KR101648539B1 - 식충식물로부터 분리한 신규한 미생물 및 그로부터 생성된 단백질분해효소 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 먹이를 소화효소나 공생세균의 활동에 의해 소화하는 식충식물로부터 분리된 단백질 분해활성을 갖는 신규 미생물과 그로부터 생성된 단백질분해 활성을 가지는 배양액 및 상기 배양액을 유효성분으로 포함하여 단백질을 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8는 15 내지 50 ℃의 온도 및 5.5 내지 11.0의 pH 범위에서 안정한 단백질분해 활성 및 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 활성을 가지는 배양액을 생산한다.
Description
본 발명은 식충식물로부터 분리한 미생물 및 그 미생물에 의해 생성되는 배양액에 관한 것으로, 특히 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주, 이의 배양 방법, 상기 균주로부터 생산된 단백질 분해 활성을 갖는 배양액 및 상기 배양액을 유효성분으로 포함하여 단백질을 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 조성물에 관한 것이다.
식충식물(食蟲植物, Carnivorous plant, Insectivorous plant, Insectivore)이란유인과 포충 기능을 가진 기관으로 곤충, 물벼룩, 미생물 등 동물을 잡아 소화와 흡수 기능을 가진 기관을 통해 양분의 일부를 얻고 있는 식물을 통칭한다. 식충식물의 유사어로 포충식물, 육식식물, 벌레잡이 식물 등도 넓게 또는 부분적으로 사용되고 있다.
식충식물은 대부분이 녹색식물로 모두 현화식물이며 종자식물로서 열매는 모두 삭과이다. 식충식물은 엥글러(Engler) 분류체계에서 속씨식물문(피자식물문, Angiospermae)이며 쌍떡잎식물강(쌍자엽식물문, Dicotyledoneae)으로 통발과(Lentibulariaceae)가 통꽃아강(합판화아강, Sympetalae)에 속하는 데 반하여 다른 모든 식충식물들은 갈래꽃아강(이판화아강, Archichalamydeae)에 속한다.
생태계의 기본질서는 동물이 단백질 등을 합성할 수가 없기 때문에 이를 생산하는 식물을 먹는 먹이사슬로 이루어져 있으나 식충식물은 이러한 먹이사슬의 상황을 반전시켜 식물이 곤충을 잡아먹는 형태로 변화한 것이다. 즉, 식충식물은 식물체가 기관의 일부를 변화시켜 곤충을 유인하는 기능과 함께 포충 기능을 하는 기관을 가지게 된 것으로, 잡은 곤충을 소화시키고 흡수하는 기능을 하는 기관을 가지게 되어 살아가는 에너지를 보충하는 특유한 생존방식으로 변이된 것이다.
식충식물은 분비선인 선세포를 통해 유인이나 포충을 위한 분비물과 소화액을 분비하며, 흡수도 선세포에 의해 이루어진다. 또한, 식충식물 자체의 소화액을 분비하는 것 이외에도 공생균류 등에 의해 소화가 진행되기도 한다.
한편, 단백질분해효소는 단백질을 저분자 펩타이드(Peptide)와 아미노산으로 분해하는 효소로 동식물과 세균, 곰팡이, 효모 등의 다양한 미생물에서 생산된다. 이 중에서, 세균유래 단백질분해효소(Protease)는 동물, 식물, 미생물계에 널리 분포하며 세포 내외에도 존재하는데, 주로 균체 외부로 대량 생산되며, 열안정성을 지니고 있을 뿐만 아니라 광범위한 산도(pH)에서 작용하므로 범용적 산업 효소로 인식되어 있다. 이러한 세균유래 단백질분해효소는 화장품, 식품, 농약, 제약, 세제, 피혁, 화장품 등 여러 분야의 산업에 이용되고 있다.
