CN114096270A - 生发剂和包含其的食品或饮品 - Google Patents

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Abstract

一种生发剂，其包含至少一种选自由Hyp、Pro‑Hyp、Hyp‑Gly、Gly‑Pro、Leu‑Hyp、Phe‑Hyp、Pro‑Ala、Pro‑Gly、Pro‑Pro、Glu‑Hyp、Gly‑Pro‑Hyp、Ala‑Hyp‑Gly、Glu‑Hyp‑Gly、Pro‑Ala‑Gly和Ser‑Hyp‑Gly组成的组的氨基酸或肽，或其盐，或其化学修饰产物。

Description

生发剂和包含其的食品或饮品
技术领域
本发明涉及一种生发剂，以及含有其的食品或饮品。
背景技术
已知胶原蛋白水解物(以下也称为“胶原蛋白肽混合物”)对活生物体表现出多种生理活性。例如，WO 2012/102308(PTL 1)公开了胶原蛋白肽混合物用作糖尿病的治疗剂或预防剂，因为胶原蛋白肽混合物对控制胰岛素分泌的酶具有作用。日本专利特开号2009-120512(PTL 2)公开了胶原蛋白肽混合物用作关节软骨再生促进剂，因为胶原蛋白肽混合物具有软骨再生促进作用。日本专利特开号2005-029488(PTL 3)公开了胶原蛋白肽混合物用作降血压剂，因为胶原蛋白肽混合物具有降血压作用。
引文列表
专利文献
PTL1：WO 2012/102308
PTL2：日本专利特开号2009-120512
PTL 3：日本专利特开号2005-029488
PTL 4：日本专利特开号2009-161509
非专利文献
NPL1：Tanimura S et al.,Cell Stem Cell,2011,Vol 8,pp.177-187
发明内容
技术问题
在此，日本专利特开号2009-161509(PTL 4)和NPL 1公开了XVII型胶原蛋白具有抑制脱发作用和抑制毛发脱色作用，但是迄今为止尚不为人所知的是，上述胶原蛋白肽混合物对头发的毛发发育或毛发生长具有促进作用或具有防止脱发进展的作用。因此，已经广泛地进行了研究以探索对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用或防止脱发进展的作用，作为胶原蛋白肽混合物和胶原蛋白肽混合物中所含的源自胶原蛋白的氨基酸、肽等的新生理活性。
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种生发剂，以及包含所述生发剂的食品或饮品，所述生发剂包含氨基酸、肽等，其具有对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用或防止脱发进展作用的至少一种。
所述问题的解决方案
在探索胶原蛋白肽混合物的新生理活性时，本发明人发现，胶原蛋白肽混合物中含有的预定氨基酸、预定肽等具有对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用或防止脱发进展的作用的至少一种，因此实现了本发明。具体地，本发明如下。
根据本发明的生发剂包含一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。
优选地，所述氨基酸和肽源自胶原蛋白。
优选地，所述生发剂是包含至少一种所述氨基酸或肽的胶原蛋白肽混合物。
优选地，所述胶原蛋白肽的重均分子量为100Da以上且8000Da以下。
优选地，所述生发剂是毛乳头细胞的细胞生长促进剂。
优选地，所述生发剂是头发的毛发发育或毛发生长的促进剂，或脱发进展防止剂。
根据本发明的食品或饮品包含生发剂。
本发明的有益效果
根据本发明，可以提供一种生发剂，以及包含所述生发剂的食品或饮品，所述生发剂包含氨基酸、肽等，其具有对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用以及防止脱发进展作用的至少一种。
附图说明
图1是一张照片，其示出了在给予镁缺乏特殊饲料的对照组中的一只11周龄的无毛小鼠的头部。
图2是一张照片，其示出了在给予含Pro-Hyp的镁缺乏特殊饲料的第一组中的一只11周龄的无毛小鼠的头部。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的实施方案。如本文所用，“A至B”形式的描述表示范围的上限和下限(即A以上且B以下)，并且当没有为A描述单位，并且只为B描述单位时，A的单位与B的单位相同。如本文所用，“生发剂”中的术语“生发”不仅包括表示生长毛发作用的“毛发生长”的含义，还包括表示发育新发和促进毛发生长作用的“毛发发育”的含义，以及表示降低脱发可能性的作用的“防止脱发进展”的含义。
[生发剂]
根据本发明的生发剂含有一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。具有这种特性的生发剂具有毛乳头细胞生长促进作用，因此可以具有对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用以及防止脱发进展的作用的至少一种。
[具有对头发的毛发发育或毛发生长促进作用或防止脱发进展作用的预定氨基酸或预定肽，或其盐，或其化学修饰产物]
