KR101046426B1 - 항균 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

Abstract

　 본 발명은 하기 화학식 I 로 표현되는 신규한 항균 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 본 발명에 따른 펩타이드는 박테리아와 진균을 포함하여 폭넓은 범위의 미생물에 대하여 강력한 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
　[화학식 I]
X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁
(단, X₁ 은 아르기닌 또는 라이신이고;
X₂ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;
X₃ 은 아르기닌 또는 라이신이고;
X₄ 는 글루탐산, 아스파트산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;
X₅ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;
X₆ 은 세린, 트립토판 또는 타이로신이고;
X₇ 은 아르기닌 또는 라이신이고;
X₈ 은 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 중 하나의 아미노산이고;
X₉ 는 페닐알라닌이고;
X₁₀ 은 메티오닌, 노루이신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;
X₁₁ 은 아르기닌 또는 라이신이다.)

Description

항균 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물{Novel Antifungal Peptides and Antifungal composition containing thereof}

본 발명은 하기 화학식 I 로 표현되는 신규한 항균 펩타이드 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 본 발명에 따른 펩타이드는 박테리아와 진균을 포함하여 폭넓은 범위의 미생물에 대한 강력한 항균활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

[화학식 I]

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁

(단, X₁ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₂ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₃ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₄ 는 글루탐산, 아스파트산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₅ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₆ 은 세린, 트립토판 또는 타이로신이고;

X₇ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₈ 은 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 중 하나의 아미노산이고;

X₉ 는 페닐알라닌이고;

X₁₀ 은 메티오닌, 노루이신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₁₁ 은 아르기닌 또는 라이신이다.)

미생물 침입에 대한 누에 에벌레의 방어기작에 세크로핀으로 불리우는 펩타이드의 항균 작용이 관여된다는 것이 밝혀지면서, 생리활성 물질로서 펩타이드에 대한 관심이 크게 증가되었다.

최근 수년간의 연구결과에 따르면, 누에 에벌레와 같은 곤충에서뿐만 아니라 거의 모든 고등생물에서도 본래의 면역체계 이외에 병원성 미생물에 대한 방어수단으로 항균 펩타이드를 체내에 축적하거나 분비하는 시스템을 가진 것으로 밝혀졌다.

현재까지 약 2,000 종 이상의 항균 펩타이드들이 발견되었으며, 이들은 공통적으로 17-24개의 아미노산으로 구성되어 있고, 현재까지 알려진 대표적인 항균 펩타이드로는 세크로핀 (cecropin), 머게이닌 (magainin), 봄비닌 (bombinin), 디펜신 (defensin), 타키플레신 (tachyplesin) 및 부포린 (buforin) 등이 있다.

대부분의 항균 펩타이드는 목적세포(target cell)에만 특이적으로 반응하여 사멸시키면서, 넓은 범위에서 활성 스펙트럼을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Park, C.B., Kim, M.S. and Kim, S.C. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 218:408-413).

또한, 이들 항균 펩타이드들은 그람 음성균, 그람 양성균, 곰팡이 등에 대한 항균 효능뿐만 아니라 원핵생물에 대한 항생효능을 가지며, 일부 펩타이드들은 항암 효능 및 항바이러스 효과도 있는 것으로 알려져 있다.

예를 들어 상기 펩타이드 항균제 중 머게이닌은 양서류 표피에서 분리된 23개의 아미노산 조성을 갖는 펩타이드 (Zasloff, M. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:5449-5453)로, 병원균에 대한 항균효능 뿐만 아니라 인체의 폐암 세포에도 항암작용을 하는 것으로 보고되었다.

이외에도 피부에서 발견된 펩타이드로서 디펜신(defensin)은 항균작용 뿐만 아니라 아토피 피부염에서의 면역조절기능 및 비타민 D를 매개하는 다양한 활성작용이 있으며, 피부에 존재하는 또 다른 펩타이드인 캐텔리시딘 (Cathelicidine)은 항균활성과 염증성 면역기능을 유도하여 주사(rosacea)와 같은 질환에 치료 효과를 나타냄이 최근 밝혀졌다 (Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Yamasaki K, Di Nardo A, Bardan A, Murakami M, Ohtake T, Coda A, Dorschner RA, Bonnart C, Descargues P, Hovnanian A, Morhenn VB, Gallo RL(2007) Nat Med Aug;13(8):975-80).

