TW202228756A - 老化之進行抑制劑、及包含其之飲食品 - Google Patents

Abstract

本發明之老化之進行抑制劑含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。

Description

老化之進行抑制劑、及包含其之飲食品

本發明係關於一種老化之進行抑制劑、及包含其之飲食品。

作為老化原因之一，可列舉活性氧類、過氧化物等對各種細胞帶來之氧化壓力。例如，據下述非專利文獻1報告，由於上述活性氧類或過氧化物於構成毛囊之細胞中蓄積，故導致頭髮變白(以下亦記為「脫色素化」)。進而，據下述非專利文獻2及下述非專利文獻3報告，17型膠原蛋白之減少促進了老化所導致之頭髮之脫落及脫色素化。日本專利特開2009-161509號公報(專利文獻1)揭示了17型膠原蛋白具有抑制頭髮之脫落及脫色素化之功能。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2009-161509號公報 [非專利文獻]

[非專利文獻1]J M Wood et al., FASEB J, 2009年, Vol 23, No.7, pp.2065-75 [非專利文獻2]Matsumura H et al., Science, 2016年, Vol 351, pp.575, add4395-1,2 [非專利文獻3]Tanimura S et al., Cell Stem Cell, 2011年, Vol 8, pp.177-87

[發明所欲解決之問題]

另一方面，使用公知之蛋白質分解酶對膠原蛋白或明膠進行水解而獲得之膠原蛋白肽混合物是眾所周知的。據報告，該膠原蛋白肽混合物於生物體內之關節、骨、軟骨、皮膚等中具有各種生理活性。然而，迄今為止，並未報告上述膠原蛋白肽混合物具有抑制頭髮之脫落及脫色素化之作用。又，作為顯示出自生物體去除活性氧類、過氧化物之所謂抗氧化作用之肽，已知有麩胱甘肽，但目前尚未有報告稱上述膠原蛋白肽混合物參與該麩胱甘肽之合成。因此，正在銳意研究探索抑制老化之進行之作用、具體而言為上述抑制頭髮之脫落及脫色素化之作用、促進麩胱甘肽之合成之作用等作為膠原蛋白肽混合物、及其所含之來自膠原蛋白之肽所具有之新的生理活性。

鑒於上述實際情況，本發明之目的在於提供一種老化之進行抑制劑、及包含其之飲食品，上述老化之進行抑制劑藉由包含發揮促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種之肽等，可獲得抑制頭髮之脫落及脫色素化之效果、或增強抗氧化作用之效果。 [解決問題之技術手段]

本發明者於探索膠原蛋白肽混合物所具有之新的生理活性之過程中，發現膠原蛋白肽混合物中所含之規定之肽發揮促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種。基於該見解，得出一種可藉由包含上述肽而獲得抑制頭髮之脫落及脫色素化之效果、或增強抗氧化作用之效果的老化之進行抑制劑，並且完成本發明。

本發明具體而言如下所述。 本發明之老化之進行抑制劑含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。

上述肽較佳為來自膠原蛋白。 上述老化之進行抑制劑較佳為包含上述肽之膠原蛋白肽混合物。

上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量較佳為100 Da以上5000 Da以下。

上述老化之進行抑制劑較佳為17型膠原蛋白之基因表現促進劑、或麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑。

本發明之飲食品包含上述老化之進行抑制劑。 [發明之效果]

根據本發明，可提供一種可獲得抑制頭髮之脫落及脫色素化之效果、或增強抗氧化作用之效果的老化之進行抑制劑、及包含其之飲食品。

以下，於本發明之實施方式中進一步詳細地說明。此處，於本說明書中，「A～B」這一形式之記法係指範圍之上限下限(即，A以上B以下)，未於A處記載單位而僅於B處記載單位時，A之單位與B之單位相同。

[老化之進行抑制劑] 本發明之老化之進行抑制劑含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。具備此種特徵之老化之進行抑制劑可發揮促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種，並且可獲得抑制頭髮之脫落及脫色素化之效果、或增強抗氧化作用之效果。

[Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體] 如上所述，老化之進行抑制劑含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。於本說明書中，關於構成上述肽之「胺基酸」，若無特別註明，則以三個字母符號之簡稱表示。進而，若無特別註明，則「胺基酸」係指L型胺基酸。進而，於本說明書中，「肽」若為例如「Gly-Pro」，則係指自N末端側向C末端側依次排列有甘胺酸、脯胺酸之肽(二肽)，若為「Glu-Hyp-Gly」，則係指自N末端側向C末端側依次排列有麩胺酸、羥基脯胺酸、甘胺酸之肽(三肽)。該情況對於除「Gly-Pro」及「Glu-Hyp-Gly」以外之肽之記載亦同樣如此。

老化之進行抑制劑較佳為含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly此兩者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。於此情形時，老化之進行抑制劑可更顯著地顯示出促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用。

上述肽之「鹽」例如形成為上述肽之鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽，甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽等有機酸鹽，鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等無機鹼鹽，三乙基銨鹽等有機鹼鹽等。