如上所述，所述生发剂包含一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。在本说明书中，除非另有说明，否则“氨基酸”由三个字符的缩写表示。此外，除非另有说明，“氨基酸”是指L型氨基酸。对于本说明书中的“肽”，例如，“Pro-Hyp”是指其中脯氨酸和羟脯氨酸以从N-末端侧向C-末端侧的顺序排列的肽(二肽)，而“Glu-Hyp-Gly”是指其中谷氨酸、羟脯氨酸和甘氨酸以从N-末端侧向C-末端侧的顺序排列的肽(三肽)。这同样适用于“Pro-Hyp”和“Glu-Hyp-Gly”以外的二肽和三肽的描述。
优选地，所述生发剂包含一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly和Pro-Ala-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。更优选地，所述生发剂包含肽Pro-Hyp或Hyp-Gly、其盐或其化学修饰产物的至少一种。此外，生发剂可包含Hyp和Pro的组合，或Hyp和Gly的组合。在这种情况下，生发剂可以更显著地表现出毛乳头细胞生长促进作用。
上述氨基酸和肽的“盐”形成为，例如，上述氨基酸或肽的无机酸盐如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐；有机酸盐，例如甲磺酸盐、苯磺酸盐、琥珀酸盐和草酸盐；无机碱盐，如钠盐、钾盐和钙盐；以及有机碱盐，例如三乙基铵盐。
每种氨基酸和肽的“化学修饰产物”是指其中作为构成单元的氨基酸残基的游离官能团被化学修饰的化合物。化学修饰可以在例如羟脯氨酸的羟基上、氨基酸的N末端(氨基末端)侧上的氨基上以及氨基酸的C末端(羧基末端)侧上的羧基上进行。对于化学修饰的具体方式和处理条件，应用了已知的针对氨基酸和肽的常规化学修饰技术。通过这种化学修饰获得的每种氨基酸和肽的化学修饰产物可以在弱酸性至中性条件下对溶解度产生增强作用，对与其他活性成分的相容性产生增强作用等。
例如，作为羟基脯氨酸中羟基的化学修饰，可以对Glu-Hyp-Gly的三肽进行O-乙酰化。所述O-乙酰化可以通过在水性溶剂或非水性溶剂中将乙酸酐施加于所述肽来进行。作为甘氨酸中的羧基的化学修饰，可以进行酯化、酰胺化等。所述酯化可以通过将肽悬浮在甲醇中，然后使干燥的氯化氢气体通过所得的悬浮液来进行。所述酰胺化可以通过将碳化二亚胺等施加于所述肽来进行。
作为所述肽中游离氨基的化学修饰，可以进行甲基化。作为所述肽中游离羟基的化学修饰，可以进行磷酸化和硫酸化的至少一种。
优选地，所述氨基酸和肽源自胶原蛋白。在本文中，作为原料的胶原蛋白可以通过以下方式获取，在例如动物(通常为牛、猪、绵羊、鸡或鸵鸟)的皮肤、真皮、骨、软骨、腱等上或鱼的骨、皮肤、鳞片等上进行已知的常规脱脂或脱钙处理、提取处理等。此外，明胶可用作所述肽的原料。所述明胶可以通过已知的常规方法(例如用热水提取)来处理由此获得的胶原蛋白来获得。对于所述胶原蛋白和明胶，可以将市售产品用作原料。
所述氨基酸和肽可以通过用组合的两种或更多种内切型蛋白酶和外切型蛋白酶将所述胶原蛋白和/或所述明胶水解来获得。所述氨基酸和肽可以作为胶原蛋白肽混合物获得，所述胶原蛋白肽混合物由于水解而与其他胶原蛋白肽一起存在，但是，任何所述胶原蛋白肽混合物本身和通过将所述胶原蛋白肽混合物部分纯化而获得的混合物都可以被用作根据本发明的生发剂。即，还优选生发剂是包含上述氨基酸或肽中的至少一种的胶原蛋白肽混合物。此外，通过进一步纯化胶原蛋白肽混合物，可以获得高纯度的包含上述氨基酸和肽之一的纯化产物。当所述氨基酸和肽源自胶原蛋白时，优选通过使用如下所述的其中在两个阶段中对胶原蛋白或明胶进行酶处理的方法来获得所述氨基酸和肽。
此外，优选地，所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量为100Da以上且8000Da以下。所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量更优选为100Da以上且6000Da以下，更优选为100Da以上且4000Da以下。当所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量在上述范围内时，生发剂更显著地表现出毛乳头细胞生长促进作用，因此可以充分获得对头发的毛发发育和毛发生长促进作用和防止脱发进展作用中的至少一种。如果重均分子量大于8000Da，则生发剂的上述效果可能不足。
可以通过在以下测量条件下进行尺寸排阻色谱法(SEC)来确定胶原蛋白肽混合物的重均分子量。
仪器：高效液相色谱(HPLC)(由TOSOH CORPORATION制造)
柱：TSKGel(注册商标)G2000SWXL
柱温：40℃
柱尺寸：7.8mm(I.D.)×30cm，5μm
洗脱液：45质量％乙腈(含0.1质量％三氟乙酸)
流速：1.0mL/min
注射量：10μL
检测：UV 214nm
分子量标记：使用以下五种类型
Figure BDA0003439369940000061