한편, 항균 펩타이드들은 발견된 종마다 그 아미노산 조성이 상이할지라도, 이들의 항균작용은 크게 (1) 균의 세포막 투과성을 증가시켜 막전위를 파괴하고 세포대사를 멈추게 하는 작용기작; 또는 (2) 균 세포내로 침투하여 DNA 또는 RNA와 결합하여 전사(transcription) 또는 번역(translation)을 억제하는 작용기작을 통해 일어난다는 것이 보고되고 있다.

이중 대부분의 항균 펩타이드들은 세포막 투과성의 변화를 유발하는 작용기작을 가지며, 세포투과를 통한 전사/번역의 억제를 일으키는 펩타이드들은 상대적으로 적다.

지금까지 알려진 세포내 침투가능한 항균 펩타이드는 (1) 양친매성 나선구조 (amphipathic helix), (2) 상기 나선구조를 안정화시키는 잔기들의 분포, (3) 염기성 잔기들의 분포, (4) 소수성 잔기들의 분포, (5) 전하를 띠는 잔기들과 나선구조의 쌍극자(dipole) 간의 상호작용, 및 (6) 반대 전하를 띠는 잔기들 간의 염다리(salt-bridge) 등의 구조적 특징을 가지고 있는 것이 알려져 있다.

한편, 항균 펩타이드들은 강력한 항균력 및 광범위한 항균 스펙트럼을 갖고, 외부 병원균에 대한 선택적인 항균작용을 가지면서도 인체에 대한 안전성이 우수하고; 일반 항생제와 달리 미생물의 내성 유발 가능성이 낮고, 글리코실레이션 (glycosylation)과 같은 펩타이드의 구조적 2차 변형(secondary modification)이 없어 유전자 조작을 통한 펩타이드의 높은 양산이 가능하며, 열, 산 또는 알칼리 등에 강한 이화학적 특성 등을 가지기 때문에 향후 제약 및 식품분야에서의 산업적 이용성이 매우 크다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들 또한 제약 및 식품분야에서 폭넓게 사용될 수 있는 펩타이드들에 관심을 갖고, 세균내로 침투하여 DNA/RNA 합성을 위한 전사/번역을 막는 펩타이드들의 구조적 특성을 갖는 신규한 펩타이드들에 대해 집중적인 연구를 진행하던 중, 본 발명에 따른 항균 펩타이드들이 광범위한 항균 스펙트럼을 가짐과 동시에 강력한 항균성능을 갖고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 광범위한 항균 스펙트럼을 가짐과 동시에 강력한 항균성능을 갖는 신규한 항균 펩타이드를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 항균 펩타이드를 포함하는 항균 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 신규한 항균 펩타이드를 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 항균 펩타이드들은 하기 화학식 I 로 표현되는 것을 특징으로 한다.

[화학식 I]

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁

(단, X₁ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₂ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₃ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₄ 는 글루탐산, 아스파트산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₅ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₆ 은 세린, 트립토판 또는 타이로신이고;

X₇ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₈ 은 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 중 하나의 아미노산이고;

X₉ 는 페닐알라닌이고;

X₁₀ 은 메티오닌, 노루이신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₁₁ 은 아르기닌 또는 라이신이다.)

본 발명에 따르면, N-말단은 아실화(acylation)되거나 되지 않을 수 있다. N-말단을 아실화시키는 경우는 친수성에 가까운 N-말단이 소수성 성질로 변화됨에 따라 생체내 존재하는 다양한 단백질 가수분해 효소(protease) 중 N-말단 부위를 인식하여 단백질 또는 펩타이드를 절단하는 효소에 분해되는 것을 억제하여 생체 내 안정성을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, C-말단은 카르복실산(CO₂H) 또는 아미드(CONH₂)일 수 있다. 펩타이드의 C-말단의 카르복실산 부분을 아미드기 형태로 변화시키는 경우, 펩타이드 또는 단백질의 C-말단을 인식하여 절단하는 단백질 가수분해 효소 (protease)에 의한 펩타이드의 절단을 억제할 수 있어 바람직하다. 즉, C-말단을 아미드기 형태로 치환하는 경우 단백질 가수분해 효소는 C-말단을 다른 아미노산과 결합된 형태로 인식하기 때문에 효소 반응이 일어나지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 항균 조성물은 상기 화학식 I로 표현되는 항균 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 0.000001 내지 2 중량% 함유할 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 종래의 항균 펩타이드와 비교하여 광범위한 균종에 대하여 강력한 항균 스펙트럼을 가지며, 종래의 항균 펩타이드 보다 독성이 적거나 없는 것을 특징으로 한다.

