JP3810821B2 - ペプチド誘導体と、その用途 - Google Patents
ペプチド誘導体と、その用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3810821B2 JP3810821B2 JP32276294A JP32276294A JP3810821B2 JP 3810821 B2 JP3810821 B2 JP 3810821B2 JP 32276294 A JP32276294 A JP 32276294A JP 32276294 A JP32276294 A JP 32276294A JP 3810821 B2 JP3810821 B2 JP 3810821B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- sample
- test
- amino acid
- amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Anti-Oxidant Or Stabilizer Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、ペプチド誘導体と、その用途に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、医薬品、医薬部外品およびその他の製品等に使用し得る安全なペプチド誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、種々の疾患の病態にフリーラジカルの関与が明らかとなってきた。人類は、生命の維持に酸素を必要とするが、その際、生体内では絶えず活性酸素、フリーラジカルが生成されている。いったん生じたフリーラジカルは、膜脂質および膜蛋白質の変性を惹起し、細胞膜を損傷させ、ＤＮＡおよび酵素の変性により、種々の疾病の原因となる。特に細胞膜中の高度不飽和脂肪酸はフリーラジカルによる攻撃を容易に受け、その結果、有害な過酸化脂質を生成し、さらに細胞障害を増強させるといわれている（現代医療、第２５巻、第１６３ページ、１９９３年）。
【０００３】
活性酸素が関係する疾病は、火傷、関節炎等の炎症、再還流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患等の広範に存在する。そしてこれらの疾患の予防、治療には活性酸素、フリーラジカル、過酸化脂質の抑制が有効であると考えられている（日経バイオテク編、「日経バイオ年鑑」、第３５０ページ、日経ＢＰ、１９９４年）。
【０００４】
一方、従来多くの抗菌剤が開発され、使用されてきたが、感染症が消滅することはなく、その原因や症状はなお一層複雑化してきている。特に、感染する細菌側の薬剤耐性の増加、また宿主側ではコンプロマイズド・ホストの出現によって、依然解決が難しくなっている。このため感染症の新しい予防法、治療法が待望されている。
【０００５】
その一つにラクトフェリンがある。ラクトフェリンは、涙、唾液、乳汁等の外分泌液、好中球顆粒中に含まれている鉄結合蛋白質であり、抗菌性、抗酸化性、免疫調節作用等の多彩な生理活性を有することが知られている（アーカイブズ・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド［Archives of Disease in Childhood］、第６７巻、第６５７ページ、１９９２年）。またラクトフェリンの分解物、ラクトフェリンに由来するペプチド類、これらとホモロジーを有するペプチド類にも抗菌性、抗酸化性等の作用のあることが知られている。例えば、ラクトフェリン分解物を有効成分とする抗菌剤（特開平５−３２００６８号公報）、少なくとも２０個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−９２９９４号公報）、１１個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−７８３９２号公報）、６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９７号公報）、５個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９６号公報）、３〜６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９５号公報）、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン類の分解物から単離されるペプチド、ラクトフェリン類の分解物から単離されるペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチドを有効成分とする抗酸化剤（特開平６−１９９６８７号公報）等である。
【０００６】
なお、ペプチドの誘導体については、それらが有する単純ペプチドには無い性質を利用して、多くの目的のために研究されている。ペプチドを誘導体化することによって、活性の増加、プロテアーゼに対する抵抗性の付与、体内での持続性の増加等が計られている。
例えば、抗酸化および抗炎症活性を有する金属ペプチド複合体（特表平５−５０３９３９号公報）、虚血性傷害および再潅流性傷害を抑制するトリペプチドアルギナール誘導体（特開平６−１９９６８２号公報）、皮膚用化粧品として使用される第４級アンモニウム誘導ペプチド（特開平４−８２８２２号公報）、標的細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞に対して生物活性を有する両親媒性イオンチャンネル形成ペプチドのＮ末端置換ペプチド（ＷＯ９３／２４１３８）、生物活性を持つ、両親媒性イオンチャンネル形成ペプチドのＣ末端置換ペプチド（ＷＯ９２／２２３１７）等が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ラクトフェリン由来ペプチドについては、誘導体の抗酸化性、抗菌性等の生理活性は、従来全く知られておらず、従って、これらを有効成分とする抗酸化剤、抗菌剤も存在しなかった。
この発明は、以上の従来技術に鑑みてなされたものであり、従来の抗酸化剤、抗菌剤とは全く異なり、ラクトフェリン由来ペプチドの誘導体を有効成分とする安全な抗酸化剤、抗菌剤を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、特定の化学式で示されるラクトフェリン由来ペプチドの誘導体、またはこれを有効成分として含有する抗酸化剤、および抗菌剤を提供する。
以下、この発明について詳しく説明する。
【０００９】
この発明において使用するペプチド誘導体は、公知の方法（例えば、ペプチド自動合成装置を用いる方法）によって合成して目的とするペプチドを得る方法、ペプチド合成装置によって合成したペプチドに、有機合成技術によりアシル基、ポリエチレングリコール等を付加する方法、またはラクトフェリン類を酸または酵素を用いて加水分解し、分解物混合物から液体クロマトグラフィー等の分離手段によって一定のアミノ酸配列を有するペプチドを含む画分を得た後、有機合成技術を用いてアシル基、ポリエチレングリコール等を付加する方法等により調製することができる。
【００１０】
この発明のペプチド誘導体の例としてアミノ末端にアセチル基、カルボキシル末端にアミドを有するペプチドの製造法を示せば次のとおりである。
ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第５３８ページ、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて次のとおり合成する。
【００１１】
Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カルビオケム―ノバビオケム社製。NovaSyn KR 0.1meq ）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プログラムにより脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチド鎖を延長する。すなわち、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（以下DMF と記載する）によりアミノ保護基である９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下Fmocと記載する）基を切断除去し、DMF で洗浄した後Fmoc- アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下HOBtと記載する）を反応させ、DMF で洗浄する操作を反復する。
【００１２】
縮合反応後、必要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全であったことを確認し、次のステップに進む。使用するアミノ酸は、Fmoc-Arg(Mtr)-Opfp、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp 、Fmoc-Met-Opfp （いずれもカルビオケム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカートリッジを用いる。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DMF で洗浄後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なう。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを確認し、のち樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、酢酸、tert−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエーテルの順によく洗浄し、真空乾燥する。
【００１３】
上記の保護ペプチド樹脂にエタンジチオール、チオアニソールを室温でアルゴン気流下攪拌した後、氷冷下で、さらに攪拌する。これにトリフルオロ酢酸を加え攪拌し、トリメチルシリルブロミドを加えて攪拌する。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早く減圧濃縮する。残査にあらかじめ冷却したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを白色粉末化する。遠沈管に移して遠心分離し、上清を捨て、冷ジエチルエーテルを新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離する操作を４回反復する。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥を行ない粗製ペプチドを得る。