단백질분해효소는 그 기질 특이성을 기초로 하여 다양하게 구분되며 각각의 특성에 따라 산업적 용도도 달라진다. 엔도펩티다제(Endopeptidase)는 효소의 특이성에 맞는 단백질을 무작위로 절단하여 펩타이드를 형성시키며, 엑소펩티다제(Exopeptidase)는 단백질을 펩타이드 사슬(鎖)를 따라 아미노산 단위로 분해한다. 또한, 효소의 구조에 따라 금속이온을 함유하는 메탈로 프로테아제(Metallo protease), 아미노산 중 세린(Serine) 잔기를 활성부위에 함유하는 세린 프로테아제(Serine protease) 등으로 구분하기도 한다. 뿐만 아니라, 산도 특성에 따라서는 호산성, 호알칼리성, 중성으로 구분하고, 온도에 따라 내열성, 중온성, 고온성 등으로 구분한다.
대부분의 식충식물이 자라는 극한조건인 습지, 이탄지(泥炭地), 사력지(砂礫地) 또는 암벽과 같은 토양에서는 생물생존에 필수적인 질소원(NO3 -, NH4 + 등 형태로서 토양에 존재하며 단백질의 구성요소)과 인산(핵산(DNA, RNA)과 ATP의 구성요소) 등이 수분에 쉽게 씻겨 내려가 양분이 부족하다.
따라서 이러한 생존에 열악한 환경에 적응하여 진화한 식충식물이 식충활동을 통해 곤충, 물벼룩, 미생물 등 동물로부터 영양원을 얻는데 착안하여, 식충식물의 분비물과 소화액에는 외래의 단백질을 효과적으로 분해할 수 있는 다양한 효소 체계가 존재하고 있을 것이며, 이들 효소 체계는 식충식물과 공생하고 있는 미생물에 의해서도 발현될 수 있을 것이므로, 식충식물의 체내 미생물 중 단백질 분해활성을 갖는 미생물을 탐색하고 분리하였으며, 그로부터 단백질분해효소를 생성하기에 이르렀다.
일반적으로 콜라겐(Collagen)은 경단백질 또는 교원질(膠原質)이라고도 하며 무척추동물이나 척추동물 등의 다세포동물에 널리 분포하며 양적으로도 가장 많이 발견되는 경단백질이다. 콜라겐의 주된 기능은 피부의 견고성, 조직의 저항력과 결합력, 세포접착의 지탱 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화로 인하여 피부의 두께가 얇아져서 발생하는 피부의 주름 형성을 방지하는 효과가 있다고 알려져 기능성 화장품 원료 등으로 사용되고 있다. 뿐만 아니라, 콜라겐은 미용, 건강 음료, 건강식품, 의약품 및 화장품 등 다양한 분야에서 원료 내지 첨가제로 사용되고 있으며, 적용되는 산업 분야는 점점 늘어가고 있다. 따라서 콜라겐 펩타이드를 효율적으로 생산할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명의 목적은 단백질분해효소의 단백질 분해작용에 착안하여, 자연 식충식물(Carnivorous plants)에서 분리한, 단백질 분해활성이 우수한 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) 신규 미생물 MK-8 균주 및 그로부터 생성된 단백질분해 활성을 갖는 배양액을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미생물을 배양하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함함으로써 단백질을 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 단백질에 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조 방법을 제공하는데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주(기탁번호: KFCC11582P)를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로부터 생산된 단백질 분해 활성을 갖는 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에 접종하여, 4 내지 37℃의 온도 및 5.5 내지 8의 pH 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주 배양 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하여 단백질을 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드 생성용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 단백질에 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조 방법을 제공한다.
상기와 같이, 본 발명은 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주, 이의 배양 방법 및 상기 균주로부터 생산된 단백질 분해 활성을 갖는 배양액을 제공한다. 본 발명의 균주는 단백질분해 활성을 갖는 배양액을 생산하며, 본 발명의 배양액은 단백질 분해 활성이 높아 단백질 함유 소재를 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드를 제조하는 데에 효과적이다. 또한 피부 각질부위에 처리하면 각질을 분해하고, 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하므로 기능성 화장료 제조에 효과적이다.
도 1은 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 배지 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 반응온도에 따른 단백질 분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 반응 pH에 따른 단백질 분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 저장온도에 따른 저장성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 단백질분해효소의 돈피 단백질 분해 활성을 확인한 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 방법에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드와 기존의 콜라겐 펩타이드의 아미노산 성분을 분석하여 비교한 결과이다(Test: 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드, Pig collagen: 기존의 콜라겐 펩타이드)
도 2는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 반응온도에 따른 단백질 분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 반응 pH에 따른 단백질 분해활성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에 의해 생산된 단백질분해효소의 저장온도에 따른 저장성 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 단백질분해효소의 돈피 단백질 분해 활성을 확인한 실험 결과이다.
