KR101036054B1 - 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법 - Google Patents

단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분리 정제방법은 (1) 단백질 폴리펩티드를 지방산 염화물과 아실화 반응시켜 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 제조하는 단계; (2) 상기 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 가수분해하는 단계; (3) 상기 가수분해물을 산 정제하여 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와 아실화되지 않은 아미노산류 및 펩티드류를 분리하는 단계; 및 (4) 상기 아실화되지 않은 아미노산류와 펩티드류를 아실화하고 산 정제하여 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류와 아실 리포펩티드류를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 분리 정제방법에 의하면, 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 자유롭게 선택 도입된 알칼리 지배적인 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 자유롭게 선택 도입된 산성 지배적인 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류로 분리할 수 있다. 따라서 이들 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류의 다양한 구조에 따른 기능성과 효과가 기대된다.

Description

단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법 {Method for selectively separating acyl lipoamino acids and lipopeptides derived from protein polypeptide}
본 발명은 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 선택적으로 분리 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백질 폴리펩티드의 측쇄와 N-말단 아미노기에 지방산기를 도입하는 아실화, 가수분해와 정제 단계를 거쳐 말단 N-위치에 NH2가 존재하면서 측쇄-NH2에는 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와, N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 합성 및 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
폴리펩티드는 2 이상의 아미노산이 사슬 모양의 펩티드 결합에 의해 길게 서로 연결되어 단백질보다는 작은 크기와 구조를 갖는 것을 말한다. 대표적 종류에는 천연 폴리펩티드(예를 들면 인슐린), 단백질을 프로테아제로 분해해서 이루어지는 폴리펩티드, 아미노산을 화학적으로 중합한 폴리펩티드 등이 있다.
콜라겐은 단백질 중에서 인체에 가장 많이 존재하는 것으로, 포유동물의 전 단백질의 1/3을 점유하고 있으며 피부, 뼈, 힘줄, 혈관, 각막 등의 결합조직의 주된 단백질이므로 동물의 몸을 유지하며 지탱, 외부로부터 생체를 보호, 근육의 신축성을 뼈에 전달, 각종 생체 세포를 지탱하는 기질로서 역할, 생명현상에 필요한 여러 세포의 분화에 관계 및 출혈 때에 혈소판 응집반응을 일으켜 지혈작용을 하는 등 여러 가지 생물학적 역할을 수행하고 있다. 분자의 길이는 3000Å이며, 두께는 15Å의 봉상 분자이나 생체 내에서는 분자가 흩어져서 존재하기 때문에 섬유구조를 형성하고 있다. 그리고 동물성 단백질인 콜라겐은 피부에 대한 친화성이 높고 수분함량의 하이드로겔(hydrogel) 생성, 상처 치유 촉진 작용, 저항원성 등의 성질을 이용하여 화장품 원료를 비롯하여 인공피부, 인공혈관, 지혈제, 콘텍트 렌즈, 세포배양의 기질 등에 많은 응용연구가 되고 있다. 동물계에 존재하는 콜라겐은 일부가 가용성 콜라겐이고, 대부분은 불용성 콜라겐이다. 이 불용성 콜라겐을 단분자의 콜라겐 분자까지 용해시키면 다량으로 얻을 수 있으며 경제적이기 때문에 각종 새로운 제품이 개발되고 있다[참고문헌: "고급 지방산 N-아실 콜라겐 유도체의 합성 및 계면활성", 한국유화학회지 10권 2호 1993년].
콜라겐의 분자구조는 아미노산 약 1,000개가 결합된 사슬 세 가닥으로 이루어져 있고, 각 사슬은 나선구조를 가지며 서로 감겨서 복합 나선을 형성하고 있다. 폴리펩티드는 세 번 마다글리신이 반복되는 반복서열로 구성되어 있으며, 글리신 외에 주요 아미노산으로는 프롤린, 히드록시프롤린이 있으며, 상기 세 가지 아미노산들로 이루어진 Gly-Pro-Hyp가 콜라겐을 대표하는 구성 펩티드로 알려져 있다. 특히 콜라겐에는 다른 단백질에 존재하지 않는 히드록시프롤린의 함량이 높은 것이 특징이다.
콜라겐을 단백질 분해 효소로 분해하여 분자량 1,000-20,000 정도로 분해한 것을 수용성 콜라겐 또는 가수분해 콜라겐이라 부른다. 친수부가 분자량 400 정도인 가수분해 콜라겐을 야자유 지방산 등으로 아실화시키면 가수분해 콜라겐의 Na, K 염은 음이온성 계면활성제와 같은 정도의 표면 장력 저하능을 가지며 안료에 대한 분산력도 있다. 이러한 가수분해 콜라겐, 아실화 가수분해 콜라겐은 주로 화장품 원료 등으로 사용되고 있다.
아미노산은 아미노기와 카르복실기를 함께 갖고 있는 화합물로 단백질이나 효소 등의 구성성분으로 생체 내에서 없어서는 안 되는 화합물이다. 공업적인 응용이란 관점에서 보면 최근에는 그 제조 기술의 진보에 따라 저렴한 아미노산류를 얻을 수 있어 여러 관능기, 광학활성 및 다양한 기능을 살린 기능성 재료를 개발하려는데 주목적이 있다. 그 중 아미노산계 계면활성제는 최근 활발한 연구개발에 따라 화장품 분야를 비롯한 여러 산업분야에서 점차 그 특징있는 성질이 발견되고 있으며 새로운 기능성 재료로서 그 종류와 용도도 다양해지고 있다.
아미노산을 이용한 유기합성의 일례로서 아미노산계 계면활성제는 소수성부로서 고급 지방산과 친수성부로서 단백질의 구성 성분인 여러 종류의 아미노산이 결합된 형태이다.