具体地，将含有约0.2g胶原蛋白肽混合物的样品添加到约100ml蒸馏水中，搅拌该混合物，然后用0.2μm滤器过滤以制备测量重均分子量的样品(测量样本)。通过对所述测量样本使用尺寸排阻色谱法，可以确定所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量。
[生产生发剂的方法]
生发剂中所含的氨基酸或肽可以通过已知的常规方法获得。例如，氨基酸(Hyp)可以通过购买市售氨基酸获得。氨基酸还可以通过使用包括水解胶原蛋白或明胶的方法获得。
所述肽(Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly)可以分别通过使用已知的常规液相或固相肽合成方法，或者包括水解胶原蛋白或明胶的方法获得。从效率的观点出发，优选通过使用如下所述的使用氨基酸的化学合成方法，或如下所述包括在两个阶段中对胶原蛋白或明胶进行酶处理的方法来制备所述肽。此外，所述肽可以通过使用包括仅用次级酶而省略初级酶来进行酶处理的方法，或包括同时用初级酶和次级酶进行酶处理的方法来生产，而不是使用包括在两个阶段中对胶原蛋白或明胶进行酶处理的方法。以下，作为生发剂中所含的肽的制造方法的一个例子，对生发剂中所含的肽中特别是“Glu-Hyp-Gly”的制造方法进行说明。
<化学合成方法>
所述肽可以通过使用常规的肽合成方法获得。作为肽合成方法，已知固相合成方法和液相合成方法。作为固相合成法，已知有Fmoc法和Boc法。所述肽可以通过使用Fmoc方法和Boc方法中的任一种来获得。作为固相肽合成方法，合成以Glu-Hyp-Gly为代表的三肽的方法可以如下进行。
首先，提供直径为约0.1mm并且具有用氨基修饰的表面的聚苯乙烯聚合物凝胶的珠粒作为固相。另外，提供二异丙基碳化二亚胺作为缩合剂。接着，用Fmoc(芴基-甲氧基-羰基)来保护甘氨酸的氨基，其是氨基酸序列的C-末端(羧基末端)侧上的氨基，使用缩合剂通过脱水反应将甘氨酸的羧基肽结合至作为固相的氨基。此外，用溶剂洗涤所述固相以除去残留的缩合剂和氨基酸，然后除去与固相肽结合的甘氨酸的氨基的保护基(脱保护)。
随后，提供其中氨基被Fmoc基团保护的羟脯氨酸，并且通过使用缩合剂使所述羟脯氨酸的羧基肽结合至甘氨酸的脱保护的氨基。之后，以与上述相同的方式，对所述羟脯氨酸的氨基进行脱保护，提供用Fmoc基保护的谷氨酸，并进行使谷氨酸与羟脯氨酸肽结合的反应，以合成由Glu-Hyp-Gly代表的三肽作为固相。最后，可以通过将谷氨酸的氨基脱保护，并通过在加热下浸入三氟乙酸将三肽与固相分离来制备三肽。
<使用胶原蛋白和明胶的生产方法>
此外，分两个阶段酶处理胶原蛋白或明胶以产生由Glu-Hyp-Gly代表的三肽的方法可以如下进行。
术语“分两个阶段酶处理(胶原蛋白或明胶)”是指以下内容。即，通过已知的破坏胶原蛋白或明胶的肽键的常规方法进行初级酶处理，然后用具有氨肽酶N活性的酶、同时具有氨肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶、或具有氨肽酶N活性的酶和具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶的组合进行次级酶处理。通过进行初级酶处理，可以获得胶原蛋白肽混合物前体。通过进一步进行次级酶处理，可以从胶原蛋白肽混合物前体中获得含有Glu-Hyp-Gly的胶原蛋白肽混合物。以下将更详细地描述用于分两个阶段酶处理胶原蛋白或明胶的方法。
(初级酶处理)
初级酶处理中使用的酶只要是能够破坏胶原蛋白或明胶的肽键的酶即可，没有特别限制，可以使用任何蛋白水解酶。具体地，其实例包括胶原酶、硫醇蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和金属蛋白酶。选自由这些酶所组成的组中的一种可以被单独使用，或者可以将其两种或更多种组合使用。作为硫醇蛋白酶，可以使用来源于植物的木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶，来源于动物的组织蛋白酶和钙依赖性蛋白酶等。作为丝氨酸蛋白酶，可以使用胰蛋白酶、组织蛋白酶D等。作为酸性蛋白酶，可以使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。考虑到本发明的生发剂用于药物、特定的保健食品等，优选地，作为初级酶处理中使用的酶，使用源自病原微生物的酶以外的酶。
基于100质量份的胶原蛋白或明胶，初级酶处理中的酶的量例如优选为上述酶的0.1至5质量份。优选地，初级酶处理中的处理温度和处理时间分别为30至65℃和10分钟至72小时。通过初级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物前体的重均分子量优选为500至20000Da，更优选为500至10000Da，还更优选为500至8000Da。可以说，当重均分子量在上述范围内时，可以适当地产生具有适当分子量的肽。如果需要，可以在初级酶处理后使酶失活。在这种情况下，失活温度例如优选为70至100℃。胶原蛋白肽混合物前体的重均分子量可以通过使用SEC的方法来确定。
(次级酶处理)