上述肽之「化學修飾體」係指作為結構單元之胺基酸殘基所具有之游離官能基被化學修飾而成之化合物。化學修飾例如可對羥基脯胺酸之羥基、N端(胺基末端)側之胺基酸之胺基及C端(羧基末端)側之胺基酸之羧基執行。化學修飾之具體手段及其處理條件應用以先前公知之胺基酸及肽為對象之化學修飾技術。藉由此種化學修飾，上述胺基酸及肽之化學修飾體可發揮在弱酸性至中性中的溶解性提高之效果、與其他有效成分之相容性提高之效果等。

例如可對三肽Glu-Hyp-Gly進行O-乙醯化等作為羥基脯胺酸中羥基之化學修飾。該O-乙醯化例如可藉由在水溶劑中或非水溶劑中使乙酸酐作用而執行。作為甘胺酸中羧基之化學修飾，可進行酯化、醯胺化等。上述酯化可藉由將上述肽懸浮於甲醇後，於其中通入乾燥氯化氫氣體而執行。上述醯胺化可藉由使碳二醯亞胺等作用於上述肽而執行。

進而，作為肽中之游離胺基之化學修飾，可進行甲基化。作為肽中之游離羥基之化學修飾，可進行磷酸化及硫酸化中之至少任一者。

上述肽較佳為來自膠原蛋白。於此情形時，作為原料之膠原蛋白可藉由對例如以牛、豬、羊、雞、鴕鳥等為代表之動物的皮、皮膚、骨、軟骨、肌腱等，或魚類之骨、皮、鱗等執行先前公知之脫脂或脫鈣處理、萃取處理等而獲得。進而，作為上述肽之原料，亦可使用明膠。明膠可藉由熱水萃取等先前公知之方法對以上述方式獲得之膠原蛋白進行處理而獲得。膠原蛋白及明膠亦可使用市售者作為原料。

上述肽可藉由將內型蛋白酶及外型蛋白酶之2種以上組合，對上述膠原蛋白及明膠之兩者或任一者並進行水解而獲得。上述肽藉由上述水解而以與其他膠原蛋白肽混合存在之膠原蛋白肽混合物之形態獲得，可將該膠原蛋白肽混合物本身、及將其部分純化所得之混合物用作本發明之老化之進行抑制劑。即，老化之進行抑制劑較佳為膠原蛋白肽混合物。進而，藉由將上述膠原蛋白肽混合物進一步純化，能夠以高純度獲得包含上述肽之純化物。於上述肽來自膠原蛋白之情形時，較佳為藉由使用將下述膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理之方法而獲得。

進而，上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量較佳為100 Da以上5000 Da以下。上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量更佳為120 Da以上3500 Da以下，進而較佳為150 Da以上3000 Da以下。於上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量為上述範圍內之情形時，老化之進行抑制劑可更充分地獲得促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用。於上述重量平均分子量超過5000 Da之情形時，有老化之進行抑制劑之上述效果變得不充分之虞。

上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量可藉由在以下測定條件下執行尺寸排除層析法(SEC)而求出。 機器：高效液相層析儀(HPLC)(東曹股份有限公司製造) 管柱：TSKgel(註冊商標)G2000SW _XL管柱溫度：40℃ 管柱尺寸：7.8 mmI.D.×30 cm、5 μm 溶離液：45質量%乙腈(包含0.1質量%三氟乙酸) 流速：1.0 mL/min 注入量：10 μL 檢測：UV214 nm 分子量標記：使用以下5種 細胞色素C(Cytochrom C)        Mw：12000 抑肽酶(Aprotinin)                  Mw：6500 桿菌肽(Bacitracin)                 Mw：1450 Gly-Gly-Tyr-Arg                   Mw：451 Gly-Gly-Gly                         Mw：189。

具體而言，將包含約0.2 g上述膠原蛋白肽混合物之試樣添加至約100 ml之蒸餾水中並攪拌後，使用0.2 μm過濾器進行過濾，藉此製備測定重量平均分子量之試樣(被測定物)。藉由將該被測定物供至上述尺寸排除層析法，可求出上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量。

[老化之進行抑制劑之製造方法] 老化之進行抑制劑中所含之上述肽可藉由先前公知之方法獲得。例如上述肽可藉由購入市售之胺基酸而獲得。上述肽亦可藉由使用將膠原蛋白或明膠水解之方法而獲得。

上述肽(Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者)分別可藉由使用先前公知之液相或固相肽合成方法、或將膠原蛋白或明膠水解之方法而獲得。就效率性之觀點而言，上述肽較佳為金額有如下方法製造：使用下述胺基酸之化學合成方法、或將下述膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理之方法。進而，上述肽亦可藉由使用省略一元酶並僅利用二元酶進行酶處理之方法、同時進行利用一元酶及二元酶之酶處理之方法而製造，代替將膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理之方法。以下，將從老化之進行抑制劑中所含之肽中著眼於「Glu-Hyp-Gly」，將其製造方法作為老化之進行抑制劑中所含之肽之製造方法之例示進行說明。

