JP3108920B1 - 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents
新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤Info
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- JP3108920B1 JP3108920B1 JP11284647A JP28464799A JP3108920B1 JP 3108920 B1 JP3108920 B1 JP 3108920B1 JP 11284647 A JP11284647 A JP 11284647A JP 28464799 A JP28464799 A JP 28464799A JP 3108920 B1 JP3108920 B1 JP 3108920B1
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- amino acid
- lys
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Abstract
【要約】
【目的】ワカメの蛋白質分解酵素分解液から、アンジオ
テンシン変換酵素阻害作用をを有する新規なテトラペプ
チドを提供する。 【構成】ワカメを蛋白質分解酵素等で処理し、新規なア
ンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する４種類のテト
ラペプチドは（１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、
（２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、（３）Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ、（４）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｙｓであり、生体内での血圧降下作用を有し、
毒性も極めて低い。
テンシン変換酵素阻害作用をを有する新規なテトラペプ
チドを提供する。 【構成】ワカメを蛋白質分解酵素等で処理し、新規なア
ンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する４種類のテト
ラペプチドは（１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ、
（２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、（３）Ｌｙｓ
−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ、（４）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｙｓであり、生体内での血圧降下作用を有し、
毒性も極めて低い。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品として有用性を
有する下記アミノ酸の配列のペプチド構造を有するテト
ラペプチドならびにそのペプチドを有効成分とするアン
ジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。 Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ （式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学に
おいて慣用の表示法によるものである。）
有する下記アミノ酸の配列のペプチド構造を有するテト
ラペプチドならびにそのペプチドを有効成分とするアン
ジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。 Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ （式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学に
おいて慣用の表示法によるものである。）
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】レニン
−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調
節に重要な役割を果たしていることはよく知られてい
る。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテン
シン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する。）が存在し、ア
ンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩ
Ｉに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物
質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系ならびに末
梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内
降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作
用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活
性を阻害することによって血圧を降下させることが可能
であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に
有効であると考えられている。この目的のためプロリン
誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確
認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡ
ＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレ
イン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と
臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は本態性
高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を
問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療
薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出され
ている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、ア
ンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンや
バソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によ
るナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、
ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン
系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活さ
せることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄
を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を
断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ところ
で、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然
物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラディキニ
ン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉ
ａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５
８３（１９７０）］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由
来の６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙ
ｐ）［Ｇ．Ｏｓｈｉｍａｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７
９）］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド
（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ
ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４
６，１３９３（１９８３）］等に始まり本発明者等のイ
ワシ筋肉由来の５種のヘクサペウチド（いずれもＣ末端
から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特
許第２０４６４８３号］、海苔由来のテトラペプチド
（Ｎ末端がＰｒｏ）［特許第２６７８１８０号］が挙げ
られ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示され
ている。更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペ
プチド［特開平６−８７８８６号］［特開平６−１６５
６８号］についての提案は行われているが、規則性を持
ったアミノ酸配列を有する鎖長の長いジ、トリペプチド
以上のペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による
降圧効果（薬理効果）は不明であり、発見されてから長
時間経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んで
いるとの報告はない。食品の場合には鈴木らが大豆、茶
類、貝類、果実類などでＡＣＥ阻害活性を認めている
［鈴木健夫、石川宣子ら；農化，５７巻，１１４３頁
（１９８３年）］が、これまでに健康食品として広く利
用されているワカメにＡＣＥ阻害物質があることは知ら
れていない。
−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調
節に重要な役割を果たしていることはよく知られてい
る。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテン
シン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する。）が存在し、ア
ンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩ
Ｉに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物
質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系ならびに末
梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内
降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作
用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活
性を阻害することによって血圧を降下させることが可能
であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に
有効であると考えられている。この目的のためプロリン
誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確
認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡ
ＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレ
イン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と
臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は本態性
高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を
問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療
薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出され
ている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、ア
ンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンや
バソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によ
るナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、
ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン
系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活さ
せることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄
を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を
断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ところ
で、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然
物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラディキニ
ン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉ
ａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５
８３（１９７０）］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由
来の６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙ
ｐ）［Ｇ．Ｏｓｈｉｍａｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７
９）］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド
（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ
ｅｔ ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４
６，１３９３（１９８３）］等に始まり本発明者等のイ
ワシ筋肉由来の５種のヘクサペウチド（いずれもＣ末端
から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特
許第２０４６４８３号］、海苔由来のテトラペプチド
（Ｎ末端がＰｒｏ）［特許第２６７８１８０号］が挙げ
られ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示され
ている。更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペ
プチド［特開平６−８７８８６号］［特開平６−１６５
６８号］についての提案は行われているが、規則性を持
ったアミノ酸配列を有する鎖長の長いジ、トリペプチド
以上のペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による
降圧効果（薬理効果）は不明であり、発見されてから長
時間経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んで
いるとの報告はない。食品の場合には鈴木らが大豆、茶
類、貝類、果実類などでＡＣＥ阻害活性を認めている
［鈴木健夫、石川宣子ら；農化，５７巻，１１４３頁
（１９８３年）］が、これまでに健康食品として広く利
用されているワカメにＡＣＥ阻害物質があることは知ら
れていない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、褐藻コンブ
目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）の海藻種に属するワカ
メの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質
を検索し、新規な３種類のテトラペプチドが強いアンジ
オテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。
そして、これら３種類のテトラペプチドを医薬として実
用化するための研究を鋭意行った。その結果、この３種
類のテトラペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来
のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見
出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明
に係る新規なペプチドは、次式（１）、（２）及び
（３） （１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ （２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （３）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ の式で示されるＬ体のアミノ酸の配列を有する新規なテ
トラペプチドであり、常温における性状は白色の粉末で
ある。
目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）の海藻種に属するワカ
メの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質
を検索し、新規な３種類のテトラペプチドが強いアンジ
オテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。
そして、これら３種類のテトラペプチドを医薬として実
用化するための研究を鋭意行った。その結果、この３種
類のテトラペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来
のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見
出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明
に係る新規なペプチドは、次式（１）、（２）及び
（３） （１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ （２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （３）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ の式で示されるＬ体のアミノ酸の配列を有する新規なテ
トラペプチドであり、常温における性状は白色の粉末で
ある。
【０００４】前記の３種類のテトラペプチドは、化学的
に合成する方法またはワカメの蛋白質分解酵素の分解液
から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に
係る新規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相
法または固相法等の通常のペプチド合成方法によって行
うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマ
ー性の固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシ
ル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミ
ノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良
い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、
トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いて
ポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖
の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）など
を用いた通常の方法で精製することができる。
に合成する方法またはワカメの蛋白質分解酵素の分解液
から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に
係る新規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相
法または固相法等の通常のペプチド合成方法によって行
うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマ
ー性の固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシ
ル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミ
ノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良
い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、
トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いて
ポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖
の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体ク
ロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）など
を用いた通常の方法で精製することができる。
【０００５】上記したように、本発明に係る新規なペプ
チドは、ワカメの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製
することができるが、その場合には、例えば以下のよう
にして行うことができる。上記の新規なペプチドを含有
しているワカメのタンパク質部分を用いて加水分解す
る。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等
のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、ワカメを
必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで
加温しｐＨを至適値に調整し酵素を加えてインキュベー
トする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させ
て加水分解液を得る。その加水分解物を濾紙及び／又は
セライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を
除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を
用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、
リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、そ
の濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強
酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤ
ｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からア
ンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する。）
阻害活性を有する成分を含有する分画を得、得られたＡ
ＣＥ阻害活性分画をゲル濾過（例えば、ファルマシア社
製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、
得られたＡＣＥ阻害活性分画を陽イオン交換ゲル濾過
（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｃ−２５等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻
害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。
チドは、ワカメの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製
することができるが、その場合には、例えば以下のよう
にして行うことができる。上記の新規なペプチドを含有
しているワカメのタンパク質部分を用いて加水分解す
る。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等
のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、ワカメを
必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで
加温しｐＨを至適値に調整し酵素を加えてインキュベー
トする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させ
て加水分解液を得る。その加水分解物を濾紙及び／又は
セライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を
除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を
用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、
リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、そ
の濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強
酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤ
ｏｗｅｘ ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からア
ンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する。）
阻害活性を有する成分を含有する分画を得、得られたＡ
ＣＥ阻害活性分画をゲル濾過（例えば、ファルマシア社
製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５等）によって分画し、
得られたＡＣＥ阻害活性分画を陽イオン交換ゲル濾過
（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｃ−２５等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻
害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。
【０００６】本発明に係る新規なペプチドの製法におい
て用いる褐藻類としては、本発明の目的を達成できる限
りいかなる褐藻類を用いても良いが、好ましくはワカメ
を用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に
係る新規なペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った
場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショック
を起こさせない。又、本発明に係る新規なペプチドはＬ
−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内の
プロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて
低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／
ｋｇ；ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチド
は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することがで
きる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している
哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射するこ
と、あるいは経口投与することがあげられる。投与量
は、例えば、動物体１ｋｇ当りこのペプチドを０．０１
〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回
程度であるが、投与経路によって、適宜、調製すること
ができる。
て用いる褐藻類としては、本発明の目的を達成できる限
りいかなる褐藻類を用いても良いが、好ましくはワカメ
を用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に
係る新規なペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った
場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショック
を起こさせない。又、本発明に係る新規なペプチドはＬ
−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内の
プロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて
低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／
ｋｇ；ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチド
は、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することがで
きる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している
哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射するこ
と、あるいは経口投与することがあげられる。投与量
は、例えば、動物体１ｋｇ当りこのペプチドを０．０１
〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回
程度であるが、投与経路によって、適宜、調製すること
ができる。
【０００７】上記の各種製剤において用いられる賦形
剤、結合剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の
注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用い
られるものを使用することができる。錠剤、カプセル
剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のもの
をあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロー
ス等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプ
ン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては澱粉
類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤と
してはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩
類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タル
ク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整
にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその
塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の
無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なペプチ
ドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニ
トール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコール
やポリエチレングリコール等のグリコールに溶解または
懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝
液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加すること
ができる。本発明に係る新規なペプチドを含有する製剤
は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解
剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもで
きる。
剤、結合剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の
注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用い
られるものを使用することができる。錠剤、カプセル
剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のもの
をあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロー
ス等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプ
ン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては澱粉
類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤と
してはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩
類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タル
ク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整
にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその
塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の
無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なペプチ
ドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニ
トール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコール
やポリエチレングリコール等のグリコールに溶解または
懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝
液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加すること
ができる。本発明に係る新規なペプチドを含有する製剤
は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解
剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもで
きる。
【０００８】本発明に係る新規なペプチドは優れたアン
ジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高
血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、
治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常
化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の
治療剤として有用である。
ジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高
血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、
治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常
化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の
治療剤として有用である。
【０００９】
【実施例】以下に実施例として、製造例および試験例を
記載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ ワカメ粉末２３．６ｇに脱イオン水７０８ｍιを加えホ
モジナイズしたワカメホモジネイトを用いた。透析チュ
ーブ（内径３６インチ，和光純薬工業社製）に詰め、流
水に対して３日間透析を行い透析内液を得た。この内液
を１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン
（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）７０８
ｍｇを添加し、４５℃で５時間撹拌しながら加水分解を
行った。分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社
製、ＹＭ１０型；分画分子量約１万）に通過させた通過
液を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．０
×５５ｃｍ）に加えた。そのカラムを脱イオン水で十分
洗滌した後、２規定の水酸化アンモニウム液２ιを用い
て溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除去し濃縮液
を予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２
５（φ１．６×１１３ｃｍ）に負荷し、流速１２ｍι／
ｈｒ、各分画量５．７ｍιでゲル濾過を行った。その結
果は図１のとおりである。ゲル濾過を繰り返して大量分
取したＡＣＥ阻害活性の高い画分を集め凍結乾燥してペ
プチド粉末とした。このペプチド粉末１．５５ｇを２０
ｍｌの脱イオン水に溶解後、予め、脱イオン水で緩衝化
したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム
（φ１．８×４０ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍ
ιから１．５％塩化ナトリウム５００ｍιの濃度勾配法
を行い、流速７０ｍι／ｈｒ、各分画量１０ｍιでクロ
マトグラフィーを行った。その結果は図２のとおりであ
る。上記クロマトグラフ中、ＡＣＥ阻害活性の高かった
分画番号１４〜２２の画分を集めて凍結乾燥して精製ペ
プチド粉末（ＳＰ−Ｉ分画）を得た。この精製ペプチド
粉末２０ｍｇを６０μιの脱イオン水に溶解した後、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。カラ
ムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−
５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相と
しては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略