【００１４】
上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離し、上清を０．４５mmフィルターで濾過する。この溶液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、ペプチドの精製を行なう。HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光製）を用い、カラムは逆相系のLichrospher100RP-18(e)250x10mm（メルク社製）を用いる。溶離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出する。クロマトグラムのピークはほぼ単一であり、相当画分を分取する。分取を数回繰り返し、これらを凍結乾燥して精製ペプチドを得る。
【００１５】
これを分析用カラム（Lichrospher100RP-18(e)250x4.6mm 。メルク社製）を用いてHPLC分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認する。また、精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的のペプチドが得られていることを確認する。
ラクトフェリン類の加水分解等で得られたペプチドにポリエチレングリコール、アシル基等を付加する方法の例を示せば次のとおりである。
【００１６】
CH3 (OCH2 CH2 )n-OH[ポリサイエンス社製。モノメトキシポリエチレングリコール（以下mPEGと記載する）] に無水酢酸を作用させてmPEG-COOH を得る。これにN-ヒドロキシスクシンイミドとジシクロヘキシルカルボジイミドを作用させ、mPEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成する。ラクトフェリン類由来のペプチドフラグメントにmPEGスクシンイミドエステルを作用させポリエチレングリコール修飾体を得る。また上記と同様の方法により、CH3 (CH 3 )n-COOH から脂肪酸スクシンイミドエステルを得る。これをラクトフェリン類由来のペプチドフラグメントに作用させアシル体を得る。ここでポリエチレングリコールおよびアシル基の分子量には特に制限はない。
【００１７】
この発明のペプチド誘導体は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等の人または動物の体内に取り入れられ、または体表面に適用される製品、その他一般に活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、さらにこの発明ペプチド誘導体でそれらの製品または原料素材を処理することができる。すなわち、この発明ペプチド誘導体は、そのまま人または動物に投与することができ、または医薬品（例えば、各種疾患予防薬、各種疾患治療薬、抗菌剤等）、食品（例えば、調製粉乳、経腸栄養剤、チュウインガム等）、医薬部外品（例えば、洗口剤、健康飲料等）、各種化粧品（例えば、クリ−ム、乳液、日焼け防止用化粧品、皮膚老化予防化粧品等）、それらの原料となる素材、その他一般に活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行なってもよく、またその他一般に活性酸素・フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。なお、公知の抗酸化剤、抗菌剤と併用することもできる。
【００１８】
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、各種化合物の抗酸化作用を調べるために行った。
１）試料の調製
次に示す８種類の試料を調製した。
試料１：ウシラクトフェリンの酵素分解から参考例記載の方法により調製した配列番号４に記載のペプチド
試料２：アミノ末端がアセチル化し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例１記載の方法により調製した次の化１のペプチド誘導体
【００１９】
【化１】
【００２０】
試料３：アミノ末端に炭素鎖数１８のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例２記載の方法により調製した次の化２のペプチド誘導体
【００２１】
【化２】
【００２２】
試料４：アミノ末端に炭素鎖数１６のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例３記載の方法により調製した次の化３のペプチド誘導体
【００２３】
【化３】
【００２４】
試料５：アミノ末端に炭素鎖数１４のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例４記載の方法により調製した次の化４のペプチド誘導体
【００２５】
【化４】
【００２６】
試料６：アミノ末端に炭素鎖数１０のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例５記載の方法により調製した次の化５のペプチド誘導体
【００２７】
【化５】
【００２８】
試料７：アミノ末端に炭素鎖数６のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例６記載の方法により調製した次の化６のペプチド誘導体
【００２９】
【化６】
【００３０】
試料８：アミノ末端がアセチル化し、カルボキシル末端にポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと記載する）が結合し、実施例７記載の方法により調製した次の化７のペプチド誘導体
【００３１】
【化７】
【００３２】
２）試験方法
グッテリッジの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第８２巻、第７６ページ、１９７７年］を、次に記載するように一部変更し、各試料の抗酸化効果を試験した。
ナス型フラスコに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）２０ｍｌ、卵黄リン脂質（ナカライテスク社製）１００ｍｇ、およびグラスビーズを添加し、窒素で置換し、３７℃でボルテックスにより５分間撹拌した。４℃で１時間保持した後、上清をリポソーム溶液として使用した。
【００３３】
０．５ｍｌのリポソーム溶液を１０ｍｌ容プラスチック・チューブに分注し、７倍濃度の試料溶液を１００μｌ、１１２μＭのＦｅＮＨ4 （ＳＯ4 ）2 ・１２Ｈ2 Ｏ（ナカライテスク社製）を５０μｌ、５３２μＭのアスコルビン酸（ナカライテスク社製）５０μｌを添加し、５秒間撹拌する。チューブにキャップをして、３７℃で１時間インキュベートする。２．９ＭのＨＣｌに溶解した１％亜ヒ酸ナトリウム（和光純薬社製）を３ｍｌ加え、混合して、４０００ｒｐｍで１５分間遠心する。清浄な溶液部分を３ｍｌ取り、０．０５ＭのＮａＯＨに溶解した１％チオバルビツール酸（ナカライテスク社製）を１ｍｌ加えて、沸騰水中で１５分間加熱する。冷却後、０．４５μＭフィルター（アドバンテック社製）で濾過する。５３２ｎｍで濾液の吸光度を測定し、リポソームリン脂質の過酸化度を求めた。なお、試料溶液の代わりに蒸留水を１００μｌ添加したものを対照とした。
【００３４】
試料の酸化抑制率（％）を次式により計算した。
酸化抑制率＝［（対照の吸光度−試料の吸光度）／対照の吸光度］×１００
３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、１００μｇ／ｍｌの濃度において、試料２から試料８は、試料１より強い酸化抑制効果を示した。また、試料３から試料７は１０μｇ／ｍｌ、試料３から試料６は１μｇ／ｍｌの低濃度においても酸化抑制作用を示した。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３５】
【表１】
【００３６】
試験例２
この試験は、各種化合物の抗菌作用を調べるために行った。
１）試料の調製
次に示す８種の試料を調製した。
試料１：試験例１の試料１と同一のもの
試料２：カルボキシル末端がアミド化し、実施例８記載の方法により調製した次の化８のペプチド誘導体
【００３７】
【化８】
【００３８】
試料３：アミノ末端にアセチル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、かつ全てのアミノ酸がＤ体であり、実施例９記載の方法により調製した次の化９のペプチド誘導体
【００３９】
【化９】
【００４０】
試料４：試験例１の試料３と同一のもの
試料５：試験例１の試料４と同一のもの
試料６：試験例１の試料５と同一のもの
試料７：試験例１の試料６と同一のもの
試料８：試験例１の試料７と同一のもの
２）試験方法
滅菌した１％バクト・ペプトン（ディフコ社製）に上記試料を、最終濃度２００、１００、５０、２５、１２、６および３μｇ／ｍｌで添加し、対数増殖期のEscherichia coli O111 またはEscherichia coli IID-861を培地中菌数１０6 細胞／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１７時間培養した。菌の増殖が肉眼的に全く認められない最小濃度をその試料の最小発育阻止濃度（以下ＭＩＣと記載する）とした。
３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなように、試料２から試料８は、試料１と同等か、または２分の１以下のＭＩＣを示し、強い抗菌効果が認められた。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４１】
【表２】
【００４２】
試験例３
この試験は、各種化合物のプロテアーゼに対する抵抗性を調べるために行った。１）試料の調製
次に示す３種の試料を調製した。
試料１：試験例１の試料１と同一のもの
試料２：カルボキシル末端がアミド化し、アミノ末端から２残基目のアミノ酸がＤ体であって、他のアミノ酸が全てＬ体であり、実施例１０記載の方法により調製した次の化１０のペプチド誘導体
