JP2007161696A - 新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

【目的】魚鱗コラーゲンからプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有する新規なペプチドを提供する。
【構成】魚鱗コラーゲンを酵素分解して得られるヘプタペプチドはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙであり、プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、かつ生体内での抗健忘症効果を有し、毒性も極めて低い。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なヘプタペプチド及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。

ヘプタペプチドは、プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤及び抗健忘症剤としての利点を持つ。
特開２００３−２６７９９５ 特開２００３−３０６４９８ 特開２００５−２０６４６９ 特願２００５−４１２６７ 特願２００５−４１２６８ Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０巻，３５８−３５９頁（１９９６年）． Ｋｉｍｕｒａ，Ｋ．等：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１巻，１７５４−１７５６頁（１９９７年）． Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．等：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５６９巻，１８４−１８９頁（１９７９年）．

老人性痴呆症はアルツハイマー病と、脳血管痴呆症は脳梗塞や脳内出血、くも膜下出血などが起因となる脳血管性痴呆との２種類に大別される。健忘症や痴呆症の患者の脳内では、プロリルエンドペプチダーゼという酵素の活性が亢進していると報告され、この酵素の働きを弱めれば健忘症や痴呆症の予防や治療が期待できる［非特許文献１］［非特許文献２］。一方、これまで発明者は、水産加工廃棄物として処理されてきた魚鱗を酵素分解して得られる魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＧｌｙおよびＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献１］、同じく、魚鱗由来ヘプタペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ及びオクタペプチドＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕに活性化酸素阻害能を見出してきた［特許文献２］。更に、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出し［特許文献３］、同じく、鰻骨由来ヘクサペプチドＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎに活性化酸素阻害能を見出し［特許文献４］、又、鰻骨由来トリペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒにアンジオテンシン変換酵素阻害能を見出してきた［特許文献５］。しかしながら、魚鱗コラーゲン由来のペプチドに関するプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用並びに経口投与による抗健忘症効果については未だ不明であり、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。

本発明者は、前記の課題を解決するために鋭意研究した結果、魚鱗コラーゲンから得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドが抗健忘症効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、魚鱗コラーゲンから薬理作用を有する物質を検索し、この新規な魚鱗コラーゲン由来ヘプタペプチドが強いプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有することを見出した。そして、この新規な魚鱗コラーゲン由来ヘプタペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行い、その結果、この新規な魚鱗コラーゲン由来ヘプタペプチドが抗健忘症効果を有し、天然物由来のプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る魚鱗コラーゲン由来のペプチドは、次式、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘプタペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。

本発明に係る新規なヘプタペプチドは、化学的に合成する方法、又は魚（チカダイ、イトヨリダイ、アカマツカサ等）の鱗コラーゲンから分離精製する方法をあげることができる。本発明に係る新規なヘプタペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常の合成方法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ当該ペプチドのカルボキシル末端側からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素などを用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などを用いた通常の方法で精製することができる。

上記したように、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、魚鱗コラーゲンから分離精製することができるが、その場合には、例えば以下のようにして行うことができる。
本発明に係る新規なヘプタペプチドを含有している魚鱗粉末を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、魚鱗粉末のホモジネートを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温し、ｐＨを至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。この加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からプロリルエンドペプチダーゼ（以下、ＰＥＰと略記する）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、その得られたＰＥＰ阻害活性画分をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５など）によって分画し、その得られたＰＥＰ阻害活性画分を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５など）によって分画し、最終的に得られたＰＥＰ阻害活性画分を逆相ＨＰＬＣによって分離することによって単離精製を行うことができる。

本発明に係る新規なヘプタペプチドの製法において用いる魚鱗としては、本発明の目的を達成できる限りいかなる魚ウロコを用いても良いが、好ましくはチカダイ、イトヨリダイ、アカマツカサ等を用いるのが良い。以上のようにして得られた新規なヘプタペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、新規なヘプタペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ_５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。新規なヘプタペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調整することができる。投与方法としては、通常は、哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体重当たりヘプタペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調整することができる。

上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、とくに限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としてはでんぷん類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロースおよびそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なヘプタペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトールなどの糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解又は懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。新規なヘプタペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。

本発明に係る新規なヘプタペプチドは、優れたプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、抗健忘症効果、抗痴呆症効果を示す。従って、軽度から中程度のアルツハイマー型痴呆症、及び脳梗塞後遺症としての、脳血管型痴呆症の痴呆症状の進行を遅らせることができることから、健忘症の予防剤又は症状改善剤として有用である。

発明を実施するための最良の形態・実施例

本発明は、医薬品としての有用性を有する下記のアミノ酸の配列のペプチド構造を有するペプチド及びこのペプチドを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである）
以下に実施例として、製造例及び試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