在所述次级酶处理中使用的酶的实例包括具有氨肽酶N活性的酶、同时具有氨肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶、以及具有氨肽酶N活性和脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶的组合。如本文所用，术语“具有氨肽酶N活性的酶”是具有从肽链的N末端侧释放氨基酸的功能的肽酶，其中当脯氨酸或羟脯氨酸以外的氨基酸存在于N末端侧的第二个位置时，所述酶起作用。如本文所用，术语“具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶”是一种肽酶，其从肽的N末端侧仅释放三个氨基酸残基，所述肽在所述N末端侧的第三位置具有脯氨酸或羟脯氨酸。考虑到本发明的生发剂用于药物、特定的保健食品等，优选地，作为次级酶处理中使用的酶，使用源自病原微生物的酶以外的酶。
具有氨肽酶N活性的酶的实例包括氨肽酶N(EC 3.4.11.2.；T.Yoshimoto等人,Agric.Biol.Chem.,52:217-225(1988))，以及来源于曲霉的具有氨肽酶N活性的酶。具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶的实例包括脯氨酰三肽基氨肽酶(EC3.4.14.；A.Banbula等人,J.Biol.Chem.,274:9246-9252(1999))。
通过进行次级酶处理，可以获得含有胶原蛋白肽混合物前体中未包含的肽的胶原蛋白肽混合物。具体地，可以获得包含Glu-Hyp-Gly的胶原蛋白肽混合物。
基于100质量份的胶原蛋白肽混合物前体，所述次级酶处理中的酶的量例如优选为上述酶的0.01至5质量份。优选地，次级酶处理中的处理温度和处理时间分别为30至65℃和10分钟至72小时。通过所述次级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物的重均分子量优选为100至10000Da，更优选为100至8000Da，还更优选为100至4000Da。所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量可以通过使用SEC的方法来确定。
所述次级酶处理主要是为了产生Glu-Hyp-Gly三肽而进行的。因此，优选在次级酶处理中调节酶的量、处理温度、处理时间和pH，以使胶原蛋白肽混合物前体中所含的肽不会被过度水解。因此，所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量优选在上述范围内。在所述次级酶处理后必须使所述酶失活。在这种情况下，失活温度例如优选为70至100℃。另外，优选在120℃下进行数秒或更久的灭菌处理。另外，所述胶原蛋白肽混合物可以通过在200℃或更高的温度加热来进行喷雾干燥。
在所述次级酶处理中，不仅可以使用具有氨肽酶N活性的酶和具有脯氨酰三肽基氨肽酶活性的酶，而且可以使用具有不同活性的酶，并且可以组合使用各自具有不同活性的两种或更多种酶。因此，副产物可以被消化和去除。优选地，根据用作原料的胶原蛋白的类型和在所述初级酶处理中使用的酶的类型，适当地选择在这种情况下使用的酶。不同活性的实例包括二肽酶活性，例如脯氨酸酶活性和羟脯氨酸酶活性。因此，可以消化和去除副产物(如二肽)。
此外，氨肽酶N活性基本上是引起在N末端侧的氨基酸逐个释放的活性。因此，在通过初级酶处理获得的胶原蛋白肽混合物前体包含分子量非常大的肽的情况下，当仅用具有氨肽酶N活性的酶进行次级酶处理时，次级酶处理的持续时间明显增加。为了应对这种情况，例如，可以在次级酶处理中使用脯氨酰寡肽酶，所述脯氨酸寡肽酶是具有引起羧基侧脯氨酸水解的活性(脯氨酸酶活性)的肽链内切酶。因此，可以有效地进行次级酶处理。
在包括分两个阶段酶处理胶原蛋白或明胶的方法中，初级酶处理能够产生具有相对大分子量的肽。该肽可以具有例如由[X1-Gly-X2-Glu-Hyp-Gly](X1和X2≠Hyp)代表的氨基酸序列。在随后的次级酶处理中，具有氨肽酶N活性的酶作用于由[X1-Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]代表的肽，从而释放N末端的X1以获得具有由[Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]代表的氨基酸序列的肽。接下来，具有氨肽酶N活性的酶两次作用于由[Gly-X2-Glu-Hyp-Gly]代表的肽，从而释放甘氨酸和X2以获得由[Glu-Hyp-Gly]代表的肽。
(胶原蛋白肽混合物的纯化)
通过实施如上所述的分两个阶段酶处理，可以制备含有Glu-Hyp-Gly的胶原蛋白肽混合物。由于所述胶原蛋白肽混合物包含由Glu-Hyp-Gly代表的三肽以外的肽，因此如果需要，优选纯化所述胶原蛋白肽混合物。作为这种情况下的纯化方法，可以使用已知的常规方法，其实例包括超滤和多种类型的液相色谱法，例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法和亲和色谱法。