【００４３】
【化１０】
【００４４】
試料３：試験例２の試料３と同一のもの
２）試験方法
▲１▼ペプチド誘導体のトリプシンによる処理
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．１）に、試料およびトリプシン（タイプＩＸ。シグマ社製）を、それぞれ最終濃度９００および５０μｇ／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートし、８０℃で１０分間熱処理することでトリプシンを失活させた。
▲２▼白癬菌産生プロテアーゼの誘導
Trichophyton mentagrophytes TIMM-1189 を培地［２％ケラチン粉末、１．２％イースト・カーボン・ベイス（ディフコ社製）、０．００５％イノシトール、０．００１％チアミンおよび０．００１％ピリドキシンからなる］で、２７℃、１０日間、振とう培養し、ウシアルブミンを基質としてプロテアーゼが誘導されていることを確認し、のちフィルター濾過し、白癬菌産生プロテアーゼ液とした。▲３▼ペプチド誘導体の白癬菌産生プロテアーゼ液による処理
２分の１に希釈した白癬菌産生プロテアーゼ液に、試料を最終濃度５００μｇ／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートし、８０℃で１０分間熱処理し、白癬菌産生プロテアーゼを失活させた。
▲４▼プロテアーゼで処理したペプチド誘導体の抗菌活性の測定
プロテアーゼで処理したペプチド誘導体のEscherichia coli O111 に対する抗菌性を、試験例２と同一の方法により測定した。
３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明らかなように、試料１はトリプシンおよび白癬菌産生プロテアーゼによって完全に失活したが、試料２は活性が若干残り、また試料３は、プロテアーゼ処理後でも活性が完全に保持されていた。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
試験例４
この試験は、各種ペプチド誘導体の急性毒性を調べるために行った。
１）使用動物
６週齢のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ４群（１群５匹）に分けて使用した。
２）試験方法
体重１ｋｇ当たり１０００および２０００ｍｇの割合で実施例１と同一の方法を反復して製造したペプチド誘導体を注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、体重１００ｇ当たり４ｍｌの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。
３）試験結果
このペプチド誘導体を１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、このペプチド誘導体のＬＤ５０は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低いことが判明した。なお、他のペプチド誘導体についても同様の試験を行ったがほぼ同様の結果が得られた。
参考例
市販の牛ラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製水０．９ｍｌに溶解し、０．１Ｎの塩酸でｐＨを２．５に調整し、のち市販の豚ペプシン（シグマ社製）１ｍｇを添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。
【００４７】
上記のラクトフェリン由来ペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイック・アシド））を用いたジスルフィド結合分析法［アナリティカル・バイオケミストリ−（Analytical Biochemistry ）、第６７巻、第４９３ページ、１９７５年］によりジスルフィド結合が存在することを確認した。
【００４８】
その結果、このペプチドは、２５個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、それぞれ結合した配列番号４に記載のアミノ酸配列を有していることが確認された。
【００４９】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００５０】
【実施例】
実施例１
ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等の方法［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第５３８ページ、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて、ペプチド誘導体を次のようにして合成した。
【００５１】
Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カルビオケム―ノバビオケム社製。 NovaSyn KR 0.1meq）１ｇを用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プログラムにより脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペプチド鎖を延長した。すなわち、２０％ DMFによりアミノ保護基であるFmoc基を切断除去し、DMF で洗浄し、のち Fmoc-アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下HOBtと記載する）各０．５mmolを反応させ、DMF で洗浄する操作を反復した。縮合反応後、必要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全であったことを確認し、次のステップに進んだ。使用したアミノ酸は、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp およびFmoc-Met-Opfp （いずれもカルビオケム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカートリッジを用いた。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DMF で洗浄後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なった。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを確認した後、樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、酢酸、tert−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエーテルの順によく洗浄し、真空乾燥した。
【００５２】
上記の保護ペプチド樹脂５７１mgにエタンジチオール１．０ml、m-クレゾール２００μl 、チオアニソール２．４mlを室温、アルゴン気流下１５分間攪拌し、のち氷冷下でさらに１０分間攪拌した。これにトリフルオロ酢酸１５mlを添加して１０分間攪拌し、トリメチルシリルブロミド２．６mlを加えて５０分間攪拌した。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早く減圧濃縮した。残査に予め冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを白色粉末化した。遠沈管に移し、遠心分離（２５００rpm 、５分間）し、上清を廃棄し、冷ジエチルエーテルを新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離する操作を４回反復した。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥を行ない粗製ペプチド６２．５mgを得た。
【００５３】
上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離（１５０００rpm 、５分間）を行ない、上清を０．４５mmフィルターで濾過し、この溶液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、ペプチドの精製を行なった。HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光製）を用い、カラムは逆相系の市販カラム（メルク社製。Lichrospher100RP-18(e)250x10mm）を用いた。溶離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。クロマトグラムはほぼ単一のピークと認められ、相当する画分を分取した。この分取操作を数回反復し、凍結乾燥し、精製ペプチド２８．５mgを得た。
【００５４】
これを分析用カラム（メルク社製。Lichrospher100RP-18(e)250x4.6mm ）によりHPLC分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認した。また、精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的とする次の化１１に示すペプチド誘導体が得られていることを確認した。
【００５５】
【化１１】
【００５６】
実施例２
実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法としてスクシンイミドエステルを用いる方法により、ペプチド誘導体を次のとおり合成した。
ステアリン酸［（CH3 (CH 2 ) 16COOH］２．８ｇをジクロロメタンに溶解させ、これにＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｇのDMF 溶液とジシクロヘキシルカルボジイミド２．３ｇのジクロロメタン溶液を加え室温で５時間攪拌した。反応進行を薄層クロマトグラフィーにてモニターし、完全に反応が終了したことを確認した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾去し、減圧濃縮し、残査にジエチルエーテルを加え遠沈管に移し遠心分離（２５００rpm 、５分間）を行なった。上清を捨て新たにジエチルエーテルを加え良く攪拌し遠心分離の操作を２回繰り返した。グラスロートで濾取し真空乾燥しステアリン酸スクシンイミドエステルを２．０ｇ得た。ペプチドシンセサイザーで合成した保護ペプチド樹脂（Ｎ端アミノ基フリー、０．１mmolスケール）にステアリン酸スクシンイミドエステル３８２mgのDMF 溶液を加え室温で５時間反応させた。カイザーテストで完全にアシル化されていることを確認した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は１．１３ｇであった。脱保護・脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１８１mgであり、次の化１２に示す精製したペプチド誘導体約９８mgを得た。