도 7은 본 발명의 방법에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드와 기존의 콜라겐 펩타이드의 아미노산 성분을 분석하여 비교한 결과이다(Test: 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드, Pig collagen: 기존의 콜라겐 펩타이드)
이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주(기탁번호: KFCC11582P)를 제공한다.
본 발명의 미생물은 자연산 식충식물로부터 다음과 같이 분리할 수 있다. 먼저, 식충식물의 표충부, 표충액, 줄기를 분리하여 수집한 후, 각 부분을 멸균한 생리식염수와 함께 균질기에 넣고 균질화한 다음, 1% 탈지분유 또는 아조카제인(Azocasein)을 첨가한 고체배지 상에 도말하여 투명환을 형성하는 균주를 선별한다. 도 1은 본 발명에 따라 식충식물로부터 분리된 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 배지 사진으로서, 배지 상에서 투명환을 형성한 균주를 확인할 수 있다.
상기 식충식물은 곤충을 영양원으로 하여 생존하는 식물을 말하며, 그 종류는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 벌레잡이풀(Nepenthes), 사라세니아(Sarracenia), 끈끈이주걱(Drosera rotundifolia L.), 벌레잡이제비꽃(Pinguicula)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물 일 수 있다.
상기와 같이 선별된 단백질 분해활성을 갖는 본 발명에 따른 미생물은 그 균주적 특성, 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성을 조사한 결과, 그람 음성(Gram negative)이고, 호기성 균주이며, 포자를 형성하지 않으면서, 운동성이 없는 직경 0.5 - 1.0mm인 간균의 특성을 보인다. 또한, 옥시다아제(Oxidase)와 카탈라아제(Catalase)에 양성이며, 4-40℃, pH 4-10, NaCl 0-3.0%(W/V)의 범위에서 생육이 가능한 특징을 보인다.
본 발명에 따른 미생물은 상기와 같은 형태학적, 생리학적 및 균체학적 특성에 의거할 때 지금까지 전혀 알려지지 않은 신규의 세균으로 본 발명의 미생물 동정을 위해 리보좀 소단위 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석한 결과, 크리지오박테리움 타이완엔스(Chryseobacterium taiwanense) BCRC 17412(T)과 그 상동성이 98% 이상이었다. 이상과 같은 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성 및 염기서열 분석 결과에 의거하여, 본 발명에 따른 미생물을 신규의 세균류인 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로 명명되었다.
본 발명에 따라 자연 식충식물로부터 분리된 신규 미생물 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8은 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 2014년 3월 17일 제14-09호(기탁번호: KFCC11582P)로 기탁되었다.
본 발명의 균주는 단백질 분해 활성을 갖는 배양액을 생산하는 특징이 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로부터 생산된 단백질분해 활성을 갖는 배양액을 제공한다.
상기 본 발명 균주에 의해 생산되는 배양액은 단백질 분해 활성이 있으며, 특히 상기 배양액은 15 내지 50 ℃의 온도 및 5.5 내지 11.0의 pH 범위에서 단백질분해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이와 같은 효과는 실시 예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일 실시 예에서는 단백질 분해활성을 나타내는 본 발명의 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 로부터 생산되는 배양액으로부터 단백질분해효소를 분리하기 위해, 먼저 상기 미생물을 배양배지(효모추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 아조카제인 1.0%(또는 1% 탈지분유), 덱스트로스 0.5%, 증류수1L)를 조제하여 표면을 살균한 후 상기 미생물을 접종하고, 30 ℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 단백질을 농축하여 부분 정제된 조효소액을 제조하였다.
본 발명의 다른 일 실시 예에서는 분리된 단백질 조효소의 특성을 검토하기 위하여 반응온도, 반응 pH 및 저장기간에 따른 안정성을 검토하였다.