본원 명세서에서 사용된 용어 '항균 펩타이드'는 특별한 언급이 없는 한 바이러스, 그람 양성균 및 그람 음성균을 포함하는 박테리아, 진균, 곰팡이(fungus), 원핵생물 등으로부터 선택된 유해 미생물 중 어느 하나 이상에 대하여 그들의 사멸 또는 증식억제를 수행할 수 있는 펩타이드를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 여드름 예방 또는 치료용 조성물은 상기 화학식 I로 표현되는 항균 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 0.000001 ~ 2.0 % 중량 함유할 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 여드름 예방 또는 치료용 조성물에 함유되는 상기 화학식 I로 표현되는 항균 펩타이드는 여드름 발생에 직접적으로 관여하는 여드름균 (P.acne)에 대한 강력한 항균 활성을 나타낸다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 세균내로 침투하여 DNA/RNA 합성을 위한 전사/번역을 막는 펩타이들의 구조적 특성을 가져서, 그람양성균, 그람음성균 및 여드름균 등에 대하여 강력한 항균 활성 및 항균 스펙트럼을 나타내므로, 본 발명에 따른 항균 펩타이드들은 항균 조성물 및 여드름 예방 또는 치료용 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.

도 1 은 본 발명에 따른 펩타이드 (화합물 01) 의 광범위한 항균 스펙트럼 및 강력한 항균활성을 보여주는 도면이다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 균 세포내로 침투하여 작용하는 펩타이드의 메커니즘에 착안하여 아미노산 서열이 결정되었으며, 보다 구체적으로 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 비교적 보존적인 일정한 서열을 갖는 중심단편과 상기 중심단편의 N-말단과 C-말단 쪽에 염기성 아미노산(basic amino acid)과 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)이 번갈아 위치하도록 펩타이드 단편을 구성함으로써, 전체 펩타이드의 이차구조가 안정화되도록 하였다.

구체적으로, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 하기의 화학식 I의 구조를 갖는다.

[화학식 I]

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁

(단, X₁ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₂ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₃ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₄ 는 글루탐산, 아스파트산, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₅ 는 트립토판 또는 히스티딘이고;

X₆ 은 세린, 트립토판 또는 타이로신이고;

X₇ 은 아르기닌 또는 라이신이고;

X₈ 은 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 중 하나의 아미노산이고;

X₉ 는 페닐알라닌이고;

X₁₀ 은 메티오닌, 노루이신 및 시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고;

X₁₁ 은 아르기닌 또는 라이신이다.)

예를 들면, 화학식 I의 화합물은 하기의 서열을 가질 수 있으나, 이는 예시적인 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 국한되는 것은 아니다.

RWRDWSRNFMR

RWRDWYRNFMR

RWRRWYRRFMR

RWRRWWRRFMR

Ac-RWRKWYRKFMR-NH₂

Ac-KWKRWYKRFMK-NH₂

Ac-KWKKWYKKFMK-NH₂

Ac-RWRHWYRHFMR-NH₂

Ac-RWRRWYRRF(Nle)R-NH₂

Ac-RWRRWYRRFCR-NH₂

Ac-RWRRWYRKFCR-NH₂

Ac-RHRRHYRRFMR-NH₂

Ac-KHKKHYKKFMK-NH₂

상기 펩타이드의 아미노산 서열에서, N-말단의 Ac- 는 아실 치환된 N-말단을 의미하며, C-말단의 -NH₂ 는 C-말단이 아미드로 치환된 CONH₂ 인 것을 의미한다.

상기 펩타이드는 유사한 항균 성능 및 펩타이드의 안정성을 크게 저하시키지 않는 범위에서 아미노산의 삽입, 치환, 삭제가 가능하며, 이 또한 본 발명의 범주내이다.