＜化學合成方法＞ 上述肽可使用一般之肽合成法而獲得。作為該肽合成法，已知有固相合成法及液相合成法。固相合成法已知有Fmoc法及Boc法。使用Fmoc法及Boc法中之任一方法皆可獲得上述肽。作為肽之固相合成法，Glu-Hyp-Gly所表示之三肽之合成方法可以如下方式進行。

首先，準備表面經胺基修飾之直徑0.1 mm左右之聚苯乙烯高分子凝膠珠粒作為固相。另外準備二異丙基碳二醯亞胺作為縮合劑。繼而，利用Fmoc(茀基甲氧基羰基，fluorenyl-methoxy-carbonyl)基保護上述胺基酸序列中C端(羧基末端)側之作為胺基酸之甘胺酸之胺基，並且藉由使用上述縮合劑之脫水反應使上述甘胺酸之羧基與上述固相之上述胺基進行肽鍵結。進而，利用溶劑將上述固相洗淨，藉此去除殘存之縮合劑及胺基酸後，將肽鍵結於上述固相之甘胺酸的胺基之保護基去除(去保護)。

接下來，準備胺基被Fmoc基保護之羥基脯胺酸，藉由使用上述縮合劑使該羥基脯胺酸之羧基與上述甘胺酸之去保護之胺基進行肽鍵結。之後，以同樣之要領執行上述羥基脯胺酸之胺基之去保護、經Fmoc基保護之麩胺酸之準備、及使該麩胺酸與上述羥基脯胺酸進行肽鍵結之反應，藉此於上述固相中合成Glu-Hyp-Gly所表示之三肽。最後，進行上述麩胺酸之胺基之去保護，進而利用三氟乙酸進行溫浸，使上述三肽自上述固相中分離，藉此可製造上述三肽。

＜使用膠原蛋白或明膠之製造方法＞ 進而，藉由將膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理而製造Glu-Hyp-Gly所表示之三肽之方法可以如下方式進行。

此處，將膠原蛋白或明膠「分2個階段進行酶處理」之含義如下。即，藉由切斷膠原蛋白或明膠之肽鍵的先前公知之方法執行一級酶處理後，藉由具有胺肽酶N活性之酶、兼具胺肽酶N活性及脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶、或具有胺肽酶N活性之酶與具有脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶之組合執行二級酶處理。藉由執行一級酶處理，可獲得膠原蛋白肽混合物前驅物。進而，藉由執行二級酶處理，可自上述膠原蛋白肽混合物前驅物獲得包含上述Glu-Hyp-Gly之膠原蛋白肽混合物。關於將膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理之方法，以下進一步進行詳細敍述。

(一級酶處理) 作為一級酶處理中所使用之酶，只要為能夠切斷膠原蛋白或明膠之肽鍵的酶，則無特別限定，可使用任意之蛋白質分解酶。具體而言，可列舉膠原酶、硫醇蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、酸性蛋白酶、鹼性蛋白酶、金屬蛋白酶等，可單獨使用選自該等之群中之1種，亦可併用2種以上。作為上述硫醇蛋白酶，可使用來自植物之木瓜凝乳酶、木瓜酶、鳳梨蛋白酶、無花果蛋白酶，來自動物之組織蛋白酶、鈣依賴性蛋白酶等。作為絲胺酸蛋白酶，可使用胰蛋白酶、組織蛋白酶D等。作為酸性蛋白酶，可使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等。作為一級酶處理中所使用之酶，於考慮將本發明之老化之進行抑制劑用於醫藥、特定保健用食品等之情形時，較佳為不使用來自病原微生物之酶，而使用除此以外之酶。

作為一級酶處理中之酶量，例如較佳為將上述酶設為相對於膠原蛋白或明膠100質量份為0.1～5質量份。較佳為將一級酶處理中之處理溫度設為30～65℃，將處理時間設為10分鐘～72小時。藉由上述一級酶處理而獲得之膠原蛋白肽混合物前驅物之重量平均分子量較佳為500～20000 Da，更佳為500～10000 Da，進而較佳為500～8000 Da。若重量平均分子量為上述範圍，則可以說充分地生成了分子量適當之肽。於一級酶處理後，可視需要使酶失活。作為此時之失活溫度，較佳為設為例如70～100℃。膠原蛋白肽混合物前驅物之重量平均分子量可藉由上述使用SEC之方法而求出。

(二級酶處理) 作為二級酶處理中所使用之酶，可列舉：具有胺肽酶N活性之酶、兼具胺肽酶N活性及脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶、或具有胺肽酶N活性之酶與具有脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶之組合。此處，本說明書中「具有胺肽酶N活性之酶」係指具有使胺基酸自肽鏈之N端側游離之作用之肽酶，係當除脯胺酸或羥基脯胺酸以外之胺基酸存在於自N端側起的第2位時發揮作用之酶。本說明書中「具有脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶」係指僅使N端側之第3個胺基酸殘基從N端側的第3位為脯胺酸或羥基脯胺酸之肽游離之肽酶。作為二級酶處理中所使用之酶，於考慮將本發明之老化之進行抑制劑用於醫藥、特定保健用食品等之情形時，亦較佳為不使用來自病原微生物之酶，而使用除此以外之酶。