【００５７】
【化１２】
【００５８】
実施例３
実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法は縮合剤を用い、次のとおり行なった。
パルミチン酸（CH3 (CH 2 ) 14COOH）１５４mg、HBTU[2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate] ２２８mg、HOBt９２mgをDMF に溶解し、DIEA( ジイソプロピルエチルアミン）１０５μl を加えた混合溶液をペプチドシンセサイザーで合成した保護ペプチド樹脂（Ｎ端アミノ基フリー、６０μmol スケール）に加え、室温で１時間攪拌し、のちカイザーテストで完全にアシル化されていることを確認した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４７６mg、脱保護・脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０３mgであり、次の化１３に示す精製したペプチド誘導体約４６mgを得た。
【００５９】
【化１３】
【００６０】
実施例４
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４４４mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は９２mgであり、次の化１４に示す精製したペプチド誘導体約４７mgを得た。
【００６１】
【化１４】
【００６２】
実施例５
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０１mgであり、次の化１５に示す精製したペプチド誘導体約５３mgを得た。
【００６３】
【化１５】
【００６４】
実施例６
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０５mgであり、次の化１６に示す精製したペプチド誘導体約５７mgを得た。
【００６５】
【化１６】
【００６６】
実施例７
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、固相樹脂は TantaGel-NH2 ［島津製作所社製、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと記載する）―スペーサー部分分子量：３０００）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は４８４mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は３１１mgであり、次の化１７に示す精製したペプチド誘導体約１３２mgを得た。
【００６７】
【化１７】
【００６８】
実施例８
実施例１と同様の操作を行なった。保護ペプチド樹脂の収量は５６２mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は６２mgであり、次の化１８に示す精製したペプチド誘導体約２９mgを得た。
【００６９】
【化１８】
【００７０】
実施例９
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、ペプチド結合形成反応はHBTU/HOBt 縮合剤を用いる方法を採用した。従って、ペプチドシンセサイザーのアミノ酸導入はマニュアルで行なった。アミノ酸は、Fmoc-D-Arg(Mtr)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Gln-OH およびFmoc-D-Met-OH （いずれも渡辺化学工業社製）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は５０２mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は５７mgであり、次の化１９に示す精製したペプチド誘導体約３２mgを得た。
【００７１】
【化１９】
【００７２】
実施例１０
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、Ｎ端から２番目のアミノ酸Arg の導入はＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ縮合剤を用いる実施例９と同様の方法で行なった。アミノ酸は、Fmoc-Arg(Mtr)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp （いずれもカルビオケム−ノボビオケム社製）、Ｎ端から２番目のアミノ酸としてFmoc-D-Arg(Mtr)-OH（渡辺化学工業社製）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は１８８mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１４mgであり、次の化２０に示す精製したペプチド誘導体約８mgを得た。
【００７３】
【化２０】
【００７４】
実施例１１
常法により次の組成の錠剤を製造した。
乳糖 ７９．４５（％）
実施例２のペプチド誘導体 ０．５５
ステアリン酸マグネシウム ２０．００
実施例１２
常法により次の組成の注射剤を製造した。
【００７５】
実施例９のペプチド誘導体 １．２０（％）
界面活性剤 ８．００
生理食塩水 ９０．８０
実施例１３
常法により次の組成のチュ−インガムを製造した。
【００７６】
ガムベ−ス ２５．００（％）
炭酸カルシウム ２．００
香料 １．００
実施例１のペプチド誘導体 ０．１０
ソルビト−ル粉末 ７１．９０
実施例１４
常法により次の組成のハンドローションを製造した。
【００７７】
カーボワックス１５００ ９．００（％）
アルコール ４．００
プロピレングリコール ４７．００
香料 ０．５０
実施例７のペプチド誘導体 ０．４０
蒸留水 ３９．１０
【００７８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化に対し優れた抑制作用を有する抗酸化剤と、細菌、真菌などの微生物に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤が提供される。これらの抗酸化剤、抗菌剤は医薬品および食品等に使用しても極めて安全である。
【００７９】
【配列表】
【産業上の利用分野】
この発明は、ペプチド誘導体と、その用途に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、医薬品、医薬部外品およびその他の製品等に使用し得る安全なペプチド誘導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、種々の疾患の病態にフリーラジカルの関与が明らかとなってきた。人類は、生命の維持に酸素を必要とするが、その際、生体内では絶えず活性酸素、フリーラジカルが生成されている。いったん生じたフリーラジカルは、膜脂質および膜蛋白質の変性を惹起し、細胞膜を損傷させ、ＤＮＡおよび酵素の変性により、種々の疾病の原因となる。特に細胞膜中の高度不飽和脂肪酸はフリーラジカルによる攻撃を容易に受け、その結果、有害な過酸化脂質を生成し、さらに細胞障害を増強させるといわれている（現代医療、第２５巻、第１６３ページ、１９９３年）。
【０００３】
活性酸素が関係する疾病は、火傷、関節炎等の炎症、再還流障害、抗癌剤の副作用、放射線障害、消化性潰瘍、細菌性ショック、悪液質、自己免疫疾患等の広範に存在する。そしてこれらの疾患の予防、治療には活性酸素、フリーラジカル、過酸化脂質の抑制が有効であると考えられている（日経バイオテク編、「日経バイオ年鑑」、第３５０ページ、日経ＢＰ、１９９４年）。
【０００４】
一方、従来多くの抗菌剤が開発され、使用されてきたが、感染症が消滅することはなく、その原因や症状はなお一層複雑化してきている。特に、感染する細菌側の薬剤耐性の増加、また宿主側ではコンプロマイズド・ホストの出現によって、依然解決が難しくなっている。このため感染症の新しい予防法、治療法が待望されている。
【０００５】
その一つにラクトフェリンがある。ラクトフェリンは、涙、唾液、乳汁等の外分泌液、好中球顆粒中に含まれている鉄結合蛋白質であり、抗菌性、抗酸化性、免疫調節作用等の多彩な生理活性を有することが知られている（アーカイブズ・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド［Archives of Disease in Childhood］、第６７巻、第６５７ページ、１９９２年）。またラクトフェリンの分解物、ラクトフェリンに由来するペプチド類、これらとホモロジーを有するペプチド類にも抗菌性、抗酸化性等の作用のあることが知られている。例えば、ラクトフェリン分解物を有効成分とする抗菌剤（特開平５−３２００６８号公報）、少なくとも２０個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−９２９９４号公報）、１１個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−７８３９２号公報）、６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９７号公報）、５個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９６号公報）、３〜６個のアミノ酸残基からなる抗菌性ペプチド（特開平５−１４８２９５号公報）、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン類の分解物から単離されるペプチド、ラクトフェリン類の分解物から単離されるペプチドと同一のアミノ酸配列を有する合成されたペプチドを有効成分とする抗酸化剤（特開平６−１９９６８７号公報）等である。
