作用を有するペプチドフラグメントを得た。
その結果は図３に示すとおりである。このようにして得
られた活性化酸素阻害作用を有するこれらペプチドのア
ミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社
製のプロテインシーケンサー４７７ Ａ型を用いて決定
された。その結果、次式 Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸残基からなる配列を有するヘ
クサペプチド及びノナペプチドであることが確認され
た。本発明に係わる小麦グルテンペプチドを活性化酸素
阻害剤として例えば錠剤に製剤する場合には、常法にし
たがって例えば次のように処理すればよい：（１）ペプ
チド１３ｇ、（２）乳糖８７ｇ、（３）コーンスターチ
２９ｇ、（４）ステアリン酸マグネシウム１ｇを原料と
し、先ず（１）、（２）及び１７ｇコーンスターチを混
和し、７ｇのコーンスターチから作ったペーストととも
に顆粒化し、この顆粒に５ｇのコーンスターチと（４）
とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤
１０００個を製造する。

【０００１１】製造例２ 本例は、合成法による製造例である。 Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａ１ａの合
成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ヘクサペプチド
を合成した。固相担体としては、スチレン−ジビニルベ
ンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化
した樹脂を使用した。まず、当該ヘクサペプチドのアミ
ノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のＧｌｎ
からクロロメチル樹脂に反応させ、ペプチド結合樹脂を
得た。このときのアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル
（以下ｔ−Ｂｏｃと略記す。）基で保護されたｔ−Ｂｏ
ｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエ
タンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁
し、室温で１０分間攪拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸
を加え、さらに１０分間攪拌した。この混合液にトリフ
ルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌
した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて
分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、
減圧下で乾燥した。このようにして得られた末精製の合
成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ
_１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相
として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１
％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が
２０分間で９３％→７１％の濃度勾配法により流速１．
４ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部
波長２１４ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分
を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする
合成ヘクサペプチドを得た。

【００１２】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、次式 Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ なるアミノ酸配列構造を有するヘクサペプチドであるこ
とが確認された。このマススペクトルの結果は図４に示
すとおりである。他のノナペプチドについても上記合成
方法に準じ固相法によりＣ末端側から反応させ合成し
た。未精製の合成ノナペプチドは以下に示すとおり精製
した。 Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕの精製方法 逆相系のカラムＣ_１８（５μ）を用いたＨＰＬＣにより
精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留
水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使
用し、（Ａ）液が２０分間で９０％→６５％の濃度勾配
法により流速１．６ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィー
を行った。紫外部波長２１６ｎｍで検出し、最大の吸収
を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することに
よって目的とする合成ノナペプチドを得た。

【００１３】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、次式 Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ なるアミノ酸配列構造を有するノナペプチドであること
が確認された。このマススペクトルの結果は図５に示す
とおりである。合成によって得られた本発明のヘクサペ
プチド及びノナペプチドは、以下に示すｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ（試験管内）試験によって、活性化酸素フリーラジカ
ル消去作用並びに抗酸化作用を確認することにより、そ
の活性化酸素阻害効果が確認された。

【００１４】試験例１ （活性化酸素フリーラジカル消去作用の測定）ウミホタ
ルルシフェリン誘導体（ＣＬＡ）は一重項酸素（^１Ｏ_２
・）、スーパーオキシドアニオン（⁻Ｏ_２・）を特異的
に検出する有効な化字発光試薬であり、発明者ら［Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５，１５７〜１６０
（１９９１）］の方法によりスーパーオキシドジムスタ
ーゼ（ＳＯＤ）を消光剤に用いた消光実験によりＣＬＡ
と⁻Ｏ_２・との反応速度がもとめられる。ＣＬＡ（Ｃ
_１３Ｈ_１１ＯＮ_３，東京化成製，最終濃度１．３９×１
０^−７〜４．６４×１０^−８）溶液１０μｌ、アルブミ
ン（５０ｍｇ／ｍｌ，シグマ社製）５００μｌ、キサン
チンオキシダーゼ（１．４５ｕｎｉｔ／ｍｌ，シグマ化
学製）５０μｌを順に円筒方石英セル（内径１４ｍｍ，
高さ６０ｍｍ）に入れ、ルミノメーターＡｌｏｋａ Ｂ
ＬＲ−１０２Ｂ型（浜松ホトニクス製）の試料室内に移
し、３ｍＭヒポキサンチン溶液２００μｌを注入して、
セル底面から化学発光を単一光量子計数により測定し
た。消光剤が存在する場合並びに存在しない場合の⁻Ｏ
_２・の発光強度の比率（Ｉ_０／Ｉ）はＩ_０／Ｉ＝１＋
［ｋ_３／（ｋ_１＋ｋ_２〔ＣＬＡ〕）］×［Ｑ］で表され
る。ここで［Ｑ］は活性化酸素阻害剤を、ｋ_１は⁻Ｏ_２
・の消光速度定数、ｋ_２は⁻Ｏ_２・と［ＣＬＡ］との反
応速度定数、ｋ_３は⁻Ｏ_２・と［Ｑ］との反応速度定数
を示す。本発明に係わる小麦グルテン由来のペプチド画
分の、活性化酸素フリーラジカル消去作用を示す活性化
酸素阻害活性（消光速度）を表１に示す。