대한민국공개특허공보 제10-2010-0031862호에는 합성 펩티드 유도체로서, 히드록시프롤린, 프롤린과 글리신을 3회 연속적으로 결합시키고 여기에 소수성의 팔미토일기를 도입하여 친수-친유 구조를 갖는 팔미토일트리펩티드 화합물이 기재되어 있다.
종래기술에 의해 콜라겐을 가수분해하여 아실화하거나 여러 가지 천연 펩티드를 아실화한 제품들이 화장품의 기능성 원료 또는 계면활성제 등으로 활용되고 있다. 기존의 리포아미노산류와 리포펩티드류는 이미 존재하거나 가수분해 등으로 만들어져 구성된 아미노산과 펩티드에 존재하는 말단과 측쇄의 아미노기(NH2)에 아실화를 시킨 물질이다. 하나의 반응에서 지방산은 아미노산 또는 펩티드의 말단과 측쇄의 NH2에 동일하게 결합될 수밖에 없다. 또한 보호기로 특정 위치의 NH2를 보호한 다음 지방산을 결합시키고, 탈보호한 후, 나머지 NH2에 다른 지방산을 결합시켜 리포아미노산이나 리포펩티드를 제조할 수도 있다(참고문헌: 대한민국공개특허공보 제10-2006-0125676호, 제10-2005-0012717호).
특히 펩티드는 피부자극의 부작용이 비교적 적으면서 피부 재생을 활성화시킬 수 있는 장점이 있으며, 현재 주름 개선용 화장품에 사용되는 펩티드 유도체들로는 Palm-Gly-His-Lys와 같은 트리펩티드 유도체, Palm-Gly-Gln-Pro-Arg와 같은 테트라펩티드 유도체, 펜타펩티드 및 헥사펩티드 등이 알려져 있다. 이러한 펩티드 유도체를 활성 성분으로 포함하는 화장용 조성물로 이루어진 화장품이 일부 시판되고 있다.
여러 가지 합성 펩티드가 개발되고 있는 시점에서 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 다양한 구조의 리포아미노산류와 리포펩티드류를 대량으로 생산할 수 있는 방법과 이들을 후속 반응시켜 새로운 리포아미노산과 리포펩티드류의 구조를 개발하려는 요구가 꾸준히 있어 왔다.
본 발명의 목적은 종래기술에 따라 단순히 단백질 폴리펩티드를 가수분해하여 아실화시키거나 천연 또는 합성 펩티드에 지방산기를 도입하여 펩티드 유도체를 제조하여 화장품 등에서 계면활성제 용도로 사용하던 것에서 벗어나 단백질 폴리펩티드의 측쇄 자유 라디칼 -NH2 및 N-말단 NH2 위치에 지방산을 자유롭게 선택하여 반응시키고 가수분해를 거쳐 정제함으로써 단백질의 구성 아미노산 종류에 따른 다양한 아실 리포아미노산류와 아실 리포펩티드류를 제조하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 분리 정제하는 방법이 제공된다:
(1) 단백질 폴리펩티드를 지방산 염화물과 아실화 반응시켜 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 제조하는 단계;
(2) 상기 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 가수분해하는 단계;
(3) 상기 가수분해물을 산 정제하여 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와 아실화되지 않은 아미노산류 및 펩티드류를 분리하는 단계; 및
(4) 상기 아실화되지 않은 아미노산류와 펩티드류를 아실화하고 산 정제하여 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류와 아실 리포펩티드류를 제조하는 단계.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 단백질 폴리펩티드는 돈피 또는 우피로부터 유래된 콜라겐 펩티드인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 지방산 염화물은 탄소수 1-20개의 지방족 또는 방향족 지방산 염화물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 가수분해는 효소 처리에 의해 실시되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류는 NH2-팔미토일-라이신, NH2-라우로일-라이신, NH2-팔미토일-아르기닌, NH2-라우로일-아르기닌, NH2-팔미토일-히스티딘 및 NH2-라우로일-히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포펩티드류는 NH2-라이실(팔미토일)-글리신, NH2-라이실(라우로일)-글리신, NH2-아르기닐(팔미토일)-글리신, NH2-아르기닐(라우로일)-글리신, NH2-히스티딘일(팔미토일)-글리신, NH2-히스티딘일(라우로일)-글리신, N-라우로일-글리실-아르기닐(라우로일)-세린, N-팔미토일글리실-아르기닐(팔미토일)-세린, N-라우로일알기닐라우로일-글리실-세린, N-라우로일글리실-세린-메티오닌, N-팔미토일알기닐팔미토일-글리실-세린 및 N-팔미토일글리실-세린-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시형태에 있어서, 상기 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류는 산성 아미노산 지배적인, 즉 염기성 아미노산 보다 산성 아미노산이 더 많이 포함된 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 분리 정제방법에 의하면, 단백질 폴리펩티드를 아실화한 N-아실 리포폴리펩티드를 가수분해한 후 산 정제하여 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 자유롭게 선택 도입된 알칼리 지배적인 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류, 및 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 자유롭게 선택 도입된 산성 지배적인 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류로 분리할 수 있다. 따라서 이들 리포아미노산류와 리포펩티드류의 다양한 구조에 따른 기능성과 효과가 기대된다.
또한 가수분해 조건에 따라 리포아미노산류와 리포펩티드류의 아미노산 배열구조 및 크기를 다양화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 분리 정제방법을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 우피 콜라겐을 팔미트산 염산염으로 아실화한 N-아실 리포폴리펩티드의 IR 흡수 스펙트럼이다.
도 3은 도 2의 N-아실 리포폴리펩티드를 가수분해, 정제하여 얻은 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류의 IR 흡수 스펙트럼이다.
도 4는 팔미트산 아미노산과 펩티드 에틸에스테르 IR 흡수 스펙트럼이다.