그 결과 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 배양액은 30~40℃의 범위에서 가장 안정적인 분해 활성을 나타내었으며 15℃에서 최고 활성 기준으로 70% 이상의 활성이 나타났으며 50℃까지 80% 이상의 활성을 나타내어 온도에 매우 안정적인 단백질 분해활성을 보였다. 또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 배양액은 pH 5.5~11.0의 범위에서 최적의 효소활성을 갖는 것으로 확인되었으며, 도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 배양액은 냉장 및 상온(25℃)에서 50℃까지 저장할 경우 저장기간에 따른 영향은 보이지 않았으며, 60℃이상의 고온에서는 단백질 분해활성이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.
한편 본 발명은 본 발명의 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주(기탁번호: KFCC11582P)의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 배양방법은 본 발명의 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주를 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에 접종하여, 4 내지 37℃의 온도 및 5.5 내지 8의 pH 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 배양방법에 사용되는 배지는 공지의 크리지오박테리움 속 미생물 배양에 사용되는 배지는 모두 사용될 수 있으며, 배양 조건 및 방식은 4 내지 37℃의 온도 및 5.5 내지 8의 pH 조건을 만족하는 한 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 방법에 의하면, 본 발명의 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주를 효과적으로 배양할 수 있으며, 효소분해활성이 높은 배양물을 효과적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 배양액은 단백질을 분해하여 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 분해 활성이 뛰어나다. 이러한 점은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.
이러한 크리지오박테리움속 MK-8 배양액의 활성은 본 발명 실시예에 잘 나타나 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 MK-8균주 배양액을 분리 정제하여 단백질 분해 활성이 높은 분획을 분리하고, 이를 사람의 피부 표피층과 유사한 조직특성을 갖는 돈피에 처리하여 단백질 분해 활성 및 저분자 콜라겐 펩타이드 생성 활성을 확인하였다. 그 결과 MK-8균주 배양액의 분획물은 단백질 분해 및 저분자 콜라겐 펩타이드의 생성 활성이 매우 우수한 것을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 단백질 분해 및 저분자 콜라겐 펩타이드 생성용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양액은 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8을 배양한 것으로 배양액 전체 또는 균을 제외한 것, 또는 상기 배양액의 분획물을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물은 각질을 제거할 뿐만 아니라 각질을 분해하여 피부에 유용한 저분자 콜라겐 펩타이드를 생성하는 활성이 뛰어나다.
한편 본 발명은 본 발명 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 또는 이의 배양액을 단백질 함유 시료에 처리하는 단계를 포함하는 저분자 콜라겐 펩타이드 제조 방법으로 제공한다.
상기 단백질은 분해하여 펩타이드를 제조하는 단백질은 모두 가능하며, 바람직하게는 섬유상 단백질(fibrous protein)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 콜라겐 또는 케라틴 일 수 있다.
상기 콜라겐 함유 시료는 콜라겐을 포함하는 것이면 어떤 것이든 가능하며, 예를들어 우피(Hide Splits), 돈피 (Pig Skin), 건조된 소뼈(Ossein), 어류일 수 있으며, 바람직하게는 돈피(pig skin, 豚皮)일 수 있다.
상기 콜라겐 펩타이드는 콜라겐을 효소로 가수분해하여 저분자화 한 것으로 바람직하게는 100,000이하의 분자량을 가지는 것일 수 있으며 더욱 바람직하게는 10,000이하의 분자량을 가지는 것 일 수 있다. 상기 콜라겐 펩타이드는 아미노산 중에서 유황을 함유한 아미노산은 적은 편이며 글리신, 프롤린, 히드록시프롤린, 글루타민산 등으로 구성된 섬유성 단백질의 일종으로 1,000여개의 아미노산이 모여 가늘고 긴 띠의 형상을 지닌 경단백질로서 사람의 몸에서 장기를 감싸는 막, 관절 연골, 눈의 각막, 뼈와 피부 등에 주로 존재하고, 특히 피부 속 진피층의 구성 성분으로 매우 중요한 역할을 하고 있다.
케라틴은 동물의 세포 내에서 중간섬유를 만드는 중간섬유 단백질의 일원이며, 특히 피부 등과 같은 표피세포에서는 각질섬유를 만드는 중요 구성 단백질이다. 케라틴은 표피에 가장 풍부하게 존재하는 세포간 섬유상 연결 단백질로서 인간의 표피에는 약 20여종의 케라틴이 발견되고 있다.