製造例１
魚鱗粉末５００ｇに２規定の酢酸水５Ｌを加え、室温で１週間攪拌して、魚鱗コラーゲンの抽出操作を行った。反応液をラジオライト＃１００による珪藻土濾過を行い、得られた濾液を透析チューブ（３６ｉｎｃｈ，和光純薬工業製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い透析内液を得た。透析内液を凍結乾燥して、５４ｇの魚鱗コラーゲン粉末を得た。この魚ウロココラーゲン粉末を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、トリプシン（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．２１．４）１．６ｇを添加し、３７℃、２４時間撹拌しながら酵素分解を行った。反応後、分解液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型、φ７６ｍｍ）に通過させ、通過液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ^＋］カラム（φ４．５×２０ｃｍ）に加え負荷した。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定のアンモニウム水５００ｍＬを用いて溶出した。減圧濃縮操作によりアンモニアを除去して濃縮液４０ｍＬを得た。この濃縮液４ｍＬを予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ２．３×１４０ｃｍ）に負荷し、流速３０ｍＬ／ｈｒ、各分画量８．７ｍＬでゲル濾過を行った。ゲル濾過を繰り返して大量分取したＰＥＰ阻害活性の高いペプチド画分を集めて凍結乾燥しペプチド粉末とした。このペプチド粉末３ｇを脱イオン水２０ｍＬに溶解後、予め脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ^＋］カラム（φ１．５×４７．２ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍＬから１．５％塩化ナトリウム水５００ｍＬの濃度勾配法を行い溶出した。流速８０ｍＬ／ｈｒ、各分画量１０ｍＬでカラムクロマトグラフィーを行った。上記クロマトグラフィー中、ＰＥＰ阻害活性画分を集めて凍結乾燥し精製ペプチド粉末を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μＬの脱イオン水に溶解した後、逆相ＨＰＬＣを行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行ってＰＥＰ阻害作用を有するペプチドフラグメントを得た。このペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、本発明に係る新規なペプチドは、次式、
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表される新規なヘプタペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドをＰＥＰ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ペプチド１６ｇ、▲２▼乳糖９１ｇ、▲３▼コーンスターチ２９ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．３ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び１５ｇのコーンスターチを混和し、８ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に４．７ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。

製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該ペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のグリシンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水に溶解した後、逆相系のカラムＣ_１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が９３分間で７８％→２５％の濃度勾配法により流速１．７ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２２１ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ヘプタペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）を得た。

この合成ヘプタペプチドをアミノ酸分析したところＧｌｙ：３．０２（理論値：３）、Ｐｒｏ：１．９５（理論値：２）及びＡｌａ：１．９１（理論値：２）を示し、又、マススペクトルの結果を図１に示す。これらの結果、アミノ酸組成及び質量分析値（Ｍ＋ｌ＝４００）が前記で示したアミノ酸配列構造を有するヘプタペプチドであることが確認された。更に、この合成ペプチドのプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を測定したところ、ＩＣ_５０値；１．４３μＭであった。
このように合成によって得られた本発明に係る新規なヘプタペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。

試験例１（プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性測定法）
酵素：プロリルエンドペプチダーゼ（生化学工業社製、酵素番号ＥＣ３．４．２１．２６）０．１Ｕ／ｍＬ、合成基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（生化学工業社製）２ｍＭを用い、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ等の方法［非特許文献３］に準じて測定した。すなわち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０００μＬ、被検液１００μＬ、酵素溶液（４０％ジオキサンを含む）１００μＬを順次加え、３０℃で５分間プリインキュベーションした。更に、基質溶液１００μＬを加え、３０℃で１０分間インキュベーションした。その後、１Ｎ ＨＣｌ５００μＬを加えることにより反応を止め、４１０ｎｍの吸光度を測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
プロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の阻害活性ＩＣ_５０値は、プロリルエンドペプチダーゼの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な被検液の濃度（Ｍ）で示した。

試験例２（ラットによる抗健忘症効果試験）
本発明に係る新規な合成ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）の抗健忘症効果試験は、ラットの受動的回避学習装置、すなわちフットショックストレス・システム（室町機械社製、ＭＦＳ−０１型）を用いて行った。実験動物は（株）九動より４週令雄性ラット（平均体重１６０ｇ）３群各３匹を購入後、受動的回避学習試験を行った。インタクト・コントロールとして生理食塩水を経口投与したラット（生理食塩水群）、コントロールとして塩酸ドネペジル（エーザイ社製）を０．２ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（塩酸ドネペジル群）、及び合成ペプチドを２００ｍｇ／ｋｇ経口投与したラット（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ群）を用いて実験を行った。これら３群のラット各々を台上に乗せ、床に降りた瞬間から電流を流し、電気ショックを避けるために台上に戻り、もはや床へ降りなくなるまでの受動的回避学習をさせる。次に、これら３群のラットに、痴呆症を引き起こすスコポラミン２０ｍｇ／ｋｇ投与すると、先の電気ショックを忘れ、床に降りるようになる。ラットが床へ降りるまでの滞在時間（秒）を測定することにより、学習前に投与した合成ペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）がこの記憶喪失をどの程度予防するかをみた。

以上の試験の結果、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）においてプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な抗健忘症効果を示すことが確認された。従って、本発明に係る新規なヘプタペプチドは痴呆症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係る新規なヘプタペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。

本発明のヘプタペプチドのマススペクトルを示すグラフ（製造例２）。

Claims (2)

1. 次式；Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
   で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチド。
2. 次式；Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ
   で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なヘプタペプチドを有効成分として含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。

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