BRPI0707837A2 - "agente para prevenÇço de arteriosclerose, agente para supressço de espessamento vascular da Íntima e agente para melhoria da funÇço endotelial vascular" - Google Patents

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Abstract

AGENTE PARA PREVENÇçO DE ARTERIOSCLEROSE, AGENTE PARA SUPRESSçO DE ESPESSAMENTO VASCULAR DA ÍNTIMA E AGENTE PARA MELHORIA DA FUNÇçO ENDOTELIAL VASCULAR A presente invenção refere-se a um agente que apresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobre funções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vascular da íntima, bem como um profilático de arteriosclerose, que apresentam excelente segurança, aperfeiçoam funções associadas ao endotélio vascular, apresentam efeitos de prevenção de várias doenças associadas a funções endoteliais vasculares e de inibição de espessamento vascular da intima, e dos quais pode-se esperar proporcionarem efeito profilático efeito sobre arteriosclerose ou similares. Os agentes da presente invenção contêm, como componente ativo: (a) Xaa-Pro-Pro, (b) um hidrolisado de caseína de leite animal que contém Xaa-Pro- Pro, ou um concentrado deste, ou (c) um produto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido por fermentação de um material de partida que contém proteína de leite com uma cepa bacteriana da espécie Lactobacílius helveticus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTEPARA PREVENÇÃO DE ARTERIOSCLEROSE, AGENTE PARA SU-PRESSÃO DE ESPESSAMENTO VASCULAR DA ÍNTIMA E AGENTE PA-RA MELHORIA DA FUNÇÃO ENDOTELIAL VASCULAR".
CAMPO NO ESTADO DA TÉCNICA
A presente invenção refere-se a um inibidor profilático de arteri-osclerose, a um inibidor de espessamento vascular da íntima e a um melho-rador da função endotelial vascular que apresentam um efeito de inibição deespessamento vascular da íntima ou de melhoria das funções endoteliaisvasculares e dos quais se espera que apresentem um efeito antiarterioscle-rótico, bem como de alimento funcional que apresenta esses efeitos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Doenças ateroscleróticas, tais como infarto do miocárdio e infar-to cerebral, respondem pela maior parte da causa de morte no Japão, jun-tamente com cânceres. Fatores de risco para arteriosclerose incluem hiperli-pemia, hiperlipidemia, hipertensão, diabetes, tabagismo, obesidade, hiperu-ricemia, envelhecimento, tensão e similares, que são inter-relacionados coma causa de angiopatia. Assim, mesmo que cada fator de risco seja baixo,acúmulo dos fatores aditivo e sinergicamente eleva o risco.
Foram identificadas convencionalmente várias funções fisiológi-cas de leite fermentado, bactérias de ácido láctico e hidrolisados enzimáticosdo leite. Por exemplo, Publicações de Patente 1 e 2 relatam o efeito de bai-xamento de colesterol, Publicação de Patente 3 e Publicação Não-Patente 1relatam o efeito hipotensivo, e Publicação de Patente 4 relata o efeito anti-tensão. Publicação de Patente 5 descreve que hidrolisado de caseína, quecontém aminoácidos e peptídeos livres e tem sido obtido por meio de hidróli-se de caseína de leite animal para apresentar um comprimento médio decadeias de não mais que 2,1 em termos do número de resíduos de aminoá-cido, apresenta atividade inibidora de enzima conversora de angiotensina Iou efeito hipotensivo. Essas publicações fornecem informação relativa a mi-tigação de cada fator de risco para arteriosclerose.Por outro lado, considera-se que mera mitigação de um dos fato-res de risco acima não resultará em prevenção de início de arteriosclerose.Por exemplo, Publicações Não Relacionadas com Patente 2 e 3 relatam aausência de inter-relação entre o nível de colesterol no sangue e início dearteriosclerose, Publicação Não-Patente 4 ensina que supressão de hiper-tensão não altera o grau de arteriosclerose, e Publicação Não-Patente 5descreve que administração de um inibidor de enzima conversora de angio-tensina I (enalapril) não resulta em um efeito inibidor de arteriosclerose.
Consequentemente, embora se saiba que o hidrolisado de case-ína particular descrito na Publicação de Patente 5 mitigue cada fator de riscopara arteriosclerose, isso não significa que o hidrolisado de caseína particu-lar descrito apresente um efeito antiarteriosclerótico.
Uma artéria composta principalmente da adventícia, da médiaque inclui a camada muscular lisa que leva o vaso sangüíneo a dilatar-se econstrigir-se, e da íntima em contato direto com sangue e que inclui a cama-da celular endotelial, que comanda a camada muscular lisa na média. Ascélulas endoteliais na íntima foram recentemente reveladas para controlarvários comandos relativos a funções vasculares, tais como fibrinólise e coa-gulação do sangue, dilatação e constrição de vasos sangüíneos, inibição edesenvolvimento de inflamação, e proliferação e regressão de vasos san-güíneos. Acredita-se que as funções endoteliais vasculares sejam associa-das à arteriosclerose e várias outras doenças. Assim, espera-se que melho-ria das funções endoteliais vasculares possam prevenir arteriosclerose.
Arteriosclerose é uma patologia em que a parede arterial é es-pessada até afrouxar sua elasticidade. Em particular, aterosclerose caracte-riza-se por espessamento arterial subíntima semelhante a pontos (ateroma)e produz sintomas de fluxo sangüíneo reduzido ou interrompido. Tais sinto-mas foram recentemente considerados como sendo atribuídos a função pre-judicada ou reduzida de células endoteliais vasculares.
Portanto, pode-se esperar que inibição de espessamento endo-telial vascular mitigue ou previna início de aterosclerose.
Medição diagnostica das funções endoteliais vasculares em serhumano sob condições inócuas é conhecida ser realizada por pletismografia,como descrito na Publicação Não-Patente 6. Pletismografia é um métodopara determinar as funções de células endoteliais por meio de vasodilatabili-dade, utilizando o fenômeno de que, quando o fluxo de sangue arterial étemporariamente interrompido, a quantidade da substância vasodilatadoragerada e liberada pelas células endoteliais eleva-se, o que aumenta transito-riamente o fluxo sangüíneo, e quando as funções endoteliais são prejudica-das, a liberação da substância vasodilatadora é baixada, o que resulta emfluxo sangüíneo reduzido.
Publicação de Patente 1: JP-2003-306436-A
Publicação de Patente 2: JP-2002-65203-A
Publicação de Patente 3: JP-2005-52090-A
Publicação de Patente 4: JP-10-45610-A
Publicação de Patente 5: WO 2005-102542-A
Publicação Não-Patente 1: American Journal of Clinicai Nutrition64 (Revista Americana de Nutrição Clínica 64) (1996), pp. 767-771
Publicação Não-Patente 2: Shoku no Kagaku 257 (1999), pp. 20-25
Publicação Não-Patente 3: Atherosclerosis 151 (2000), pp. 501-508
Publicação Não-Patente 4: Circulation 104 (2001), pp. 2391-2394
Publicação Não-Patente 5: International Journal of Cardiology 81(2001), pp. 107-115
Publicação Não-Patente 6: The American Journal of Cardiology87 (2001), pp. 121-125
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Trata-se de um objetivo da presente invenção proporcionar umagente que apresente pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobrefunções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vas-cular da íntima, e um profilático de arteriosclerose, que seja excelentementeseguro, que melhore funções endoteliais, que se espere apresentar efeitoprofilático sobre várias doenças associadas a funções endoteliais, tal comoarteriosclerose, que apresente efeito mitigador ou profilático sobre espessa-mento vascular da íntima e que se espere apresentar efeito profilático sobreaterosclerose.