作為具有胺肽酶N活性之酶，例如可列舉胺肽酶N(EC3.4.11.2.; T.Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem., 52:217-225(1988))等。又，例如可列舉來自麴菌(Aspergillus)屬之具有胺肽酶N活性之酶。作為具有脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶，例如可列舉脯胺醯三肽胺基肽酶(EC3.4.14.; A.Banbula et al., J.Biol. Chem., 274:9246-9252(1999))等。

藉由執行二級酶處理，可獲得包含上述膠原蛋白肽混合物前驅物中未包含之肽之膠原蛋白肽混合物。具體而言，可獲得包含上述Glu-Hyp-Gly之膠原蛋白肽混合物。

作為二級酶處理中之酶量，例如較佳為將上述酶設為相對於上述膠原蛋白肽混合物前驅物100質量份為0.01～5質量份。較佳為將二級酶處理中之處理溫度設為30～65℃，將處理時間設為10分鐘～72小時。藉由上述二級酶處理而獲得之膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量較佳為100～5000 Da，更佳為120～3500 Da，進而較佳為150～3000 Da。膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量亦可藉由上述使用SEC之方法而求出。

二級酶處理以生成上述三肽Glu-Hyp-Gly為主要目的而執行。因此，較佳為以使上述膠原蛋白肽混合物前驅物中所含之肽不過度水解之方式調整二級酶處理中之酶量、處理溫度、處理時間及pH值。較佳為藉此將膠原蛋白肽混合物設為上述重量平均分子量之範圍內。於二級酶處理後，需要使酶失活。作為此時之失活溫度，例如較佳為70～100℃。較佳為進而於120℃下進行數秒以上之殺菌處理。又，亦可對其施加200℃以上之熱而進行噴霧乾燥。

於二級酶處理中，除上述具有胺肽酶N活性之酶、具有脯胺醯三肽胺基肽酶活性之酶以外，可使用兼具不同活性之酶，且亦可併用2種以上具有不同活性之酶。藉此可將副產物分解去除。作為此時所使用之酶，較佳為根據作為原料之膠原蛋白之種類、一級酶處理中所使用之酶之種類而適當選擇。作為上述不同活性，例如可列舉脯肽酶活性、羥基脯肽酶活性等二肽酶活性。藉此可將作為副產物之二肽等分解去除。

進而，胺肽酶N活性基本上是使N末端側之胺基酸逐一游離之活性。因此，於藉由一級酶處理而獲得之膠原蛋白肽混合物前驅物中包含分子量極大之肽之情形時，當僅藉由具有胺肽酶N活性之酶執行二級酶處理時，該處理時間顯著變長。為了應對此種情形，可於二級酶處理中使用例如脯胺醯寡肽酶，其係具有將脯胺酸之羧基側水解之活性(脯肽酶活性)之內肽酶。藉此可有效率地進行二級酶處理。

於將膠原蛋白或明膠分2個階段進行酶處理之方法中，可藉由一級酶處理生成分子量相對較大之肽。該肽例如可具有[X ₁-Gly-X ₂-Glu-Hyp-Gly](X ₁及X ₂≠Hyp)所表示之胺基酸序列。於接下來之二級酶處理中，具有胺肽酶N活性之酶作用於上述[X ₁-Gly-X ₂-Glu-Hyp-Gly]所表示之肽，使N末端之X ₁游離，藉此獲得具有[Gly-X ₂-Glu-Hyp-Gly]所表示之胺基酸序列之肽。繼而，具有胺肽酶N活性之酶再次作用於上述[Gly-X ₂-Glu-Hyp-Gly]所表示之肽，使甘胺酸及X ₂游離，藉此獲得[Glu-Hyp-Gly]所表示之肽。

(膠原蛋白肽混合物之純化) 藉由執行上述2個階段之酶處理，可製造包含Glu-Hyp-Gly之膠原蛋白肽混合物。上述膠原蛋白肽混合物亦包含除Glu-Hyp-Gly所表示之三肽以外之肽，因此較佳為視需要進行純化。作為此時之純化方法，可使用先前公知之方法，例如可使用超過濾、尺寸排除層析法、離子交換層析法、逆相層析法、親和層析法等各種液相層析法等。

具體而言，可藉由以下操作對膠原蛋白肽混合物進行純化。即，將約2 g/10 mL上述膠原蛋白肽混合物負載於離子交換管柱(例如商品名：「Toyopearl(註冊商標)DEAE-650」、東曹股份有限公司製造)後，回收溶出於蒸餾水中之第1空隙體積組分。繼而，將第1空隙體積組分負載於具有與上述離子交換管柱相反之離子交換基的管柱(例如商品名：「Toyopearl(註冊商標)SP-650」、東曹股份有限公司製造)後，回收溶出於蒸餾水中之第2空隙體積組分。

繼而，將第2空隙體積組分負載於凝膠過濾管柱(例如商品名：「Sephadex LH-20」、GE Healthcare Japan股份有限公司製造)，以30質量%甲醇水溶液進行溶出，藉此回收包含三肽Glu-Hyp-Gly之組分。最後，對於對該組分，使用裝填有逆相管柱(例如商品名：「μBondasphere 5μC18 300Å管柱」、Waters公司製造)之高效液相層析法(HPLC)，藉由包含0.1質量%三氟乙酸之32質量%以下之乙腈水溶液之直線濃度梯度進行區分，藉此能夠以高純度獲得Glu-Hyp-Gly。