記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦ
Ａの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍι／ｍｉｎ、検出
波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、ＡＣＥ阻害活性の高
いペプチドフラグメントを得た。その結果は図３に示す
とおりである。｛溶出時間；（１）のペプチド９９．６
２５分、（２）のペプチド８０．７２４分及び（３）の
ペプチド３２．０３３分｝このようにして得られたＡＣ
Ｅ阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列は、アプラ
イドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシーク
エンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、３
種類のペプチドは、それぞれ、次式、 （１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ （２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （３）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なテトラ
ペプチドであることが確認された。常温における性状は
白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なテトラペプ
チドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合
には、常法に従って、例えば次のように処理すればよ
い：ペプチド１０ｇ、乳糖６８ｇ、コーンスター
チ３９ｇ、ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料
とし、先ず、及び２０ｇのコーンスターチを混和
し、１１ｇのコーンスターチから作ったペーストととも
に顆粒化し、この顆粒に９ｇのコーンスターチととを
加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０
００個を製造する。
記載し、本発明を更に詳細に説明する。 製造例１ ワカメ粉末２３．６ｇに脱イオン水７０８ｍιを加えホ
モジナイズしたワカメホモジネイトを用いた。透析チュ
ーブ（内径３６インチ，和光純薬工業社製）に詰め、流
水に対して３日間透析を行い透析内液を得た。この内液
を１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン
（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）７０８
ｍｇを添加し、４５℃で５時間撹拌しながら加水分解を
行った。分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社
製、ＹＭ１０型；分画分子量約１万）に通過させた通過
液を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．０
×５５ｃｍ）に加えた。そのカラムを脱イオン水で十分
洗滌した後、２規定の水酸化アンモニウム液２ιを用い
て溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除去し濃縮液
を予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２
５（φ１．６×１１３ｃｍ）に負荷し、流速１２ｍι／
ｈｒ、各分画量５．７ｍιでゲル濾過を行った。その結
果は図１のとおりである。ゲル濾過を繰り返して大量分
取したＡＣＥ阻害活性の高い画分を集め凍結乾燥してペ
プチド粉末とした。このペプチド粉末１．５５ｇを２０
ｍｌの脱イオン水に溶解後、予め、脱イオン水で緩衝化
したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム
（φ１．８×４０ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍ
ιから１．５％塩化ナトリウム５００ｍιの濃度勾配法
を行い、流速７０ｍι／ｈｒ、各分画量１０ｍιでクロ
マトグラフィーを行った。その結果は図２のとおりであ
る。上記クロマトグラフ中、ＡＣＥ阻害活性の高かった
分画番号１４〜２２の画分を集めて凍結乾燥して精製ペ
プチド粉末（ＳＰ−Ｉ分画）を得た。この精製ペプチド
粉末２０ｍｇを６０μιの脱イオン水に溶解した後、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。カラ
ムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−
５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相と
しては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略
記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦ
Ａの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍι／ｍｉｎ、検出
波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、ＡＣＥ阻害活性の高
いペプチドフラグメントを得た。その結果は図３に示す
とおりである。｛溶出時間；（１）のペプチド９９．６
２５分、（２）のペプチド８０．７２４分及び（３）の
ペプチド３２．０３３分｝このようにして得られたＡＣ
Ｅ阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列は、アプラ
イドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシーク
エンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、３
種類のペプチドは、それぞれ、次式、 （１）Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ （２）Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ （３）Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なテトラ
ペプチドであることが確認された。常温における性状は
白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なテトラペプ
チドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合
には、常法に従って、例えば次のように処理すればよ
い：ペプチド１０ｇ、乳糖６８ｇ、コーンスター
チ３９ｇ、ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料
とし、先ず、及び２０ｇのコーンスターチを混和
し、１１ｇのコーンスターチから作ったペーストととも
に顆粒化し、この顆粒に９ｇのコーンスターチととを
加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０
００個を製造する。
【００１０】製造例２ 本例は、合成法による製造例である。 Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のロイシンからク
ロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。こ
の時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ
−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミ
ノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジ
チオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室
温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加
え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロ
メタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した
後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離
し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧
下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペ
プチドは蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系の
カラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製し
た。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、
（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用
し、（Ａ）液が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法
により流速１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチオドを得た。
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のロイシンからク
ロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。こ
の時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ
−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミ
ノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジ
チオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室
温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加
え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロ
メタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した
後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離
し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧
下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペ
プチドは蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系の
カラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製し
た。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、
（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用
し、（Ａ）液が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法
により流速１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを
行った。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を
示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによ
って目的とする合成ペプチオドを得た。
【００１１】この合成ペプチドをマススペクトルにより
分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で
示したアミノ酸配列構造を有するテトラペプチドである
ことが確認された。このマススペクトルの結果は図４に
示す通りである。 Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のチロシンからク
ロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。こ
の時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ
−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ
酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチ
オールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温
で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、
更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタ
ンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無
水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、そ
の沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾
燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチド
は蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラム
Ｃ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移
動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）
０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、
（Ａ）液が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法によ
り流速１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行っ
た。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示し
た溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって
目的とする合成ペプチオドを得た。この合成ペプチドを
マススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及び
アミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有する
テトラペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図５に示す通りである。 Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のリシンからクロ
ロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この
時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−
Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸
を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオ
ールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で
１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更
に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタン
スルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水
エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その
沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥
した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは
蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラムＣ
１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動
相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．
１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液
が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法により流速
１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫
外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出
画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的と
する合成ペプチオドを得た。この合成ペプチドをマスス
ペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ
酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するテトラ
ペプチドであることが確認された。このマススペクトル
の結果は図６に示す通りである。合成によって得られた
本発明の３種類のテトラペプチドは、以下に示す試験に
よって薬理効果が確認された。
分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で
示したアミノ酸配列構造を有するテトラペプチドである
ことが確認された。このマススペクトルの結果は図４に
示す通りである。 Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のチロシンからク
ロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。こ
の時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ
−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ
酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチ
オールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温
で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、
更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタ
ンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無
水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、そ
の沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾
燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチド
は蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラム
Ｃ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移
動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）
０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、
（Ａ）液が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法によ
り流速１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行っ
た。紫外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示し
た溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって
目的とする合成ペプチオドを得た。この合成ペプチドを
マススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及び
アミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有する
テトラペプチドであることが確認された。このマススペ
クトルの結果は図５に示す通りである。 Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓの合成法 アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置
４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成
した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共
重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂
を使用した。まず、当該テトラペプチドのアミノ酸配列
に従って、常法どおり、そのＣ末端側のリシンからクロ
ロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この
時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−
Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸
を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオ
ールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で
１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更
に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタン
スルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水
エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その
沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥
した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは
蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラムＣ
１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動
相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．
１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液
が４０分間で８３％→５３％の濃度勾配法により流速
１．３ｍｌ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫
外部波長２１８ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出
画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的と
する合成ペプチオドを得た。この合成ペプチドをマスス
ペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ
酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するテトラ
ペプチドであることが確認された。このマススペクトル
の結果は図６に示す通りである。合成によって得られた
本発明の３種類のテトラペプチドは、以下に示す試験に
よって薬理効果が確認された。
【００１２】試験例１ （アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法）ＡＣＥ
（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５
ｍＵ、合成基質Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙ
ｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）１２．５
ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本
等の方法［日胸疾会誌，１８巻，２９７−３０２頁（１
９８９年）］に準じて測定した。すなわち、生成した馬
尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定
した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝
液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応
させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。 阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）× １
００ ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活
性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度
（Ｍ）で示した。本発明に係る３種類のテトラペプチド
の牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活
性（ＩＣ５０値）；（１）のテトラペプチド２１．０μ