도 1은 본 발명의 분리 정제방법을 도식적으로 나타낸 도면으로, 단백질 폴리펩티드와 지방산 염화물의 아실화 반응, 가수분해 및 정제 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 분리 정제방법에 대한 전체 반응 메커니즘을 개략적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저 알칼리 조건에서 단백질 폴리펩티드와 지방산 염화물을 아실화 반응시켜 단백질 폴리펩티드의 말단 및 측쇄에 존재하는 모든 아미노산의 아미노기(NH2)에 지방산기를 유도시킨다. 아실화 반응이 종료되면 적절한 효소를 선택하고 효소의 최적 활성 조건에 따라 pH와 온도를 조절하여 가수분해를 시킨다. 효소 반응 종료 후 6N HCl로 산 정제를 실시한다. 효소반응으로 생성된 고상의 분리층은 측쇄의 N-위치에 NH2가 존재하는 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류는 정제하여 직접 원료로 사용하거나 2, 3차의 후속 반응 후 사용한다. 효소반응으로 생성된 액상의 분리층은 염을 제거하여 직접 원료로 사용하거나 아실화 반응 후 추가로 에스테르화시켜 사용한다.
이하, 도 1를 참조하여 본 발명의 분리 정제방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 아실화 반응
본 단계에서는 단백질 폴리펩티드를 지방산 염화물과 아실화 반응시켜 구성 아미노산의 말단과 측쇄의 -NH2에 지방산기가 도입된 아실 리포폴리펩티드를 제조한다.
상기 단백질 폴리펩티드로서 다음과 같은 구조의 콜라겐 폴리펩티드를 사용한다:
NH2-(CHRCONH)n-CHRCOOH
콜라겐 펩티드는 일반적으로 다음과 같은 아미노산의 서열을 포함한다.
Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X....
(X와 Y는 아미노산으로서 각각 서로 동일하거나 상이할 수 있다).
상기 아실화 반응을 반응식으로 나타내면 다음과 같다.
NH2-(CHRCONH)n-CHRCOOH + XCl + 2KOH →
XNH-(CHRXCONH)n"-(CHRCONH)n'-CHRCOOK + KCl + H2O
상기 식에서, n, n', n"은 자연수로서 n' + n" = n이고, R은 아미노산의 종류를 결정하는 부위이고, XCl은 지방산 염화물을 의미한다.
상기 단백질 폴리펩티드는 콜라겐 펩티드로서, 콜라겐의 기질은 동물성의 젤라틴 분자량 5만 이상의 상품을 사용한다. 직접적인 젤라틴의 1차 원료인 돈피, 또는 우피 등을 사용할 수도 있으나 이들에 한정되는 것은 아니고, 상업적으로 활용할 수 있는 모든 시판품을 사용할 수 있다.
상기 지방산 염화물은 탄소수가 1-20개, 바람직하게는 5-18개의 지방족 또는 방향족 지방산 염화물, 가장 바람직하게는 라우로일 클로라이드(CH3(CH2)10COCl) 또는 팔미토일 클로라이드(CH3(CH2)14COCl)이다.
상기 아실화는 선택된 지방산의 종류에 따라서 온도 조건이 조금씩 다르나 라우릴, 코코일, 팔미토일 염화물의 경우 65℃-70℃인 것이 바람직하고, pH는 수산화칼슘(KOH)과 수산화나트륨(NaOH)와 같은 알칼리 조건(pH 10.5-11.5)을 유지하는 것이 바람직하다.
상기 아실화는 쇼텐-바우만(Schotten-Baumann) 아실화 합성법을 이용하여 진행한다.
측쇄에 자유 아민기를 갖는 아미노산 단위는 알칼리 아미노산인 라이신, 아르기닌과 히스티딘이 있고, 알칼리 아미노산 외에 산성 아미노산인 아스파라긴산(Aspartic acid)과 글루타민산(Glutamic acid) 및 기타 아미노산은 지방산 염화물과 반응하지 않아 아실화되지 않는다. 즉, 아미노산의 구조상 펩티드 결합에 관여하지 않는 부분(NH2CHRCOOH의 R)이 아실화 반응에 참여하지 않거나 다른 화학반응을 유도할 수 없는 구조를 갖는(즉 자유 아미노기 또는 기타 반응성기를 갖지 않는) 아미노산은 아실화 반응에 참여할 수 없는 반면에, 측쇄에 반응성 자유 라디칼을 갖는 아미노산만이 지방산 염화물과 선택적 반응을 일으킬 수 있는 것이다. 콜라겐 펩티드의 경우 약 13-14%의 알칼리 아미노산이 존재하는 것으로 알려져 있다. 또한 다른 단백질의 경우에 있어서도 측쇄에 자유 아미노기(-NH2)를 갖는 구조도 많이 존재한다.
이와 같이 콜라겐 펩티드와 지방산 염화물과의 아실화로 얻어질 수 있는 N-아실 리포폴리펩티드의 개략적인 구조는 다음과 같다.
Figure 112010036529639-pat00001
R : 아미노산의 측쇄-NH2를 갖는 라디칼
R': 아미노산의 측쇄에 NH2를 갖지 못하는 라디칼
n: 자연수
X: N 말단에 유도된 지방산
X': 폴리펩티드의 결합 내에 NH2를 갖는 아미노산과 결합된 지방산
상기 구조식에서와 같이 N-말단의 아미노산이 반드시 글리신으로 시작되는 것은 아니지만, Gly-Z-Y-Gly-Z-Y 아미노산의 반복적인 조합구조는 콜라겐의 특성이다.