[17型膠原蛋白之基因表現促進劑或麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑] 本發明之老化之進行抑制劑較佳為17型膠原蛋白之基因表現促進劑、或麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑。老化之進行抑制劑如上所述含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。藉此可發揮促進17型膠原蛋白之基因表現之作用。因此，老化之進行抑制劑可作為17型膠原蛋白之基因表現促進劑而促進17型膠原蛋白之基因表現，並且抑制頭髮之脫落及脫色素化。17型膠原蛋白之基因表現促進劑促進17型膠原蛋白之基因表現，因此可期待抑制老年性毛髮稀少、脫髮及白髮之進行之效果、及促進美膚之效果等。

進而，老化之進行抑制劑含有上述肽、或其鹽、或其化學修飾體，因此，可發揮促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用。因此，老化之進行抑制劑可作為麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑而促進麩胱甘肽合成酶之基因表現，並且自生物體內去除活性氧類、過氧化物等。麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑可自生物體內去除活性氧類、過氧化物等，因此亦可期待發揮基於抑制炎症所引起之色素沈積的美白、基於抑制濕疹等之美膚、促進角膜損傷之治癒、改善肝功能及改善帕金森氏症等效果。

老化之進行抑制劑可經口或非經口地以各種形態投予。作為該形態，於經口投予之情形時，例如可製成錠劑、顆粒劑、膠囊劑、粉劑、液劑、懸浮製劑、乳化製劑等劑型。進而，亦可將上述劑型之老化之進行抑制劑與飲食品混合。老化之進行抑制劑包含上述肽，但該等於腸道中會被迅速吸收，故而能以經口投予之方式攝取。

老化之進行抑制劑於非經口投予之情形時，例如可製成軟膏、霜劑、洗劑等外用劑、經皮劑等劑型。進而，亦可製成用以直接塗抹於頭皮之液劑或塗佈劑。於將老化之進行抑制劑做成塗佈劑之情形時，塗佈劑中所含之上述肽等之濃度較佳為0.001～5質量%。

老化之進行抑制劑之投予量會因對象者之年齡、性別、體重、敏感性差異、投予方法、投予間隔、製劑之種類等而有所不同。於經口投予上述老化之進行抑制劑之情形時，投予量例如較佳為成人每日0.0001～2500 mg/kg，更佳為0.0001～500 mg/kg。老化之進行抑制劑於其劑型為例如錠劑之情形時，製成每錠包含0.001～80質量%之老化之進行抑制劑之錠劑，於其劑型為例如粉劑之情形時，可製成包含0.001～100質量%之老化之進行抑制劑之粉劑。關於上述投予量，於非經口投予之情形時，以其他形態之製劑進行投予時，可參考經口投予時之投予量來適當確定。老化之進行抑制劑可分為每日1次～數次進行投予，或亦可每日～數日投予1次。

老化之進行抑制劑可於不對本發明之效果造成不良影響之範圍內適當含有其他有效成分、製劑用載體等。作為其他有效成分，可列舉：菊糖、咖啡酸、奎尼酸及該等之衍生物、來自馬郁蘭之萃取物、羅勒、瓜子金(遠志)及白眉草、假鷹爪等各種天然藥、蜂王漿、來自紫錐菊之萃取物、來自阿薩伊漿果之萃取物、來自大花可可之萃取物等。進而，作為製劑化成醫藥製劑時所使用之藥學上容許之載體，可列舉：稀釋劑、結合劑(糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃芪膠、聚乙烯吡咯啶酮)、賦形劑(乳糖、蔗糖、玉米澱粉、磷酸鉀、山梨糖醇、甘胺酸)、潤滑劑(硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、矽石)、崩解劑(馬鈴薯澱粉)及濕潤劑(月桂基硫酸鈉)等。

[用途發明] 本發明之老化之進行抑制劑如上所述含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。老化之進行抑制劑可發揮作為上述肽之屬性的促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種。換言之，本發明可以說是一種基於上述屬性新發現抑制老化之進行之用途的肽、或其鹽、或其化學修飾體。

[飲食品] 本發明之飲食品包含上述老化之進行抑制劑。例如較佳為老化之進行抑制劑中所含之上述肽如上所述地會在腸道中被迅速吸收，故而能以經口投予之方式攝取。因此，本發明可作為包含上述老化之進行抑制劑之飲食品混合在膳食或飲料中以供攝取。進而，本發明之老化之進行抑制劑亦可用作特定保健用食品、或功能性食品。作為飲食品中所含之老化之進行抑制劑之濃度，較佳為0.001～100質量%。 [實施例]