【表１】 本発明に係る新規なヘクサペプチドの活性化酸素フリー
ラジカル消去作用を示す活性化酸素阻害活性値（反応速
度定数ｋ_３）は３．５×１０^−６Ｍ^−１ｓｅｃ^−１であ
る。又、本発明に係る新規なノナペプチドの活性化酸素
フリーラジカル消去作用を示す活性化酸素阻害活性値
（反応速度定数ｋ_３）は１．２×１０^−６Ｍ^−１ｓｅｃ
^−１である。尚、標品ＳＯＤの活性化酸素フリーラジカ
ル消去作用を示す活性化酸素阻害活性値（ｋ_３）は３．
４７×１０^−８Ｍ^−１Ｓ^−１である。

【００１５】試験例２ （抗酸化作用の測定）抗酸化作用の測定方法として、反
応液はリノール酸５１．５ｍｇ、エタノール４．０５２
ｍｌ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４．０ｍ
ｌ、脱イオン水１．９４８ｍｌの混合液に、抗酸化作用
を有するペプチド１〜３ｍｇ添加し、全量が１０ｍｌと
なるように調整した。この溶液をネジ付き試験管で密封
し５０℃の恒温器中に放置し、２４時間毎にリノール酸
の過酸化物価をロダン鉄法で測定した。即ち反応液０．
１ｍｌ、７５％エタノール液９．７ｍｌ、３０％ロダン
アンモニウム液０．１ｍｌ、０．０２Ｍ塩化第二鉄を含
む３．５％塩酸溶液０．１ｍｌを添加し、３分間反応さ
せた後、吸光度５００ｎｍを測定した。その際、５００
ｎｍの吸光値が０．３５に達するまでの日数を誘導期間
（日）とした。本発明に係わる小麦グルテン由来のペプ
チド画分の、抗酸化作用を示す活性化酸素阻害活性（誘
導日数）を図６に示す。本発明に係る新規なヘクサペプ
チド及びノナペプチドの抗酸化作用を示す活性化酸素阻
害活性値（誘導日数）は、トコフェロール２ｍｇの６．
５日に対して、ヘクサペプチド０．１ｍｇの１４日、ノ
ナペプチド１ｍｇの１６日である。以上の試験の結果、
本発明に係る新規なヘクサペプチド及びノナペプチドは
活性化酸素フリーラジカルル消去作用並びに抗酸化作用
を有することから、ｉｎｖｉｔｒｏ（試験管内）試験に
おいて有意な活性化酸素阻害作用を示すことが確認され
た。したがって、本発明に係るヘクサペプチド及びノナ
ペプチドは活性化酸素阻害剤の対象となる虚血性心疾患
者、慢性関節リュウマチおよび重症火傷患者の治療また
は予防薬として有用である。尚、本発明に係るヘクサペ
プチド及びノナペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列
を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用する
こともできる。

【００１６】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わる小麦グルテンのペプシン分解液
の、製造例１におけるＳｅｐａｄｅｘＧ−２５カラムク
ロマトグラフィーによる活性化酸素阻害ペプチドの分離
精製の結果を示す図である。尚、図中マーカーとして分
子量６千のインシュリン、分子量３５００のインシュリ
ンＢ鎖、分子量２５５０のインシュリンＡ鎖、分子量１
４５０のバシトラシンおよび分子量７５のグリシンを用
いた。

【図２】本発明に係る小麦グルテンペプチドの、製造例
１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｈ^＋）
カラムクロマトグラフィーによる活性化酸素阻害ペプチ
ドの分離精製の結果を示すである。

【図３】本発明に係わる小麦グルテンペプチドの、製造
例１における逆相ＨＰＬＣにおける活性化酸素阻害ペプ
チドフラグメントの分離精製の結果を示す図である。

【図４】本発明に係わるヘクサペプチドの、製造例２で
得られた合成ヘクサペプチドのマススペクトルを示す図
である。

【図５】本発明に係わるノナペプチドの、製造例２で得
られた合成ノナペプチドのマススペクトルを示す図であ
る。

【図６】本発明に係わる小麦グルテンペプチドの、製造
例１におけるＳＰ画分（１，２，３ｍｇ）の誘導日数
（日）を示し、抗酸化作用を表わす活性化酸素阻害作用
を示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次式；Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なヘクサペプチド。
2. 【請求項２】 次式；Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉ
   ｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なヘクサペプチドを有効成分として含有する
   ことを特徴とする活性化酸素阻害剤。
3. 【請求項３】 次式；Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なノナペプチド。
4. 【請求項４】 次式；Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
   有する新規なノナペプチドを有効成分として含有するこ
   とを特徴とする活性化酸素阻害剤。