또한, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 펩타이드의 세포내 이동을 촉진하는 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 펩타이드에는 TAT 펩타이드 (RKKRRYRRR) 및 Tat-PTD 펩타이드(GRKKRRQRRR: Tat PTD)일 수 있으나, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 세포 투과성 펩타이드가 본 발명에 따른 펩타이드의 항균 활성을 저해하지 않는 범위내의 것이라면, 본 발명의 범위내이다.

한편, 본 발명의 펩타이드는 염의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용 가능한 염의 형태는 화합물의 최종 분리 및 정제 동안 또는 아미노기를 적절한 산과 반응시키는 것에 의해 만들어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 산 부가염으로 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 산 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산일 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 폭넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있어, 항균 조성물에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 여드름 발생 및 병변 악화에 직접적인 관계를 가진 것으로 알려진 프로피니박테리움 아크네스(P.acnes)에 대해서 우수한 항균 성능을 나타내어 여드름 예방 또는 치료제 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있음이 본 발명자들에 의해서 확인되었다.

여드름은 피지가 많이 분비되는 부위, 특히 모공에서 생기기 쉬운 질환으로, 모공 속에 피지나 각질이 모여 모공을 막으면서 혐기성 조건이 형성되면, 여드름균인 프로피니박테리움 아크네스가 피지를 이용하여 모공에서 증식하면서 피부 안에 염증을 일으키는 단백질을 자극하여 여드름이 발생하는 것으로 알려져 있다.

여드름 치료에는 얼굴 등을 깨끗이 세안하여 피지나 각질이 모여 모공을 막지 않도록 함으로써 프로피니박테리움 아크네스가 증식하지 못하는 방법이 일반적이지만, 그 증상이 심할 경우에는 프로피니박테리움 아크네스에 대한 항균성능을 나타내는 약물을 직접 처방하여 치료한다. 그러나, 이러한 약물은 독성을 가지고 있기 때문에, 일정 기간 동안 제한된 양만을 처방하도록 되어 있다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 자극이 덜할 뿐만 아니라, 부작용도 거의 없기 때문에, 여드름 치료제 조성물에 적용할 경우 많은 이점을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항균 조성물은 상기 화학식 I 로 표현되는 서열을 갖는 펩타이드를 1종 혹은 2종 이상 포함할 수 있고, 본 발명에 따른 펩타이드의 항균 효능을 방해하지 않는 범위내에서 기존에 알려진 항균제를 추가로 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 여드름 예방 또는 치료용 조성물은 상기 화학식 I 로 표현되는 서열을 갖는 펩타이드를 1종 혹은 2종 이상 포함할 수 있고, 본 발명에 따른 펩타이드의 여드름 예방 또는 치료 효능을 방해하지 않는 범위내에서 기존에 알려진 여드름 치료제를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 신규 항균 펩타이드 화합물의 안정화, 제제화 또는 생체내 전달을 위하여 당업계에 알려진 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 펩타이드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다.　예를 들어, 지질 화합물에는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일 올레일포스파티딜글리세롤(POPG), 포스파티딜글리세롤(PG), C18 포화 지방산, C16 불포화 지방산, C18 불포화 지방산 등이 있다.　

본 발명의 신규 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태일 수 있다.　비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고; 경구 투여 제제에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 포함할 수 있고; 주사제에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 포함할 수 있고; 국소 투여 제제에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 포함할 수 있다.　

본 발명에 따른 조성물의 약제학적 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며,　예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

적절한 투여 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여된다.　복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.　그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다.　또한, 본 발명에 따른 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.　바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 증식을 억제하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 약학적으로 유효량으로 투여한다. 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

예를 들면 본 발명에 따른 항균 펩타이드의 생체 투여용량은 항균 혹은 여드름 치료 성능을 나타내기 위한 정도이면 제한되지 않으며, 당업자라면 목적하는 효과를 나타내기 위한 투여분량을 적의선정할 수 있다.

한편, 본 발명에 따르면, 본 발명의 항균 펩타이드는 인간뿐만 아니라 유사한 생체면역반응을 보일 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드는 당업계에 공지된 펩타이드 합성 기술, 예를 들어 고체상 및 용액상 합성 기술 등에 의해 합성될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성을 위한 기술은 문헌 [J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (1963) W.H. Freeman Co. (San Francisco); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, (1973) vol. 2, p. 46, Academic Press (New York)] 등을 참조할 수 있다. 또한, 통상적인 용액 합성에 대한 기술은 문헌 [G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, (1965) vol. 1, Academic Press (New York)]을 참조할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에서는 펩타이드의 합성 방법으로 고체상에 일정하게 결합된 아미노산 골격에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 연속적으로 아미드 결합을 형성하는 방식으로 제조하였으나, 본 발명이 이에 한정되지 않는다는 것은 자명하다.

일반적으로, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카복실기는 적합한 보호기에 의해 보호될 수 있다. 보호된 아미노산은 고체 지지체에 부착되거나 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용액중에서 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 보호기는 적합한 보호기로 보호된 아미노산을 첨가하기 이전에 완전히 제거된다. 모든 아미노산이 목적하는 바에 따라 연결된 후, 유리된 잔류 보호기 및 유리된 고형 지지체로부터 연속적으로 또는 동시에 분리하여 최종 목적하는 펩타이드를 얻는다.

본 발명에서는 일반적으로 키랄 센터가 라세미화되지 않는 조건하에서 적합하게 보호된 테트라펩타이드를 적절하게 보호된 또 다른 디펩타이드와 축합시켜 아미드결합을 형성시킨 후 탈보호하여 목적하는 헥사펩타이드를 합성하여 얻는 절편 축합반응 기술을 또한 이용할 수 있다.

본 발명의 펩타이드 화합물을 제조하기 위한 가장 바람직한 합성 방법으로는 고체상 폴리머 지지체를 이용하여 합성하는 고체상 펩타이드 합성 방법이며 특히 α-아미노기는 산 또는 염기 민감성 작용기에 의해 보호된다. 보호기는 펩타이드 축합 반응 조건에서 안정한 성질을 가져야만 하고 연장되는 펩타이드 사슬의 파괴 없이 또는 거기에 함유된 임의의 키랄 센터의 라세미체화 없이 용이하게 제거 가능한 성질을 가져야만 한다. 이와 같이 적합한 보호기들로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), t -부톡시카보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (α,α)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카보닐 등일 수 있으며, 이러한 목적으로 당업계에 알려진 적합한 다른 보호기들 또한 본 발명의 범위내이다.

본 발명에 따른 항균 펩타이드 합성에서 가장 바람직한 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 (Fmoc) 보호기이며, 대부분 Fmoc 보호기로 보호된 아미노산을 합성 원료로 이용하는 것이 바람직하다.

특히, 본 발명의 펩타이드 합성에서 사용되는 아미노산 잔기의 보호기로는 아르기닌의 경우 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 및 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-S-설포닐(Pbf)이고; 아스파라긴의 경우, 트리틸(Trt)이고; 아스파트산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 글루타민의 경우, 트리틸(Trt)이고; N-메틸글루타민산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 히스티딘의 경우, 트리틸(Trt)이고; 라이신의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 세린의 경우, 7t-부틸(t-Bu)이고; 트레오닌 및 알로트레오닌의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 트립토판의 경우, t -부톡시카보닐(Boc)이고; 티로신의 경우, t-부틸(t-Bu)인 것이 바람직하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

고체상 펩타이드 합성 방법에서, C-말단 아미노산은 적합한 고형 지지체 또는 수지에 부착된다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고형 지지체로는 단계적 축합-탈보호 반응의 시약 및 반응 조건에 불활성이고 사용되는 매질에 불용성인 물질이 바람직하며, 예를 들면 링크 아미드(rink amid) 또는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지(rink amid MBHA resin)일 수 있다. 특히, C-말단 아미드 펩타이드에 대해 바람직한 고형 지지체는 Novabiochem Corporation 로부터 시판되는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지일 수 있다.

C-말단 아미드(amide)는 디클로로메탄, N-메틸피리돈(NMP) 또는 DMF과 같은 용매중에서 10℃ 내지 50 ℃의 온도에서, 바람직하게는 30 ℃의 온도조건에서, 약 1 내지 24 시간 동안 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), N-메틸모르폴린 (NMM), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀클로라이드(BOPCI)의 존재 또는 부재하에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미(DIC), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루로포스페이트](HATU) 또는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU)에 카르복실 산을 활성화시켜 축합을 통해 수지 또는 고체상 지지체에 커플링된다.

