KR20080105073A - 동맥경화 예방제, 혈관 내막의 비후 억제제 및 혈관 내피 기능 개선제 - Google Patents

동맥경화 예방제, 혈관 내막의 비후 억제제 및 혈관 내피 기능 개선제 Download PDF

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Abstract

혈관 내피에 관계되는 기능을 개선할 수 있고, 혈관 내피 기능에 관계되는 각종 질병의 예방이나, 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖고, 동맥경화 예방 등의 작용을 기대할 수 있는, 안전성이 우수한 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 제제, 및 동맥경화 예방제를 제공한다. 본 발명의 제제는 (a) Xaa Pro Pro 또는, (b) Xaa Pro Pro를 포함하는 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물, (c) 락토바실루스-헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어지는, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 유효성분으로서 함유한다.
혈관 내피 기능, 동맥경화 예방, 카세인, 유단백질, 발효물.

Description

동맥경화 예방제, 혈관 내막의 비후 억제제 및 혈관 내피 기능 개선제{AGENT FOR PREVENTING ARTERIOSCLEROSIS, AGENT FOR SUPPRESSING VASCULAR INTIMAL THICKENING AND AGENT FOR IMPROVING VASCULAR ENDOTHELIAL FUNCTION}
본 발명은 혈관 내막의 비후 억제 작용이나 혈관 내피의 기능 개선 작용을 나타내며, 항동맥경화 작용을 기대할 수 있는 동맥경화 예방제, 혈관 내막의 비후 억제제, 혈관 내피 기능 개선제 및 이러한 작용을 나타내는 기능성 식품에 관한 것이다.
심근경색이나 뇌경색 등의 동맥경화성 질환은 암과 함께 일본에서 사인의 가장 큰 비율을 나타내고 있다. 동맥경화의 위험인자로서는 고지혈증, 고혈압, 당뇨병, 흡연, 비만, 고요산혈증, 가령(加齡), 스트레스 등을 들 수 있고, 그것들이 서로 얽혀 혈관장해를 일으킨다. 이 때문에, 개개의 위험인자의 정도가 경미하더라도, 그것들의 중복에 의해 위험도가 상가적, 상승적으로 증가한다.
종래, 발효유, 유산균 또는 젖의 효소 분해물에 있어서의 생리기능이 많이 발견되었다. 예를 들면, 특허문헌 1 및 2에는, 콜레스테롤 저하 작용이 있는 것, 특허문헌 3 및 비특허문헌 1에는, 혈압 저하 작용이 있는 것, 특허문헌 4에는, 항스트레스 작용이 있는 것이 기재되어 있고, 또한 특허문헌 5에는, 짐승젖 카세인을 평균 사슬 길이가 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해하여 얻은, 유리 아미노산 및 펩티드를 포함하는 카세인 가수분해물이 안지오텐신I 변환 효소 저해 활성 또는 혈압 강하 작용을 갖는 것이 기재되어 있다. 즉, 이들 문헌에는, 동맥경화에 대한 개개의 위험인자를 경감하는 지견이 기재되어 있다.
한편, 상기의 하나의 위험인자 작용을 저하시키는 것만으로는 동맥경화의 발증 예방에는 이르지 못하는 것으로 여겨지고 있다. 예를 들면, 비특허문헌 2 또는 3에는, 혈중 콜레스테롤 농도와 동맥경화 발증이 상관되지 않는 것이, 비특허문헌 4에는, 고혈압 상태를 억제해도 동맥경화의 정도에 변화가 보이지 않는 것이, 또한 비특허문헌 5에는, 안지오텐신I 변환 효소 저해제(에날라프릴)를 투여해도 동맥경화 억제 작용은 보이지 않는 것이 기재되어 있다.
따라서, 상기 특허문헌 5에 기재된 특정한 카세인 가수분해물에, 동맥경화에 대한 개개의 위험인자를 경감하는 지견이 얻어지고 있어도, 이것에 의해, 이 특정 가수분해물이 항동맥경화 작용을 갖는다고는 할 수 없다.