以下，列舉實施例對本發明更詳細地進行說明，但本發明並不限定於該等。

[實施例1] [試樣之準備] ＜肽及膠原蛋白肽混合物之準備＞ 藉由利用上述方法製造、或自下述製造商獲取以下之表1～4中所示之肽及膠原蛋白肽混合物來準備。上述肽及膠原蛋白肽混合物係用以評估是否對下述表皮細胞中之17型膠原蛋白基因之信使RNA量(mRNA量)、及麩胱甘肽合成酶基因之mRNA量造成影響之檢體。

此處，表1及表2中所示之肽使用以一個字母表示構成其之胺基酸之簡稱。表1中，「EO」為麩胺酸-羥基脯胺酸所表示之二肽(PH Japan股份有限公司製造)。「GP」為甘胺酸-脯胺酸所表示之二肽(商品名：「G-3015」、BACHEM公司製造)。「EOG」為麩胺酸-羥基脯胺酸-甘胺酸所表示之三肽(PH Japan股份有限公司製造)。

進而，表3中所示之膠原蛋白肽混合物A(商品名：「Collapep PU」、新田明膠股份有限公司製造、重量平均分子量(Mw)：約630 Da)於下述條件下執行之LC-MS/MS之定量分析中，以下述量包含「EOG」及「GP」。 Glu-Hyp-Gly：4 ppm、Gly-Pro：2379 ppm、合計：2383 ppm。

繼而，表4中所示之膠原蛋白肽混合物B(商品名：「TYPE-S」、新田明膠股份有限公司製造、重量平均分子量(Mw)：約750 Da)於下述條件下執行之LC-MS/MS之定量分析中，以下述量包含「EOG」及「GP」。 Glu-Hyp-Gly：9 ppm、Gly-Pro：1159 ppm、合計：1168 ppm。

表4中所示之膠原蛋白肽混合物C係新田明膠股份有限公司正在開發中之膠原蛋白肽混合物(重量平均分子量(Mw)：約450 Da)，於下述條件下執行之LC-MS/MS之定量分析中，以下述量包含「EOG」及「GP」。 Glu-Hyp-Gly：24 ppm、Gly-Pro：26387 ppm、合計：26411 ppm。

LC-MS/MS之定量分析於以下條件下執行。 HPLC裝置：「ACQUITY UPLC H-Class Bio」(Waters Corporation製造) 管柱：「Hypersil GOLD PFP 2.1×150 mm、5 μm(Thermo Fisher Scientific. Inc製造) 管柱溫度：40℃(線性梯度) 流動相：(A)含有0.2%甲酸及2 mM乙酸銨之水溶液 (B)100%甲醇 (梯度設定) Time(分鐘)       流速(μL/分鐘)     流動相(A)之質量% 初始                 200                    98 3.50                 200                    98 3.51                 400                    5 7.00                 400                    5 7.10                 200                    98 17.00               200                    98 注入量：0.5 μl。

MS/MS裝置：「Xevo TQ-XS」，Waters Corporation公司製造 離子化法：正ESI(electron spray ionization，電灑離子化法) 毛細管 (kV)：1 脫溶劑溫度(℃)：500 源溫度(℃)：150 MRM條件： 肽(簡稱)                前驅物離子(m/z)       產物離子(m/z) Gly-Pro(GP)                         173                    116 Glu-Hyp-Gly(EOG)                318                    225。

＜表皮細胞之準備＞ 首先，獲取人類正常表皮角化細胞NHEK(NB)(倉敷紡織股份有限公司製造)作為表皮細胞。將上述細胞分別以1.25×10 ⁴個(具有0.25×10 ⁴細胞/mL之濃度的細胞分散液5 mL)之量播種於所需數量之市售之ϕ60 mm培養皿中，並藉由無血清培養基(商品名：「HuMedia KG-2」、倉敷紡織股份有限公司製造)培養2日。繼而，確認上述細胞於上述培養皿內亞融合後，將上述培養皿內之培養基替換成基礎培養基(商品名：「HuMedia KB-2」、倉敷紡織股份有限公司製造)。藉此準備用以評估17型膠原蛋白基因之mRNA量、及麩胱甘肽合成酶基因之mRNA量之表皮細胞。

＜基因表現試驗＞ 針對各培養皿中之基礎培養基，分別以成為表1～4所示之濃度之方式添加上述肽或膠原蛋白肽混合物，並且於37℃、二氧化碳濃度為5體積%之氛圍下培養72小時，藉此準備供於基因表現試驗之各試樣。又，針對上述培養皿中之基礎培養基，準備僅添加有離子交換水之對照試樣(以下，亦記為「Blank」)。關於該對照試樣，亦於37℃、二氧化碳濃度5體積%之氛圍下培養72小時。

繼而，按照上述套組中附帶之操作流程使用RNA提取套組(商品名：「TRIzol(註冊商標)Reagent」、Life Technologies Japan股份有限公司製造)，藉此自上述培養皿中之表皮細胞提取總RNA，並針對上述各試樣獲得包含總RNA之提取物。繼而，針對該提取物中之RNA，按照上述套組中附帶之操作流程使用cDNA製作套組(商品名(商品號)：「High Capacity RNA-to-cDNA Kit(4387406)」、Life Technologies Japan股份有限公司製造)，藉此執行反轉錄，自上述提取物中之RNA獲得cDNA。進而，針對上述cDNA，藉由DNA擴增裝置(商品名：「Step One Plus(TM)即時PCR系統」、Applied Biosystems製造)執行即時(RT)-PCR。