【０００６】
なお、ペプチドの誘導体については、それらが有する単純ペプチドには無い性質を利用して、多くの目的のために研究されている。ペプチドを誘導体化することによって、活性の増加、プロテアーゼに対する抵抗性の付与、体内での持続性の増加等が計られている。
例えば、抗酸化および抗炎症活性を有する金属ペプチド複合体（特表平５−５０３９３９号公報）、虚血性傷害および再潅流性傷害を抑制するトリペプチドアルギナール誘導体（特開平６−１９９６８２号公報）、皮膚用化粧品として使用される第４級アンモニウム誘導ペプチド（特開平４−８２８２２号公報）、標的細胞、ウイルス、ウイルス感染細胞に対して生物活性を有する両親媒性イオンチャンネル形成ペプチドのＮ末端置換ペプチド（ＷＯ９３／２４１３８）、生物活性を持つ、両親媒性イオンチャンネル形成ペプチドのＣ末端置換ペプチド（ＷＯ９２／２２３１７）等が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ラクトフェリン由来ペプチドについては、誘導体の抗酸化性、抗菌性等の生理活性は、従来全く知られておらず、従って、これらを有効成分とする抗酸化剤、抗菌剤も存在しなかった。
この発明は、以上の従来技術に鑑みてなされたものであり、従来の抗酸化剤、抗菌剤とは全く異なり、ラクトフェリン由来ペプチドの誘導体を有効成分とする安全な抗酸化剤、抗菌剤を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記の課題を解決するものとして、特定の化学式で示されるラクトフェリン由来ペプチドの誘導体、またはこれを有効成分として含有する抗酸化剤、および抗菌剤を提供する。
以下、この発明について詳しく説明する。
【０００９】
この発明において使用するペプチド誘導体は、公知の方法（例えば、ペプチド自動合成装置を用いる方法）によって合成して目的とするペプチドを得る方法、ペプチド合成装置によって合成したペプチドに、有機合成技術によりアシル基、ポリエチレングリコール等を付加する方法、またはラクトフェリン類を酸または酵素を用いて加水分解し、分解物混合物から液体クロマトグラフィー等の分離手段によって一定のアミノ酸配列を有するペプチドを含む画分を得た後、有機合成技術を用いてアシル基、ポリエチレングリコール等を付加する方法等により調製することができる。
【００１０】
この発明のペプチド誘導体の例としてアミノ末端にアセチル基、カルボキシル末端にアミドを有するペプチドの製造法を示せば次のとおりである。
ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第５３８ページ、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて次のとおり合成する。
【００１１】
Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カルビオケム―ノバビオケム社製。NovaSyn KR 0.1meq ）を用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プログラムにより脱保護基反応および縮合反応を反復してペプチド鎖を延長する。すなわち、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（以下DMF と記載する）によりアミノ保護基である９−フルオレニルメトキシカルボニル（以下Fmocと記載する）基を切断除去し、DMF で洗浄した後Fmoc- アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下HOBtと記載する）を反応させ、DMF で洗浄する操作を反復する。
【００１２】
縮合反応後、必要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全であったことを確認し、次のステップに進む。使用するアミノ酸は、Fmoc-Arg(Mtr)-Opfp、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp 、Fmoc-Met-Opfp （いずれもカルビオケム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカートリッジを用いる。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DMF で洗浄後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なう。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを確認し、のち樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、酢酸、tert−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエーテルの順によく洗浄し、真空乾燥する。
【００１３】
上記の保護ペプチド樹脂にエタンジチオール、チオアニソールを室温でアルゴン気流下攪拌した後、氷冷下で、さらに攪拌する。これにトリフルオロ酢酸を加え攪拌し、トリメチルシリルブロミドを加えて攪拌する。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早く減圧濃縮する。残査にあらかじめ冷却したジエチルエーテルを添加し、ペプチドを白色粉末化する。遠沈管に移して遠心分離し、上清を捨て、冷ジエチルエーテルを新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離する操作を４回反復する。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥を行ない粗製ペプチドを得る。
【００１４】
上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離し、上清を０．４５mmフィルターで濾過する。この溶液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、ペプチドの精製を行なう。HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光製）を用い、カラムは逆相系のLichrospher100RP-18(e)250x10mm（メルク社製）を用いる。溶離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出する。クロマトグラムのピークはほぼ単一であり、相当画分を分取する。分取を数回繰り返し、これらを凍結乾燥して精製ペプチドを得る。
【００１５】
これを分析用カラム（Lichrospher100RP-18(e)250x4.6mm 。メルク社製）を用いてHPLC分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認する。また、精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的のペプチドが得られていることを確認する。
ラクトフェリン類の加水分解等で得られたペプチドにポリエチレングリコール、アシル基等を付加する方法の例を示せば次のとおりである。
【００１６】
CH3 (OCH2 CH2 )n-OH[ポリサイエンス社製。モノメトキシポリエチレングリコール（以下mPEGと記載する）] に無水酢酸を作用させてmPEG-COOH を得る。これにN-ヒドロキシスクシンイミドとジシクロヘキシルカルボジイミドを作用させ、mPEGのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成する。ラクトフェリン類由来のペプチドフラグメントにmPEGスクシンイミドエステルを作用させポリエチレングリコール修飾体を得る。また上記と同様の方法により、CH3 (CH 3 )n-COOH から脂肪酸スクシンイミドエステルを得る。これをラクトフェリン類由来のペプチドフラグメントに作用させアシル体を得る。ここでポリエチレングリコールおよびアシル基の分子量には特に制限はない。
【００１７】
この発明のペプチド誘導体は、医薬品としてのみならず、食品、飼料、化粧品等の人または動物の体内に取り入れられ、または体表面に適用される製品、その他一般に活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる製品に配合して使用することができ、さらにこの発明ペプチド誘導体でそれらの製品または原料素材を処理することができる。すなわち、この発明ペプチド誘導体は、そのまま人または動物に投与することができ、または医薬品（例えば、各種疾患予防薬、各種疾患治療薬、抗菌剤等）、食品（例えば、調製粉乳、経腸栄養剤、チュウインガム等）、医薬部外品（例えば、洗口剤、健康飲料等）、各種化粧品（例えば、クリ−ム、乳液、日焼け防止用化粧品、皮膚老化予防化粧品等）、それらの原料となる素材、その他一般に活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる物品に添加、配合、噴霧、付着、被覆、含浸等を行なってもよく、またその他一般に活性酸素・フリーラジカル、脂質の過酸化の抑制、細菌、真菌等の微生物の抑制、殺菌が望まれるあらゆる物品の処理に用いることができる。なお、公知の抗酸化剤、抗菌剤と併用することもできる。
【００１８】
次に試験例を示してこの発明をさらに詳しく説明する。
試験例１
この試験は、各種化合物の抗酸化作用を調べるために行った。
１）試料の調製
次に示す８種類の試料を調製した。
試料１：ウシラクトフェリンの酵素分解から参考例記載の方法により調製した配列番号４に記載のペプチド
試料２：アミノ末端がアセチル化し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例１記載の方法により調製した次の化１のペプチド誘導体
【００１９】
【化１】
試料３：アミノ末端に炭素鎖数１８のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例２記載の方法により調製した次の化２のペプチド誘導体
【００２１】
【化２】
試料４：アミノ末端に炭素鎖数１６のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例３記載の方法により調製した次の化３のペプチド誘導体