具体地，可以按照以下步骤纯化所述胶原蛋白肽混合物。即，将约2g/10ml的胶原蛋白肽混合物加载到离子交换柱(例如，由TOSOH CORPORATION制造的“TOYOPEARL”(注册商标)DEAE-650”(商品名))中，然后收集用蒸馏水洗脱的第一孔隙体积级分。随后，将所述第一孔隙体积级分装载到具有与上述离子交换柱相反的离子交换基团的柱(例如，由TOSOHCORPORATION制造的“TOYOPEARL”(注册商标)SP-650)中，然后收集用蒸馏水洗脱的第二孔隙体积级分。
接下来，将所述第二孔隙体积级分加载到凝胶过滤柱(例如，GE HealthcareJapan Corporation生产的“SEPHADEX LH-20”(商品名))中，并用30质量％的甲醇水溶液洗脱以收集含有Glu-Hyp-Gly三肽的级分。最后，使用具有反相柱(例如，Waters Corporation制造的“μBondasphere 5μC18
Figure BDA0003439369940000111
Column”(商品名))的高效液相色谱(HPLC)，根据包含0.1质量％的三氟乙酸的32质量％或更低的乙腈水溶液的线性浓度梯度，将所述级分进行分级分离。以此方式，可以以高纯度获得Glu-Hyp-Gly。
[毛乳头细胞的细胞生长促进剂、头发的毛发发育或毛发生长促进剂和脱发进展防止剂]
本发明的生发剂优选为毛乳头细胞的细胞生长促进剂。如上所述，所述生发剂包含一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物，因此可以发挥毛乳头细胞生长促进作用。这使得生发剂能够表现出对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用和防止脱发进展的作用中的至少一种。因此，生发剂可以作为毛乳头细胞的细胞生长促进剂用于促进毛乳头细胞的细胞生长。
优选地，所述生发剂是头发的毛发发育或毛发生长的促进剂或脱发进展防止剂，因为生发剂剂包含上述氨基酸或肽，其盐，或化学修饰产物的任一种。如上所述，所述生发剂具有毛乳头细胞生长促进作用，因此可以作为头发的毛发发育或毛发生长的促进剂用于治疗以通过使毛乳头细胞生长促进头发的毛发发育或毛发生长。此外，生发剂可以作为头发的脱发进展防止剂用于使毛乳头细胞生长的目的，以抑制和防止由于毛乳头细胞减少而发生的脱发的进展。
所述生发剂可以以多种形式口服或肠胃外施用。对于这些形式，所述生发剂当口服施用时可以采取以下剂型，例如片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、液体剂、混悬剂和乳剂。此外，可以将任意上述剂型的所述生发剂与食品或饮品混合。生发剂包含例如上述氨基酸、氨基酸或肽的组合中的至少一种，其在肠道中快速吸收，因此可以口服给药。
当肠胃外给药时，生发剂可以采用如外用制剂的剂型如软膏剂、乳膏剂和洗剂以及经皮制剂等。此外，生发剂可以采用溶液或涂层的形式涂抹到头部皮肤中。
所述生发剂的剂量根据受试者的年龄、性别、体重和敏感性差异、施用方法、施用间隔、制剂类型等而变化。当口服施用所述生发剂时，每位成人的剂量例如优选为0.0001至2500mg/kg，更优选为0.0001至500mg/kg。当所述生发剂的剂型是例如片剂时，所述片剂含有的所述生发剂的量可以为每片0.001至80质量％，而当所述生发剂的剂型是例如散剂时，所述散剂含有的所述生发剂的量可以为0.001至100质量％。当将所述生发剂肠胃外施用或通过另一种形式的制剂施用时，可以参考口服施用的剂量适当地确定剂量。所述生发剂可以每日一次或分几次施用，或每日一次或每几日一次。
所述生发剂可以适当地包含其他活性成分、制剂载体等，只要不对本发明的效果产生不利影响即可。其他活性成分的例子包括菊粉、咖啡酸、奎尼酸、其衍生物、马郁兰提取物、生药如Kinfukan、益母草(远志)、Hakubiso和Desmos chinensis Lour、蜂王浆、紫锥花提取物、巴西莓提取物、Cupuacu提取物等。此外，用于配制成药物制剂的药学上可接受的载体的实例包括稀释剂、粘合剂(糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶和聚乙烯烷酮)、赋形剂(乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钾、山梨糖醇和甘氨酸)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅)、崩解剂(马铃薯淀粉)和润湿剂(月桂基硫酸钠)。
[使用发明]
如上所述，根据本发明的生发剂含有一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。所述生发剂具有作为上述氨基酸和肽的未知属性的毛乳头细胞生长促进作用，因此可以具有对头发的毛发发育或毛发生长的促进作用以及防止脱发进展作用的至少一种。换言之，本发明是用于促进头发的毛发发育或毛发生长或防止脱发进展的氨基酸或肽、其盐或其化学修饰产物中的任一种。
[食品或饮品]
根据本发明的食品或饮品含有生发剂。例如，优选包含在所述生发剂中的肽在肠道中被迅速吸收，因此可以口服施用。因此，本发明的生发剂可以作为食品或饮品来施用，其中所述生发剂与食品或饮料混合。此外，根据本发明的食品或饮品可以被用作特定的保健食品或具有功能要求的食品。食品或饮品中所含的生发剂的浓度优选为0.001至100质量％。