케라틴은 분자량이 크며 시스틴 이중 황결합(cystine disulfide bonds)에 의해서 연결되어 있기에 불용성이며 잘 분해되지 않고 분자량이 크기에 세정제 단독으로는 쉽게 제거되지 않는다. 이러한 단백질 불순물들을 작게 분해함으로써 효과적으로 제거할 수 있다. 케라틴은 콜라겐과 유사 단위구조를 가지는 섬유상 단백질로, 저분자로 분해하는 경우 저분자 콜라겐 펩타이드를 효과적으로 생성한다.
본 발명은 단백질 분해활성이 뛰어난 효소를 이용하므로, 돈피로부터 간단한 공정으로 효율적으로 콜라겐 펩타이드를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드는 분자량이 일반 콜라겐에 비하여 월등히 낮으므로 생체 흡수율이 뛰어나 식품, 화장료 원료에 적합하다.
이하, 실시 예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1> 식충식물로부터 미생물의 분리
시료로부터 프로테아제 활성을 갖는 미생물을 분리하기 위하여 벌레잡이풀(Nepenthes), 사라세니아(Sarracenia), 끈끈이주걱(Drosera rotundifolia L.), 벌레잡이제비꽃(Pinguicula) 등 4종의 식충식물을 준비하고, 식충식물의 포충 및 식충 부위로부터 일정량의 시료를 채취하여 식충식물 시료 1g에 살균된 생리식염수 9mL을 첨가한 후, 멸균 생리식염수를 이용하여 순차적 희석한다.
단백질을 분해하는 활성을 보유한 균주의 선별을 위하여 효소추출물0.3%, 펩톤 0.5%, 아조카제인(또는 1% 탈지분유) 0.5%, 증류수1L 조성의 배지(단백질 분해 미생물 분리용 배지)를 조제하여 미생물의 분리에 이용한다. 희석된 시료를 배지에 100-200 μL를 분주한 후, 곤다리 봉을 이용하여 평판 도말한다.
분주된 플레이트는 30℃ 배양기에서 3일간 배양한 후 단백질 분해로 인해 clear zone이 형성된 미생물 군락을 일차 선별한다. 단백질분해효소를 갖는 미생물이 미생물 생육 중 기질로 첨가된 아조카제인 또는 탈지분유 내의 단백질원을 단백질분해효소에 의해 분해하게 되면, 이로 인해 콜로니 주변에 clear zone이 형성된다. 이를 활용하여, 단백질분해효소를 갖는 미생물을 선별한다.
<실시 예 2> 분리 미생물 동정(Identification, 同定)
단백질 분해능을 갖는 미생물을 동정하기 위하여 16s rDNA 염기서열을 분석하였다. 분리된 균주의 염기서열은 솔젠트사(대전, 대한민국)에 의뢰하여 수행하였으며, 분석된 염기서열은 EzTaxon 데이터서버(Data server: http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)를 이용하여 분석하여, 균주의 종과 속명 등을 확인하여 동정하였다.
분석 결과, 시료번호 SW-4는 크리지오박테리움 타이완엔스(Chryseobacterium taiwanense) BCRC 17412(T)와 98.16% 일치하였다. 크리지오박테리움 타이완엔스(Chryseobacterium taiwanense) BCRC 17412(T) 균주는 주로 토양에서 분리하여 보고되는 균주로 알려져 있어, 식충식물 시료와 토양과의 관계가 무관하지 않음을 알 수 있다. 특히, 이러한 균주는 다양한 효소활성이 있다고 보고되고 있다. 본 발명을 통해서 분리된 미생물은 크리지오박테리움 타이완엔스(Chryseobacterium taiwanense) BCRC 17412(T)와 98.16% 일치하는 것으로 보아 신종 균주로 판단되어, 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로 명명하고 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 2014년 3월 17일자로 기탁번호 KFCC11582P로 기탁하였다.