Ｍ、（２）のテトラペプチド６４．２μＭ及び（３）の
テトラペプチド２１３μＭである。
（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５
ｍＵ、合成基質Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙ
ｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）１２．５
ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本
等の方法［日胸疾会誌，１８巻，２９７−３０２頁（１
９８９年）］に準じて測定した。すなわち、生成した馬
尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定
した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝
液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応
させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。 阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）× １
００ ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活
性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度
（Ｍ）で示した。本発明に係る３種類のテトラペプチド
の牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活
性（ＩＣ５０値）；（１）のテトラペプチド２１．０μ
Ｍ、（２）のテトラペプチド６４．２μＭ及び（３）の
テトラペプチド２１３μＭである。
【００１３】試験例２ （高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果）実験動物
は日本チャールズ・リバー社より１５週齢雄性高血圧自
然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する。）を購入し、
１週間の予備飼育後、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上
（体重２８０〜３３０ｇ）の動物６匹１群として用い
た。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％およ
び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整され
た飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに
１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製
ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）
をそれぞれ自由に摂取させた。血圧は非観血的尾動脈血
圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔ
ａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後１時間、２
時間、３時間、４時間及び６時間のＳＨＲ尾動脈の収縮
期血圧値（ｍｍＨｇ）の測定を測定時間毎に５回行い、
得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均
値をもって各時間の測定値とした。３種類の合成テトラ
ペプチド５０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与した時の収
縮期血圧値（ｍｍＨｇ）への作用についての結果は、図
７、図８及び図９に示すとおりである。以上の試験の結
果、本発明に係る３種類のテトラペプチドは、アンジオ
テンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生
体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認
された。従って、本発明に係る３種類のテトラペプチド
は高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、本
発明に係る３種類のテトラペプチドは、構造的にそのア
ミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中
に採用することもできる。
は日本チャールズ・リバー社より１５週齢雄性高血圧自
然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する。）を購入し、
１週間の予備飼育後、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上
（体重２８０〜３３０ｇ）の動物６匹１群として用い
た。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％およ
び１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整され
た飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに
１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製
ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）
をそれぞれ自由に摂取させた。血圧は非観血的尾動脈血
圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔ
ａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後１時間、２
時間、３時間、４時間及び６時間のＳＨＲ尾動脈の収縮
期血圧値（ｍｍＨｇ）の測定を測定時間毎に５回行い、
得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均
値をもって各時間の測定値とした。３種類の合成テトラ
ペプチド５０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与した時の収
縮期血圧値（ｍｍＨｇ）への作用についての結果は、図
７、図８及び図９に示すとおりである。以上の試験の結
果、本発明に係る３種類のテトラペプチドは、アンジオ
テンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生
体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認
された。従って、本発明に係る３種類のテトラペプチド
は高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、本
発明に係る３種類のテトラペプチドは、構造的にそのア
ミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中
に採用することもできる。
【００１４】
【図１】本発明に係るワカメの蛋白質分解液の、製造例
１におけるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグ
ラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を
示す図である。尚、図中マーカーとして分子量６千のイ
ンスリン、分子量３，５００のインスリンＢ鎖、分子量
２，５００のインスリンＡ鎖、分子量１，０５２のブラ
ジキニン及び分子量７５のグリシンを用いた。
１におけるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグ
ラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を
示す図である。尚、図中マーカーとして分子量６千のイ
ンスリン、分子量３，５００のインスリンＢ鎖、分子量
２，５００のインスリンＡ鎖、分子量１，０５２のブラ
ジキニン及び分子量７５のグリシンを用いた。
【図２】本発明に係るワカメの蛋白質分解液の、製造例
１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｈ＋）
カラムクロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの
分離精製の結果を示す図である。
１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５（Ｈ＋）
カラムクロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの
分離精製の結果を示す図である。
【図３】本発明に係る３種類のテトラペプチドの、製造
例１における逆相ＨＰＬＣによるＡＣＥ阻害ペプチドの
分離精製の結果を示す図である。
例１における逆相ＨＰＬＣによるＡＣＥ阻害ペプチドの
分離精製の結果を示す図である。
【図４、図５、図６】本発明に係る３種類のテトラペプ
チドの、製造例２で得られた３種類の合成テトラペプチ
ドのマススペクトルを示す図である。
チドの、製造例２で得られた３種類の合成テトラペプチ
ドのマススペクトルを示す図である。
【図７、図８、図９】製造例２で得られた３種類の合成
テトラペプチド５０ｍｇ／ｋｇを、それぞれＳＨＲに経
口投与した場合の収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）の経時的変
化を示す図である。尚、図中、対照降圧剤としてカプト
プリル（１０ｍｇ／ｋｇ）を、又、コントロールとして
０．９％の生理食塩水３ｍｌを用いた。
テトラペプチド５０ｍｇ／ｋｇを、それぞれＳＨＲに経
口投与した場合の収縮期血圧値（ｍｍＨｇ）の経時的変
化を示す図である。尚、図中、対照降圧剤としてカプト
プリル（１０ｍｇ／ｋｇ）を、又、コントロールとして
０．９％の生理食塩水３ｍｌを用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 5/103 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 5/10 - 5/117 C12N 9/99 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 次式；Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチド。 - 【請求項２】 次式；Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 - 【請求項３】 次式；Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチド。 - 【請求項４】 次式；Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｙｒ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。 - 【請求項５】 次式；Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチド。 - 【請求項６】 次式；Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を
有する新規なテトラペプチドを有効成分として含有する
ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
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| JP11284647A JP3108920B1 (ja) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11284647A JP3108920B1 (ja) | 1999-08-30 | 1999-08-30 | 新規なテトラペプチドおよびアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
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|---|---|
| JP3108920B1 true JP3108920B1 (ja) | 2000-11-13 |
| JP2001064299A JP2001064299A (ja) | 2001-03-13 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3108920B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4505707B2 (ja) * | 2003-02-13 | 2010-07-21 | 株式会社白子 | 血管拡張による肩凝り又は冷え症治療用の医薬組成物 |
-
1999
- 1999-08-30 JP JP11284647A patent/JP3108920B1/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．１６７，Ｎｏ．２，ｐ．３７７−３８２（１９７７） |
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|---|---|
| JP2001064299A (ja) | 2001-03-13 |
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