於上述RT-PCR中，測定作為靶基因之17型膠原蛋白(Life Technologies Japan股份有限公司製造、引子：Hs009900361_ml)、及麩胱甘肽合成酶(GSS、Life Technologies Japan股份有限公司製造、引子：Hs01547656_ml)之mRNA量。選擇GAPDH作為內部標準(校正基因)。mRNA量之計算使用校準曲線法。用於上述RT-PCR之引子及探針使用試劑套組(商品名：「TaqMan(註冊商標) Gene Expression Assays」、Applied Biosystems公司製造)中所附帶者。

以如下方式解析自上述RT-PCR獲得之資料。首先，於各試樣及對照試樣中，分別算出上述2種靶基因(17型膠原蛋白及麩胱甘肽合成酶)之mRNA量(基因表現量)。繼而，用作為校正基因之GAPDH之mRNA量校正2種靶基因之mRNA量，藉此獲得各試樣及對照試樣之校正值。具體而言，分別求出2種靶基因之mRNA量除以GAPDH之mRNA量所得之值(相對值)。

繼而，將對照試樣之校正值設為100，求出各試樣所獲得之校正值相對於上述對照試樣之校正值之比率(基因表現上升率(%))。藉此評估基於在上述表皮細胞中添加上述肽及膠原蛋白肽混合物而對17型膠原蛋白基因之mRNA量、及麩胱甘肽合成酶基因之mRNA量之影響(有無基因表現促進作用)。

進而，藉由對上述基因表現上升率(%)進行統計處理，評估各試樣中之17型膠原蛋白基因及麩胱甘肽合成酶基因之基因表現促進作用之顯著性。關於該顯著性之評估，統計處理使用軟體(商品名：「excel統計(Ver2.1)」、Social Survey Research Information股份有限公司製造)執行Smirnov-Grubbs(雙側檢定)，且將閾值設定為0.01作為顯著水準(P值)。其後，藉由執行Student's t-test(t檢定)進行判斷。將結果示於表1～4。於表1～4中，對於標附有「++」之試樣，判斷為上述基因之表現促進作用具有顯著性。於標附有「+」之試樣中，基因表現上升率(%)超過100。對於標附有「-」之試樣，判斷為上述基因之表現促進作用不具有顯著性。

此處，表1表示將肽「EO」、「GP」及「EOG」分別添加於表皮細胞時之17型膠原蛋白基因之基因表現上升率。表2表示將肽「GP」及「EOG」分別添加於表皮細胞時之麩胱甘肽合成酶基因之基因表現上升率。表3表示將上述「膠原蛋白肽混合物A」分別添加於表皮細胞時之17型膠原蛋白基因之基因表現上升率。表4表示將上述「膠原蛋白肽混合物B」及「膠原蛋白肽混合物C」分別添加於表皮細胞時之麩胱甘肽合成酶基因之基因表現上升率之增加量。

[表1]

表1
肽(試樣)	含量 (最終濃度)	基因表現上升率	對照比 t檢定	判定
Blank	0 mM	100 ± 0.87	-	-
EO	1 mM	100 ± 6.46	0.934	-
GP	1 mM	201 ± 8.42	0.00007	+ +
EOG	1 mM	144 ± 17.01	0.024	+

[表2]

表2
肽(試樣)	含量 (最終濃度)	基因表現上升率	對照比 t檢定	判定
Blank	0 mM	100 ± 11	-	-
GP	1 mM	106 ± 2	0.292	+
EOG	1 mM	131 ± 10	0.024	+

[表3]

表3
膠原蛋白肽混合物(試樣)	含量(質量%) (最終濃度)	基因表現上升率	對照比 t檢定	判定
Blank	-	100 ± 5.08	-	-
膠原蛋白肽混合物A	0.05%	132 ± 5.08	0.03	+

[表4]

表4
膠原蛋白肽混合物(試樣)	含量(質量%) (最終濃度)	基因表現上升率	對照比 t檢定	判定
Blank	-	100 ± 11	-	-
膠原蛋白肽混合物B	0.5%	189 ± 10	0.001	++
膠原蛋白肽混合物C	0.5%	202 ± 5	0.0003	++

[考察] 根據表1～4可理解，含有Gly-Pro(GP)及Glu-Hyp-Gly(EOG)之兩者或任一者之肽的試樣具有促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種。包含該等肽之膠原蛋白肽混合物A～C亦具有促進17型膠原蛋白之基因表現之作用、或促進麩胱甘肽合成酶之基因表現之作用中之至少任一種。另一方面，含有Glu-Hyp(EO)所表示之肽之試樣並未顯示出明確之促進17型膠原蛋白之基因表現之作用。藉此得出如下啟示：上述肽Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly、以及包含該等之膠原蛋白肽混合物作為老化之進行抑制劑而促進了17型膠原蛋白之基因表現，因此具有抑制頭髮之脫落及脫色素化之效果。進而得出如下啟示：上述肽、及包含該等之膠原蛋白肽混合物作為老化之進行抑制劑而促進麩胱甘肽合成酶之基因表現，因此具有促進麩胱甘肽之合成並自生物體內去除活性氧類、過氧化物等之抗氧化效果。