<실시 예 3> 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 특성
상기 명명한 신규 미생물인 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 형태학적, 생리학적, 발효학적 특성을 검토하였다. 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8은 그람 염색결과 그람 음성(Gram negative)을 보이고, 호기적 조건에서 잘 생육하였으며, 아포(Spore)를 형성하지 않고, 운동성이 보이지 않는 간균 형태의 균으로 보인다. 뿐만 아니라, 옥시다아제 및 카탈라아제에 양성으로, 4 내지 37℃(최적 20 내지 30℃), pH 5.5 내지 8.0(최적 7.0 내지 7.5), 0 내지 3.0%(w/v) NaCl에서 생육이 가능하다. 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주의 생리학적 특성을 하기의 표 1 및 표 2에 나타내었다. 표 2는 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8의 지방산 조성을 나타낸 것으로, tr(traces)은 1.0 % 미만이다.
| Characteristics | MK-8 | characteristics | MK-8 |
| Catalase | + | Gluconate | _ |
| Oxidase | + | Citrate | _ |
| Growth temperature(℃) | 4 - 37 | Histidine | + |
| pH for growth | 5.5 - 8 | L-Rhamnose | _ |
| Growth with NaCl(%, w/v) | 0 - 3 | Sucrose | + |
| Indole production | + | Enzyme activity: | |
| Nitrate reduction | - | Esterase(C4) | + |
| Hydolysis of: | Cystine arylamidase | + | |
| Urea | - | Trypsin | + |
| DNA | + | α-Chymotrypsin | + |
| Assimilation of: | α-Galactosidase | - | |
| Arginine dihydrolase | - | β-Galactosidase | w |
| Histidine | + | β-Glucosidase | + |
| D-Gluose | + | N-Acetyl-β-glucosaminidase | + |
| L-Arabinose | + | DNA G+C content(mol%) | 41.7 |
| D-mannose | - |
| 지방산 | MK-8 |
| Saturated | |
| C16 :0 | 1.7 |
| Unsaturated | |
| C18 :1ω5C | tr |
| iso-C17 :1ω9C | 7.84 |
| Branched-chain | |
| iso-C13 :0 | 1.4 |
| iso-C15 :0 | 48.7 |
| iso-C16 :0 | tr |
| iso-C17 :0 | tr |
| anteiso-C15 :0 | 5 |
| iso-C15 :03OH | 4 |
| iso-C16 :03OH | Tr |
| iso-C17 :03OH | 17.4 |
| Hydroxy | |
| C16 :03OH | 1 |
| C17 :02OH | 1 |
| *Summed feature 3 | 6.64 |
<실시 예 4> 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8에서 유래한 단백질분해효소 특성
단백질 분해활성을 측정하기 위하여, 배양액을 원심분리 하여 그 상등액을 취하여 조효소액으로 사용하였다. 회수된 조효소액을 이용하여 기질로 0.5% casein 300mL과 조효소액 200mL을 37℃에서 10분간 반응한 후, Tricholoacetic acid 500mL을 첨가하여 반응을 종결시킨 후 흡광도를 측정하여 그 분해능을 검토하였으며, 조효소액 중의 단백질량을 정량하기 위하여 BCA법을 이용하여 단백질량을 정량하였다. Bicinchoninic acid 용액과 copper sulfate 용액을 49:1의 비율로 혼합 후, 혼합액 950μL와 시료(조효소액) 50μL를 혼합 후 37℃에서 20분간 반응 후 흡광도를 측정하여, 단백질량을 정량하였다.
효소의 특성을 검토하기 위하여 반응온도, 반응 pH 및 저장기간에 따른 안정성을 검토하고 이를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
반응온도를 검토한 결과 30 내지 40℃의 범위에서 가장 안정적인 분해 활성을 나타내었으며 15℃에서 최고 활성 기준으로 70% 이상의 활성이 나타났으며 50℃까지 80% 이상의 활성을 나타내어 온도에 매우 안정적인 단백질 분해활성을 보인다. 이는 식충식물의 생육 시 노출되는 다양한 온도 조건에 따라 프로테아제의 활성 또한 다양한 온도범위에서 유지되는 것으로 판단된다. 본 발명 프로테아제의 활성은 10℃ 이하의 저온과 60℃이상의 온도에서는 급격히 감소하는 경향을 나타내었으나, 이로부터 화장품 원료로서 적용시키기 좋은 활성 온도범위를 보유하는 것을 알 수 있다(도 2 참조).