제2단계: 가수분해
제1단계 아실화 반응 종료 후 반응액을 분획하여 일부(ca)는 산 처리에 의해 정제하고, 나머지 일부(cb)는 효소처리에 의해 가수분해하여 제1단계에서 얻어진 N-아실 리포폴리펩티드를 아미노산 및/또는 펩티드 단위로 절단하고 N-말단과 C-말단을 자유롭게 한다.
상기 분획(ca)을 산 용액으로 pH를 1 내지 2에서 정제하여 아실화 반응물(ca-1)과 아실화 미반응물(ca-2)을 얻는다. ca-1은 N-아실 리포폴리펩티드이고, 정제 후 반응 생성물로 하거나 알칼리를 이용하여 pH를 중성 또는 그 이상으로 하여 계면활성제로 활용할 수 있다.
상기 분획(cb)의 가수분해는 상기 N-아실 리포폴리펩티드를 연결하는 펩티드 결합을 분해시켜 단일 아미노산류 또는 2개 이상의 아미노산이 결합된 펩티드류로 만들고 이들 아미노산류와 펩티드류의 새로운 N위치에 아미노기(NH2)를 생성시킨다. 상기 펩티드류는 구성 아미노산 개수에 따라 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드 등일 수 있다.
상기 가수분해에 의해 생성된 아미노산류와 펩티드류는 분자량이 작아 생체 기능성과 함께 인체에 직접 흡수가 가능하다. 이때, 지방산기와 결합된 아미노산 및 펩티드도 가수분해된다.
가수분해를 위한 촉매로서 효소 외에 알칼리 또는 산을 이용할 수도 있지만 일정한 펩티드의 결합을 얻기 위하여 특정 부위를 절단하는 단백질 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다. 산과 알칼리 촉매는 비특정 부위를 무작위로 가수분해하므로 작은 단위체를 얻기에는 적합하나, 본 발명에서와 같이 아미노산 연결 부위만을 특정적으로 가수분해하여 일정한 특성 물질을 얻기 위해서는 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 효소가 펩티드결합의 특정 아미노산 결합부위에 작용하는 특성을 이용하여 N-아실 리포폴리펩티드 측쇄의 아미드기를 제외한 펩티드 결합부위만을 분해한다.
단백질 펩티드의 결합 중 일정한 아미노산의 위치에서 특정 작용기전을 가지고 펩티드를 가수분해시키는 단백질 가수분해 효소들이 많이 알려져 있다. 효소마다 단백질에 대한 작용기전은 다르며, 단백질 내 아미노산의 배열과 조성에 따라서 효소반응 결과가 다르게 나타난다. 따라서 적절한 효소의 선택은 단백질을 분해하여 얻어지는 아미노산과 펩티드의 혼합물이 적은 오차에서 균질적인 평균분자량의 분포와 일정한 물질적 특성을 기대할 수 있다. 효소와 단백질 기질의 선택에 따라서 펩티드와 아미노산의 혼합물 조성도 일정하게 얻어질 수 있다.
효소의 종류가 다양하지만 본 발명의 분리 정제방법에서 사용된 효소의 종류 및 펩티드 결합에 대한 작용기전을 하기 표 1에 나타내었다.
효소의 종류 절단 위치
파파인 아르기닌, 라이신, 글루타민산, 히스티딘, 글리신, 티로신 포함위치
트립신 라이신과 이소류신 사이
알칼라아제 -
파인애플 유래 프로테아제 아르기닌, 페닐알라닌, 티로신 포함 위치
알칼라아제의 작용기전은 정확하게 밝혀진 바 없으나, 콜라겐에 대한 작용이 뛰어나 가수 분해도를 높일 때 다른 효소들보다 작용이 뛰어나다.
사용 효소의 종류에 의해 얻어지는 아실 리포아미노산류와 아실 리포펩티드류의 구조가 달라진다.
가수분해에 의한 상기 N-아실 리포폴리펩티드의 구조식 변환을 개략적으로 나타내면 다음과 같다:
Figure 112010036529639-pat00002
상기 반응식에서 n은 자연수이고, R은 아미노산의 측쇄 라디칼로써 지방산기가 도입되어 아실화가 이뤄진 부분(즉, 아실화를 할 수 있는 NH2를 갖는 라디칼)일 수도 있고 아실화가 일어나지 않은 부분일 수도 있다.
상기 아실 펩티드류의 구조는 단백질 폴리펩티드 내 아미노산 배열순서와 가수분해의 위치에 따라 결정된다.
예를 들면 N 말단의 아미노산이 아실화된 부분을 "C"라 하고, 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류를 "A"와 "B"라 하고, 그 외 아실화되지 않는 라디칼을 포함하는 아미노산을 "D"라 하면, 상기 아실 펩티드류는 CADD, CDD, ADD, CDDA, CB, CD, BD, DB, DA, AD 등을 포함할 수 있다. 이때, 가수분해되기 이전의 콜라겐 펩티드의 분자량은 일반적으로 10만 이상으로 크기 때문에 C의 확률은 매우 낮다. 또한, 분자량이 큰 측쇄 자유 라디칼-NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포펩티드류를 얻고자 하는 경우 펩티드 결합을 크게 가수분해하게 되면, CDADDBDDDDDBDDDDADDDDDDB... 등과 같은 수십의 결합형태도 가질 수 있다. 이렇게 수십의 아미노산 결합으로 리포펩티드에서 리포폴리펩티드까지의 결합형태로 결합 크기를 조절하여 얻을 수 있는 것이 효소 가수분해의 특징이라 할 수 있다. 측쇄 아미노기를 갖지 않는 산성 아미노산 등으로 이루어진 D, DD, DDD, DDDD... 형태도 가질 수 있다. 이러한 형태의 아미노산류 및 펩티드류의 말단 아미노기에서 아실화를 진행하여 산성 아미노산이 지배적으로 존재하는 아실화 아미노산(예: 팔미토일(Pal)-D) 및 아실화 펩티드(예: 팔미토일(Pal)-DD, -DDD, -DDDD...)를 얻을 수 있다.
제3단계: 산 정제
본 단계에서는 제2단계에서 얻어진 가수분해물을 산 정제하여 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와 아실화되지 않은 아미노산류 및 펩티드류를 분리한다.
상기 가수분해물을 염산용액으로 pH 1.0-2.0으로 조정하면 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류(cb-1)를 분리할 수 있다. 구체적으로, 상기 산 정제에 의해 제1단계에서 아실화 반응하지 않은 아미노산과 펩티드 단위들이 자연스럽게 분리되는데 이 물질들은 본래의 거대한 단백질 폴리펩티드의 결합에서 측쇄(자유 라디칼)에 아미노기를 갖지 않는 아미노산들과 그들이 결합된 펩티드들이다. 지방산으로 유도된 아미노산 및 펩티드들은 N-말단 NH2 위치의 아미노산, 중간에 결합되어 있던 알칼리 아미노산 및 알칼리 아미노산을 한 개 이상 포함하는 펩티드들이다.
따라서 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류는 단백질 폴리펩티드 내 알칼리 아미노산으로부터 유래된 것이 지배적이며, cb-1을 얻기 위하여 정제된 여액(cb-2)에는 단백질 폴리펩티드 내 산성 아미노산으로부터 유래된 것이 지배적이다. 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류의 예로는 NH2-팔미토일-라이신, NH2-라우로일-라이신, NH2-팔미토일-아르기닌, NH2-라우로일-아르기닌, NH2-팔미토일-히스티딘 및 NH2-라우로일-히스티딘이 있고, 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포펩티드류의 예로는 NH2-라이실(팔미토일)-글리신, NH2-라이실(라우로일)-글리신, NH2-아르기닐(팔미토일)-글리신, NH2-아르기닐(라우로일)-글리신, NH2-히스티딘일(팔미토일)-글리신, NH2-히스티딘일(라우로일)-글리신, N-라우로일-글리실-아르기닐(라우로일)-세린, N-팔미토일글리실-아르기닐(팔미토일)-세린, N-라우로일알기닐라우로일-글리실-세린, N-라우로일글리실-세린-메티오닌, N-팔미토일알기닐팔미토일-글리실-세린, N-팔미토일글리실-세린-메티오닌 및 이와 유사한 아미노산들의 구조가 있다.
이러한 정제 여액에는 글루타민산과 아스파라긴산과 같은 산성계 단일 아미노산, Gly-Glu, Gly-Asp과 같은 산성계 디펩티드, Gly-Glu-Asp, Gly-Asp-Glu와 같은 산성계 트리펩티드 등이 함유되어 있다.
제4단계: 아실화 /산 정제
상기 여액을 알칼리 조건에서 지방산을 투입하여 아실화 반응시키면 또 다른 아미노산의 조성을 갖는 N-아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 얻을 수 있다. 상기 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류는 N-말단 NH2 위치의 NH2가 아실화된 것으로, 말단 C 위치의 COOH는 후속 반응으로 에스테르화를 진행시킬 수 있다.
결과적으로 본 단계에서는 아실화 반응과 가수분해에 의해 절단된 부위에 NH2와 말단의 COOH를 갖고 측쇄가 아실화된 아미노산류 및 펩티드류(아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류)와 측쇄가 아실화 반응에 관여하지 못하고 가수분해에 의해 절단된 부위에 NH2와 말단의 COOH를 갖는 아미노산과 펩티드를 얻고 이를 아실화시켜 말단이 아실화된 아미노산류 및 펩티드류(아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류)를 분리합성 할 수 있다. 아실화된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류는 C 말단의 카르복실기(-COOH)에 에스테르화 반응을 통해 다른 합성 물질들로 유도될 수 있다.
본 발명의 분리 정제방법에 의하면, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드를 산성, 극성, 비극성으로 구성된 아미노산 및 그를 주로 하는 펩티드와 알칼리계의 아미노산과 그를 포함하는 펩티드만을 분리하여 합성함으로써 새로운 형태의 다양한 아미노산 및 펩티드의 유도체를 얻을 수 있다.
특히 알칼리계의 아미노산 및 그의 펩티드는 가수분해로 인하여 생성되는 N-말단 NH2 위치에 NH2가 존재하면서 측쇄의 아미노기에 지방산 지방산기가 유도된 새로운 형태의 아실화물이 얻어짐으로써 말단 NH2와 말단 COOH에 2차, 3차의 후속 반응을 통해 2차, 3차의 유도체를 만들 수 있다. 예를 들면, N-말단 NH2에서는 이민, 아마이드, 알킬 직쇄의 4급 암모늄 유도 반응 등을 진행시킬 수 있으며, 말단 COOH에서는 에스테르화 반응을 진행시킬 수 있다.
N-말단 NH2에서의 후속 반응에 의해 새로운 유도물질의 합성과 항균제, 항바이러스제, 대전방지제, 항암제 등에서 이들의 용도를 기대할 수 있다. 예를 들면, 팔미토일 유도체의 경우 의약부외품으로 약품 안정제, 침투제, 침투 안정제로서 직간접적으로 상당한 효과가 입증될 것이며, 특히 친수성 펩티드-소수성 팔미토일기로 이루어진 친유-친수 구조를 갖는 계면활성제, 유화제, 침투제 등 펩티드 유도체를 제공하여 피부 장벽에 대한 침투 어려움을 극복할 수 있다.
말단 COOH에서의 후속 반응에 의해 새로운 유도물질의 합성과 유연화장수, 영양로션, 영양크림 등의 화장품, 피부개선, 자외선 차단, 잔주름 제거, 기미 제거 및 생성 억제, 피부의 탄력 유지, 보습 유지, 콜라겐 생성의 촉진 등 향장 분야에서 이들의 용도를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
1) 반응기에서 콜라겐(분자량 ≥ 50,000, 삼미산업) 100g을 60℃의 정제수 900g에 용해시킨 다음, KOH 5g을 넣어 콜라겐의 아실화 반응조건인 알칼리 상태로 만들었다. 이후, 60℃에서 30분 이상 충분히 교반하였다. 팔미트산 염화물(CH3(CH2)14COCl (MW = 274.5) 79.6g을 반응시켜 콜라겐 펩티드를 아실화시켰다. 이때 콜라겐 펩티드의 사용량 79.6g은 콜라겐 펩티드의 말단 및 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 존재하는 NH2 함량을 0.29mol로 하여 계산한 양이다(0.29mol × 274.5 g/mol = 79.6g). 아실화 반응 온도를 65-70℃로 유지하는 동안 반응액에 20% KOH 용액을 첨가하여 pH를 11 이상 알칼리로 유지하였다. 팔미트산 염화물 투입 후 2시간 이상 더 교반한 다음 반응을 종료하였다. 측쇄의 NH2의 몰수는 NH2가 존재하는 콜라겐의 아미노산의 중량%를 각각의 아미노산 분자량으로 나누고 각각의 몰%를 합하여 측쇄에 치환될 수 있는 NH2의 몰수로 산출하였다.
아실화 반응 종료 후 반응액을 분획하여 일부(ca)는 산처리하여 정제하였고, 나머지 일부(cb)는 가수분해한 후 정제하여 분리하였다.
분획(ca)을 6N HCl 용액으로 pH 1.0-2.0로 조정하고, 냉각한 후, 원심분리 또는 용매를 사용하여 맑은 용액(ca-2)과 산 용액에 불용성인 N-아실 리포폴리펩티드(ca-1)를 얻었다. 상기 N-아실 리포폴리펩티드는 물에는 용해되지 않으나 분자량과 지방산 치환율에 따라 에탄올/물의 혼합용매에는 잘 용해되었다. 정제 후 분리층(ca-2)에 미반응의 콜라겐과 펩티드가 미량 검출되었으나 질소함량은 0.05% 이하로 매우 낮았다.
상기 N-아실 리포폴리펩티드(ca-1)는 정제 후 반응 생성물로 하거나 알칼리를 이용하여 pH를 중성 또는 그 이상으로 하여 계면활성제로 활용할 수 있다.
아실화 반응 후 분획물(cb)을 pH 9.0-10.0, 온도 60-65℃를 유지하면서 8시간 동안 알칼라아제 효소로 처리하여 가수분해하였다. 가수분해 종료 후, 6N HCl용액으로 pH를 1.0-2.0으로 조정하여 정제하였다. ca-1를 정제하면서 얻어진 여액(ca-2)과 cb-1를 얻기 위하여 정제된 여액(cb-2)을 정성적으로 실리카 엷은 막 분리(TLC)와 닌히드린 용액을 이용한 아미노산 정색 반응 실험을 하였다. 그 결과 ca-2 여액은 미량이지만 Rf 값은 매우 낮은 범위(0.0-0.2)에서 존재하였고 특히 0.1 이상에서는 더욱 적었으며 여액 cb-2 여액은 TLC의 Rf값이 다양하게 나타났으며, 특히 Rf 값이 0.3-0.6사이에 많은 아미노산과 펩티드가 짙은 농도를 나타냈다. 단일의 아미노산들의 발색도 명확하나 2개 이상의 아미노산이 결합된 부분들이 존재하여 Rf 값이 0.2-0.4까지는 띠가 이어진 현상으로 나타났다. cb-1에는 알칼리 아미노산으로부터 유래된 측쇄에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류가 지배적이었으며, cb-2에는 아실화 반응을 하지 않은 산성 아미노산으로부터 유래된 아미노산류 및 펩티드류가 지배적이었다. 이어서, 알칼리 조건에서 cb-2에 지방산을 투입하여 또 다른 아미노산의 조성을 갖는 N-아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 얻었다. 이 N-아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류의 N-말단 NH2 위치에는 지방산기가 결합되었다. 반응 전 콜라겐, 상기 N-아실 리포폴리펩티드(ca-1)와 여액(cb-2)의 아미노산 분포도를 하기 표 2에 나타내었다.
번호 아미노산 종류 콜라겐(반응 전) cb-1 cb-2
일반명칭 부호
1 글루타민산 Glu 8.3 2.8 19.5
2 아스파라긴산 Asp 5.6 1.2 14.5
3 알라닌 Ala 8.9 4.7 9.2
4 글리신 Gly 28.4 23.1 28.8
5 히스티딘 His 0.8 1.0 0.6
6 류신 Leu 2.3 1.8 2.8
7 이소류신 Ile 1.5 1.9 1.3
8 메티오닌 Met 0.7 0.6 1.4
9 페닐알라닌 Phe 2.4 2.7 3.4
10 세린 Ser 3.6 2.8 3.9
11 트레오닌 Thr 1.7 0.9 1.8
12 티로신 Tyr 0.5 0.7 0.4
13 발린 Val 2.2 1.6 3.3
14 프롤린 Pro 9.4 11.0 5.1
15 히드록시프롤린 Hyp 11.5 13.4 3.4
16 아르기닌 Arg 7.7 16.0 0.3
17 라이신 Lys 3.5 11.7 0.1
18 히드록시라이신 Hyl 1.0 2.1 0.2
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 반응 전 콜라겐 펩티드의 아미노산 구성에서는 구성단위 특성상 글리신, 히드록시프롤린과 프롤린의 함량이 높았고, cb-1에는 글리신 외 알칼리 아미노산(아르기닌, 라이신, 히드록시라이신)의 함량이 지배적이며, cb-2에는 글리신 외 산성 아미노산(글루타민산, 아스파라긴산)의 함량이 지배적이었다. 산성 아미노산의 분포가 대표적으로 아실화가 진행되지 않은 정제 여액(cb-2)에서 나타나는 것으로 볼 때 콜라겐 펩티드를 형성하는 아미노산들이 일정한 주기로 반복되어 결합되는 특성을 이해한다면 다음과 같은 결론에 도달한다. 즉, 콜라겐 펩티드의 아미노산 중 측쇄의 NH2를 가진 아미노산 단위는 아실화에 관여하지만 그렇지 않은 아미노산 단위는 아실화 반응에 기여할 수 없고, 아실화 된 콜라겐 펩티드를 가수분해하면 중간에 존재하는 산성 아미노산과 아실화 반응을 일으키지 않은 아미노산과 펩티드들은 산에 의해 정제되어 분리된다.
적외선( IR ) 분석
N-아실화 반응과 가수분해 후 IR 흡수 스펙트럼을 각각 도 2와 3에 나타내었다. 도 4는 아실 아미노산 및 펩티드의 IR 흡수 스펙트럼이다. 각 스펙트럼의 피크를 비교 검토하였다. 가수분해에 의해 얻어지는 가장 큰 변화는 말단에만 -COOH가 존재하는 N-아실 리포폴리펩티드와 달리 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류의 말단에는 -COOH가 새롭게 생성되었다는 것이다. 새롭게 생성되는 -COOH의 C=O를 분석 확인하였다. 아미드기(-CONH-)에서의 C=O 흡수 영역은 1,675-1,690cm-1 ("IR-A")이고, 카르복실기(-COOH)에서의 C=O 흡수 영역은 1,680-1,725cm-1 ("IR-C")에서 관찰된다. 도 2와 3을 참조하면, N-아실 리포폴리펩티드의 IR 흡수 스펙트럼은 IR-A의 영역에서 확인되지만 IR-C의 영역에서는 미약하거나 인접된 IR-A영역에 흡수되어 나타난다. 그러나 가수분해되어 COOH가 증가된 리포아미노산류와 리포펩티드류의 혼합물에서는 IR-C가 명확하게 나타남을 알 수 있다. 또한 C-O(COOH) 흡수영역은 가수분해로 증가될 수 있고 C-N의 흡수영역의 펩티드결합의 가수분해로 줄어들 수 있다. 이들 영역의 변화를 보면 C-O의 흡수영역이 1080-1300cm-1이고, C-N의 흡수영역 1180-1360cm-1을 보면, 1333cm-1 대의 감소변화와 1270cm-1 대의 증가변화를 나타낸다. 이러한 결과로부터 아실화 반응을 거쳐 가수분해가 진행되었음을 알 수 있다.
원소 분석( EA )
N-아실 리포폴리펩티드와 측쇄에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류의 C,H,O,N의 성분을 분석하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
질소(%) 탄소(%) 수소(%)
N-아실 리포폴리펩티드 6.5805 39.88853 6.788441
아실 리포아미노산류/리포펩티드류 6.143964 52.8395 8.521328
도입되는 지방산의 구조는 C, H, O로만 구성되고 질소가 없기 때문에 도입 전후 N의 함량에 있어 뚜렷한 변화가 나타나며 미약하나마 O의 함량 변화도 나타난다. 지방산의 탄소수가 증가되고 NH2에 대한 아실화가 진행될수록 N의 함량은 낮아지고, 또한 지방산에 존재하는 O의 함량이 낮으므로 비례적으로 O의 함량도 낮아지게 된다. 이러한 폴리펩티드에 지방산기 결합으로 나타나는 원소성분의 변화는 쉽게 추정될 수 있는 부분이다. 보다 중요한 것은 리포폴리펩티드와 리포폴리펩티드를 가수분해하여 얻어진 리포아미노산류와 리포펩티드류의 혼합물에 대한 원소분석 결과 비교이다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 리포폴리펩티드를 가수분해하면 합성에 관여하지 않은 미반응의 산성 지배적 아미노산과 펩티드가 분리되어 나오게 되므로 상대적으로 N위치에 NH2가 존재하는 알칼리 지배적 리포아미노산류 및 리포펩티드류는 아실 리포폴리펩티드에 비하여 질소함량이 더욱 낮게 분석되었다. 이러한 결과로부터 아실 리포폴리펩티드가 분해되어 폴리펩티드에 존재하는 산성 아미노산 및 반응에 관여하지 않은 아미노산 및 펩티드들이 가수분해로 분리되었음을 알 수 있다.
실시예 2
반응기에서 콜라겐 100g을 60℃ 증류수 900g에 용해시킨 다음, KOH를 4g 넣어 65℃를 유지하면서 30분 동안 교반하여 알칼리 조건으로 만들었다. 이어서, 65-70℃에서 20% KOH 용액으로 pH 11 이상을 유지하면서 라우르산 염화물 62.4g(0.29mol)을 투입하였다. 교반을 하는 동안 시간 경과에 따라 점도가 증가하므로 교반에 유의하여 2시간 동안 같은 조건에서 충분히 반응시킬 수 있도록 하였다. 아실화 반응 종료 후, 반응물을 1/2로 분획하였다. 분획물의 1/2는 6N HCl로 pH 1.0-2.0으로 조절하여 산 처리하였고(ca), 다른 분획 1/2은 알칼라아제 효소(상품명 Protex 6L, bacterial protease)로 pH 8.5-10.5를 유지하면서 60℃에서 4시간 이상 가수분해시켰다. 6N HCl 용액으로 pH 1.0-2.0으로 조절하여 산 처리하였다(cb).
ca를 산 처리에 의해 N-라우로일 아실 리포폴리펩티드와 여액으로 분리 정제하였다. 여액에 대한 정성 반응으로서 닌히드린의 정색 반응에서 매우 작은 발색을 확인하였고, 여액의 질소 함량을 측정한 결과 0.12%가 나타났다. 이는 반응에서 미 반응의 펩티드와 아미노산이 나타날 수 있으며 또한 산 정제 과정에서 약간의 아미노산과 펩티드가 단리되어 나타나는 것으로 판단된다. N-라우로일 아실 리포폴리펩티드는 정제 후 건조하여 IR과 EA를 측정하여 반응 전후와 cb와의 반응 대조를 위하여 비교 분석한 결과, 실시예 1의 분석 결과와 일치하였다.
cb를 효소 반응 후 산 처리하여 측쇄에 라우로일기가 도입된 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류를 분리하고(cb-1), 건조하여 IR, EA를 측정한 결과, 실시예 1과 동일한 결과를 얻었다.
cb에서 cb-1을 분리하고 남은 여액(cb-2) 300ml 중 질소함량을 측정하였다(0.7%). 가수분해로 생성된 아실 리포아미노산류와 리포펩티드류는 콜라겐의 일반적 질소함량(14.0-14.5%(w/w))을 감안했을 때 29.4g인 것으로 계산되었다(0.007 x 300 ml x 14 = 29.4g)
cb-1을 정제 후 에탄올에 염산 0.1N이 되도록 넣어 주고 중탕하여 4시간동안 에스테르화 반응시킨 후, 에탄올을 증발시키고 정제수로 세척한 시료를 IR 분광법으로 분석하였다. 에스테르화 반응 전후 IR 흡수 스펙트럼(도 3 및 4)에서 C-말단의 카르복실기(-COOH)의 -C=O- 흡수에 해당하는 1,699.97cm-1에서 피크가 관찰되었고(도 3), 에스테르기(-COO-)의 -C=O- 흡수에 해당하는 1734.7cm-1에서 피크가 관찰되었다(도 4). 이러한 결과로부터 본래의 cb-1이 갖는 카르복실기가 에스테르기로 변환되어 에스테르화 반응이 진행되었음을 알 수 있다.
이상의 실험 및 분석 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질 폴리펩티드 내에 존재하는 측쇄의 N-위치에 NH2를 아실화 시킨 후 효소 가수분해하여 N-말단 NH2 위치에 NH2가 존재하는 새로운 형태의 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 얻을 수 있었다. 또한 정제 과정에서 얻어진 산성 아미노산 또는 산성 아미노산이 지배적인 아미노산 및 펩티드를 분리할 수 있었으며, 이를 이용하여 또 다른 성분 구성을 가진 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 얻을 수 있었다.
본 발명의 분리 정제방법에 의해 제조되는 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 개개의 화합물로 순수 분리하거나 에스테르화, 이민, 아마이드, 4급 암모늄화 반응을 유도하여 다수의 새로운 화합물을 얻을 수 있다. N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류 또한 순수 분리하거나 에스테르화 반응을 유도하여 많은 새로운 화합물을 얻을 수 있다.
여러 가지 합성 펩티드가 개발되고 있는 시점에서 본 발명의 분리 정제방법에 의하면 천연 펩티드를 대량으로 생산할 수 있어 관련 산업에서 매우 유용하다. 이러한 신규한 아미노산류 또는 펩티드류를 유효성분으로 함유하는 각종 식품, 미용 및 의약 분야에서 다양한 활용이 가능하다.

Claims (7)

  1. 하기 단계를 포함하는, 단백질 폴리펩티드로부터 유도된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류를 분리 정제하는 방법:
    (1) 단백질 폴리펩티드를 지방산 염화물과 아실화 반응시켜 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 제조하는 단계;
    (2) 상기 N-NH2, 측쇄-NH2 아실 리포폴리펩티드를 가수분해하는 단계;
    (3) 상기 가수분해물을 산 정제하여 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류 및 리포펩티드류와 아실화되지 않은 아미노산류 및 펩티드류를 분리하는 단계; 및
    (4) 상기 아실화되지 않은 아미노산류와 펩티드류를 아실화하고 산 정제하여 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 리포아미노산류와 아실 리포펩티드류를 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 폴리펩티드가 돈피 또는 우피로부터 유래된 콜라겐 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방산 염화물이 탄소수 1-20개의 지방족 또는 방향족 지방산 염화물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가수분해가 효소 처리에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 아미노산류가 NH2-팔미토일-라이신; NH2-라우로일-라이신; NH2-팔미토일-아르기닌; NH2-라우로일-아르기닌; NH2-팔미토일-히스티딘 및 NH2-라우로일-히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 측쇄 자유 라디칼 -NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 펩티드류가 NH2-라이실(팔미토일)-글리신; NH2-라이실(라우로일)-글리신; NH2-아르기닐(팔미토일)-글리신; NH2-아르기닐(라우로일)-글리신; NH2-히스티딘일(팔미토일)-글리신; NH2-히스티딘일(라우로일)-글리신; N-라우로일-글리실-아르기닐(라우로일)-세린; N-팔미토일글리실-아르기닐(팔미토일)-세린; N-라우로일알기닐라우로일-글리실-세린; N-라우로일글리실-세린-메티오닌; N-팔미토일알기닐팔미토일-글리실-세린 및 N-팔미토일글리실-세린-메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 N-말단 NH2 위치에 지방산기가 도입된 아실 아미노산류와 펩티드류가, 염기성 아미노산 보다 산성 아미노산이 더 많이 포함된 아실 아미노산류와 펩티드류인 것을 특징으로 하는 방법.
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KR20170005935A (ko) 2015-07-06 2017-01-17 김철군 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법
KR20190065916A (ko) 2017-12-04 2019-06-12 김철군 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초의 재배방법

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