实施例
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，所述实施例不应被解释为限制本发明。
[实施例1：细胞生物学测试(体外测试)]
[样品的制备]
<氨基酸、肽和胶原蛋白肽混合物的制备>
作为用于评价毛乳头细胞生长促进作用的样品，下表1和表2中所示的氨基酸、氨基酸的组合、二肽、三肽和胶原蛋白肽混合物是通过使用上述方法生产或从后面描述的制造商购买而提供的。
这里，对于表1中所示的氨基酸、氨基酸的组合和肽，使用了其中氨基酸各自由一个字符表示的缩写。表1中，“PO”代表脯氨酸-羟脯氨酸的二肽(商品名：“G-3025”，BACHEM公司制造)，而“OG”代表羟脯氨酸-甘氨酸的二肽(商品名：“G-2365”，BACHEM公司制造)。“GPO”代表甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸的三肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。“PO”是指脯氨酸和羟脯氨酸以从N末端侧向C末端侧顺序排列的肽。这同样适用于“PO”以外的肽的描述。
此外，在表1中，“AOG”代表丙氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸三肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)，而“EOG”代表谷氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸三肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。“SOG”代表丝氨酸-羟脯氨酸-甘氨酸三肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)，而“GP”代表甘氨酸-脯氨酸二肽(商品名：“G-3015”，BACHEM公司制造)。“LO”代表亮氨酸-羟脯氨酸二肽(由PH JapanCo.,Ltd.制造)，“FO”代表苯丙氨酸-羟脯氨酸的二肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)，而“EO”代表谷氨酸-羟脯氨酸二肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。
“PA”代表脯氨酸-丙氨酸二肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)，而“PAG”代表脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸三肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。“PG”代表脯氨酸-甘氨酸的二肽(由PHJapan Co.,Ltd.制造)。“PP”代表脯氨酸-脯氨酸二肽(由PH Japan Co.,Ltd.制造)。“O”代表羟脯氨酸(商品名：“080-01642”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)，“G”代表甘氨酸(商品名：“073-00732”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)，“P”代表脯氨酸(商品名：“161-04602”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)，“P+O”代表脯氨酸和羟脯氨酸的组合，而“O+G”代表羟脯氨酸和甘氨酸的组合。
此外，在后述的条件下通过LC-MS/MS进行的定量分析中，发现表2中所示的胶原蛋白肽混合物A(商品名：“TYPE-S”，由Nitta Gelatin Inc.制造，重均分子量(Mw)：约750Da)包括以下组成。
Pro-Hyp:8ppm、Hyp-Gly:7,389ppm、Gly-Pro-Hyp:8ppm、Ala-Hyp-Gly:199ppm、Glu-Hyp-Gly:9ppm、Ser-Hyp-Gly:176ppm、Gly-Pro:1,159ppm、Pro-Ala-Gly:2,229ppm、总共：11,177ppm。
此外，在后述的条件下通过LC-MS/MS进行的定量分析中，发现表2中所示的胶原蛋白肽混合物B(商品名：“COLLAPEP PU”，由Nitta Gelatin Inc.制造，重均分子量(Mw)：约630Da)包括以下组成。
Pro-Hyp:8ppm、Hyp-Gly:3,447ppm、Gly-Pro-Hyp:36ppm、Ala-Hyp-Gly:436ppm、Glu-Hyp-Gly:4ppm、Ser-Hyp-Gly:120ppm、Gly-Pro:2,379ppm、Pro-Ala-Gly:2,645ppm、总共：9,074ppm。
LC-MS/MS的定量分析在以下条件下进行。