[實施例2] [試樣之準備] ＜膠原蛋白肽混合物之準備＞ 準備膠原蛋白肽混合物D(商品名：「Collagenaid」、新田明膠股份有限公司製造、重量平均分子量(Mw)：約4000 Da)作為含有Gly-Pro(GP)及Glu-Hyp-Gly(EOG)之兩者或任一者之肽的膠原蛋白肽混合物。於與上述[實施例1]相同之條件下執行之LC-MS/MS之定量分析中，膠原蛋白肽混合物D合計包含132 ppm之「EOG」及「GP」。

[以人類為對照之老化之進行抑制試驗] 於使年齡層為10多歲～70多歲之合計95名受驗者(男性2名、女性92名)攝取膠原蛋白肽混合物D之情形時，調查上述受驗者是否感受到老化之進行抑制效果。具體而言，於不指定攝取時間之情況下使上述95名受驗者每日經口攝取4～6 g之膠原蛋白肽混合物D 10～20日(平均14日)。其後，當受驗者感受到老化之進行抑制效果時，對其部位、以及上述效果之詳情(具體內容)執行訪談調査(問卷調查)。

將結果示於表5～10。表5表示感受到老化之進行抑制效果之部位、及於該部位感受到老化之進行抑制效果之人數(有複數個人回答)。表6表示於肌膚感受到老化之進行抑制效果時之具體內容、及回答該內容之人數(有複數個人回答)。表7表示於頭髮感受到老化之進行抑制效果時之具體內容、及回答該內容之人數(有複數個人回答)。表8表示於指甲感受到老化之進行抑制效果時之具體內容、及回答該內容之人數(有複數個人回答)。表9表示於關節感受到老化之進行抑制效果時之具體內容、及回答該內容之人數(有複數個人回答)。表10表示於其他部位感受到老化之進行抑制效果時之具體內容、及回答該內容之人數(有複數個人回答)。

[表5]

表5
	感受到效果之部位	人數
肌膚	46
關節	6
骨	1
指甲	22
頭髮	24
其他	5

[表6]

表6
	肌膚：效果之詳情(內容)	人數
改善緊繃	8
改善鬆弛	2
改善乾燥、濕潤	15
改善角質粗糙	2
改善肌理	2
改善脫妝	3
改善皺紋	4
改善毛孔	1
改善手粗糙	3
改善肌膚亮度	2
彈力	2
光澤度	5
豐滿、彈柔感	3
平滑、光滑感	3
緊致整張臉	1
減少痘痘	1
改善黃褐斑	1
合計	58

[表7]

表7
	頭髮：效果之詳情(內容)	人數
改善光澤度	4
改善乾燥(分叉)	4
減少脫髮	4
改善整齊度	2
改善梳理性	2
乾爽感	2
改善頭髮之粗度	2
減少白髮	1
改善柔軟度	1
改善頭髮之韌性	1
提高頭量	1
頭髮生長	1
合計	25

[表8]

表8
	指甲：效果之詳情(內容)	人數
改善易斷裂	3
光澤度	1
結實度	1
合計	5

[表9]

表9
	關節：效果之詳情(內容)	人數
改善關節痛	3
關節響	1
改善不適感	1
合計	5

[表10]

表10
	其他：效果之詳情(內容)	人數
改善排便	3
胸圍增大	1
合計	4

[考察] 根據表5～10可知，含有Gly-Pro(GP)及Glu-Hyp-Gly(EOG)之兩者或任一者之肽的膠原蛋白肽混合物D(老化之進行抑制劑)於肌膚、頭髮、指甲、關節及其他部位發揮老化之進行抑制效果。

如上所述對本發明之實施方式及實施例進行了說明，並且一開始就計劃將上述各實施方式及實施例之構成適當地組合。

此次揭示之實施方式及實施例應被認為於所有方面均為例示而非限制性者。本發明之範圍由發明申請專利範圍而非上述說明示出，其目的是包含與發明申請專利範圍均等之含義及範圍內之所有變更。

Claims (6)

1. 一種老化之進行抑制劑，其含有Gly-Pro及Glu-Hyp-Gly之兩者或任一者之肽、或其鹽、或其化學修飾體。
2. 如請求項1之老化之進行抑制劑，其中上述肽來自膠原蛋白。
3. 如請求項1之老化之進行抑制劑，其中上述老化之進行抑制劑為膠原蛋白肽混合物。
4. 如請求項3之老化之進行抑制劑，其中上述膠原蛋白肽混合物之重量平均分子量為100 Da以上5000 Da以下。
5. 如請求項1至4中任一項之老化之進行抑制劑，其中上述老化之進行抑制劑為17型膠原蛋白之基因表現促進劑、或麩胱甘肽合成酶之基因表現促進劑。
6. 一種飲食品，其包含如請求項1至5中任一項之老化之進行抑制劑。