【００２３】
【化３】
試料５：アミノ末端に炭素鎖数１４のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例４記載の方法により調製した次の化４のペプチド誘導体
【００２５】
【化４】
試料６：アミノ末端に炭素鎖数１０のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例５記載の方法により調製した次の化５のペプチド誘導体
【００２７】
【化５】
試料７：アミノ末端に炭素鎖数６のアシル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、実施例６記載の方法により調製した次の化６のペプチド誘導体
【００２９】
【化６】
試料８：アミノ末端がアセチル化し、カルボキシル末端にポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと記載する）が結合し、実施例７記載の方法により調製した次の化７のペプチド誘導体
【００３１】
【化７】
２）試験方法
グッテリッジの方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第８２巻、第７６ページ、１９７７年］を、次に記載するように一部変更し、各試料の抗酸化効果を試験した。
ナス型フラスコに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）２０ｍｌ、卵黄リン脂質（ナカライテスク社製）１００ｍｇ、およびグラスビーズを添加し、窒素で置換し、３７℃でボルテックスにより５分間撹拌した。４℃で１時間保持した後、上清をリポソーム溶液として使用した。
【００３３】
０．５ｍｌのリポソーム溶液を１０ｍｌ容プラスチック・チューブに分注し、７倍濃度の試料溶液を１００μｌ、１１２μＭのＦｅＮＨ4 （ＳＯ4 ）2 ・１２Ｈ2 Ｏ（ナカライテスク社製）を５０μｌ、５３２μＭのアスコルビン酸（ナカライテスク社製）５０μｌを添加し、５秒間撹拌する。チューブにキャップをして、３７℃で１時間インキュベートする。２．９ＭのＨＣｌに溶解した１％亜ヒ酸ナトリウム（和光純薬社製）を３ｍｌ加え、混合して、４０００ｒｐｍで１５分間遠心する。清浄な溶液部分を３ｍｌ取り、０．０５ＭのＮａＯＨに溶解した１％チオバルビツール酸（ナカライテスク社製）を１ｍｌ加えて、沸騰水中で１５分間加熱する。冷却後、０．４５μＭフィルター（アドバンテック社製）で濾過する。５３２ｎｍで濾液の吸光度を測定し、リポソームリン脂質の過酸化度を求めた。なお、試料溶液の代わりに蒸留水を１００μｌ添加したものを対照とした。
【００３４】
試料の酸化抑制率（％）を次式により計算した。
酸化抑制率＝［（対照の吸光度−試料の吸光度）／対照の吸光度］×１００
３）試験結果
この試験の結果は表１に示すとおりである。表１から明らかなように、１００μｇ／ｍｌの濃度において、試料２から試料８は、試料１より強い酸化抑制効果を示した。また、試料３から試料７は１０μｇ／ｍｌ、試料３から試料６は１μｇ／ｍｌの低濃度においても酸化抑制作用を示した。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００３５】
【表１】
試験例２
この試験は、各種化合物の抗菌作用を調べるために行った。
１）試料の調製
次に示す８種の試料を調製した。
試料１：試験例１の試料１と同一のもの
試料２：カルボキシル末端がアミド化し、実施例８記載の方法により調製した次の化８のペプチド誘導体
【００３７】
【化８】
試料３：アミノ末端にアセチル基が結合し、カルボキシル末端がアミド化し、かつ全てのアミノ酸がＤ体であり、実施例９記載の方法により調製した次の化９のペプチド誘導体
【００３９】
【化９】
試料４：試験例１の試料３と同一のもの
試料５：試験例１の試料４と同一のもの
試料６：試験例１の試料５と同一のもの
試料７：試験例１の試料６と同一のもの
試料８：試験例１の試料７と同一のもの
２）試験方法
滅菌した１％バクト・ペプトン（ディフコ社製）に上記試料を、最終濃度２００、１００、５０、２５、１２、６および３μｇ／ｍｌで添加し、対数増殖期のEscherichia coli O111 またはEscherichia coli IID-861を培地中菌数１０6 細胞／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１７時間培養した。菌の増殖が肉眼的に全く認められない最小濃度をその試料の最小発育阻止濃度（以下ＭＩＣと記載する）とした。
３）試験結果
この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明らかなように、試料２から試料８は、試料１と同等か、または２分の１以下のＭＩＣを示し、強い抗菌効果が認められた。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４１】
【表２】
試験例３
この試験は、各種化合物のプロテアーゼに対する抵抗性を調べるために行った。１）試料の調製
次に示す３種の試料を調製した。
試料１：試験例１の試料１と同一のもの
試料２：カルボキシル末端がアミド化し、アミノ末端から２残基目のアミノ酸がＤ体であって、他のアミノ酸が全てＬ体であり、実施例１０記載の方法により調製した次の化１０のペプチド誘導体
【００４３】
【化１０】
試料３：試験例２の試料３と同一のもの
２）試験方法
▲１▼ペプチド誘導体のトリプシンによる処理
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．１）に、試料およびトリプシン（タイプＩＸ。シグマ社製）を、それぞれ最終濃度９００および５０μｇ／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートし、８０℃で１０分間熱処理することでトリプシンを失活させた。
▲２▼白癬菌産生プロテアーゼの誘導
Trichophyton mentagrophytes TIMM-1189 を培地［２％ケラチン粉末、１．２％イースト・カーボン・ベイス（ディフコ社製）、０．００５％イノシトール、０．００１％チアミンおよび０．００１％ピリドキシンからなる］で、２７℃、１０日間、振とう培養し、ウシアルブミンを基質としてプロテアーゼが誘導されていることを確認し、のちフィルター濾過し、白癬菌産生プロテアーゼ液とした。▲３▼ペプチド誘導体の白癬菌産生プロテアーゼ液による処理
２分の１に希釈した白癬菌産生プロテアーゼ液に、試料を最終濃度５００μｇ／ｍｌの割合で添加し、３７℃で１時間インキュベートし、８０℃で１０分間熱処理し、白癬菌産生プロテアーゼを失活させた。
▲４▼プロテアーゼで処理したペプチド誘導体の抗菌活性の測定
プロテアーゼで処理したペプチド誘導体のEscherichia coli O111 に対する抗菌性を、試験例２と同一の方法により測定した。
３）試験結果
この試験の結果は表３に示すとおりである。表３から明らかなように、試料１はトリプシンおよび白癬菌産生プロテアーゼによって完全に失活したが、試料２は活性が若干残り、また試料３は、プロテアーゼ処理後でも活性が完全に保持されていた。なお、ペプチド誘導体の種類を変更して同様の試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４５】
【表３】
試験例４
この試験は、各種ペプチド誘導体の急性毒性を調べるために行った。
１）使用動物
６週齢のＣＤ（ＳＤ）系のラット（日本ＳＬＣから購入）の両性を用い、雄および雌を無作為にそれぞれ４群（１群５匹）に分けて使用した。
２）試験方法
体重１ｋｇ当たり１０００および２０００ｍｇの割合で実施例１と同一の方法を反復して製造したペプチド誘導体を注射用水（大塚製薬社製）に溶解し、体重１００ｇ当たり４ｍｌの割合で金属製玉付き針を用いて単回強制経口投与し、急性毒性を試験した。
３）試験結果
このペプチド誘導体を１０００ｍｇ／ｋｇ体重および２０００ｍｇ／ｋｇ体重の割合で投与した群に死亡例は認められなかった。従って、このペプチド誘導体のＬＤ５０は、２０００ｍｇ／ｋｇ体重以上であり、毒性は極めて低いことが判明した。なお、他のペプチド誘導体についても同様の試験を行ったがほぼ同様の結果が得られた。
参考例
市販の牛ラクトフェリン（シグマ社製）５０ｍｇを精製水０．９ｍｌに溶解し、０．１Ｎの塩酸でｐＨを２．５に調整し、のち市販の豚ペプシン（シグマ社製）１ｍｇを添加し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、透明な上清を得た。この上清１００μｌをＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む２０％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２０〜６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、２４〜２５分の間に溶出する画分を集め、真空乾燥した。この乾燥物を２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で精製水に溶解し、再度ＴＳＫゲルＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィ−にかけ、０．８ｍｌ／分の流速で試料注入後１０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４％アセトニトリルで溶出し、のち３０分間０．０５％ＴＦＡを含む２４〜３２％のアセトニトリルのグラジエントで溶出し、３３．５〜３５．５分の間に溶出する画分を集めた。上記の操作を２５回反復し、真空乾燥し、ペプチド約１．５ｍｇを得た。
【００４７】
上記のラクトフェリン由来ペプチドを６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計を用いて常法によりアミノ酸組成を分析した。同一の試料を気相シ−クェンサ−（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて２５回のエドマン分解を行ない、２５個のアミノ酸残基の配列を決定した。またＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾイック・アシド））を用いたジスルフィド結合分析法［アナリティカル・バイオケミストリ−（Analytical Biochemistry ）、第６７巻、第４９３ページ、１９７５年］によりジスルフィド結合が存在することを確認した。