HPLC仪器：“ACQUITY UPLC H-Class Bio”(Waters Corporation制造)
柱：“Hypersil GOLD PFP 2.1×150mm,5μm”(Thermo Fisher Scientific.Inc.制造)
柱温：40℃(线性梯度)
流动相：(A)含0.2％甲酸和2mM醋酸铵的水溶液
(B)100％甲醇
(梯度设定)
Figure BDA0003439369940000161
注射量：0.5μl
MS/MS仪器："Xevo TQ-XS"，Waters Corporation制造
电离方法：正ESI
毛细管电压(kV)：1
脱溶剂温度(℃)500
源温度(℃)150
MRM条件：
Figure BDA0003439369940000162
Figure BDA0003439369940000171
<毛乳头细胞的制备>
首先获得人正常毛乳头细胞HFDPC-C(由Takara Bio Inc.制造)，然后将毛乳头细胞以0.2×104个/皿接种于用于细胞培养的96孔板的每孔中(由Corning Inc.制造)。此外，将200μL含有伴随得到的毛乳头细胞的生长因子的基础培养基(商品名：“毛囊真皮乳头细胞基础培养基”，由Takara Bio Inc.制造)供给至各孔，将毛乳头细胞在各孔中在37℃下预培养24小时。
接下来，确认毛乳头细胞亚汇合，然后将每孔中的基础培养基替换为200μL不含上述生长因子的另一种基础培养基(商品名：“毛囊真皮乳头细胞基础培养基”，由Takara BioInc.制造)。以此方式，制备了用于确定添加上述样品是否促进细胞生长的毛乳头细胞。
[细胞生长测试]
向如上所述制备的毛乳头细胞中添加作为上述样品的氨基酸、氨基酸的组合、肽和胶原蛋白肽混合物，其最终浓度如表1和2所示，并且将毛乳头细胞在每孔中在37℃下培养72小时。在此，在含有如上所述制备的毛乳头细胞的孔之一中加入20μL纯化水，与其他毛乳头细胞一样，在37℃下培养72小时以制备对照试验样品(对照)。此后，对于含有纯化水或样品的孔中的每个毛乳头细胞，通过中性红法计数活细胞数(活细胞数)。这里，“中性红法”是如下所述的方法：将中性红以150μg/mL的终浓度添加到培养细胞的孔中，将细胞培养20分钟，用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)洗涤，向孔中加入200μL含有1质量％乙酸的50质量％乙醇溶液作为提取液，搅拌混合物，并且在540nm波长处测量含有中性红的孔的吸光度以测量孔中的活细胞数。
将含有样品的孔中毛乳头细胞的活细胞数相对于含有纯化水的孔中毛乳头细胞(对照试样)的活细胞数确定为细胞生长率(％)以评价样品中的毛乳头细胞生长促进作用。此外，对细胞生长率(％)进行统计处理以评价样品中的毛乳头细胞生长促进作用的显著性。对于显著性评估，使用软件(“Excel(Ver 2016)”(商品名)，Social Survey ResearchInformation Co.,Ltd.制造)进行统计处理，进行了Smirnov-Grubbs(双侧检验)，并且将显著性水平(P值)设为0.05作为阈值。此后，进行了学生t检验(t检验)以评估显著性。表1和表2示出了结果。在表1和表2中，带有“++”的样品被确定为对毛乳头细胞生长促进作用具有显著性。在带有“+”的样品中，细胞生长率(％)超过100。
[表1]
表1
Figure BDA0003439369940000181
Figure BDA0003439369940000191
[表2]
表2
Figure BDA0003439369940000192
Figure BDA0003439369940000201
<讨论>
由表1和表2可知，一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽、其盐或其化学修饰产物具有毛乳头细胞生长促进作用。含有氨基酸或肽的胶原蛋白肽混合物具有毛乳头细胞生长促进作用。此外，Pro和Hyp的氨基酸的组合以及Hyp和Gly的氨基酸的组合具有毛乳头细胞生长促进作用。这表明上述氨基酸和肽以及含有所述氨基酸和肽的胶原蛋白肽混合物作为毛发生长剂，特别是毛乳头细胞的细胞生长促进剂、头发的毛发发育或毛发生长促进剂，或脱发进展防止剂是有效的。
[实施例2：使用无毛小鼠确认毛发发育效果和毛发生长效果的试验(体内试验)]
30只8周龄雄性和雌性无毛小鼠购自Hoshino Laboratory Animals,Inc.。无毛小鼠被分为五组，每组由六只小鼠组成，不分性别。具体地，所述多个组由以下组成：给予正常饲料(商品名：“Labo MR Stock”，由Nosan Corporation制造)的正常组、给予缺镁特殊饲料(商品名：“HR-AD Feed”，由Nosan Corporation制造)的对照组、给予通过向缺镁的特殊饲料中添加0.3质量％的Pro-Hyp获得的混合饲料的第一组、给予通过向缺镁的特殊饲料中添加5质量％的胶原蛋白肽混合物A获得的混合饲料的第二组、以及给予通过向缺镁的特殊饲料中添加2.5质量％的后述组成的胶原蛋白肽混合物C而获得的混合饲料的第三组。