Trata-se de outro objetivo da presente invenção proporcionar a-limento funcional que apresente pelo menos um dentre um efeito de melho-ria sobre funções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessa-mento vascular da íntima, que possa ser submetido a administração de roti-na e administração prolongada e seja excelentemente seguro.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se um agenteque apresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobre funçõesendoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vascular daíntima, agente este que compreende como componente ativo um hidrolisadode caseína de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro, ou um concentradodeste.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se também umagente que apresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobrefunções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vas-cular da íntima, agente este que compreende Xaa-Pro-Pro como componen-te ativo.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se também umagente que apresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobrefunções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vas-cular da íntima, agente este que compreende como componente ativo umproduto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido porfermentação de um material de partida que compreende proteína de leitecom uma cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se adicional-mente um profilático de arteriosclerose que compreende qualquer dos agen-tes acima como componente ativo.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se alimentofuncional que compreende como componente ativo um hidrolisado de casei-na de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro1 ou um concentrado deste, ali-mento funcional este que apresenta pelo menos um dentre um efeito de me-lhoria sobre funções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espes-samento vascular da íntima.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se também a-limento funcional que compreende Xaa-Pro-Pro como componente ativo,componente este que apresenta pelo menos um dentre um efeito de melho-ria sobre funções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessa-mento vascular da íntima.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se adicional-mente alimento funcional que compreende como componente ativo um pro-duto fermentado que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido por fermen-tação de um material de partida que compreende proteína de leite com umacepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus, componente este queapresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobre funções endo-teliais vasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vascular da ínti-ma.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se uso de umhidrolisado de caseína de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro ou um con-centrado deste, uso de Xaa-Pro-Pro ou uso de um produto de fermentaçãoque contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido por fermentação de um ma-terial de partida que compreende proteína de leite com uma cepa bacterianada espécie Lactobacillus helveticus, na produção de um agente ou alimentofuncional que apresenta pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobrefunções endoteliais vasculares ou um efeito inibidor sobre espessamentovascular da íntima.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se tambémuso de um hidrolisado de caseína de leite animal que contém Xaa-Pro-Proou um concentrado deste, uso de Xaa-Pro-Pro ou uso de um produto defermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido por fermenta-ção de um material de partida que compreende proteína de leite com umacepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus, na produção de um pro-filático de arteriosclerose.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se adicional-mente um método para pelo menos um dentre melhoria das funções endote-liais vasculares e inibição de espessamento vascular da íntima, método esteque compreende a etapa de administrar a um animal um hidrolisado de ca-seína de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro ou um concentrado deste,Xaa-Pro-Pro, ou um produto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ouVal-Pro-Pro obtido por fermentação de um material de partida que compre-ende proteína de leite com uma cepa bacteriana da espécie Lactobacillushelveticus.
De acordo com a presente invenção, proporciona-se adicional-mente um método de tratamento profilático de arteriosclerose, que compre-ende a etapa de administrar a um animal um hidrolisado de caseína de leiteanimal que contém Xaa-Pro-Pro ou um concentrado deste, Xaa-Pro-Pro ouum produto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtidopor fermentação de um material de partida que compreende proteína de leitecom uma cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus.
Contendo, como componente ativo, o hidrolisado de caseína par-ticular ou um concentrado deste, Xaa-Pro-Pro, o produto de fermentaçãoparticular que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro, ou Xaa-Pro-Pro, o agen-te e o alimento funcional de acordo com a presente invenção que apresen-tam pelo menos um dentre um efeito de melhoria sobre funções endoteliaisvasculares e um efeito inibidor sobre espessamento vascular da íntima, sãoexcelentemente seguros, e, em particular, o alimento funcional poderá sertomado rotineiramente por um período de tempo prolongado. Assim, o pre-sente agente e o alimento funcional melhoram hipertensão crônica ou mode-ram arteriosclerose ou espessamento vascular da íntima, que são associa-dos a funções endoteliais vasculares, e, em particular, moderam aterogêne-se causada por funções deprimidas ou dano de células endoteliais vascula-res devido a envelhecimento ou estilo de vida. Consequentemente, pode-seesperar mitigação ou prevenção de início de aterosclerose.
Uma vez que o profilático de arteriosclerose da presente inven-ção contém o agente da presente invenção acima como componente ativo,efeito profilático sobre arteriosclerose poderá ser esperado.
DESCRIÇÃO CONCISA DO DESENHO
A Figura 1 é um gráfico que mostra os resultados de teste con-firmador do efeito inibidor sobre espessamento vascular da íntima conduzidono Exemplo 2-1 e Exemplo Comparativo 2.
MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO
A presente invenção será agora explicada mais detalhadamente.O agente e o alimento funcional que apresentam pelo menos umdentre um efeito de melhoria sobre funções endoteliais vasculares ou umefeito inibidor sobre espessamento vascular da íntima de acordo com a pre-sente invenção contêm, como componente ativo:
(a) Xaa-Pro-Pro (referido como componente (a) daqui por dian-te);
(b) um hidrolisado de caseína de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro, ou um concentrado deste (referido como componente (b) daqui pordiante); ou
(c) um produto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro obtido por fermentação de um material de partida que contém prote-ína de leite com uma cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus(referida como componente (c) daqui por diante). Isto é, os componentes (b)e (c) incluem componente (a). Entende-se dos Exemplos a serem descritosabaixo que o componente (a), em particular Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro, éútil como componente ativo.
Prefere-se que Xaa-Pro-Pro nos componentes (a) e (b) incluamIle-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro, e que o componente (b) contenha adicional-mente Xaa-Pro.
O teor de Xaa-Pro-Pro em componente (b) é usualmente menorque 1%, preferencialmente 1 a 5% em peso da quantidade total dos peptí-deos e aminoácidos livres no componente (b). Com teor não menor que 1%em peso, efeito ainda mais excelente pode-se esperar ser obtido. Adicional-mente, os teores de Ile-Pro-Pro e Val-Pro-Pro em componente (b) poderãoser independentemente ou coletivamente não menores que 0,3% em pesoda quantidade total dos peptídeos e aminoácidos livres em componente (b),em cujos ambos os casos excelente efeito poderá ser esperado. Adicional-mente, quando os teores de Ile-Pro-Pro e Val-Pro-Pro em componente (b)são independentemente não menores que 0,3% em peso, efeito ainda maiorpoderá ser esperado.
O teor de Xaa-Pro em componente (b) é usualmente não menorque 5% em peso, preferencialmente 5 a 25% em peso da quantidade totaldos peptídeos e aminoácidos livres em componente (b). Com teor não me-nor que 5% em peso, efeito ainda mais excelente poderá ser esperado.
O teor de Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro em componente (c) é nãomenor que 10 mg, preferencialmente não menor que 15 mg, por 100 g doproduto de fermentação sob forma liofilizada. Com esse teor, o efeito dese-jado poderá ser esperado.
O Xaa em Xaa-Pro-Pro e Xaa-Pro em componente (b) poderãoser qualquer aminoácido. Por exemplo, Xaa-Pro-Pro poderá ser Ser-Pro-Pro,Leu-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro ou Val-Pro-Pro, e Xaa-Pro poderá ser Ile-Pro, Glu-Pro, Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro ou Tyr-Pro. Componente (b) poderá prefe-rencialmente conter pelo menos um, dois ou mais do Xaa-Pro-Pro listadoacima, e poderá mais preferencialmente ser um hidrolisado de caseína quecontém adicionalmente um ou dois ou mais do Xaa-Pro listado acima.
Os componentes (b) e (c) poderão conter aminoácidos livres a-lém dos peptídeos, e poderão adicionalmente conter, além dos peptídeos eaminoácidos livres, por exemplo, lipídeo, cinza, hidrocarboneto, fibras dieté-ticas, umidade e similares, que são usualmente contidos em caseína de leiteanimal ou proteína de leite comercialmente disponíveis. Parte ou todo ocomponente adequado qualquer além desses componentes poderá ser re-movido como exigido.
Componente (b) poderá ser preparado, por exemplo, hidrolisan-do caseína de leite animal com um grupo de enzimas que fornece Xaa-Pro-Pro e opcionalmente Xaa-Pro conforme exigido, ou por fermentação de ca-seína de leite animal com mofo cójico.A caseína de leite animal é uma proteína que se encontra em a-limentos ou similares ricos em Pro1 e apresenta segurança confirmada. E-xemplos de caseína de leite animal poderão incluir caseínas de leite de va-ca, leite de égua, leite de cabra e leite de ovelha, com a caseína de leite devaca sendo preferida.
Ao hidrolisar ou fermentar a caseína de leite animal, a concen-tração de caseína não é particularmente limitada, e poderá preferencialmen-te ser de 3 a 19% em peso para produção eficiente de componente (b).
O grupo de enzimas poderá preferencialmente ser o Grupo (X)de enzimas que contêm, por exemplo, uma peptidase que é capaz de clivara seqüência Pro-Xaa no término carboxila de Xaa-Pro-Xaa ou Xaa-Pro-Pro-Xaa.
O Grupo (X) de enzimas poderá preferencialmente incluir umaserina proteinase que apresenta serina em seu centro ativo, ou uma metalo-proteinase que apresenta metal em seu centro ativo. A metaloproteiriasepoderá ser protease I neutra, protease Il neutra, Ieucina aminopeptidase ousimilar. Prefere-se que o Grupo (X) de enzimas contenha pelo menos umadessas metaloproteinases para obter o hidrolisado desejado eficientementeem um curto tempo em uma reação de uma etapa. A peptidase que é capazde clivar a seqüência Pro-Xaa poderá preferencialmente ser uma enzimaque apresenta o ponto isoelétrico na região ácida.
O grupo de enzimas ou Grupo (X) de enzimas poderá ser umgrupo de enzimas derivadas de mofo cójico, tal como Aspergillus oryzae.Esse grupo de enzimas poderá ser obtido cultivando as células bacterianasem um meio adequado, e extraindo com água as enzimas produzidas. Entreos grupos de enzimas derivadas de Aspergillus oryzae, aqueles que apre-sentam o ponto isoelétrico na região ácida são particularmente preferidos.
O grupo de enzimas derivadas de Aspergillus oryzae poderá serum produto comercialmente disponível, por exemplo, Sumizyme FP, LP ouMP (todas marcas registradas, produzidas por SHIN NIHON CHEMICALCO., LTD.), Umamizyme (marca registrada, produzido por AMANO ΕΝΖΥ-ΜΕ, INC.), Sternzyme B11024, PROHIDROXY AMPL (ambos nomes comer-ciais, produzidos por HIGUCHI, INC.), Orientase ONS (marca registrada,produzido por HANKYU BIOINDUSTRY, INC.) ou Denazyme AP (marca re-gistrada, produzido por NAGASE BIOCHEMICALS, LTD.), com SumizymeFP (marca registrada, produzido por SHIN NIHON CHEMICAL CO., LTD.)sendo particularmente preferido.
Para o uso desses produtos comerciais, condições ótimas sãousualmente fixadas, mas as condições, tal como a quantidade de enzimasusadas ou o tempo de reação, poderão ser adequadamente ajustadas de-pendendo do grupo de enzimas a serem usadas, de modo a obter o hidroli-sado de caseína discutido acima.
A quantidade do grupo de enzimas usado na hidrólise da caseí-na de leite animal poderá ser tal que, por exemplo, a razão ponderai do gru-po de enzimas para a caseína de leite animal não seja menor que 1/1000,preferencialmente de 1/1000 a 1/10, mais preferencialmente de 1/100 a 1/10,ainda mais preferencialmente de 1/40 a 1/10, em uma solução aquosa dacaseína de leite animal.
As condições de reação poderão ser adequadamente seleciona-das dependendo do grupo de enzimas a ser usado, de modo a obter o hidro-lisado de caseína objeto. A temperatura poderá usualmente ser de 25 a60°C, preferencialmente de 45 a 55°C, e o pH é usualmente de 3 a 10, pre-ferencialmente de 5 a 9, mais preferencialmente de 5 a 8. A duração da rea-ção enzimática é usualmente de 2 a 48 horas, preferencialmente de 7 a 15horas.
A reação enzimática poderá ser terminada mediante inativaçãoda enzima. Usualmente, a enzima é inativada a 60 a 110 0C para terminar areação.
Após a terminação da reação enzimática, prefere-se remover oprecipitado resultante por centrifugação ou várias filtrações, conforme dese-jado.
Adicionalmente, peptídeos que apresentam gosto amargo ouodor poderão ser removidos do hidrolisado resultante conforme desejado.Tais componentes de gosto amargo ou odor poderão ser removidos usandocarbono ativado ou resinas hidrofóbicas. Por exemplo, a remoção poderá serrealizada adicionando ao hidrolisado obtido 1 a 20% em peso de carbonoativado com relação à quantidade de caseína utilizada e reagindo por 1 a 10horas. O carbono ativado poderá após uso ser removido por método con-vencional, tal como centrifugação ou operação de processo em membrana.
O líquido da reação que contém o componente (b) resultante po-derá ser adicionado como tal a um produto líquido, tais como bebidas, paraproduzir alimento funcional. Alternativamente, a fim de aperfeiçoar a versati-lidade do hidrolisado de caseína no componente (b), prefere-se concentrar esecar o líquido da reação para constituir um pó. Ao ser convertido em pó, olíquido da reação que contém componente (b) poderá tornar-se um agenteque confere funcionalidade, por exemplo, pelo menos um dentre um efeitoinibidor sobre espessamento vascular da íntima, um efeito de melhoria sobrefunções endoteliais vasculares e um efeito profilático sobre arteriosclerose.
Para melhoria do equilíbrio nutricional, paladar, aroma ou similar,vários aditivos auxiliares poderão ser adicionados ao pó, tais como várioshidrocarbonetos, lipídeos, vitaminas, minerais, edulcorantes, agentes de a-romatização, agentes de coloração ou aperfeiçoadores de textura.
A dose de agente que apresenta o efeito de melhoria das fun-ções endoteliais vasculares e/ou que inibe espessamento vascular da íntima,quando o componente (b) é o componente ativo, é usualmente de 10 pg a10 g, preferencialmente de 1 mg a 5 g, mais preferencialmente de cerca de 3mg a 1 g por dia para ser humano em termos de Xaa-Pro-Pro ou do total deXaa-Pro-Pro e Xaa-Pro em componente (b). A dose poderá ser administradaem diversas doses divididas por dia.
O período de dosagem poderá ser ajustado em relação aos sin-tomas de uma doença, e é usualmente de um dia ou mais, preferencialmen-te de 7 a 365 dias. Consumo regular é preferido.
A cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus usada napreparação de componente (c) é uma cepa dessa espécie isoladamente.Entretanto, na fermentação, outras bactérias de ácido láctico poderão opcio-nalmente ser usadas, contanto que o efeito desejado da presente invençãonão seja prejudicado.
A cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus poderápreferencialmente ser uma cepa apresenta alta atividade de proteinase ex-tracelular, que é preferida como bactérias capazes de produzir sob alto ren-dimento Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro que apresentam os efeitos de melhoriadas funções endoteliais vasculares e/ou inibem espessamento vascular daíntima. Por exemplo, cepas que apresentam um valor U/OD59C) não menorque 400 são preferidas, como medido de acordo com o método de Yamamo-to e outros (Yamamoto N. e outros, J. Biochem. (1993) 114, 740), com baseno método de Twining e outros (Twining, S., Anal. Biochem. 143 3410(1984).
Um exemplo preferido da cepa de Lactobacillus helveticus podeser a cepa CM4 de Lactobacillus helveticus (depositada no Depósito Interna-cional de Organismos de Patentes, Instituto Nacional de Ciência IndustrialAvançada e Tecnologia (International Patent Organism Depositary, NationalInstitute of Advanced Industrial Science e Technology), Tsukuba Central 6,1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japão, sob número de acesso FERMBP-6060, em 15 de agosto de 1997) (referida como cepa CM4 daqui por di-ante). A cepa CM4 foi depositada sob o número de acesso acima menciona-do sob o Tratado de Budapeste sob o Reconhecimento Internacional do De-pósito de Microorganismos Para Fins de Procedimento de Patente (Internati-onal Recognition ofthe Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure) e já foi patenteada.
O componente (c) poderá ser preparado adicionando um inicia-dor de leite fermentado que contém uma cepa bacteriana da espécie Lacto-bacillus helveticus a um material de partida que contém proteína de leite, efermentando esse material sob condições adequadamente selecionadas, talcomo temperatura de fermentação.
Componente (c) como componente ativo poderá incluir um pro-duto em pó preparado mediante, por exemplo, liofilização ou secagem porpulverização de um concentrado do componente (c) obtido.
A cepa bacteriana da espécie Lactobacillus helveticus poderápreferencialmente ser na forma de um iniciador pré-cultivado que apresentaatividade suficientemente elevada. A contagem inicial de células poderá pre-ferencialmente ser de cerca de IO5-IO9 células/ml.
Para uso na produção de, por exemplo, alimento funcional e be-bida, tais como alimentos para usos especificados para a saúde, o compo-nente (c) poderá ser preparado por co-fermentação com a cepa da espécieLactobacillus helveticus e um lêvedo para fornecer o gosto e aroma, bemcomo palatabilidade, aperfeiçoados do produto resultante. A cepa do lêvedonão é particularmente limitada e poderá preferencialmente ser, por exemplo,lêvedo do gênero Saccharomyces, tal como Saccharomyces cerevisiae. Oteor de lêvedo poderá adequadamente ser selecionado de acordo com afinalidade.
O material de partida que contém proteína de leite poderá ser,por exemplo, leites animais, tais como leite de vaca, leite de égua, leite deovelha e leite de cabra; leites vegetais, tal como leite de soja; e leites pro-cessados destes, tais como leite desnatado, leite reconstituído, leite em pó eleite condensado. Entre estes, leite de vaca, leite de soja e leite processadodestes são preferidos, e leite de vaca e leite processado são particularmentepreferidos.
O teor de sólidos do leite não é particularmente limitado, e quan-do leite desnatado é utilizado, o teor de sólido que não constitui gordura éusualmente de cerca de 3 a 15% em peso, e preferencialmente de 6 a 15%em peso para boa produtividade.
A fermentação poderá ser realizada usualmente sob agitação oucondições estáticas, por exemplo, a 25 a 45°C, preferencialmente 30 a 45°C,por 3 a 72 horas, preferencialmente 12 a 36 horas, e parada quando a aci-dez do ácido láctico atinge 1,5% ou mais.
A dose do agente que apresenta o efeito de melhoria das fun-ções endoteliais vasculares e/ou inibe espessamento vascular da íntima,quando o componente (c) é o componente ativo, é usualmente de 1 a 100 g,preferencialmente de cerca de 2 a 50 g, por dia para ser humano em termosdo produto seco de componente (c), e poderá ser administrada em diversasdoses divididas por dia. A dose em termos de Val-Pro-Pro e/ou Ile-Pro-Prono componente (c) é usualmente de 10 pg a 10 g, preferencialmente de 1mg a 5 g, mais preferencialmente de cerca de 3 mg a 1 g, e poderá ser ad-ministrada em diversas doses divididas por dia.
O período de dosagem poderá ser ajustado em relação aos sin-tomas de uma doença, e é usualmente de um dia ou mais, preferencialmen-te de 7 a 365 dias. Consumo regular é preferido.
O profilático de arteriosclerose de acordo com a presente inven-ção contém o agente que apresenta o efeito de melhoria das funções endo-teliais vasculares e/ou inibe espessamento vascular da íntima discutido aci-ma. Em particular, quando o agente apresenta um efeito inibidor sobre es-pessamento vascular da íntima, o profilático é útil como um profilático deaterosclerose.
A dose do profilático de arteriosclerose de acordo com a presen-te invenção é usualmente de 10 pg a 10 g, preferencialmente de 1 mg a 5 g,mais preferencialmente de cerca de 3 mg a 1 g por dia para ser humano emtermos de Xaa-Pro-Pro1 do total de Xaa-Pro-Pro e Xaa-Pro, ou de Val-Pro-Pro e/ou Ile-Pro-Pro nos componentes (a) to (c). A dose poderá ser adminis-trada em diversas doses divididas por dia.
O período de dosagem do profilático de arteriosclerose poderáser ajustado, levando em consideração a idade do ser humano ou animal aoqual o profilático deve ser administrado, ou o ambiente do ser humano ouanimal associado aos fatores de risco de arteriosclerose. O período é usu-almente de um dia ou mais, preferencialmente de 7 a 365 dias, e consumoregular é preferido.
O agente que apresenta o efeito de melhoria das funções endo-teliais vasculares e/ou inibe espessamento vascular da íntima e o profiláticode arteriosclerose de acordo com a presente invenção são usualmente ad-ministrados de forma oral.
Os agentes da presente invenção poderão ser formulados paraadministração oral. Por exemplo, os agentes poderão ser na forma de com-primidos, pílulas, cápsulas duras, cápsulas macias, microcápsulas, pós, grâ-nulos ou líquido.
Os presentes agentes poderão ser formulados com, por exem-plo, um veículo, adjuvante, excipiente, excipiente auxiliar, antisséptico, esta-bilizante, Iigante1 regulador de pH, tampão, espessante, gelatinizador, con-servante, antioxidante ou similares que são aceitáveis para uso farmacêuti-co, e produzidos em uma forma de dose unitária que é exigida em formula-ção geralmente aprovada.
O alimento funcional de acordo com a presente invenção contémcomponente (b) ou (c), que é o componente ativo do agente que apresenta oefeito de melhoria das funções endoteliais vasculares e/ou inibe espessa-mento vascular da íntima da presente invenção, e poderá ser produzido co-mo alimentos para cuidados com a saúde, tais como alimentos para usosespecificados para cuidados com a saúde que reivindicam o efeito de melho-ria das funções endoteliais vasculares e/ou inibem espessamento vascularda íntima.
Levando em consideração o fato de que o presente alimento fun-cional poderá ser tomado regularmente e poderá ser tomado contínua ouintermitentemente por um longo período de tempo, o consumo do presentealimento funcional para obter tal efeito é usualmente de 10 pg a 10 g, prefe-rencialmente de 1 mg a 5 g, mais preferencialmente cerca de 3 mg a 1 g ordia para ser humano em termos de Xaa-Pro-Pro ou do total de Xaa-Pro-Proe Xaa-Pro no componente (b), ou de Val-Pro-Pro e/ou Ile-Pro-Pro no com-ponente (c). O consumo simples do alimento funcional poderá ser menor quea quantidade acima, dependendo do número de ingestões por dia.
O período para tomar o alimento funcional da presente invençãonão é particularmente limitado, e é preferido tomá-lo por um período de tem-po prolongado. A fim de obter o efeito discutido acima, o período de consu-mo é usualmente de um dia ou mais, particularmente de 7 a 365 dias, e con-sumo regular é preferido.
O alimento funcional de acordo com a presente invenção poderáopcionalmente conter, além do componente ativo, componente (b) ou (c),aditivos, tal como produto de fermentaçãos com bactérias de ácido lácticodiferentes de Lactobacillus helveticus, ou outros componentes usados emalimentos e bebidas, por exemplo, açúcares, proteínas, lipídeos, vitaminas,minerais, agentes de aromatização e misturas dos mesmos.
O alimento funcional da presente invenção poderá ser produzidosob qualquer forma, tal como sólido, gel ou líquido, mediante adição decomponente (b) ou (c) como tal ou em forma de pó ou grânulo a vários ali-mentos ou bebidas. Por exemplo, o presente alimento funcional poderá serna forma de produtos lácteos fermentados, tais como bebidas de bactériasdo ácido láctico, vários alimentos e bebidas processados, pós secos, com-primidos, cápsulas, grânulos, bem como várias bebidas, iogurte, dieta defluidos, gelatina, doces, alimento embalado pelo processo de retorta, docesem tabletes, cookies, pães-de-ló, pães, biscoitos ou chocolates.
EXEMPLOS
A presente invenção será agora explicada mais detalhadamentecom referência a Exemplos, Exemplos Analíticos e Exemplos Comparativos,que são ilustrativos apenas e não limitam a presente invenção.Exemplo de Produção 1
1g de caseína derivada de leite de vaca (produzida por NIPPONNZMP (Japão) LTD.) foi adicionado a 99 g de água destilada ajustada a cer-ca de 80°C, e a mistura resultante foi totalmente agitada. O pH da mistura foiajustado em 7,0 com solução 1 N de hidróxido de sódio (produzida por WA-KO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.), e a temperatura foi ajustada em20°C, para preparar uma solução de substrato.
A essa solução de substrato, uma enzima comercialmente dis-ponível (Sumizyme FP, marca registrada, produzida por SHIN NIHON CHE-MICAL CO., LTD.), que é derivada de Aspergillus oryzae e contém pelo me-nos metaloprotease, serina protease, protease I neutra, protease Il neutra eleucina aminopeptidase, foi adicionada na razão enzima/caseína de 1/25 empeso, e a mistura resultante foi reagida a 50°C por 14 horas. Em seguida, oproduto de reação foi submetido a autoclave a 110°C por 10 minutos parainativar a enzima, obtendo desse modo uma solução de hidrolisado enzimá-tico de caseína. A solução de hidrolisado enzimático foi secada em um se-cador por pulverização para preparar um pó.
O pó resultante foi analisado em relação a composição. O teorde proteína foi determinado pelo método de Kjeldahl, e o teor de aminoáci-dos foi determinado com um analisador de aminoácidos. O teor de peptídeosfoi calculado subtraindo o teor de aminoácidos do teor de proteína. Adicio-nalmente, o teor de lipídeos foi determinado pelo método da hidrólise ácida,o teor de cinzas pelo método direto de formação de cinzas, e o teor de umi-dade pelo método do forno de ar. O teor de hidrocarbonetos foi tomado co-mo o restante após subtrair os teores desses componentes de 100%. Comoresultado, foi determinado que o teor de aminoácidos foi de 35,8% em peso,o teor de peptídeos, de 45,7% em peso, o teor de umidade, de 6,6% em pe-so, o teor de lipídeos, de 0,2% em peso, o teor de cinzas, de 4,1% em pesoe o teor de hidrocarbonetos, de 7,6% em peso.
Determinação de Aminoácidos que Constituem Peptídeos
O pó preparado acima foi dissolvido em uma quantidade adequa-da de água destilada e analisado em um sequenciador de proteína automati-zado (nome comercial PPSQ-10, fabricado por SHIMADZU CORPORATION)em relação a seqüência de aminoácidos do término N. Incidentalmente, oanalisador de peptídeos automáticos não detecta aminoácidos livres.
A quantidade total de aminoácidos no resíduo 5 foi de 120 pmo-les e a quantidade total de aminoácidos no resíduo 6 foi de 100 pmoles. Apartir desses resultados, verificou-se que a maior parte dos peptídeos conti-dos no pó era di e tripeptídeos. Adicionalmente, a porcentagem dos peptí-deos que apresentam Pro no resíduo 2 foi de 49,5%, que foi notavelmentealta, e a porcentagem de peptídeos que apresentam Pro no resíduo 3 foitambém tão elevada quanto 29,8%.
Consequentemente, estima-se que o teor de Xaa-Pro ou Xaa-Pro-Pro no pó é alto e que esses peptídeos apresentam alta resistência àhidrólise enzimática com proteases no corpo vivo.
Determinação de Peptídeos em Hidrolisado Enzimático
O hidrolisado enzimático em pó obtido acima foi medido em rela-ção aos teores de di e tripeptídeos mostrados na Tabela 1 de acordo comum método de rotina usando vários peptídeos padrões quimicamente sinteti-zados. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 19</column></row><table>
O teor de peptídeos e aminoácidos livres em uma solução do póem água destilada foi de 8,15 mg/ml, o teor de peptídeos, de 4,57 mg/ml e oteor de Xaa-Pro nos peptídeos, de 514,5 Mg. Confirmou-se que a porcenta-gem de Xaa-Pro na quantidade total de peptídeos e de aminoácidos livres nopó foi de 6,3% em peso. Adicionalmente, o teor de Xaa-Pro-Pro nos peptí-deos foi de 116,5 pg. Confirmou-se que a porcentagem de Xaa-Pro-Pro naquantidade total de peptídeos e de aminoácidos livres no pó foi de 1,4% empeso.
Exemplo 1-1
Um teste em relação ao efeito do hidrolisado de caseína prepa-rado no Exemplo de Produção 1 para melhorar funções endoteliais vascula-res foi conduzido em dois grupos de adultos do sexo masculino de 40 a 65anos de idade apresentando uma pressão sangüínea sistólica de 140 a 159mmHg ou uma pressão sangüínea diastólica de 90 a 99 mmHg, com 24 indi-víduos por grupo. O teste foi conduzido como um estudo de entrecruzamen-to duplo-cego entre os dois grupos, em que 1,25 g do hidrolisado de caseínaem pó preparado no Exemplo de Produção 1 em uma cápsula como um ali-mento objeto desta invenção ou 1,25 g de caseinato de sódio em pó em umacápsula como placebo foi dado diariamente 30 minutos ou dentro de 30 mi-nutos após dejejum por 7 dias.
No teste, o fluxo de sangue na artéria do antebraço foi medidoem repouso e após liberação de torniquete, antes da ingestão do alimentoobjeto desta invenção ou placebo e após o sétimo dia de consumo, usandoum pletismógrafo EC6, fabricado por Primetech Co.. Os resultados são mos-trados na Tabela 2 como médias de cada grupo.
Tabela 2
<formula>formula see original document page 20</formula>
Na Tabela 2, cada valor é a média dos 24 indivíduos ± desviopadrão, e FSA representa fluxo de sangue no antebraço.
A diferença no fluxo sangüíneo máximo e (B)/(A)x100 entre ogrupo de alimento objeto desta invenção e o grupo de placebo foi significati-va (p<0.001). A diferença no fluxo sangüíneo máximo e (B)/(A)x100 do grupode alimento objeto desta invenção entre antes e depois de consumo foi signi-ficativa (p<0,001).
Como mostrado na Tabela 2, nenhuma diferença significativa nofluxo de sangue arterial no antebraço em repouso foi observada entre o gru-po de alimento objeto desta invenção e o grupo de placebo antes ou apósconsumo.Por outro lado, antes de consumo, nenhuma diferença significa-tiva no fluxo sangüíneo máximo após liberação de torniquete foi observadaentre os dois grupos, mas após consumo, o fluxo sangüíneo máximo foi sig-nificativamente maior no grupo de alimento objeto desta invenção, em com-paração com antes de consumo ou com o grupo de placebo (ambos p<0,001por meio de teste-t).
Sob a razão de fluxo sangüíneo máximo após hiperemia reativapara fluxo sangüíneo em repouso, nenhuma diferença significativa foi obser-vada antes de consumo entre os dois grupos, mas a razão foi significativa-mente maior para o grupo de alimento objeto desta invenção após consumo,em comparação com antes de consumo ou com o grupo de placebo (ambosp<0,001 por meio de teste-t). Incidentalmente, nenhuma melhoria significati-va na pressão sangüínea foi observada durante o período de teste.
Pelos resultados discutidos acima, o hidrolisado de caseína pre-parado no Exemplo de Produção 1 demonstrou exibir, por meio de adminis-tração, um notável efeito de melhoria na avaliação fisiológica de funções en-doteliais vasculares por pletismografia, e confirmou-se como um eficaz agen-te para melhoria de funções endoteliais vasculares. Confirmou-se tambémque esse efeito de melhoria não foi incidental em um efeito hipotensivo.
Aos indivíduos sob teste de cada grupo, 0,3 mg de nitroglicerinafoi oralmente administrado por pulverização. Em seguida, a resposta vasodi-Iatadora independente de endotélio a NO exógeno foi observada após 10minutos, e o fluxo sangüíneo máximo durante o período foi tomado comomedição. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3
<table>table see original document page 21</column></row><table>Na Tabela 3, cada valor é a média dos 24 indivíduos em cadagrupo ± desvio padrão, e FSA representa fluxo de sangue no antebraço.
Como mostrado na Tabela 3, nenhuma diferença significativa foiobservada na resposta vasodilatadora independente de endotélio entre an-tes de e após consumo em cada grupo, bem como entre os dois grupos. Re-sultados similares foram obtidos na razão da resposta vasodilatadora inde-pendente de endotélio para o fluxo sangüíneo em repouso.
Pelos resultados discutidos acima, o efeito de melhoria do hidro-lisado de caseína preparado no Exemplo de Produção 1 sobre o fluxo san-guíneo reativo demonstrou ser independente da melhoria das funções damédia, que responde a NO, e confirmou ser um reflexo direto da melhorianas funções endoteliais vasculares.Exemplo de Síntese
Ile-Pro-Pro e Val-Pro-Pro foram sintetizados por meio da síntesequímica orgânica seguinte pelo método da fase sólida em um sintetizadorde peptídeos automatizado (PSSM-8) fabricado por SHIMADZU CORPO-RATION.
50mg de resina de 2-clorotritil poliestireno a que prolina apre-sentando seu grupo amino protegido com um grupo fluorenilmetiloxicarbonila(abreviado como Fmoc daqui por diante) foi ligada (marca registrada resinaSynProPep1 produzida por SHIMADZU CORPORATION), foi usado comosuporte de fase sólida. 100 pmoles cada de Fmoc-lle, Fmoc-Pro e Fmoc-Val1em que os grupos amino foram protegidos com o grupo Fmoc, foram se-qüencialmente reagidos por meio de um método de rotina de acordo com aseqüência de aminoácidos acima para obter uma resina ligada a peptídeos.
A resina ligada a peptídeos foi suspensa em 1 ml de líquido dereação A (ácido acético a 10% em volume, trifluoretanol a 10% em volume ediclorometano a 80% em volume), reagida a temperatura ambiente por 30 a60 minutos para clivar os peptídeos da resina e filtrada através de um filtrode vidro. O solvente no filtrado resultante foi removido sob pressão reduzidae imediatamente 1 ml de líquido de reação B (ácido trifluracético a 82,5% emvolume, sulfeto de etil metila a 3% em volume, água purificada a 5% em vo-lume, tioanisol a 5% em volume, etanoditiol a 2,5% em volume e tiofenol a2% em volume) foi adicionado. A mistura resultante foi reagida a temperatu-ra ambiente por 6 horas para remover os grupos protetores da cadeia lateral,à qual 10 ml de éter anidro foram adicionados para precipitar os peptídeos.
O precipitado foi separado por centrifugação a 3.000 rpm por 5 minutos, la-vado diversas vezes com éter anidro e secado mediante pulverização de gásnitrogênio. Todos os peptídeos brutos sintetizados assim obtidos foram dis-solvidos em 2 ml de uma solução aquosa 0,1 N de ácido clorídrico e purifi-cados por HPLC C18 de fase inversa sob as seguintes condições:
Bomba: bomba inteligente modelo L6200 (fabricada por HITA-CHI, LTD.y, Detector: absorção ultravioleta a 215 nm foi detectada com de-tectar de UV modelo L4000 (fabricado por HITACHI, LTD.)·, Coluna:/L/fio/?dasp/7ere 5μ C18 (fabricada por Nihon Waters K.K.)\ Eluído: Líquido Ade uma solução aquosa de TFA 0,1% em peso e Líquido B de acetonitrilacontendo TFA 0,1% em peso, (B/A+B)x100 (%): 0 a 40% (mais de 60 min);
Vazão: 1 ml/min.
A fração eluída apresentando a absorção maxima foi extraída eIiofilizada para obter os peptídeos sintetizados objetos Ile-Pro-Pro e Val-Pro-Pro sob os rendimentos de 5,7 mg e 6,5 mg, respectivamente. Os peptídeospurificados foram analisados a partir do término N em um sequenciador deproteínas automatizado (modelo PPSQ-10, fabricado por SHIMADZU COR-PORATION) e adicionalmente analisados em um analisador de aminoácidos(modelo série 800, fabricado por JASCO CORPORATION). Confirmou-seque os peptídeos foram preparados conforme projetado.
Exemplo 1-2
Ratas Wistar (7 semanas de idade) como animais de teste foramaclimatizadas por uma semana. Um inibidor de síntese de oxido nítrico, ésterNG-nitro-L-arginino metílico cloridreto (L-NAME, produzido por SIGMA-ALDRICH CORP.), foi dissolvido em água potável sob a concentração de 1g/L, e, similarmente, L-NAME e Val-Pro-Pro sintetizados acima, sob 1 g/L e0,3 g/L, respectivamente, e L-NAME e Ile-Pro-Pro sintetizados acima, sob 1g/L e 0,3 g/L, respectivamente. As ratas foram deixadas ter livre acesso poruma semana à água potável preparada. Como controle, somente a águapotável sem L-NAME dissolvido nela foi dada a um grupo sem tratamento.
Em seguida, as ratas foram submetidas à exsanguinação fatalsob anestesia com éter dietílico. A aorta torácica foi extraída, cortada em 2mm de comprimento e tornada um anel aórtico. O anel foi colocado em umaparelho Magnus (nome do produto "banho de microtecido orgânico MTOB-1Z\ produzido por LABO SUPPORT CO., LTD.), enchido com 5 ml de solu-ção de Tyrode (composição: 158,3 mM de NaCI, 4,0 mM de KCI, 2,0 mM deCaCI2, 1,05 mM de MaCI2, 0,42 mM de NaH2PO4, 10,0 mM de NaHCO3 e 5,6mM de glicose; pH 7,4, 37±0,5°C), e deixado equilibrar-se com a tensão derepouso de 2,0 g. O anel aórtico foi então deixado constrigir-se com 1 μΜ defenilefrina. As amostras estavelmente constritas foram observadas em relaçãoà resposta vasodilatadora dependente de endotélio usando 10 μΜ de acetilco-lina. O grau de vasodilatação pela resposta foi determinada como razão naconstrição com 1 μΜ de fenilefrina. Os resultados são mostrados na Tabela 4.Na Tabela, cada valor é uma média de cada grupo de 8 animais.
Exemplo Comparativo 1
O grau de vasodilatação pela resposta de vasodilatação foi me-dido da mesma maneira que no Exemplo 1-2, exceto pelo fato de que Val-Pro-Pro ou Ile-Pro-Pro foi substituído por um inibidor de enzima conversorade angiotensina I (ACE), enalapril, para livre acesso sob a concentração de0,5 mg/L, que exibiu atividade inibidora comparável à de Val-Pro-Pro ou Ile-Pro-Pro. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Na Tabela, cada valor éuma média de cada grupo de 9 animais.
Tabela 4
<table>table see original document page 24</column></row><table>
*: p <0,05.Os resultados na Tabela 4 mostram que o grau de vasodilataçãofoi significativamente maior nos grupos que receberam Val-Pro-Pro ou Ile-Pro-Pro juntamente com L-NAME do que no grupo que recebeu apenas L-NAME, indicando que Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro melhoram funções endoteli-ais vasculares. Por outro lado, no Exemplo Comparativo 1, em que enalapril,que apresenta uma atividade inibidora de ACE1 foi dado, nenhuma diferençasignificativa foi observada em vasodilatação em comparação com o grupoque recebeu apenas L-NAME. Demonstrou-se, assim, que uma substânciaque apresenta uma atividade inibidora de ACE não melhorou necessaria-mente funções endoteliais vasculares.
Exemplo 2-1
Preparação de alimento com leite fermentado com CM4Um leite desnatado comercialmente disponível foi dissolvido emágua destilada sob teor de sólidos de 9% (p/p), submetido à pasteurização aalta temperatura em uma autoclave a 105°C por 10 minutos e resfriado até atemperatura ambiente. Em seguida, a solução foi inoculada com 3% (v/p) deum líquido de fermentação de iniciador cepa CM4 (contagem de células de 5-108 células/mL) e fermentada sob condições estáticas a 37°C por 24 horaspara obter um leite fermentado com CM4.
O leite fermentado com CM4 assim obtido foi pasteurizado a80°C e Iiofilizado para obter um pó. O pó Iiofilizado foi misturado com umalimento em pó comercialmente disponível (nome comercial "CE-2", produ-zido por CLEA JAPAN, INC.) sob uma razão de 10 : 90 em massa para pre-parar um alimento sólido, que é referido como alimento de leite fermentadocom CM4. Esse alimento continha Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro derivados doleite fermentado com CM4 nas quantidades de 34,1 mg/kg e 17,1 mg/kg,respectivamente.
Teste de Confirmação de Efeito de Inibicão de Espessamento Vascular daíntima Independente de Melhoria de Lipídeos no Sangue
Camundongos ApoE nocante (5 semanas de idade) foram preli-minarmente criados por uma semana e em seguida deixados ter livre acessopor 31 semanas ao alimento de leite fermentado com CM4 preparado acima,ou um alimento sólido como alimento de controle preparado a partir de umalimento em pó comercialmente disponível (nome comercial "CE-2", produ-zido por CLEA JAPAN, INC.) não contendo o pó liofilizado do leite fermenta-do com CM4 (5 animais em cada grupo).
Após os consumos, sangue foi coletado transcardiacamente doscamundongos e submetido à testes bioquímicos para determinar os níveisde colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL e triglicerídeos. Os resul-tados são mostrados na Tabela 5.
A aorta torácica dos camundongos foi extraída e corada comhematoxilina-eosina para calcular a razão da área íntima/média. Os resulta-dos são mostrados na Figura 1 em um gráfico.
Exemplo Comparativo 2
Um leite desnatado comercialmente disponível foi dissolvido emágua destilada sob um teor de sólidos de 9% (p/p), submetido a pasteuriza-ção a alta temperatura em uma autoclave a 105°C por 10 minutos e resfriadoaté a temperatura ambiente. Ácido láctico foi adicionado à solução de modoa fornecer acidez comparável àquela do leite fermentado com CM4 prepara-do no Exemplo 2-1 (2,3%), para preparar um leite não-fermentado.
O leite não-fermentado assim obtido foi pasteurizado a 80°C e li-ofilizado para obter um pó. O pó Iiofilizado foi misturado com um alimento empó comercialmente disponível (nome comercial "CE-2", produzido por CLEAJAPAN, INC.) sob uma razão de 10 : 90 em massa para preparar um alimen-to sólido, que é referido como alimento de leite não-fermentado. O alimentode leite não-fermentado não continha Xaa-Pro-Pro ou Xaa-Pro.
O alimento de leite não-fermentado foi dado aos camundongosda mesma maneira que no Exemplo 2-1, e os testes bioquímicos e cálculoda razão da área vascular íntima/média foram realizados da mesma maneiraque no Exemplo 2-1. Os resultados são mostrados na Tabela 5 e Figura 1.Tabela 5
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Os resultados na Tabela 5 mostram que nenhum efeito de me-lhoria sobre hiperlipemia foi observado em relação ao leite fermentado comCM4 contendo Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro1 em comparação com o alimentode controle e o alimento de leite não-fermentado. Por outro lado, os resul-tados na Figura 1 mostram que o leite fermentado com CM4 inibiu significa-tivamente espessamento vascular da íntima em comparação com o alimen-to de controle e o alimento de leite não-fermentado. Deduzindo do fato deque o leite não-fermentado contém uma quantidade comparável ou mesmomaior de componentes do leite em comparação com o leite fermentadocom CM4, o efeito da presente invenção não é atribuível a componentes doleite.
Entende-se desse modo que o leite fermentado com CM4 exibiuo efeito de moderar espessamento vascular da íntima por meio de um me-canismo diferente daquele para melhorar hiperlipemia, e é assim eficaz con-tra aterosclerose causada por diferentes hiperlipemia de animais, incluindohumanos.
Exemplo 2-2
Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro sintetizados no Exemplo de Síntese, oleite fermentado com CM4 preparado no Exemplo 2-1 e o hidrolisado de ca-seína em pó preparado no Exemplo de Produção 1 (referido como pó do E-xemplo de Produção 1 daqui por diante) foram respectivamente misturadoscom um alimento em pó comercialmente disponível (nome comercial "CE-2",produzido por CLEA JAPAN, INC.) sob uma razão como mostrado na Tabela6 para preparar alimentos sólidos. O alimento em pó comercialmente dispo-nível foi também usado como controle.Teste de Confirmação de Efeito de Inibição de Espessamento Vascular daíntima
Camundongos ApoE nocante (6 semanas de idade, 8 animaispara cada grupo) foram deixados ter livre acesso aos Alimentos 1 a 7 comomostrado na Tabela 6 por 31 semanas. Em seguida, a aorta torácica doscamundongos foi extraída, fixada em formalina a 10% tamponada neutra esubmetida à coloração Elastica-van Gieson. Micrografias dos espécimes detecido foram escaneadas para o computador, e o grau de espessamentovascular da íntima (razão da área íntima/média (%)) foi calculado usando umsoftware de processamento de imagens (Image J). Os resultados são mos-trado na Tabela 6. Os valores do grau de espessamento mostrado na tabelasão as médias de cada grupo.<table>table see original document page 29</column></row><table>Dos resultados mostrados na Tabela 6, entende-se que Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro inibiram espessamento vascular da íntima dependente-mente de concentração. Adicionalmente, o leite fermentado com CM4 quecontém Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro e o pó de hidrolisado de caseína de leiteanimal produzido no Exemplo de Produção 1 que contém Xaa-Pro-Pro eXaa-Pro também inibiram espessamento vascular da íntima. Entende-se,assim, que os agentes ou alimentos que contêm pelo menos um dentre ospeptídeos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro moderaram espessamento vascular daíntima e são eficazes para prevenir aterosclerose.
Exemplos 3-1 e 3-2 e Exemplos Comparativos 3 e 4
Leites fermentados foram preparados da mesma maneira que noExemplo 2-1, usando cepa CM4 (Exemplo 3-1), Lactobacillus helveticusJCM1004 (Exemplo 3-2), Lactobacillus gasseri JCM1131 (Exemplo Compa-rativo 3) e iniciador Iiofilizado CH-1 comercialmente disponível (produzidopor Chr. Hansen A/S, que contém Streptococcus thermophilus e Lactobacil-Ius delbruekii sp. bulgarieus), respectivamente, sob as condições de quanti-dade de líquido de iniciador adicionado e de tempo de fermentação comomostrado na Tabela 7, e um produto Iiofilizado de cada leite fermentado foiobtido.
O produto Iiofilizado assim preparado foi misturado com um ali-mento em pó comercialmente disponível (nome comercial "CE-2", produzidopor CLEA JAPAN, INC.) sob uma razão de 10 : 90 em peso para prepararum alimento sólido. Os teores de Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro desse alimentosólido são mostrados na Tabela 7.
O teste de confirmação do efeito de inibição de espessamentovascular da íntima foi conduzido sobre cada um dos alimentos sólidos assimproduzidos da mesma maneira que no Exemplo 2-2, e o grau de espessa-mento da íntima (razão da área íntima/média (%)) foi calculado. Os resulta-dos são mostrado na Tabela 7. Os valores do grau de espessamento da ín-tima na tabela são as médias de cada grupo.<table>table see original document page 31</column></row><table>Dos resultados mostrados na Tabela 7, revelou-se que os produ-tos de fermentação com Lactobacillus helveticus moderaram espessamentovascular da íntima, cujo efeito não foi observado para os produtos de fer-mentação com outra espécie bacteriana.

Claims (15)

1. Agente que apresenta pelo menos um dentre um efeito de me-lhoria sobre funções endoteliais vasculares e um efeito inibidor sobre espes-samento vascular da íntima, o referido agente compreende como componen-te ativo um hidrolisado de caseína de leite animal que contém Xaa-Pro-Pro1ou um concentrado deste.
2. Agente de acordo com a reivindicação 1, no qual o teor do re-ferido Xaa-Pro-Pro não é menor que 1% em peso da quantidade total depeptídeos e aminoácidos livres no hidrolisado de caseína de leite animal.
3. Agente de acordo com a reivindicação 1, no qual o referidoXaa-Pro-Pro compreende Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro.
4. Agente de acordo com a reivindicação 3, no qual o teor do re-ferido Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro não é menor que 0,3% em peso da quan-tidade total de peptídeos e aminoácidos livres no hidrolisado de caseína deleite animal.
5. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,no qual o referido hidrolisado de caseína de leite animal compreende Xaa-Pro.
6. Agente de acordo com a reivindicação 5, no qual o referidoXaa-Pro compreende pelo menos um peptídeo selecionado do grupo queconsiste de Ile-Pro, Glu-Pro1 Arg-Pro, Gln-Pro, Met-Pro1 Tyr-Pro e misturasdestes.
7. Agente de acordo com a reivindicação 5 ou 6, no qual o teordo referido Xaa-Pro não é menor que 5% em peso da quantidade total depeptídeos e aminoácidos livres no hidrolisado de caseína de leite animal.
8. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,no qual o referido hidrolisado de caseína de leite animal é um produto defermentação de caseína de leite animal com mofo cójico.
9. Agente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,no qual o referido hidrolisado de caseína de leite animal é um produto dehidrólise enzimática de caseína de leite animal com uma enzima derivada demofo cójico.
10. Agente de acordo com a reivindicação 9, no qual a enzimaextracelular derivada de mofo cójico é uma enzima derivada de Aspergillusoryzae.
11. Agente que apresenta pelo menos um dentre um efeito demelhoria sobre funções endoteliais, vasculares e um efeito inibidor sobreespessamento vascular da íntima, agente o referido compreendendo Xaa-Pro-Pro como componente ativo.
12. Agente de acordo com a reivindicação 11, no qual o referidoXaa-Pro-Pro compreende Ile-Pro-Pro e/ou Val-Pro-Pro.
13. Agente que apresenta pelo menos um dentre um efeito demelhoria sobre funções endoteliais vasculares, e um efeito inibidor sobreespessamento vascular da íntima, o referido agente compreende ndocornocomponente ativo um produto de fermentação que contém Ile-Pro-Pro e/ouVal-Pro-Pro obtidos por fermentação de um material de partida que compre-ende proteína de leite com uma cepa bacteriana da espécie LactobaciHushelveticus.
14. Agente de acordo com a reivindicação 13, no qual o referidoLactobacillus helveticus compreende cepa CM4 de Lactobacillus helveticus(depositada no Depósito Internacional de Organismos de Patentes, InstitutoNacional de Ciência Industrial Avançada e Tecnologia (International PatentOrganism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science eTechnology), sob número de acesso FERM BP-6060).
15. Profilático de arteriosclerose que compreende como compo-nente ativo um agente como definido em uma das reivindicações 1 a 14.
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