【００４８】
その結果、このペプチドは、２５個のアミノ酸残基からなり、３番目と２０番目のシステイン残基がジスルフィド結合し、３番目のシステイン残基からＮ−末端側に２個のアミノ酸残基が、２０番目のシステイン残基からＣ−末端側に５個のアミノ酸が、それぞれ結合した配列番号４に記載のアミノ酸配列を有していることが確認された。
【００４９】
次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００５０】
【実施例】
実施例１
ペプチドシンセサイザー（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製。LKB Biolynx 4170）を使用し、シェパード等の方法［ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイエティー・パーキンＩ(Journal of Chemical Society Perkin Ｉ) 、第５３８ページ、１９８１年］による固相ペプチド合成法に基づいて、ペプチド誘導体を次のようにして合成した。
【００５１】
Ｃ末端アミドペプチド合成用固相樹脂（カルビオケム―ノバビオケム社製。 NovaSyn KR 0.1meq）１ｇを用いて、上記ペプチドシンセサイザーの合成プログラムにより脱保護基反応及び縮合反応を繰り返してペプチド鎖を延長した。すなわち、２０％ DMFによりアミノ保護基であるFmoc基を切断除去し、DMF で洗浄し、のち Fmoc-アミノ酸活性エステル／N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下HOBtと記載する）各０．５mmolを反応させ、DMF で洗浄する操作を反復した。縮合反応後、必要に応じてカイザーテストを行ないカップリングが完全であったことを確認し、次のステップに進んだ。使用したアミノ酸は、Fmoc-Lys(Boc)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp およびFmoc-Met-Opfp （いずれもカルビオケム―ノバビオケム社製）で０．５mmolのカートリッジを用いた。ペプチド鎖の伸張反応が全て終了した後、２０％ピペリジン／DMF によりFmoc基を切断し、DMF で洗浄後１０％無水酢酸／DMF でアセチル化を行なった。カイザーテストによりアセチル化が完了したことを確認した後、樹脂をDMF 、tert−ペンチルアルコール、酢酸、tert−ペンチルアルコール、DMF 、ジエチルエーテルの順によく洗浄し、真空乾燥した。
【００５２】
上記の保護ペプチド樹脂５７１mgにエタンジチオール１．０ml、m-クレゾール２００μl 、チオアニソール２．４mlを室温、アルゴン気流下１５分間攪拌し、のち氷冷下でさらに１０分間攪拌した。これにトリフルオロ酢酸１５mlを添加して１０分間攪拌し、トリメチルシリルブロミド２．６mlを加えて５０分間攪拌した。グラスフィルターで樹脂を濾去し、濾液を手早く減圧濃縮した。残査に予め冷却したジエチルエーテルを加えてペプチドを白色粉末化した。遠沈管に移し、遠心分離（２５００rpm 、５分間）し、上清を廃棄し、冷ジエチルエーテルを新たに加えてよく攪拌し、再び遠心分離する操作を４回反復した。ペプチド沈殿物を真空乾燥し、水に溶解して凍結乾燥を行ない粗製ペプチド６２．５mgを得た。
【００５３】
上記粗製ペプチドを水に溶解し、遠心分離（１５０００rpm 、５分間）を行ない、上清を０．４５mmフィルターで濾過し、この溶液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供し、ペプチドの精製を行なった。HPLCはガリバーPU-986高圧グラジエントシステム（日本分光製）を用い、カラムは逆相系の市販カラム（メルク社製。Lichrospher100RP-18(e)250x10mm）を用いた。溶離液は０．１％TFA ／水をＡ液、８０％アセトニトリル／Ａ液をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。クロマトグラムはほぼ単一のピークと認められ、相当する画分を分取した。この分取操作を数回反復し、凍結乾燥し、精製ペプチド２８．５mgを得た。
【００５４】
これを分析用カラム（メルク社製。Lichrospher100RP-18(e)250x4.6mm ）によりHPLC分析を行ない、精製物が単一であることをさらに確認した。また、精製ペプチドの構造確認は、常法のアミノ酸分析、アミノ酸配列分析、元素分析、質量分析等を実施し、目的とする次の化１１に示すペプチド誘導体が得られていることを確認した。
【００５５】
【化１１】
実施例２
実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法としてスクシンイミドエステルを用いる方法により、ペプチド誘導体を次のとおり合成した。
ステアリン酸［（CH3 (CH 2 ) 16COOH］２．８ｇをジクロロメタンに溶解させ、これにＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．２ｇのDMF 溶液とジシクロヘキシルカルボジイミド２．３ｇのジクロロメタン溶液を加え室温で５時間攪拌した。反応進行を薄層クロマトグラフィーにてモニターし、完全に反応が終了したことを確認した。副生成物のジシクロヘキシルウレアを濾去し、減圧濃縮し、残査にジエチルエーテルを加え遠沈管に移し遠心分離（２５００rpm 、５分間）を行なった。上清を捨て新たにジエチルエーテルを加え良く攪拌し遠心分離の操作を２回繰り返した。グラスロートで濾取し真空乾燥しステアリン酸スクシンイミドエステルを２．０ｇ得た。ペプチドシンセサイザーで合成した保護ペプチド樹脂（Ｎ端アミノ基フリー、０．１mmolスケール）にステアリン酸スクシンイミドエステル３８２mgのDMF 溶液を加え室温で５時間反応させた。カイザーテストで完全にアシル化されていることを確認した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は１．１３ｇであった。脱保護・脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１８１mgであり、次の化１２に示す精製したペプチド誘導体約９８mgを得た。
【００５７】
【化１２】
実施例３
実施例１と同様の操作を行なったが、アシル基導入方法は縮合剤を用い、次のとおり行なった。
パルミチン酸（CH3 (CH 2 ) 14COOH）１５４mg、HBTU[2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate] ２２８mg、HOBt９２mgをDMF に溶解し、DIEA( ジイソプロピルエチルアミン）１０５μl を加えた混合溶液をペプチドシンセサイザーで合成した保護ペプチド樹脂（Ｎ端アミノ基フリー、６０μmol スケール）に加え、室温で１時間攪拌し、のちカイザーテストで完全にアシル化されていることを確認した。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４７６mg、脱保護・脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０３mgであり、次の化１３に示す精製したペプチド誘導体約４６mgを得た。
【００５９】
【化１３】
実施例４
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４４４mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は９２mgであり、次の化１４に示す精製したペプチド誘導体約４７mgを得た。
【００６１】
【化１４】
実施例５
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０１mgであり、次の化１５に示す精製したペプチド誘導体約５３mgを得た。
【００６３】
【化１５】
実施例６
実施例３と同様の操作を行なった。アシル化保護ペプチド樹脂の収量は４９３mg、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１０５mgであり、次の化１６に示す精製したペプチド誘導体約５７mgを得た。
【００６５】
【化１６】
実施例７
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、固相樹脂は TantaGel-NH2 ［島津製作所社製、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧと記載する）―スペーサー部分分子量：３０００）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は４８４mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は３１１mgであり、次の化１７に示す精製したペプチド誘導体約１３２mgを得た。
【００６７】
【化１７】
実施例８
実施例１と同様の操作を行なった。保護ペプチド樹脂の収量は５６２mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は６２mgであり、次の化１８に示す精製したペプチド誘導体約２９mgを得た。
【００６９】
【化１８】
実施例９
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、ペプチド結合形成反応はHBTU/HOBt 縮合剤を用いる方法を採用した。従って、ペプチドシンセサイザーのアミノ酸導入はマニュアルで行なった。アミノ酸は、Fmoc-D-Arg(Mtr)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-D-Gln-OH およびFmoc-D-Met-OH （いずれも渡辺化学工業社製）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は５０２mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は５７mgであり、次の化１９に示す精製したペプチド誘導体約３２mgを得た。
【００７１】
【化１９】
実施例１０