뿐만 아니라, 반응 시 pH를 3.5 내지 13.0의 범위에서 단백질 분해활성을 검토한 결과, 약산성과 알칼리성 범위의 pH 범위(pH 5.5~11.0)에서는 효소활성에 영향을 주지 않아 매우 넓은 pH 범위에서 효소활성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 산성 및 강한 알칼리 범위 pH에서는 단백질 변성에 의한 효소의 분해활성이 현저히 감소하는 것을 알 수 있다(도 3 참조).
또한, 저장기간 중의 효소활성의 안정성을 검토한 결과, 효소의 활성을 강하게 나타내는 35℃에서는 한 달간의 저장 기간 중 효소활성의 감소를 거의 나타내지 않았으며 이는 50℃에서도 초기에 활성 감소 후에 저장 중의 큰 변화는 나타나지 않았다. 한편, 60℃이상의 고온에서는 단백질 분해활성이 현저하게 감소하였는데, 이는 효소 자체의 열변성에 의한 것으로 판단된다(도 4 참조).
<실시 예 5> 단백질 분해효소 제조 및 활성 측정
<5-1> 단백질 분해 효소 제조
Chryseobacterium sp. MK-8로부터 생산되는 배양액으로부터 단백질 분해효소를 분리하기 위해, 먼저 상기 미생물을 배양배지 (효모추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, 아조카제인 1.0% (또는 1% 탈지분유), 덱스트로스 0.5%, 증류수1L) 를 조제하여 표면을 살균한 후 상기 미생물을 접종하고, 30 ℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심 분리하여 상등액을 취하고, 단백질을 농축하여 부분 정제된 조효소액을 제조하였다.
<5-2> 단백질 분해 활성 측정
살균한 돈피를 가로 20mm x 세로 4mm x 두께 1mm로 절단한 후 팔콘 튜브에 넣고 상기 <5-1>에서 분리한 효소액을 50% 희석하여 30ml을 첨가하여 35℃ 배양기에서 6일 동안 조효소액(효소액)의 돈피 분해를 확인하였다.
대조군으로는 돈피에 조효소액 대신 증류수를 처리하였다.
그 결과 도 6에서 보는 바와 같이, 대조군은 반응 종료시까지 돈피에 특별한 변화가 없으나, 조효소액이 첨가된 실험군의 경우 반응 6일째 돈피가 완전히 분해 된 것을 확인하였다. 이로서 본 발명 배양액이 단백질 분해 활성을 가짐을 확인하였다.
<5-3> 콜라겐 펩타이드 조성 측정
상기 돈피 분해 결과물을 한국기초과학지원연구원의 아미노산 조성 분석을 의뢰하여 판매 중인 콜라겐 파우더의 아미노산 조성 분석 결과와 비교하였다.
그 결과 하기 표 3 및 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 균주 유래 콜라겐 분해용 조성물에 의해 제조된 콜라겐 펩타이드의 아미노산 조성이 기존의 콜라겐 펩타이드와 유사한 것을 확인하였다.
| 실시예 | 비교예1 Pig collagen |
|
| AA | MOL % | MOL % |
| ASX | 5.26 | 5.07 |
| GLX | 9.70 | 8.44 |
| SER | 2.68 | 4.50 |
| GLY | 36.56 | 36.59 |
| HIS | 2.01 | 0.21 |
| ARG | 0.92 | 0.56 |
| THR | 2.33 | 2.25 |
| ALA | 12.78 | 12.95 |
| PRO | 13.40 | 15.20 |
| TYR | 0.57 | 0.38 |
| VAL | 2.64 | 2.81 |
| MET | 0.73 | 0.79 |
| ILE | 1.45 | 9.01 |
| LEU | 3.07 | 1.13 |
| PHE | 1.79 | 0.10 |
| LYS | 4.10 | 0.00 |
| TOTAL | 100.00 | 100.00 |
이로서 본 발명의 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로부터 생산된 단백질분해 활성을 갖는 배양액을 유효성분으로 하는 본 발명의 조성물은 단백질 분해 활성이 우수하며, 상기 배양액을 처리하여 콜라겐 펩타이드가 생산되는 것을 확인하였다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.
<110> LEE, hyun gy
<120> Novel microorganism separated from carnivorous plants and
protease produced therefrom
<130> p2014
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA
<213> Chryseobacterium sp. MK-8(KFCC11582P)
<400> 1
ccagacggag ctaaatgcag ctgagcggag aggcccttcg gggtcttgag agcggcgtac 60
gggtgcggaa cacgtgtgca acctgccttt atcaggggga tagcctttcg aaaggaagat 120
taatacccca taatattttg gatggcatca tttaaaattg aaaactgagg tggataaaga 180
tgggcacgcg caagattaga tagttggtga ggtaacggct caccaagtcg atgatcttta 240
gggggcctga gagggtgatc ccccacactg gtactgagac acggaccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt gaggaatatt ggacaatggg ttagcgcctg atccagccat cccgcgtgaa 360
ggacgacggc cctatgggtt gtaaacttct tttgtacagg gataaaccta tctacgtgta 420
gatagctgaa ggtactgtac gaataagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacggagggt gcaagcgtta tccggattta ttgggtttaa agggtccgta ggcggatgtg 540
taagtcagtg gtgaaatctc acagctcaac tgtgaaactg ccattgatac tgcatgtctt 600
gagtaaggta gaagtggctg gaataagtag tgtagcggtg aaatgcatag atattactta 660
gaacaccaat tgcgaaggca ggtcactatg tcttaactga cgctgatgga cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgct aactcgtttt 780
tggggattta tcttcagaga ctaagcgaaa gtgataagtt agccacctgg ggagtacgaa 840
cgcaagtttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt 900
taattcgatg atacgcgagg aaccttacca aggcttaaat gggaattgat cggtttagaa 960
atagaccttc cttcgggcaa ttttcaaggt gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg 1020
aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc aacccctgtt actagttgct accattaagt 1080
tgaggactct agtaagactg cctacgcaag tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1140
atcacggccc ttacgccttg ggccacacac gtaatacaat ggccggtaca gagggcagct 1200
acacagcgat gtgatgcaaa tctcgaaagc cggtctcagt tcggattgga gtctgcaact 1260
cgactctatg aagctggaat cgctagtaat cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgttacacac cgcccgtcaa gccatggaag tctggggtac cgaagtcggg 1380
accgaacaga gcgccaggta tcgctgttat tt 1412
Claims (7)
15 내지 50 ℃의 온도 및 5.5 내지 11.0의 pH 범위에서 최고 활성 기준 70% 이상의 활성을 유지하며, 카제인, 콜라겐 및 젤라틴 분해 활성을 갖는 단백질 분해효소를 생산하는 것을 특징으로 하는 식충식물 유래 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8 균주(기탁번호: KFCC11582P).
제1항의 크리지오박테리움속(Chryseobacterium sp.) MK-8로부터 생산된 단백질분해 활성을 갖는 배양액.
제2항에 있어서, 상기 배양액은 15 내지 50 ℃의 온도 및 5.5 내지 11.0의 pH 범위에서 최고 활성 기준 70% 이상의 활성으로 카제인, 콜라겐 및 젤라틴 분해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 배양액.
삭제
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하여 카제인, 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 분해하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 펩타이드 생성용 화장료 조성물.
제1항의 균주 또는 이의 배양액을 카제인, 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 단백질 함유 시료에 처리하는 단계를 포함하는 콜라겐 펩타이드 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 배양액은 카제인, 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 단백질을 분해하여 콜라겐 펩타이드로 전환하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 배양액.
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Citations (2)
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| JP2001218590A (ja) | 1999-12-03 | 2001-08-14 | Amano Enzyme Inc | 新規蛋白質脱アミド酵素、それを生産する微生物、それをコードする遺伝子、その製造法及び用途 |
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Korean Journal of Microbiology, Vol.49, pp.78-82(2013.03.)* |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111944724A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-11-17 | 山东大学 | 一株高效转化甜菊苷为甜茶苷的菌株及其培养方法与应用 |
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