在上述条件下通过LC-MS/MS进行的定量分析发现胶原蛋白肽混合物C(由NittaGelatin Inc.开发的胶原蛋白肽混合物)包括以下组成。
Pro-Hyp:12,772ppm、Hyp-Gly:6,353ppm、Gly-Pro-Hyp:32,010ppm、Ala-Hyp-Gly:454ppm、Glu-Hyp-Gly:24ppm、Ser-Hyp-Gly:239ppm、Gly-Pro:26,387ppm、Pro-Ala-Gly:2,183ppm、总共：80,422ppm。
上述各组无毛小鼠在饲养3周至11周龄后立即在以下条件下观察头部：温度为23±2℃，相对湿度为55±10％，光照周期为12小时，光照周期从7:00开始到19:00结束，并允许小鼠自由进食。在这里，已知无毛小鼠在2周龄后开始脱毛，并在大约4周龄时无毛。在获得无毛小老鼠时，它们的头上没有毛。图1示出了在给予镁缺乏特殊饲料的对照组中的11周龄的无毛小鼠的头部。图2示出了在给予含Pro-Hyp的镁缺乏特殊饲料的第一组中的11周龄的无毛小鼠的头部。
结果，正如从图1和图2之间的比较所理解的，食用含有Pro-Hyp的混合饲料的无毛小鼠的头发发生毛发发育。
另外，开始脱毛前的2周龄的无毛小鼠获自Hoshino Laboratory Animals,Inc.，相对于定义为10的该无毛小鼠的头毛量，目测各组中每只11周龄无毛小鼠的头毛量。表3示出了结果。表中各数值代表每组6只无毛小鼠的头发量的平均值。
[表3]
表3
组 评分
正常组 0
对照组 0
第一组 8
第二组 3
第三组 7
[讨论]
上述结果表明，Pro-Hyp、胶原蛋白肽混合物A和胶原蛋白肽混合物C具有毛乳头细胞生长促进作用，因此作为生发剂是有效的，特别是作为毛乳头细胞的细胞生长促进剂、头发的毛发发育或毛发生长促进剂，或脱发进展防止剂。
[实施例3：对照测试(细胞生物学测试(体外测试)]
[样品的制备]
<氨基酸、肽和胶原蛋白肽混合物的制备>
作为用于评价毛乳头细胞生长促进作用的样品，制备了：丙氨酸(商品名：“L-丙氨酸”，Kanto Kagaku Co.,Inc.制造，货号：01101-30)、精氨酸(商品名：“L-精氨酸”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，货号：015-04613)、谷氨酰胺(商品名：“L-谷氨酰胺”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，货号：074-00522)和脯氨酸(商品名：“L-脯氨酸”，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造，货号：161-04602)。
<毛乳头细胞的制备>
毛乳头细胞通过与上述实施例1中<毛乳头细胞的制备>部分所述相同的方法制备。
[细胞生长测试]
以与上述实施例1的[细胞生长测试]部分中所述相同的方式评价各样品(氨基酸)中的毛乳头细胞生长促进作用和显著性。表4示出了结果。在任一样品中，均未表现出显著的毛乳头细胞生长促进作用。
[表4]
表4
Figure BDA0003439369940000221
Figure BDA0003439369940000231
[讨论]
由图4可知，丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸的毛乳头细胞生长促进作用差，仅Hyp等特定氨基酸具有毛乳头细胞生长促进作用。
尽管上面已经描述了本发明的实施方案和实施例，但是可以如最初设想的那样适当地组合上述实施方案和实施例的配置。
本文公开的实施方案和实施例应被认为是说明性的，而不是以任何方式进行限制。本发明的范围由所附权利要求书而不是前述说明书给出，并且落入所附权利要求书及其等同物范围内的所有改变均包含在其中。

Claims (7)

1.一种生发剂，其包含一种或多种选自由Hyp、Pro-Hyp、Hyp-Gly、Gly-Pro、Leu-Hyp、Phe-Hyp、Pro-Ala、Pro-Gly、Pro-Pro、Glu-Hyp、Gly-Pro-Hyp、Ala-Hyp-Gly、Glu-Hyp-Gly、Pro-Ala-Gly和Ser-Hyp-Gly组成的组的氨基酸或肽，其盐或其化学修饰产物。
2.根据权利要求1所述的生发剂，其中所述氨基酸和肽源自胶原蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的生发剂，其中所述生发剂是含有至少一种所述氨基酸或肽的胶原蛋白肽混合物。
4.根据权利要求3所述的生发剂，其中所述胶原蛋白肽混合物的重均分子量为100Da以上且8000Da以下。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的生发剂，其中所述生发剂为毛乳头细胞的细胞生长促进剂。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的生发剂，其中所述生发剂是头发的毛发发育或毛发生长促进剂，或脱发进展防止剂。
7.一种食品或饮品，其包含根据权利要求1-6的任一项所述的生发剂。
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