고형 지지체가 rink amide MBHA 수지인 경우, 바람직한 보호기로서 Fmoc 작용기는 C-말단 아미노산으로 커플링하기 전에 2급 아민 용액, 바람직하게는 20%의 피페리딘 DMF 용액을 과량 사용하여 절단한다. 상기 탈보호된 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도에틸 수지에 목적하는 제1 아미노산을 축합시키는데 사용되는 바람직한 시약들로는 적합하게 보호된 제1 아미노산 (1당량)에 대하여 DMF 용매중에서 N-메틸모르폴린(NMM, 1당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt, 1당량) 및 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트] (HATU, 1당량), O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU, 1당량), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)과 같은 축합 반응 시약들이다.

본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려져 있는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동으로 직접 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 작용기로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 피페리딘으로 처리하여 탈보호시킨 후, 과량의 용매로 세척하고 커플링을 원하는 또 다른 각각의 보호된 아미노산을 이어서 약 5배 몰 과량 첨가하여 바람직하게는 DMF 용매 중에서 반응을 수행한다.

본 발명에서 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호기들을 탈보호시킨다. 수지로부터 펩타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈보호 조건으로는 일반적으로 수지-펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 티오아니졸, 물 또는 에탄디티올 (EDT)등으로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 상기 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 티오아니졸, 물 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻는다.

완전히 탈보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매를 흘리고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제한다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조 시켜 완전히 농축 건조 시킴으로써 고형의 펩타이드를 얻는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

하기 실시예 및 명세서 전반에서 약어 및 표기어는 다음과 같은 의미를 가진다.

명세서 전반에 걸쳐 기재된 펩타이드내 아미노산 및 아미노아실 잔기의 α-탄소의 입체화학은 'L' 혹은 'D' 형상일 수 있다. 카흔-인골드-프레로그 'R' 및 'S' 명명을 사용하여 본 발명의 펩타이드의 N-말단에서 특정 아실 치환체내 키랄 센터의 입체화학을 표기할 수 있다.

'R, S'의 명명은 2개의 에난티오머 형태의 라세믹 혼합물을 지칭한다. 당해 명명법은 문헌 [R.S. Cahn, et al., Angew.Chem. Int. Ed. Engl., (1966) 5, 385-415 ]에 기재된 명명에 따른다.

모든 펩타이드 서열은 α-N-말단 아미노산 잔기를 좌측에 α-C-말단을 우측상에 기재하는 일반적으로 허용되는 협약에 따라 기재되었다.

본원에 사용된 바와 같이, 'α-N-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-아미노기를 언급하고, 용어 'α-C-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-카복실산 말단을 언급한다. 대부분, 본원에 사용되는 천연적으로 존재하고 비천연적으로 존재하는 아미노아실 잔기에 대한 명명은 유기화학의 명명에 대한 IUPAC 위원회 및 문헌 ['Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)' Biochemistry, (1975) 14(2)]에 제시된 바와 같은 생화학 명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회에 의해 제안된 명명법 협약에 따른다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산의 명명 및 약어는 아래와 같이 표기한다.

Ala, A: 알라닌; Arg, R: 아르기닌; Asn, N: 아스파라긴; Asp, D: 아스파트산; Cys, C: 시스테인; Glu, E: 글루탐산; Gln, Q: 글루타민; Gly, G: 글리신; His, H: 히스티딘; Ile, I: 이소루이신; Leu, L: 루이신; Lys, K: 라이신; Met, M: 메티오닌; Nle: 노오루이신; Phe, F: 페닐알라닌; Pro, P: 프롤린; Ser, S: 세린; Thr, T: 트레오닌; Trp, W: 트립토판; Tyr, Y: 티로신; Val, V: 발린.

DMF: N,N-디메틸포름아미드; DCC: N,N'-디사이클로헥실카보디이미드; DIC: N,N'-디이소프로필카보디이미드; DIEA: 디이소프로필에틸아민; EDT: 에틸 디티올; HOBt: 1-하이드록시벤조 트리아졸; HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N',-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트; MC: 디클로로메탄; NMM: N-메틸모르폴린 NMP: N-메틸피리돈; TIS: 트리이소프로필실란 및 TFA: 트리플루오로아세트산.

위에서 약어로서 표기되지 않은 경우, 명명법 및 약어는 문헌[Calbiochem-Novabiochem Corp. 1999 Catalog and Peptide Synthesis Handbook or the Chem-Impex International, Inc. Tools for Peptide amp; Solid Phase Synthesis 1998-1999 Catalogue]을 참조할 수 있다.

[실시예]

<실시예 1 : 화합물 01 내지 12 의 합성>

화합물 01: RWRDW SRNFMR

Novabiochem corporation으로부터 구입한 트리틸 클로라이드 (Trt) 수지 (g당 0.6 mmol이 로딩된 수지)을 50 mg(0.03 mmol) 측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 스웰링(swelling)시켰다.

Fmoc-Arg(Pbf) (97 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 8 시간 정도 진동교반시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 20% 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 진동교반시키고 피페리딘 용액을 제거한 후, 다시 20% 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem.(1970) 34, 595]를 실시하여 확인하였다.

다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:

(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.

Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (2) Fmoc-Met , 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Phe , 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Asn(Trt) , 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Arg(Pbf) , 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Ser(t-Bu) , 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Trp(Boc) , 2 시간 커플링; (8) Fmoc-Asp(Trt) , 2 시간 커플링; (9) Fmoc-Arg(Pbf) , 2 시간 커플링; (10) Fmoc-Trp(Boc) , 2 시간 커플링; (11) Fmoc-Arg(Pbf) , 2 시간 커플링; 20% 피페리딘 DMF 용액을 처리시켰다.

합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 수지를 3시간 동안 TFA/티오아니졸/EDT/TIS/ 물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하므로써 침전물을 생성시켰다. 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.

얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 RWRDWSRNFMR 을 얻었다.

화합물 01: RWRDWSRNFMR : Rt=11.43 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1453.

상기와 화합물 01과 아미노산 잔기의 종류를 달리한 것을 제외하고는 동일한 제조 과정을 이용하여 화합물 02 내지 04 의 펩타이드를 제조하였다.

화합물 02: RWRDWYRNFMR : Rt=18.63 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1685.

화합물 03: RWRRWYRRFMR : Rt=17.48 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1769.

화합물 04: RWRRWWRRFMR : Rt=18.25 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1792.

화합물 05: Ac-RWRKWYRKFMR-NH₂ 의 합성

Novabiochem corporation으로부터 구입한 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지)을 50 mg(0.03 mmol) 측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 스웰링시켰다. 스웰링(Swelling)된 수지에 20% 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 진동교반시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20% 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem.(1970) 34, 595]를 실시하여 확인하였다. 그런 다음, 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:

(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척하였다. 이어서, 상기 화합물 01~04 합성 방법에 준하여 펩타이드 화합물 05를 합성하였다.

화합물 05: Ac-RWRKWYRKFMR-NH₂: Rt=19.21 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1712.

상기와 화합물 05과 아미노산 잔기의 종류를 달리한 것을 제외하고는 동일한 제조 과정을 이용하여 화합물 06 내지 13 의 펩타이드를 제조하였다.

화합물 06: Ac-KWKRWYKRFMK-NH₂: Rt=17.55 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1656.

화합물 07: Ac-KWKKWYKKFMK-NH₂: Rt=17.29 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1600.

화합물 08: Ac-RWRHWYRHFMR-NH₂: Rt=18.63 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1730.

화합물 09: Ac-RWRRWYRRF(Nle)R-NH₂: Rt=17.50 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1736.

화합물 10: Ac-RWRRWYRRFCR-NH₂: Rt=18.14 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1739.

화합물 11: Ac-RWRRWYRKFCR-NH₂: Rt=18.77 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1755.

화합물 12: Ac-RHRRHYRRFMR-NH₂: Rt=18.04 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1670.

화합물 13: Ac-KHKKHYKKFMK-NH2: Rt=19.02 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1502.

<실시예 2: 화합물 01 의 펩타이드 및 유도체의 항균 활성 측정>

표준균주 스트렙토코커스 아우레스 (Staphylococcus aureus, ATCC 29213); E.coli (Escherichia coli) O157; 스트렙코코커스 피오젠스 (Streptococcus pyogens, ATCC 19615); 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans, Ingbritt); 프로피니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, ATCC 11828) 에 대해 사용농도 0, 1, 10 및 100 μg/ml의 화합물 01 의 항균 펩타이드를 정제수에 2 mg/ml이 되도록 녹여서 준비 (4℃ 보관)하였다. 각 균주액 2 ml씩 준비 (16 웰에 첨가): BHI 배양액(broth)에 하룻밤 동안 호기 진탕배양한 S. aureus 및 E. coli; BHI 배양액(broth)에 24 시간 호기 정치배양한 S. pyogens; M17 배양액(broth)에 하루밤 동안 호기 정치배양한 S. mutans; 및 액티노마이세스 배양액(Actinomyces broth)에 24시간 혐기배양한 P.acnes를 OD 600=0.5 (~5x10⁸/ml)로 맞춘 후 다시 100배 (~5x10⁶/ml) 및 10배씩 (~5x10⁷/ml: S. mutans, S. pyogens, P. acnes) 희석하였다.

펩타이드 시료는 최종농도 0, 1, 10, 100 μg/ml이 되도록 0.1 ml로 맞추어 96 웰 플레이트에 균액 0.1 ml와 함께 섞었다. 균 접종하지 않은 개별배양액으로 대조군을 삼고 균주에 따라 혐기성 혹은 호기성 배양은 24시간 수행하고 ELISA 판독기로 OD600에서 측정한 결과는 하기 도 1에서 보는 바와 같다.

도 1 에서 보는 바와 같이, 광범위한 항균 스펙트럼 및 강력항 항균활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

<실시예 3: 화합물 01 내지 13의 펩타이드 및 유도체의 항균 활성 측정>

실시예 1에서 제조된 화합물 01 내지 13에 대한 항균 활성을 96-웰 마이크로다이루션 최소저해농도 측정법(minimal inhibitory concentration assay)으로 측정하였다.

스트렙토코커스 아루레스(Staphylococcus aureus, ATCC 29213), Escherichia coli O157 및 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes, ATCC 11828)을 각각 BHI 배양액 및 M17 배양액에서 하룻밤 동안 배양한 후, 이들을 새 배지에 접종하여 2시간 더 배양하여 균주들이 대수기가 되도록 하였다.이들을 1 ml 당 10⁵ 균주가 되도록 희석한 후 96-웰 플레이트에 190 ㎕씩 접종하고, 순차적으로 희석되어 있는 실시예 1에서 제조된 화합물 01 내지 13의 펩타이드를 각 웰에 10 ㎕씩 처리하였다. 96-웰 플레이트를 12시간 배양하여 각 웰의 흡광도를 측정하여 균주가 전혀 자라지 못하게 하는 최소농도를 최소저해농도로 정하였다. 그 결과는 하기 표 1 에서 보는 바와 같다.

펩타이드 화합물	Staphylococcus aureus (MIC농도, uM)	Escherichia coli	Propionibacterium acnes
화합물 1	128	64	32
화합물 2	256	128	64
화합물 3	256	256	128
화합물 4	256	256	128
화합물 5	128	64	32
화합물 6	256	128	64
화합물 7	128	128	64
화합물 8	128	64	64
화합물 9	256	128	32
화합물 10	256	256	64
화합물 11	128	32	16
화합물 12	256	256	64
화합물 13	128	64	32

상기한 바와 같이 본 발명에 따른 항균 펩타이드들은 매우 우수한 항균 성능을 나타냄을 알 수 있다.

Claims (8)

1. RWRDWSRNFMR, RWRDWYRNFMR, RWRRWYRRFMR, RWRRWWRRFMR, RWRKWYRKFMR, KWKRWYKRFMK, KWKKWYKKFMK, RWRHWYRHFMR, RWRRWYRRF(Nle)R, RWRRWYRRFCR, RWRRWYRKFCR, RHRRHYRRFMR, KHKKHYKKFMK, Ac-RWRKWYRKFMR-NH₂, Ac-KWKRWYKRFMK-NH₂, Ac-KWKKWYKKFMK-NH₂, Ac-RWRHWYRHFMR-NH₂, Ac-RWRRWYRRF(Nle)R-NH₂, Ac-RWRRWYRRFCR-NH₂, Ac-RWRRWYRKFCR-NH₂, Ac-RHRRHYRRFMR-NH₂, Ac-KHKKHYKKFMK-NH₂로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, 상기 Ac 는 아세틸, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐, 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (a,a)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페닐, 3-시아노-t-부톡시옥시카보닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
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7. 제 1 항에 따른 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
8. 제 1 항에 따른 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 여드름 예방 또는 치료용 조성물.
   
   

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