実施例１と同様の操作を行なった。ただし、Ｎ端から２番目のアミノ酸Arg の導入はＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ縮合剤を用いる実施例９と同様の方法で行なった。アミノ酸は、Fmoc-Arg(Mtr)-Opfp、Fmoc-Trp(Boc)-Opfp、Fmoc-Gln-Opfp （いずれもカルビオケム−ノボビオケム社製）、Ｎ端から２番目のアミノ酸としてFmoc-D-Arg(Mtr)-OH（渡辺化学工業社製）を用いた。保護ペプチド樹脂の収量は１８８mgであり、脱保護、脱樹脂後の粗製ペプチドの収量は１４mgであり、次の化２０に示す精製したペプチド誘導体約８mgを得た。
【００７３】
【化２０】
実施例１１
常法により次の組成の錠剤を製造した。
乳糖 ７９．４５（％）
実施例２のペプチド誘導体 ０．５５
ステアリン酸マグネシウム ２０．００
実施例１２
常法により次の組成の注射剤を製造した。
【００７５】
実施例９のペプチド誘導体 １．２０（％）
界面活性剤 ８．００
生理食塩水 ９０．８０
実施例１３
常法により次の組成のチュ−インガムを製造した。
【００７６】
ガムベ−ス ２５．００（％）
炭酸カルシウム ２．００
香料 １．００
実施例１のペプチド誘導体 ０．１０
ソルビト−ル粉末 ７１．９０
実施例１４
常法により次の組成のハンドローションを製造した。
【００７７】
カーボワックス１５００ ９．００（％）
アルコール ４．００
プロピレングリコール ４７．００
香料 ０．５０
実施例７のペプチド誘導体 ０．４０
蒸留水 ３９．１０
【００７８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、活性酸素、フリーラジカル、脂質の過酸化に対し優れた抑制作用を有する抗酸化剤と、細菌、真菌などの微生物に対して優れた抗菌作用を有する抗菌剤が提供される。これらの抗酸化剤、抗菌剤は医薬品および食品等に使用しても極めて安全である。
【００７９】
【配列表】
Claims (3)
- 次の一般式ａ）、ｂ）またはｃ）
ａ）Ｒ１−Ｘ
ｂ）Ｘ−Ｒ２
ｃ）Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
（前記化学式においてＲ１は、アセチル基、アシル基またはポリエチレングリコールを示し、Ｘは、Ｄ体またはＬ体のアミノ酸からなる配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｒ２は、アミノ基、アシル基またはポリエチレングリコールを示す）で示されるペプチド誘導体。 - 次の一般式ａ）、ｂ）またはｃ）
ａ）Ｒ１−Ｘ
ｂ）Ｘ−Ｒ２
ｃ）Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
（前記化学式においてＲ１は、アセチル基、アシル基またはポリエチレングリコールのいずれかを示し、Ｘは、Ｄ体またはＬ体のアミノ酸からなる配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、Ｒ２は、アミノ基、アシル基またはポリエチレングリコールを示す）で示されるペプチド誘導体を有効成分として含有する抗酸化剤。 - ペプチド誘導体が、少なくとも１μｇ／ｍｌ含有されている請求項２の抗酸化剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32276294A JP3810821B2 (ja) | 1994-12-26 | 1994-12-26 | ペプチド誘導体と、その用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32276294A JP3810821B2 (ja) | 1994-12-26 | 1994-12-26 | ペプチド誘導体と、その用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08176190A JPH08176190A (ja) | 1996-07-09 |
| JP3810821B2 true JP3810821B2 (ja) | 2006-08-16 |
Family
ID=18147365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32276294A Expired - Lifetime JP3810821B2 (ja) | 1994-12-26 | 1994-12-26 | ペプチド誘導体と、その用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3810821B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN2000KO00299A (ja) * | 1999-05-28 | 2005-11-18 | Johnson & Johnson Consumer | |
| US6858581B2 (en) | 2000-06-16 | 2005-02-22 | Arizona State University | Chemically-modified peptides, compositions, and methods of production and use |
| JP2008069073A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Yokohama Tlo Co Ltd | ラクトフェリン複合体及びその製造方法 |
-
1994
- 1994-12-26 JP JP32276294A patent/JP3810821B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08176190A (ja) | 1996-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1853620B1 (en) | Antimicrobial hexapeptides | |
| JP5747100B2 (ja) | 抗菌化合物および処方物 | |
| AU5367596A (en) | Anti-fungal peptides | |
| AU2001237616A1 (en) | Antimicrobial compounds and formulations | |
| KR101046426B1 (ko) | 항균 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물 | |
| JP2002522556A (ja) | アメリカカエルの皮膚から単離された抗菌性ペプチド | |
| AU709738B2 (en) | Anti-fungal peptides | |
| JP3810821B2 (ja) | ペプチド誘導体と、その用途 | |
| JPH0873499A (ja) | 新規ペプチドおよび免疫賦活剤 | |
| WO1991019512A1 (en) | Antimicrobial peptides | |
| KR101036054B1 (ko) | 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법 | |
| AU763679B2 (en) | Crosslink-stabilized indolicidin analogs | |
| EP0305615A1 (en) | Peptide antagonists for the C5a anaphylatoxin | |
| JPH0474197A (ja) | 新規な免疫調整生理活性ペプチド | |
| JPH08183795A (ja) | ペプチド誘導体と、その用途 | |
| WO2002040536A2 (en) | Acylated antimicrobial peptides | |
| US7326684B2 (en) | Peptides for enhancing resistance to microbial infections | |
| JPH10182479A (ja) | ペプチド誘導体類からなる薬剤 | |
| Lourens | The influence of immobilisation and peptide structure on the bioactivity of model antimicrobial peptides | |
| JPH07196688A (ja) | 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途 | |
| JP2011020926A (ja) | 修飾ペプチド及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051115 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060116 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060207 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060410 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060502 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060525 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090602 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100602 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100602 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110602 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110602 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120602 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120602 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130602 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |