KR20170005935A - 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 누에 같은 기존의 기주곤충 대신 펩티드를 사용하는 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 평균분자량 400~10,000의 펩티드를 전체 배지 중 5~40중량%로 포함하는 동충하초 재배용 배지조성물과 이를 이용한 동충하초 재배방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, 동충하초 자체의 수확률과 생산성을 크게 높일 수 있을 뿐만 아니라 코디세핀의 함량이 크게 증가되므로 생산된 동충하초의 가치가 증대되고 코디세핀의 생산성을 크게 개선할 수 있다.

Description

동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법{Medium composition for cultivating vegetable worms and the method of cultivating vegetable worms}

본 발명은 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 누에 같은 기존의 기주곤충 대신 펩티드를 사용하는 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법에 관한 것이다.

동충하초는 겨울에는 곤충의 몸에 있다가 여름에는 풀처럼 나타난다는 데서 이름지어진 일종의 버섯으로, 곰팡이의 일종인 동충하초균이 살아있는 곤충의 몸속으로 들어가 발생하는 곤충기생성 약용버섯이다. 동충하초 중 식품으로 인정된 것은 코디세프스 시네시스(Cordyceps sinensis), 밀리타리스 동충하초(Codyceps militaris) 및 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica)의 3종류이다. 이중 세계적으로 사용이 인정된 것은 코디세프스 시네시스와 밀리타리스 동충하초의 2종류로 유성생식의 완전균주이고, 눈꽃 동충하초는 국내에서 인정된 무성생식의 불완전균류이다.

동충하초는 동의보감을 통해서 오랫동안 많은 효능이 인정되어 각종 성인병 질환의 치료 및 건강유지를 위하여 사용되어 왔다. 중국에서는 육상선수들이 동충하초를 복용하고 기적의 기록들을 나타낸다고 하여 동충하초를 3대 천연식품 건강 명약으로 인정하고 있다.

동충하초는 작물들 중 단백질 함량이 가장 높은 (건조함량의 28%이상) 군에 속하고, 면역력을 강화시키는 물질이 다량 함유되어 있다. 동충하초의 면역활성물질 중에는 키닉산(quinic acid)의 이성체로 밝혀진 '코디세핀(Cordycepin :3'-deoxy-adenosine)' 이 포함되어 있으며, 동충하초 중에서도 밀리타리스 동충하초가 다른 동충하초에 비하여 코디세핀의 함량이 월등히 높다. 코디세핀은 핵산 물질로서 세포의 유전정보에 관여하면서 저하된 면역기능을 활성화하여 정상세포가 암세포로 전환되는 것을 방지하는 작용을 한다. 동충하초를 투입한 임상실험에서 암세포를 죽이는 면역세포인 NK세포(natural killer cell/자연살해세포)와 면역세포에서 분비되는 사이토카인의 함량이 18%~25% 증가되는 것으로 확인되어 혈액암치료용으로 활용되고, 건강기능식품으로서도 많은 관심을 받고 있다. 이러한 결과를 토대로 국내에서는 코디세핀이 함유된 동충하초가 버섯으로는 유일하게 건강기능식품으로 식약처인증을 받았다. 또한 동충하초는 혈압과 당뇨를 조절하는 효능과 폐와 간 기능 등에도 많은 도움을 주는 것으로 임상연구결과가 발표되고 있다.

이와 같이, 동충하초는 작물로서의 가치가 높기 때문에 국내의 의약 및 식품분야에서 지속적으로 연구되고 있는 중요한 농작물이며, 의약품으로서 뿐만 아니라 건강보조식품으로서도 중요성이 인식되어 현재 각종 분말이나 액체 형태의 제품이 시판되고 있다. 또한 동충하초가 자연생태계에서 곤충의 밀도를 조절하는 것을 이용하여 무공해 미생물 농약을 개발하고자 하는 연구도 활발한데, 이러한 천연 생물 농약의 개발은 그 해충의 천적이 되는 미생물이 해충의 방제는 물론이고 화학농약에 의해 발생하는 환경오염문제까지도 해결할 수 있기 때문에 큰 관심을 끌고 있다.

동충하초는 버섯류 중에서도 많은 소비가 이루어지고 있지만 천연에서 채집되는 양은 매우 적어서 수요를 충당할 수 없으므로 전 세계의 많은 농가들이 인공재배법으로 재배사를 만들어서 대량 재배하고 있다. 그러나 동충하초는 성장속도가 느리고, 외부환경에 민감하여 농약을 살포할 수 없는 식물이어서 재배가 매우 까다롭다. 대량재배에 성공하기는 하였지만 오랫동안 재배를 해온 농가에서도 동충하초 재배의 수확률은 저조한 것으로 알려져 있다. 즉, 10개를 배양하여 수확하면 1~2개 정도가 오염되거나 이상 균주가 성장하여 수확율이 낮아진다.

현재 동충하초의 재배에 가장 많이 사용되는 방법은, 누에애벌레에 직접 균을 접종하여 키우는 애벌레 번데기 동충하초 재배법, 누에 번데기가루와 현미를 혼합한 배지에 균을 접종하여 키우는 현미+번데기 가수 동충하초 재배법, 상기 재배방법에 게르마늄 성분들을 강화시킨 재배법 등이며, 멸균된 상태에서 접종하여 평판에서 재배하거나 다른 버섯류와 같이 병에서 재배하는 것이 일반적이다.

동충하초가 갖는 약리성분과 효능을 높이기 위한 종균의 개발과 재배기술에 대한 연구는 중국, 한국, 일본에서 주도적으로 이루어지고 있었으나, 이제는 세계적인 관심을 갖는 버섯이 되어 세계 각국에서 경쟁적 연구가 진행되고 있는 상태이다.

폴리펩티드(polypeotide)는 20종의 천연 아미노산들이 펩티드결합에 의해 서로 길게 사슬모양으로 연결된 것이다. 일반적으로 분자량이 비교적 작으면 폴리펩티드라고 하고 분자량이 매우 크면 단백질이라고 하지만 통상 두가지를 혼용하여 사용한다. 다만, 2 이상의 폴리펩티드가 모여서 하나의 집합체를 형성하여 생체 내 또는 생체 내외에서 기능할 수 있는 형태일 때는 반드시 단백질(protein)이라고 부른다. 폴리펩티드/단백질은 생물체의 몸의 구성성분이며 세포 내의 각종 화학반응의 촉매 물질로서 중요하다.

콜라겐(Collagen)은 포유동물의 전체 단백질 중 1/3을 차지하는 단백질로서, 인체에 가장 많이 존재하는 단백질이다. 콜라겐은 피부, 뼈, 힘줄, 혈관, 각막 등의 결합조직을 구성하는 주된 단백질로서, 동물의 몸을 유지 및 지탱하고, 외부로부터 생체를 보호하며, 근육의 신축성을 뼈에 전달하고, 각종 생체 세포를 지탱하는 기질로서의 역할을 하며, 생명현상에 필요한 여러 세포의 분화에 관여하고, 출혈시 혈소판 응집반응을 일으켜 지혈작용을 하는 등 여러 가지 생물학적 역할을 수행한다.

콜라겐의 분자구조는 아미노산 약 1,000개가 결합된 사슬 세가닥으로 이루어져 있고, 각 사슬은 나선구조를 가지며 서로 감겨서 복합 나선을 형성하고 있다. 콜라겐은 분자의 길이가 3000Å이고 두께는 15Å인 봉상 분자이나 생체 내에서는 분자가 흩어져서 존재하기 때문에 섬유구조를 형성하고 있다. 콜라겐의 폴리펩티드는 3번 마다 글리신이 반복되는 반복서열로 구성되어 있으며, 글리신 외에 주요 아미노산으로는 프롤린, 히드록시프롤린이 있으며, 상기 세 가지 아미노산들로 이루어진 Gly-Pro-Hyp가 콜라겐을 대표하는 구성 펩티드로 알려져 있다. 특히 콜라겐에는 다른 단백질에는 존재하지 않는 히드록시프롤린의 함량이 높은 것이 특징이다.

콜라겐이 피부에 대한 친화성이 높고 수분을 함유한 하이드로겔(hydrogel)을 생성하며 상처 치유를 촉진하고 저항원성을 가지는 등의 성질을 이용하여 화장품 원료, 인공피부, 인공혈관, 지혈제, 콘택트 렌즈, 세포배양의 기질 등으로 사용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 동물계에 존재하는 콜라겐은 일부만이 가용성 콜라겐이고 대부분은 불용성 콜라겐이지만, 이러한 고분자의 불용성 콜라겐을 분해하여 얻은 수용성의 저분자 펩티드를 이용한 각종 새로운 제품이 개발되고 있다.

콜라겐을 단백질 분해 효소로 분해하여 분자량 1,000-20,000 정도로 분해한 것을 수용성 콜라겐 또는 가수분해 콜라겐이라 부른다. 친수부가 분자량 400 정도인 가수분해 콜라겐을 야자유 지방산 등으로 아실화시키면 가수분해 콜라겐의 Na, K 염은 음이온성 계면활성제와 같은 정도의 표면장력 저하능을 가지며 안료에 대한 분산력도 있다. 이러한 가수분해 콜라겐, 아실화 가수분해 콜라겐은 주로 화장품 원료 등으로 사용되고 있다. 이밖에도 인체에 유익한 펩티드를 만들기 위한 연구들이 의약, 식품, 화장품 등 여러 산업 분야에서 이루어지고 있다.

1. 대한민국 특허등록 제10-1264441호 2. 대한민국 특허등록 제10-1421742호 3. 대한민국 특허등록 제10-1036054호

1. 고급 지방산 N-아실 콜라겐 유도체의 합성 및 계면활성. 한국유화학회지 10권 2호 1993년.

본 발명은 콜라겐 등의 가수분해, 아실화 가수분해 등에서 발생한 분자량이 작은 펩티드를 동충하초 재배에 이용하면, 종래 사용되던 누에 같은 기주곤충으로부터 동충하초가 흡수 이용하는 영양성분보다도 동충하초 내 흡수와 이용이 용이할 수 있다는 점, 이에 따라 성장속도가 빨라지고 유효성분의 함량을 높일 수 있는 가능성이 있다는 점에 착안하여 실험을 통해 이를 확인하고 도출한 것이다.

본 발명은 평균분자량 10,000 이하의 펩티드를 이용하여 동충하초의 성장속도를 빠르게 하고 동충하초에 함유된 코디세핀의 함량을 높일 수 있는 동충하초 재배용 배지조성물과 동충하초 재배방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,

평균분자량 400~10,000의 펩티드를 전체 배지 중 5~40중량%로 포함하는 동충하초 재배용 배지조성물을 제공한다.

상기 펩티드는 평균분자량 400~800의 올리고펩티드인 것이 바람직하다.

상기 배지조성물은 동충하초 재배용 기본배지 95~60중량%와 펩티드 5~40중량%를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 배지조성물에서, 상기 동충하초 재배용 기본배지는 발아현미인 것이 바람직하다.

상기 배지조성물에서, 상기 펩티드는 콜라겐으로부터 유래된 것임이 바람직하다.

상기 배지조성물에서, 상기 올리고펩티드는, (1) 폴리펩티드를 지방산과 축합반응시켜 지방산 폴리펩티드를 제조하는 단계; (2) 상기 지방산 폴리펩티드를 단백질 가수분해효소에 의해 가수분해하는 단계; 및 (3) 상기 가수분해물을 산 정제하여 올리고펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는,

평균분자량 400~10,000의 펩티드를 5~40중량% 포함하는 배지에 동충하초를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 동충하초 재배방법을 제공한다.

상기 펩티드는 평균분자량 400~800의 올리고펩티드인 것이 바람직하다.

상기 배지는 바람직하게는 동충하초 재배용 기본배지 95~60중량%와 펩티드 5~40중량%를 포함한다.

상기 펩티드는 콜라겐으로부터 유래된 것임이 바람직하다.

본 발명의 평균분자량 400~10,000인 펩티드를 동충하초를 재배하는 기본배지에 혼합하여 제조한 배지조성물은 동충하초의 성장속도를 높이고 비해의 발생을 줄이며 동충하초에 포함된 코디세핀 등 유효성분의 함량을 크게 높이는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 동충하초 자체의 수확률과 생산성을 크게 높일 수 있을 뿐만 아니라 코디세핀의 함량이 크게 증가되므로 동충하초의 가치가 증대되고 코디세핀의 생산성을 크게 개선할 수 있다.

도 1 내지 3은 본 발명의 올리고펩티드의 분자량을 분자량 0~900 범위에서 확인한 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4 내지 6은 본 발명의 올리고펩티드의 분자량을 분자량 1,400 영역까지 확대하여 확인한 분석결과를 나타낸 것이다.

I. 올리고펩티드의 제조

본 발명의 올리고펩티드는 (1) 지방산과 폴리펩티드를 축합반응시켜 지방산 폴리펩티드를 제조하는 단계, (2) 합성된 지방산 폴리펩티드를 효소에 의해 가수분해하는 단계 및 (3) 산 정제단계를 포함하여 제조된다.

이하 각 단계를 상세하게 설명한다.

1. 지방산과 폴리펩티드의 축합반응 단계

폴리펩티드를 지방산과 축합반응시켜 구성 아미노산의 말단과 측쇄의 -NH₂에 지방산기를 도입하여 지방산 폴리펩티드를 제조한다.

상기 폴리펩티드로는 알칼리성 아미노산의 함량이 높은 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐을 사용하는 것이 보다 바람직한데, 콜라겐은 일반적으로 Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X....형태의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 X와 Y는 아미노산으로서 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

콜라겐으로는 동물성의 젤라틴 분자량 5만 이상의 상품을 사용하는 것이 바람직하다. 어류 콜라겐(어류비늘에서 얻어진 콜라겐), 돈피 콜라겐(돼지 껍질에서 얻어진 정제 콜라겐), 우피 콜라겐(소가죽에서 얻어진 정제 콜라겐) 등을 사용하는 것이 보다 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상업적으로 활용할 수 있는 모든 시판품을 사용할 수 있다.

상기 지방산은 지방산 염화물의 형태로 사용하는 것이 바람직하며, 탄소수가 8~16개인 지방족 또는 방향족 지방산 염화물을 사용하는 것이 바람직하다. 대표적인 지방산 염화물의 예로는 옥타노일 클로라이드, 데카노일 클로라이드, 라우로일 클로라이드, 코코일 클로라이드, 미리스토일 클로라이드, 팔미토일 클로라이드 등이 있다.

폴리펩티드와 지방산의 반응은 알칼리 조건 하에서 이루어지며, pH 11 이상에서 반응시키는 것이 바람직하다. 알칼리 조건은 수산화칼륨(KOH)이나 수산화나트륨(NaOH)과 같은 강염기를 사용하여 형성하는 것이 바람직하다. 또한, 반응온도는 사용되는 지방산의 종류에 따라 조금씩 다르지만, 60℃ 이상인 것이 바람직하다.

폴리펩티드를 60℃ 이상의 온도에서 물에 용해시켜 약 25~35% 용액상태로 만들고 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 용액을 사용하여 pH 11 이상의 알칼리 조건을 유지하면서 지방산 염화물을 투입하여 축합반응을 시킨다.

지방산과 폴리펩티드의 축합반응을 위해서는 폴리펩티드의 아미노산 조성을 분석하여야 하며, 분석된 아미노산 중 알칼리 아미노산의 몰%(mole%)를 계산하여 지방산 1몰(mole)에 반응하는 폴리펩티드의 몰함량을 결정한다.

폴리펩티드 중 콜라겐의 경우 약 17~18%의 알칼리 아미노산이 존재한다. 콜라겐의 종류별 분자량과 이들에 포함된 알칼리 아미노산의 몰%를 한국기초과학연구원에 의뢰하여 확인하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다:

콜라겐의 종류	평균분자량	알칼리 아미노산 몰%
어류 콜라겐	15,000 ~ 30,000	18%
돈피 콜라겐	30,000 ~ 50,000	17%
우피 콜라겐	25,000 ~ 50,000	18%

알칼리 아미노산의 몰함량에 따라 하기와 같은 반응식의 반응이 이루어진다:

지방산 1몰 + 폴리펩티드 중 알칼리 아미노산의 몰% + 2.2몰 NaOH or KOH → 지방산 폴리펩티드 + NaCl or KCl + H₂O

상기 반응에서, 측쇄에 자유 아미노기를 갖는 알칼리 아미노산인 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과, 측쇄에 반응성기인 히드록시기를 갖는 히드록시프롤린이 지방산 염화물과 선택적으로 반응을 한다. 즉, 이들 아미노산을 제외한 아미노산들은 아미노산의 구조상 펩티드 결합에 관여하지 않는 부분이 자유 아미노기 또는 기타 반응성기를 가지지 않기 때문에 지방산과 반응하지 않는다.

2. 효소에 의한 가수분해 단계

상기 축합반응이 종료되면 효소가 작용할 수 있는 온도조건을 맞추기 위하여 반응온도를 낮추면서 정제수를 이용하여 합성 반응물의 농도를 희석한다.

가수분해를 위한 촉매로는 특정 부위의 펩티드 결합을 절단하는 단백질 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다. 가수분해를 위한 촉매로서 효소 외에 알칼리 또는 산을 이용할 수도 있지만, 산과 알칼리 촉매의 경우 비특정 부위를 무작위로 가수분해하므로 작은 단위체를 얻기에는 적합하나, 아미노산 연결부위만을 특정적으로 가수분해하여 일정한 특성의 물질을 얻기에는 바람직하지 않다. 즉, 효소가 펩티드 결합의 특정 아미노산 결합부위에 작용하는 특성을 이용하여 지방산 폴리펩티드 측쇄의 아미드기를 제외한 펩티드 결합부위만을 분해한다.

단백질 펩티드의 결합 중 일정한 아미노산의 위치에서 특정 작용기전을 가지고 펩티드를 가수분해하는 단백질 가수분해 효소들이 많이 알려져 있다. 효소마다 단백질에 대한 직용기전은 다르며, 단백질 내 아미노산의 배열과 조성에 따라서 효소반응결과가 다르게 나타난다. 따라서 적절한 효소를 선택함으로써 평균분자량의 분포가 균질하고 물질적 특성이 일정한 아미노산과 펩티드의 혼합물을 얻을 수 있다.

단백질 가수분해 효소는 종류가 다양하지만 본 발명에서 사용될 수 있는 대표적인 효소의 종류 및 이들 효소의 펩티드 결합에 대한 작용기전은 하기 표 2와 같다.

효소의 종류	절단 위치
파파인	아르기닌, 라이신, 글루타민산, 히스티딘, 글리신, 티로신 포함위치
트립신	라이신과 이소류신 사이
알칼라제	-
파인애플 유래 프로테아제	아르기닌, 페닐알라닌, 티로신 포함위치

단백질 가수분해 효소는 일정한 아미노산 결합위치에서 가수분해를 일으키므로 사용하는 효소의 종류에 따라 얻어지는 아미노산과 펩티드의 구조가 달라지며, 동일한 효소를 사용하여 일정한 분자량의 펩티드를 얻을 수 있다.

상기 효소들 중 알칼라제는 폴리펩티드를 매우 잘 분해하는 효소로서, 50℃ 전후의 온도와 7.5~9.5의 pH 영역에서 가장 효율적인 단백질 분해를 한다. 알칼라제의 작용기전은 정확하게 밝혀진 바 없으나, 콜라겐에 대한 작용이 뛰어나므로 콜라겐의 가수분해도를 높일 때 다른 효소들보다 작용이 우수하다.

3. 산 정제단계

상기 효소를 이용한 가수분해단계에서 얻어진 가수분해물을 산 정제하여 올리고펩티드를 분리한다.

합성과 효소분해가 끝난 제조물은 아미노산, 펩티드, 지방산 아미노산 및 지방산 펩티드의 혼합물로 이루어져 있다.

지방산 아미노산과 지방산 펩티드는 N-말단의 아미노기와 결합된 N-말단의 지방산 아미노 결합부분과, 중간의 자유 라디칼인 아미노기와 히드록시기에 지방산이 축합된 부분이 존재한다. 폴리펩티드의 중간 부분에서 지방산이 결합될 수 있는 간격은 알칼리 아미노산과 히드록시프롤린이 폴리펩티드를 형성하는 아미노산의 서열에서 어느 위치에 있는가에 따라서 결정된다. 예를 들어, 이론적으로 가정하였을 때, 알칼리 아미노산의 서열이 반응하지 않는 아미노산의 5번째 위치에 한번씩 온다면 이는 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 중에 지방산과 반응할 수 있는 아미노산은 20몰%인 것을 의미하고, 따라서 효소 반응으로 분리될 수 있는 최대 크기의 펩티드는 4개의 아미노산이 결합된 펩티드가 된다. 그러나, 실제로는 폴리펩티드가 매우 다양한 아미노산 서열을 가지므로 얻어지는 펩티드의 크기도 다양할 것이며, 합성 후 효소 분해를 하였을 때 얻어지는 올리고펩티드의 평균 분자량은 폴리펩티드에 지방산을 축합하는 반응에서 몰반응의 비율을 조절하여 어느 범위까지는 조절할 수 있다.

상기와 같이 혼합물을 구성하는 4가지 성분인 아미노산, 펩티드, 지방산 아미노산 및 지방산 펩티드를 물리적 및 화학적 특성을 이용하여 분리할 수 있다.

이들을 분리하는 방법들의 예로는 반응이 종료된 화합물을 건조시켜 산성영역에서 지방산 화합물들이 알코올류 등에 용해되는 물성을 이용하여 정제 분리하는 방법, 반응이 종료된 화합물을 산성영역으로 만들면 지방산 아미노산과 지방산 펩티드가 산성영역에서 난용성의 물질을 형성하는 특성을 이용하여 여과 분리하는 방법 등이 있다.

산성영역에서 알코올류를 이용하여 정제하는 방법의 경우, 특정된 정제물을 얻는 경우가 아니라면 미량의 지방산 화합물이 올리고펩티드 쪽에 존재하거나 올리고펩티드가 지방산 화합물 영역에 미량 존재할 수 있으며, 올리고펩티드에 존재하는 미량의 지방산화합물을 제거하려면 건조된 올리고펩티드영역의 물질을 에탄올로 세척하여 제거하여야 하므로 경제적으로 바람직하지 못하다.

산성영역에서 여과분리하는 방법의 경우, 반응이 종료된 화합물에 대하여 염산(HCl), 황산(H₂SO₄) 등의 강산을 이용하여 pH 3~4의 산성조건을 형성하면 지방산 아미노산과 지방산 펩티드는 산성영역에서 난용성이 되어 슬러지형태로 가라앉게 되고 아미노산과 올리고펩티드는 여액에 남게 되므로 여과에 의하여 이들을 분리한다. 따라서, 산성영역에서 여과 분리하는 방법이 보다 바람직하다.

상기 제조공정을 거쳐 얻어지는 올리고펩티드는 평균 분자량의 범위가 400~800이다. 종래의 효소분해 펩티드는 분자량 1,000을 기준으로 나타내어지는데 비해, 본 발명의 올리고펩티드는 400~800의 더 작은 분자량 범위를 가진다.

Ⅱ. 동충하초 재배용 배지조성물

본 발명의 동충하초 재배용 배지조성물은 평균분자량 400~10,000의 펩티드를 전체 배지 중 5~40중량%로 포함하도록 조성한다. 바람직하게는 동충하초 재배용 기본배지 95~60중량%와 평균분자량 400~10,000의 펩티드 5~40중량%로 조성한다.

본 발명에서 "동충하초 재배용 기본배지"는 동충하초의 재배에 사용될 수 있는 고상 또는 액상의 배지로서 탄수화물, 당, 무기질, 수분 중 어느 하나 이상을 공급할 수 있는 배지로 정의된다.

상기 동충하초 재배용 기본배지로 바람직하게는 현미, 발아현미 등을 사용할 수 있다.

자연에서의 동충하초는 곤충의 애벌레, 번데기 또는 곤충과 같은 단백질의 함량이 높은 매개체를 이용하여 성장한다. 곤충과 애벌레들의 단백질을 구성하는 폴리펩티드 사슬의 크기는 일반적인 동물의 폴리펩티드보다는 작아 흡수되기 쉬운 펩티드의 형태가 많다. 동충하초가 성장하려면 곤충과 애벌레가 동충하초의 균에 감염이 된 후 땅에서 자라거나 나무 위에서 자라는데, 그 매개체인 곤충과 애벌레는 지표면의 많은 미생물과 자연이 주는 습도와 에너지 등 여러 가지 조건에 의해서 분해가 진행되고 그 과정에서 동충하초도 성장한다. 따라서 곤충과 애벌레가 가지고 있는 폴리펩티드도 분해되고 동충하초의 성장을 위한 영양원이 된다.

따라서, 본 발명에서는, 고단백의 영양원인 폴리펩티드를 흡수되기 쉬운 형태의 펩티드로 분해하여 공급함으로써 동충하초가 자연에서 성장할 때의 조건과 유사한 조건을 형성한다.

펩티드 제조원료인 단백질로는 분자량을 일정하게 조절하기 쉽고 재료의 공급이 원활하고 경제적이며 상품이 우수한 콜라겐을 사용하는 것이 바람직하다. 대표적인 콜라겐으로는 어류 콜라겐(어류비늘에서 얻어진 콜라겐), 돈피 콜라겐(돼지 껍질에서 얻어진 정제 콜라겐), 우피 콜라겐(소가죽에서 얻어진 정제 콜라겐) 등이 있다.

펩티드로는 평균분자량이 400~10,000인 펩티드를 사용하며, 평균분자량이 400~800인 올리고펩티드를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 평균분자량 400~800인 올리고펩티드는 콜라겐을 효소 가수분해하여 얻을 수 있는 가장 작은 단위이다. 평균분자량 400~800인 올리고펩티드의 제조방법은 상기 설명한 바와 같다.

펩티드는 총 배지 조성물 중 5~40중량%로 포함되는데, 펩티드 용액의 형태로 만들어 배지에 혼합할 때는, 5~15% 용액으로 만들어 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 10% 용액으로 만들어 사용했다. 이때 용매로는 물, 특히 멸균정제수를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 배지 조성물을 사용하여 동충하초를 재배하면 동충하초의 성장속도가 빠르고 동충하초에 함유된 코디세핀의 함량이 높아지는 효과가 있다.

Ⅲ. 동충하초의 재배

상기와 같이 조성된 본 발명의 배지조성물에 동충하초를 접종하고 배양한다. 배양은 바람직하게는 15~28℃로 유지되는 배양실에서 실시하며, 더욱 바람직하게는 19~23℃에서 배양한다.

눈꽃 동충하초는 성장의 속도가 밀리타리스 동충하초에 비하여 성장이 빠르고 수확기간이 짧다. 계절 또는 재배사의 조건에 따른 온도, 빛의 조사량, 습도 등에 따라서 수확기간이 달라질 수 있지만, 일반적으로 눈꽃 동충하초는 접종 후 45~60일이면 수확이 가능하다.

밀리타리스 동충하초는 눈꽃 동충하초에 비하여 성장이 느리고 수확기간이 길다. 계절 또는 재배사의 조건에 따른 온도, 빛의 조사량, 습도 등에 따라서 수확기간이 달라질 수 있지만, 일반적으로 밀리타리스 동충하초는 접종 후 75~80일 이내에 수확이 가능하다.

[ 실시예 ]

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예와 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

라우로일 클로라이드( Lauroyl chloride; L-Cl)와 돈피콜라겐(Pig skin collagen; PSC )을 이용한 올리고펩티드의 제조

라우로일 클로라이드(분자량 218.5) 218.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 라우로일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 60℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 135g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(라우로일 콜라겐; Lauroyl collagen - Sodium Lauroyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실시예 2>

코코일 클로라이드( Cocoyl chloride ; C- Cl )와 돈피콜라겐을 이용한 올리고펩티드의 제조

코코일 클로라이드(분자량 222.5) 222.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 코코일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 70℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총 함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 139g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g 중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(코코일 콜라겐 ; Cocoyl collagen - Sodium Cocoyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실시예 3>

팔미토일 클로라이드( Palmitoyl chloride ; P- Cl )와 돈피콜라겐을 이용한 올리고펩티드의 제조

팔미토일 클로라이드(분자량 274.5) 274.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 팔미토일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 60℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총 함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 130g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g 중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(팔미토일 콜라겐 ; Palmitoyl collagen - Sodium Palmitoyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실시예 4>

밀리스토일 클로라이드( Milistoyl chloride ; M- Cl )와 돈피콜라겐을 이용한 올리고펩티드의 제조

밀리스토일 클로라이드(분자량 246.5) 246.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 밀리스토일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 70℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총 함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 135g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g 중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(밀리스토일 콜라겐 ; Milistoyl collagen - Sodium Milistoyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실시예 5>

옥타노일 클로라이드( Octanoyl chloride ; O- Cl )와 돈피콜라겐을 이용한 올리고펩티드의 제조

옥타노일 클로라이드(분자량 162.5) 162.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 옥타노일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 60℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총 함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 145g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g 중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(옥타노일 콜라겐; Octanoyl collagen - Sodium Octanoyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실시예 6>

데카노일 클로라이드 ( Decanoyl chloride ; D- Cl )와 돈피콜라겐을 이용한 올리 고펩티드의 제조

데카노일 클로라이드(분자량 162.5) 162.5g을 준비하고, 돈피콜라겐 400.0g을 60~70℃의 정제수 1,000g에 용해시켜 두었다. 20% NaOH 용액 500g을 준비하고, 20% NaOH 용액을 사용하여 콜라겐이 용해되어 있는 반응기 내부의 pH가 11 이하로 내려가지 않도록 유지하면서 데카노일 클로라이드를 투입하여 지방산 축합반응을 실시하였다. 이때 온도는 60℃ 이상을 유지하였다. 1시간 정도 투입하고 온도를 유지하면서 4시간 이상 교반하여 반응을 종료하였다. 종료 후 온도를 50℃ 전후로 낮추고, 20% NaOH 또는 6N HCl을 사용하여 pH를 7.5~8.5 범위로 조절하였다.

온도와 pH 조절이 끝나면 알칼라제를 2.0g 넣어 주고 12시간 교반하여 효소에 의한 가수분해를 종료하였다.

상기 2단계의 반응이 끝난 반응물은 6N HCl용액을 사용하여 pH 3~4의 산성으로 조정하여 여과 분리하였다. 여과 분리가 끝난 여액과 슬러지는 각각 분획하여 여액은 분자량과 단백질 총 함량을 측정하고, 슬러지는 수분을 최대한 제거한 후 20% NaOH 용액을 사용하여 pH 8.0~9.0으로 조정하였다.

얻어진 올리고펩티드의 함량은 140g 정도였다. 반응에 사용한 콜라겐 400g 중 상기 올리고펩티드를 제외한 나머지 콜라겐은 지방산 콜라겐 계면활성제(데카노일 콜라겐; Decanoyl collagen - Sodium Decanoyl collagen)의 구성물이 되었다.

< 실험예 1>

콜라겐의 아미노산 함량 분석

실시예 1에서 사용한 돈피콜라겐과 얻어진 올리고펩티드의 아미노산 함량을 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 분석은 한국기초과학지원연구원(생명과학연구부)에 의뢰하였다.

먼저, 돈피콜라겐 시료 200㎕를 취하여 PICO-tag 방법을 이용하여 가수분해하고 PITC 라벨링(labeling)을 실시하였다. PITC 라벨링된 시료 400㎕ 중 10㎕를 취하여 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)에 로딩(loading)하였다. 결과적으로, HPLC로 분석한 시료의 양은 5㎕에 해당한다. 254nm UV 검출기로 검출하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

번호	아미노산 종류		콜라겐 (반응 전)	지방산펩티드	효소가수분해 올리고펩티드
	일반명칭	부호
1	아스파라긴산	Asp	0.40	0.77	5.49
2	글루타민산	Glu	1.16	1.85	11.16
3	세린	Ser	1.08	1.41	4.02
4	글리신	Gly	30.71	15.30	25.55
5	히스티딘	His	0.85	1.13	0.85
6	류신	Leu	1.16	1.18	0.00
7	이소류신	Ile	1.05	0.93	1.39
8	메티오닌	Met	1.51	0.69	0.93
9	페닐알라닌	Phe	1.29	2.97	2.33
10	알라닌	Ala	3.58	4.98	12.17
11	트레오닌	Thr	0.96	1.10	1.81
12	티로신	Tyr	0.43	0.89	0.52
13	발린	Val	0.89	1.48	2.86
14	프롤린	Pro	50.43	61.23	16.58
15	히드록시프롤린	Hyp
16	아르기닌	Arg	1.51	3.66	9.25
17	라이신	Lys	0.00	0.00	5.03
18	시스테인2	Cys2	0.00	0.03	0.04

상기 표 3의 아미노산 함량 분석 결과를 보면, 콜라겐은 14번의 프롤린과 15번의 히드록시프롤린과 같은 프롤린류의 함량이 높은 것을 알 수 있다.

< 실험예 2>

올리고펩티드의 분자량 분석

본 발명의 올리고펩티드의 분자량을 한국화학연구소에 의뢰하여 분석하였다. 분자량 0~900 범위에 대하여 확인한 결과를 도 1 내지 3에 나타내었고, 분자량을 1,400 영역까지 확대하여 확인한 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.

도 1 내지 3의 올리고펩티드의 분자량 분포도를 보면, 본 발명의 올리고펩티드의 분자량 영역이 450~800임을 알 수 있다. 또한, 도 4 내지 6에서와 같이, 분자량을 1,400의 영역까지 확대하여 확인을 하여도 평균 분자량의 범위가 450~800임을 확인할 수 있다.

< 실시예 7>

눈꽃(누에) 동충하초의 재배실험

1. 재배방법

눈꽃 동충하초 종균을 배양한 후 표 4와 같은 조건의 멸균 배지에 접종하였다. 기본배지로 발아현미를 사용하였다. 대조군 1은 기본배지에 멸균정제수를 혼합하였고, 대조군 2는 농가에서 사용하는 기본배지에 누에가루와 멸균정제수를 혼합하였다. 실험군 1은 평균분자량 4,000~10,000의 폴리펩티드 10% 멸균정제수용액을 기본배지에 혼합하였으며, 실험군 2는 평균분자량이 400~800의 올리고펩티드 10% 멸균정제수용액을 발아현미에 혼합하였다. 실험군 2에서 사용한 올리고펩티드는 실시예 1에서 제조한 올리고펩티드를 사용하였다. 실험군 1에서 사용한 평균분자량 4,000~10,000의 폴리펩티드는, 돈피콜라겐에 알칼라제 0.1중량%를 가하고 55±5℃에서 3~6시간 분해하여 얻은 것을 사용하였다.

대조군 1, 대조군 2, 실험군 1 및 실험군 2에 대하여 각각 100개씩 멸균 재배용기에 종균을 접종하여 19~23℃의 배양실에서 배양하였다.

	배지조건
대조군 1	발아현미 50g + 멸균정제수 60g
대조군 2	발아현미 50g + 누에가루 10g + 멸균정제수 60g
실험군 1	발아현미 50g + 펩티드 10% 용액 60g
실험군 2	발아현미 50g + 올리고펩티드 10% 용액 60g

2. 재배결과

(1) 자실체 길이

상기와 같이 재배한 눈꽃 동충하초의 자실체 길이를 재배 7일, 14일, 21일 및 28일에 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

구분	배지재배 7일	배지재배 14일	배지재배 21일	배지재배 28일
대조군 1	균사체형성	균사체형성	3~4cm	4~9cm
대조군 2	균사체형성	0.2~0.5cm	4~5cm	8~11cm
실험군 1	균사체형성	1~2cm	6~9cm	12~16cm
실험군 2	균사체형성	2~3cm	7~10cm	13~17cm
	백색의 균형성	백색의 자실형성이 뚜렷하게 나타난다.

상기 표 5의 결과로부터, 실험군 1과 2는 대조군 1과 2에 비하여 자실체의 성장이 빠르고, 실험군 2가 실험군 1에 비하여 자실체의 성장이 빠른 것을 알 수 있다. 또한 대조군 1과 2는 재배기간 28일 경과 이후에는 성장높이 12~13cm에서 성장이 멈추었다.

(2) 성장 후 자실체와 균사체의 무게변화

배지재배 35일 경과 후의 무게변화와 성장길이를 측정하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 무게의 변화는 균사체와 자실체를 포함한 무게를 측정하였다.

구분	배지재배 35일 경과 후 무게	배지재배 35일 경과 후 성장길이
대조군 1	115g/(110g)	8~11cm
대조군 2	136g/(130g)	8~13cm
실험군 1	136g/(120g)	12~16cm
실험군 2	138g/(120g)	13~17cm

상기 표 6의 결과로부터, 대조군 1과 2의 성장 후 무게변화에 비하여 실험군 1과 2의 성장 후 무게변화가 많은 것을 알 수 있다. 이러한 차이는 성장속도와 양호한 성장으로 인한 것으로 보인다.

(3) 비해(비정상 성장 및 오염) 여부

상기 재배된 눈꽃 동충하초 각 100개의 시료에 대하여 비해(비정상 성장 및 오염) 여부를 육안으로 판정하고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 백색의 균사체가 비정상으로 나타나 자실의 성장이 안 되거나 성장 속도가 현저하게 떨어지는 것을 비해로 판단하였다.

구분	배지재배 7일	배지재배 14일	배지재배 21일	배지재배 28일
대조군 1	양호 100	양호 91	양호 83	양호 80
대조군 2	양호 100	양호 93	양호 90	양호 83
실험군 1	양호 100	양호 100	양호 100	양호 100
실험군 2	양호 100	양호 100	양호 100	양호 100

상기 표 7의 결과로부터, 재배기간이 길어짐에 따라 대조군 1과 2의 경우에는 비해가 발생함에 반해, 실험군 1과 2의 경우에는 비해가 발생하지 않음을 알 수 있다.

(4) 코디세핀의 함량분석

상기와 같이 재배한 눈꽃 동충하초의 코디세핀 함량을 다음과 같은 방법으로 분석하였다.

먼저, 대조군과 실험군의 종균을 접종한 후 60일 동안 재배한 동충하초 중 각 10개의 자실체만을 취하여 동결건조시켰다. 건조된 동충하초의 자실체 10g을 정제수 190g에 분산시키고 80℃에서 2시간 동안 추출하고 원심분리한 후 상등액을 여과하여 분석시료로 사용하였다. 코디세핀함량은 HPLC에 의해 분석하였으며, 코디세핀의 기준물질은 '시그마 알드리치'사로부터 구매하여 사용하였다.

분석은 한국화학연구원에 의뢰하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

	코디세핀
대조군 1	15ppm
대조군 2	30ppm
실험군 1	380ppm
실험군 2	583ppm

종래의 방식으로 재배(현미재배, 또는 번데기나 곤충의 애벌레를 이용한 재배)한 눈꽃 동충하초나 기주곤충에서 자란 눈꽃 동충하초(자연에서 곤충이나 애벌레에 감염되어 존재하는 채집된 눈꽃 동충하초)의 경우에는 코디세핀이 검출되지 않거나 검출되어도 함량이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.

그러나 상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 펩티드를 이용하여 재배한 눈꽃 동충하초는 높은 코디세핀의 함량을 나타내었다.

< 실시예 8>

밀리타리스 (번데기) 동충하초의 재배실험

밀리타리스 동충하초는 눈꽃 동충하초에 비하여 성장이 느리고 수확기간이 길다. 계절 또는 재배사의 조건에 따른 온도, 빛의 조사량, 습도 등에 따라서 수확기간이 달라질 수 있지만, 일반적으로 밀리타리스 동충하초는 접종 후 75~80일에 수확한다.

1. 재배방법

밀리타리스 동충하초 종균을 배양한 후 다음과 같은 멸균된 배지에 접종하였다. 기본배지인 발아현미에, 대조군 3은 멸균정제수를 혼합하고, 대조군 4는 농가에서 사용하는 번데기가루와 멸균정제수를 혼합하였다. 실험군 3은 평균분자량 4,000~10,000의 폴리펩티드 10% 멸균정제수용액을 발아현미에 혼합하였으며, 실험군 4는 올리고펩티드(평균분자량이 400~800) 10% 멸균정제수용액을 발아현미에 혼합하였다. 실험에 사용한 평균분자량 4,000~10,000의 폴리펩티드 및 올리고펩티드는 실시예 7의 실험군 1, 2와 동일한 것을 사용하였다.

대조군 3, 대조군 4, 실험군 3 및 실험군 4에 대하여 각각 100개씩 멸균 재배용기에 종균을 접종하여 19~23℃의 배양실에서 배양하였다.

	배지조건
대조군 3	발아현미 50g + 멸균정제수 60g
대조군 4	발아현미 50g + 번데기가루 10g + 멸균정제수 60g
실험군 3	발아현미 50g + 펩티드 10% 용액 60g
실험군 4	발아현미 50g + 올리고펩티드 10% 용액 60g

2. 재배결과

(1) 자실체길이

상기와 같이 재배한 밀리타리스 동충하초의 자실체 길이를 재배 10일, 20일, 30일 및 40일에 측정하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

구분	배지재배 10일	배지재배 20일	배지재배 30일	배지재배 40일
대조군 3	황색균사체형성	0.5cm 이하	2~5cm	7~8cm
대조군 4	황색균사체형성	0.5cm 이하	2~5cm	7~9cm
실험군 3	황색균사체형성	0.5~1cm	4~9cm	8~12cm
실험군 4	황색균사체형성	1~1.5cm	5~10cm	8~14cm
	균사체형성	자실형성단계	자실성장단계	자실성장단계

상기 표 10의 결과에서 알 수 있듯이, 실험군 3과 4는 대조군에 비해 자실체의 형성이 빠르고, 자실의 성장단계인 배지재배 40일에는 대조군들에 비하여 성장이 매우 빠르고 40일 경과 이후 대조군의 성장이 완성되는 단계에 실험군은 포자가 형성되고 있었다. 따라서 수확의 시기도 빨라진다.

(2) 성장 후 자실체와 균사체의 무게변화

배지재배 40일 경과 후의 무게변화와 성장높이를 측정하여 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 무게의 변화는 균사체와 자실체를 포함한 무게를 측정하였다.

구분	배지재배 40일 경과 후 무게	배지재배 40일 경과 후 성장길이
대조군 3	129g/(110g)	10~12cm
대조군 4	148g/(120g)	10~13cm
실험군 3	151g/(110g)	12~16cm
실험군 4	155g/(110g)	13~17cm

상기 표 11의 결과로부터, 대조군 3과 4의 성장 후 무게변화에 비하여 실험군 3과 4의 성장 후 무게변화가 많은 것을 알 수 있다. 이러한 차이는 성장속도와 양호한 성장으로 인한 것으로 보인다.

(3) 비해(비정상 성장 및 오염) 여부

상기와 같이 재배한 밀리타리스 동충하초 각 100개의 시료에 대하여 비해(비정상 성장 및 오염) 여부를 육안으로 판정하고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 균사체의 형성이 더디게 나타나거나 자실성장이 없는 불량을 비해로 판단하였다.

구분	배지재배 10일	배지재배 20일	배지재배 30일	배지재배 40일
대조군 3	양호 100	양호 95	양호 93	양호 93
대조군 4	양호 100	양호 99	양호 97	양호 96
실험군 3	양호 100	양호 100	양호 99	양호 99
실험군 4	양호 100	양호 100	양호 100	양호 100

상기 표 12의 결과로부터, 재배기간이 길어짐에 따라 대조군 3과 4의 경우에는 비해가 발생함에 반해, 펩티드를 사용한 실험군 3과 올리고펩티드를 사용한 실험군 4의 경우에는 비해가 발생하지 않음을 알 수 있다.

(4) 코디세핀의 함량

상기 재배된 밀리타리스 동충하초의 코디세핀 함량을 다음과 같은 방법으로 분석하였다.

먼저, 대조군과 실험군의 종균을 접종한 후 60일 동안 재배한 동충하초 중 각 10개의 자실체만을 취하여 동결건조시켰다. 건조된 동충하초의 자실체 10g을 정제수 190g에 분산시키고 80℃에서 2시간 동안 추출하고 원심분리한 후 상등액을 여과하여 분석시료로 사용하였다. 코디세핀함량은 HPLC에 의해 분석하였으며, 코디세핀의 기준물질은 '시그마 알드리치'사로부터 구매하여 사용하였다.

분석은 한국화학연구원에 의뢰하였으며, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

	코디세핀
대조군 3	330ppm
대조군 4	590ppm
실험군 3	1,130ppm
실험군 4	1,830ppm

상기 표 13의 결과에서 알 수 있듯이, 대조군 3과 4에 비해, 본 발명의 펩티드를 사용한 실험군 3의 코디세핀 함량이 2~3배 정도 높았으며, 올리고펩티드를 사용한 실험군 4의 코디세핀의 함량은 3~6배 정도 높았다.

(5) 총 단백질의 함량

상기 재배된 밀리타리스 동충하초의 건조 자실체의 총 단백질 함량을 분석하였다. 총 단백질 함량은 대덕기초과학연구소에 분석을 의뢰하였다. 그 결과를 하기 표 14에 나타내었으며, 함량은 (건조함량 기준 w/w%)로 나타내었다.

	총단백질
대조군 3	27.5%
대조군 4	28.7%
실험군 3	29.1%
실험군 4	31.2%

상기 표 14의 결과에서 알 수 있듯이, 밀리타리스 동충하초에 함유된 총 단백질의 함량도 실험군 3은 29.1%, 실험군 4는 31.2%로서, 27.5%인 대조군 3과 28.7%인 대조군 4에 비해 높았다. 이러한 결과로부터, 밀리타리스 동충하초에 함유된 총 단백질 함량의 차이는 재배배지의 단백질 함량과 영향이 있음을 알 수 있다.

상기 실시예들의 결과에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 본 발명은 저분자의 올리고펩티드에서 폴리펩티드에 이르기까지, 즉, 분자량 400에서 10,000의 아미노산 단 단위에서부터 폴리펩티드에 이르기까지의 폴리펩티드를 사용하여 기존의 누에를 이용하는 동충하초 재배방식과 차별화된 효과적인 새로운 배지와 재배방법을 제공한다. 나아가 본 발명은 이 이상의 영역, 즉 분자량 400 미만이나 10,000 이상의 펩티드나 폴리펩티드를 이용하여서도 기존의 누에 및 현미를 이용한 배지 및 재배방법과 다른 새로운 배지 및 재배방법이 가능함을 제시한다. 본 발명은, 동충하초 재배에서 배지 조성물로 폴리펩티드를 직접 이용함으로써 성장을 촉진하고 유효성분을 증가시키는 것이 본 발명의 발명개념이다.

이상 기술한 바와 같이 본 발명은 상기 바람직한 실시예 및 구체적인 실시예들을 중심으로 설명되었으나, 발명의 요지 및 특허청구범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 많은 다른 가능한 수정과 변형이 이루어질 수 있다. 본 발명에 대한 권리범위는 이하의 청구범위에서 정해지는 것으로서, 명세서 본문의 기재에 구속되지 않으며, 청구범위의 균등범위에 속하는 변형과 변경은 모두 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 동충하초 재배용 배지조성물 및 동충하초 재배방법은, 누에 같은 기주곤충을 사용하지 않고도, 펩티드, 특히 저분자량의 펩티드를 사용하여 높은 생산성으로 유효성분의 함량이 크게 증가된 동충하초를 얻을 수 있으므로, 본 발명은 종래의 동충하초 재배 방법 및 배지조성물을 대체하여 널리 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 평균분자량 400~10,000의 펩티드를 전체 배지 중 5~40중량%로 포함하는 동충하초 재배용 배지조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩티드는 평균분자량 400~800의 올리고펩티드인 것을 특징으로 하는 동충하초 재배용 배지조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 배지조성물은 동충하초 재배용 기본배지 95~60중량%와 펩티드 5~40중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 재배용 배지조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 동충하초 재배용 기본배지는 발아현미인 것을 특징으로 하는 동충하초 재배용 배지조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 펩티드는 콜라겐으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 동충하초 재배용 배지조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 펩티드는,
   (1) 폴리펩티드를 지방산과 축합반응시켜 지방산 폴리펩티드를 제조하는 단계;
   (2) 상기 지방산 폴리펩티드를 단백질 가수분해효소에 의해 가수분해하는 단계; 및
   (3) 상기 가수분해물을 산 정제하여 올리고펩티드를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 동충하초 재배용 배지조성물.
7. 평균분자량 400~10,000의 펩티드를 5~40중량% 포함하는 배지에 동충하초를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 동충하초 재배방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 펩티드는 평균분자량 400~800의 올리고펩티드인 것을 특징으로 하는 동충하초 재배방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
   상기 배지는 동충하초 재배용 기본배지 95~60중량%와 펩티드 5~40중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 동충하초 재배방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 펩티드는 콜라겐으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 동충하초 재배방법.

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