그런데, 동맥은 외막과, 혈관의 확장·수축을 행하는 평활근층을 갖는 중막과, 혈액과 직접 접하고, 또한 상기 중막의 평활근층에 지령을 내리는 내피세포층을 갖는 내막으로 주로 구성된다. 이 내막에서의 내피세포는, 혈액의 선용(fibrinolysis)·응고, 혈관의 확장·수축, 염증의 억제·진전, 혈관의 증식·퇴축 또는 축소 등의 혈관기능에 관계되는 여러 지령을 담당하는 것이 최근 밝혀지게 되었고, 이 내피 기능은 동맥경화를 비롯한 여러 질병에 관계되는 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 혈관 내피 기능을 개선함으로써 동맥경화의 예방 등을 기대할 수 있다.
또, 동맥경화는, 동맥벽이 비후하여 탄력성이 없어지는 병태이며, 그중에서도 아테로마성 동맥경화는 동맥의 내막 아래에서의 반점 모양의 비후(아테로마)를 특징으로 하는 혈류를 감소 또는 두절시키는 증상을 나타내는 동맥경화이다. 최근, 이러한 증상의 요인으로서, 혈관 내피세포의 손상이나 기능 저하가 거론되고 있다.
따라서, 혈관 내막의 비후를 억제함으로써 아테로마성 동맥경화 발증의 완화, 예방 작용을 기대할 수 있다.
상기 혈관 내피 기능의 측정을 인간에게 있어서 비파괴 조건으로 진단 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, 비특허문헌 6에 개시되는 바와 같이, 혈량측정법(plethysmography)이 알려져 있다. 이 혈량측정법은 동맥의 혈류를 일시적으로 멈추었을 때, 내피세포가 생산·방출하는 혈관확장 물질의 양이 증대하여, 일과성으로 혈류량이 증가하는 것을 이용하여, 혈관확장성으로부터 내피세포의 기능을 측정하는 방법이며, 내피세포의 기능이 상해되어 있으면, 혈관확장 물질의 방출량이 저하되기 때문에, 혈류량도 저하되는 것에 근거하는 방법이다.
특허문헌 1: 일본 특개 2003-306436호 공보
특허문헌 2: 일본 특개 2002-65203호 공보
특허문헌 3: 일본 특개 2005-52090호 공보
특허문헌 4: 일본 특개 평10-45610호 공보
특허문헌 5: 국제공개 2005-102542호 팸플릿
비특허문헌1: American Journal of Clinical Nutrition 64(1996) p767-771
비특허문헌 2: 쇼쿠노 카가쿠 257 (1999) p20-25
비특허문헌 3: Atherosclerosis 151 (2000) p501-508
비특허문헌 4: Circulation 104 (2001) p2391-2394
비특허문헌 5: International Journal of Cardiology 81 (2001) p107-115
비특허문헌 6: The Amencan Journal of Cardiology 87 (2001) p121-125
(발명이 해결하고자 하는 과제)
본 발명의 과제는 혈관 내피에 관계되는 기능을 개선할 수 있고, 혈관 내피 기능에 관계되는 각종 질병, 예를 들면, 동맥경화 예방 등의 작용을 기대할 수 있고, 또 혈관 내막의 비후를 완화, 예방 작용을 나타내며, 아테로마성 동맥경화 예방을 기대할 수 있는, 안전성이 우수한 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제 및 동맥경화 예방제를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 과제는, 일상적으로 연용(連用) 가능하고, 안전성이 우수하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 기능성 식품을 제공하는 것에 있다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물을 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제가 제공된다.
또 본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제가 제공된다.
또한 본 발명에 의하면, 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 유효성분으로서 포함하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제가 제공된다.
더욱이 또 본 발명에 의하면, 상기 어느 하나의 약제를 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방제가 제공된다.
또 본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물을 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 기능성 식품이 제공된다.
또한 본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 기능성 식품이 제공된다.
더욱이 또 본 발명에 의하면, 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 유효성분으로서 포함하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 기능성 식품이 제공된다.
또 본 발명에 의하면, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제 또는 기능성 식품을 제조하기 위한, Xaa Pro Pro를 포함한, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물, Xaa Pro Pro, 혹은 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 넣는 원료를 발효되게 해서 얻어진, l1e Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물의 사용이 제공된다.
또한 또 본 발명에 의하면, 동맥경화 예방제를 제조하기 위한, Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물, Xaa Pro Pro, 혹은 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물의 사용이 제공된다.
더욱이 또, 본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물, Xaa Pro Pro, 혹은 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 동물에게 투여하는, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나를 개선 또는 억제하는 방법이 제공된다.
또 본 발명에 의하면, Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물, Xaa Pro Pro, 혹은 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 동물에게 투여하는, 동맥경화의 예방 방법이 제공된다.
(발명의 효과)
본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 약제 또는 기능성 식품은, 특정 카세인 가수분해물 또는 그 농축물, Xaa Pro Pro, 혹은 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 특정한 발효물 혹은 Xaa Pro Pro를 유효성분으로서 포함하므로, 안전성이 우수하고, 특히, 기능성 식품의 경우에는, 일상적으로 연용 가능하다. 따라서, 혈관 내피 기능에 관한, 만성적인 고혈압증의 개선이나, 동맥경화증, 혈관 내막의 비후를 억제하고, 특히 가령, 생활 습관 등에 의해 혈관 내피세포의 기능 저하나 손상에 의한 아테로마 형성을 억제하고, 아테로마성 동맥경화의 발증을 완화, 예방할 수 있다.
본 발명의 동맥경화 예방제는 본 발명의 상기 제제를 유효성분으로 포함하므로, 동맥경화의 예방 작용을 기대할 수 있다.
도 1은 실시예 2-1 및 비교예 2에서 행한 혈관 내막의 비후 억제 효과의 확인 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 제제 및 기능성 식품은 (a) Xaa Pro Pro(이하, (a) 성분이라고 함) 또는, (b) Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물(이하, (b) 성분이라고 함), (c) 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜 얻어지는, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함 하는 발효물(이하, (c) 성분이라고 함)을 유효성분으로서 함유한다. 즉, (b) 및 (c) 성분은 (a) 성분을 포함하고, (a) 성분, 특히, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro가 유효성분으로서 유용한 것은 후술하는 실시예 등에 의해 이해할 수 있다.
(a) 또는 (b) 성분의 Xaa Pro Pro로서는 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 것이 바람직하다. (b) 성분은 Xaa Pro를 더 포함하는 것이 바람직하다.
(b) 성분 중에 포함되는 Xaa Pro Pro의 함유 비율은, (b) 성분 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여 통상 1중량% 이상, 바람직하게는 1∼5중량%이다. 이 함유 비율을 1중량% 이상으로 함으로써, 보다 높은 작용이 기대된다. 또, (b) 성분 중에 포함되는 Ile Pro Pro 또는 Val Pro Pro의 함유 비율은 성분 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여, 각각 단독으로 0.3중량% 이상이어도, Ile Pro Pro 및 Val Pro Pro의 합계량이 0.3중량%이상이어도, 높은 효과가 기대된다. 또한, Ile Pro Pro 및 Val Pro Pro의 각각을 0.3중량% 이상 함유하는 경우에는, 보다 높은 효과가 기대된다.
(b) 성분 중에 포함되는 Xaa Pro의 함유 비율은 (b) 성분 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여 통상 5중량% 이상, 바람직하게는 5∼25중량%이다. 이 함유 비율을 5중량% 이상으로 함으로써, 보다 높은 작용이 기대된다.
(c) 성분 중에 포함되는 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro의 함유 비율은 발효물의 동결 건조물 100g 중으로 환산하여 10mg 이상, 바람직하게는 15mg 이상이면 원하는 효과가 기대된다.
(b) 성분 중의 Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro의 Xaa는 임의의 아미노산이면 된다. 예를 들면, Xaa Pro Pro로서는 Ser Pro Pro, Leu Pro Pro, Ile Pro Pro, Val Pro Pro를 들 수 있고, Xaa Pro로서는, Ile Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gln Pro, Met Pro, Tyr Pro를 들 수 있다. (b) 성분으로서는, 상기 예시한 Xaa Pro Pro의 적어도 1종 혹은 2종 이상을 포함하는 것이 바람직하고, 게다가, 상기 예시한 Xaa Pro의 1종 혹은 2종 이상을 포함하는 카세인 가수분해물을 바람직하게 들 수 있다.
(b) 또는 (c) 성분은 펩티드 이외에 유리 아미노산을 함유하고 있어도 되고, 또한, 상기 펩티드 및 유리 아미노산 이외에, 예를 들면 시판의 짐승젖 카세인, 유단백질에 통상 포함되는, 지방질, 회분, 탄수화물, 식물 섬유, 수분 등이 함유되어 있어도 되고, 또한 필요에 따라 이들 중 적당한 성분의 일부 혹은 전부를 제거해도 된다.
(b) 성분을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 상기 Xaa Pro Pro, 또 Xaa Pro가 얻어지는 효소군을 사용하여, 짐승젖 카세인을 가수분해하는 방법, 짐승젖 카세인을 누룩곰팡이에 의해 발효하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
짐승젖 카세인은 Pro를 많이 포함하는 식품 등에 사용되는 안전성이 확인된 단백질이며, 예를 들면 우유, 말젖, 염소젖, 양젖 등의 카세인을 들 수 있으며, 특히 우유 카세인을 바람직하게 사용할 수 있다.
짐승젖 카세인을 가수분해 또는 발효할 때의 카세인 농도는, 특별히 한정되지 않지만 (b) 분해물을 효율적으로 생산하기 위하여, 3∼19중량%가 바람직하다.
상기 효소군으로서는, 예를 들면, Xaa Pro Xaa 또는 Xaa Pro Pro Xaa의 카르복시 말단의 Pro Xaa 배열을 절단할 수 있는 펩티다제를 포함하는 효소군(X)을 바 람직하게 들 수 있다.
효소군(X)은 활성 중심에 세린을 갖는, 세린 타입의 프로티나제 혹은, 활성 중심으로 금속을 갖는 금속 프로티나제를 포함하는 것이 바람직하다. 금속 프로티나제로서는 중성 프로테아제 1, 중성 프로테아제 II 및 류신 아미노펩티다제 등을 들 수 있고, 이것들의 적어도 1종을 더 포함하는 것이, 원하는 가수분해물을 효율적으로, 또한 단시간에, 게다가 1단계 반응에서 얻을 수 있는 점에서 바람직하다. 또 상기 Pro Xaa 배열을 절단할 수 있는 펩티다제로서는 등전점이 산성 영역을 나타내는 효소인 것이 바람직하다.
상기 효소군 또는 효소군(X)로서는, 예를 들면, 아스페르길루스·오리재(Aspergillus oryzae) 등의 누룩곰팡이 유래의 효소군을 들 수 있다. 이러한 효소군은 적당한 배지에서 균체를 배양하고, 생산되는 효소를 수분 추출한 효소군 등을 들 수 있고, 특히, 아스페르길루스·오리재 유래의 효소군 중의 등전점이 산성영역을 나타내는 효소군을 바람직하게 들 수 있다.
아스페르길루스·오리재 유래의 효소군으로서는 시판품을 이용할 수 있고, 예를 들면, 수미자임 FP, LP 또는 MP(이상, 등록상표, 신니혼카가쿠(주)제), 우마미자임(등록상표, 아마노 엔자임(주)제), Sternzyme B11024, PROHIDR0XY AMPL(이상, 상품명, 주식회사 히구치쇼카이제), 오리엔타제 ONS(등록상표, 한큐 바이오인더스트리(주)제), 데나자임 AP(등록상표, 나가세 생화학사제) 등을 들 수 있고, 특히, 수미자임 FP(등록상표, 신니혼카가쿠(주)제)의 사용이 바람직하다.
이들 시판의 효소군을 사용하는 경우에는, 통상, 지적조건이 설정되어 있지 만, 상기 카세인 가수분해물이 얻어지도록 조건, 예를 들면, 사용 효소량이나 반응시간 등을, 사용하는 효소군에 따라 적당하게 변경하여 행할 수 있다.
상기 짐승젖 카세인을 가수분해할 때의 효소군의 첨가량은, 예를 들면, 짐승젖 카세인을 용해한 수용액에, 효소군/짐승젖 카세인이 중량비로 1/1000 이상, 바람직하게는 1/1000∼1/10, 특히 바람직하게는 1/100∼1/10, 더욱 바람직하게는 1/40∼1/10의 비율이 되는 것과 같은 양이다.
반응조건은 효소군에 따라 원하는 카세인 가수분해물이 얻어지도록 적당하게 선택할 수 있지만, 온도는, 통상 25∼60℃, 바람직하게는 45∼55℃이며, pH는 3∼10, 바람직하게는 5∼9, 특히 바람직하게는 5∼8이다. 또, 효소반응 시간은 통상 2∼48시간, 바람직하게는 7∼15시간이다.
효소 반응의 종료는 효소를 실활시킴으로써 행할 수 있고, 통상, 60∼110℃에서 효소를 실활시켜, 반응을 정지시킬 수 있다.
효소반응 정지 후, 필요에 따라 침전물을 원심분리 제거나 각종 필터 처리에 의해 제거하는 것이 바람직하다.
또, 필요에 따라, 얻어지는 가수분해물로부터 쓴맛이나 불쾌한 냄새를 갖는 펩티드를 제거할 수도 있다. 이러한 쓴맛 성분이나 불쾌한 냄새 성분의 제거는 활성탄 또는 소수성 수지 등을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 얻어진 가수분해물 중에, 사용한 카세인량에 대하여 활성탄을 1∼20중량% 첨가하고, 1∼10시간 반응시킴으로써 실시할 수 있다. 사용한 활성탄의 제거는 원심 분리나 막처리 조작 등의 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.
얻어지는 (b) 성분을 포함하는 반응액은 그대로 음료 등의 액체제품에 첨가하여 기능성 식품에 이용할 수 있다. 또, (b) 성분 중 카세인 가수분해물의 범용성을 높이기 위하여, 상기 반응액을 농축 후, 건조하여 분말의 형태로 하는 것이 바람직하다. 분말로 함으로써, 예를 들면, 혈관 내막의 비후 억제 작용, 혈관 내피 기능 개선 작용, 동맥경화 예방 작용 중 적어도 하나의 작용을 각종 식품 등에 부여할 수 있는, 기능성 부여제로 하는 것이 가능하다.
이러한 분말에는, 영양적 밸런스나 풍미 등을 개선하기 위하여, 각종 보조 첨가제를 함유시킬 수도 있다. 예를 들면, 각종 탄수화물, 지방질, 비타민류, 미네랄류, 감미료, 향료, 색소, 텍스처 개선제 등을 들 수 있다.
본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 제제에 있어서 (b) 성분을 유효성분으로 할 때의 투여량은, 인간의 경우, 1일당, (b) 성분 중의 Xaa Pro Pro 혹은, Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro의 합계량으로서, 통상 10μg∼10g, 바람직하게는 1mg∼5g, 더욱 바람직하게는 3mg∼1g 정도이며, 1일에 여러 회로 나누어 섭취해도 된다.
투여기간은 그 질병의 증상 등에 따라 조정할 수 있으며, 통상 1일 이상, 바람직하게는 7일∼365일 사이에서, 상용적인 섭취가 바람직하다.
(c) 성분의 제조에 사용하는 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주는 락토바실루스·헬베티쿠스종 단독이지만, 발효 시에는, 본 발명의 원하는 효과를 손상시키지 않는 범위에서 다른 유산균 등을 포함하고 있어도 된다.
락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주로서는 혈관 내피 기능 개선 작용 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 많이 생산할 수 있는 생산균으로서 바람직한 균체외 프로티나제 활성이 높은 것의 사용이 바람직하다. 예를 들면, Twining 등의 방법(Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410(1984))을 바탕으로 한 Yamamoto 등의 방법(Yamamoto, N. 등 J. Biochem.(1993) 114, 740)에 준하여 측정한 U/OD 590의 값이 400 이상을 나타내는 균주가 바람직하다.
바람직한 락토바실루스·헬베티쿠스로서는, 예를 들면, 락토바실루스·헬베티쿠스 CM4주(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터 일본 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 중앙 제6기탁번호: FERM BP-6060, 기탁일 1997. 8. 15)(이하, CM4주라고 칭함)를 들 수 있다. 이 CM4주는 특허수속상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 상기 기탁번호로 등록되어 있고, 이 주는 이미 특허되어 있다.
(c) 성분은 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주를 포함하는 발효유 스타터를 유단백질을 포함하는 원료에 첨가하고, 발효온도 등의 발효조건을 적당하게 선택하여 발효시킴으로써 얻을 수 있다.
유효성분인 (c) 성분은, 얻어지는 (c) 성분의 농축물 등을 동결건조, 분무건조 등에 의해 분말로 한 것을 포함한다.
락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주는 미리 사전 배양해 둔 충분히 활성이 높은 스타터로서 사용하는 것이 바람직하다. 시발 균수는 바람직하게는 105 ∼109개/ml 정도이다.
(c) 성분은, 예를 들면, 특정 보건용 식품 등의 기능성 음식품에 이용할 때에, 풍미를 양호하게 하고, 기호성을 양호하게 하기 위하여, 상기 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 효모를 병용하여 발효시킬 수도 있다. 효모의 균종은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 사카로미세스 세레비세 등의 사카로미세스속 효모 등을 바람직하게 들 수 있다. 효모의 함유 비율은 그 목적에 따라 적당하게 선택할 수 있다.
유단백질을 포함하는 원료로서는, 예를 들면 우유, 말젖, 양젖, 염소젖 등의 동물유, 및 두유 등의 식물유, 이것들의 가공유인 탈지유, 환원유, 분유, 연유를 들 수 있고, 우유, 두유, 이것들의 가공유가 바람직하며, 우유 또는 그 가공유가 특히 바람직하다.
젖의 고형분 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 탈지유를 사용하는 경우의 무지유 고형분 농도는, 통상 3∼15중량% 정도이며, 생산성 면에서는 6∼15중량%가 바람직하다.
상기 발효는, 통상 정치 혹은 교반 발효에 의해, 예를 들면, 발효온도 25∼45℃, 바람직하게는 30∼45℃, 발효시간 3∼72시간, 바람직하게는 12∼36시간에, 락트산 산도가 15% 이상으로 된 시점에서 발효를 정지하는 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 제제에 있어서 (c) 성분을 유효성분으로 할 때의 투여량은, 인간의 경우, 1일당, (c) 성분의 건조량으로서, 통상 1∼100g, 특히 2∼50g 정도가 바람직하고, 1일에 여러 회로 나누어서 섭취해도 된다. 또 (c) 성분 중의 Val Pro Pro 및/또는 Ile Pro Pro량으로서, 통상 10μg∼10g, 바람직하게는 1mg∼5g, 더욱 바람직하게는 3mg∼1g 정도이며, 1일에 여러 회로 나누어서 섭취해도 된다.
투여기간은 그 질병의 증상 등에 따라 조정할 수 있고, 통상 1일 이상, 바람직하게는 7일∼365일 사이에서, 상용적으로 섭취하는 것이 바람직하다.
본 발명의 동맥경화 예방제는, 상기 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 제제를 포함한다. 특히, 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 경우에는, 아테로마성 동맥경화 예방제로서 유용하다.
본 발명의 동맥경화제의 투여량은 1일당, 인간의 경우, 상기 (a)∼(c) 성분 중의 Xaa Pro Pro 혹은, Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro의 합계량, 또는 Val Pro Pro 및/또는 Ile Pro Pro량으로서, 통상 10μg∼10g, 바람직하게는 1mg∼5g, 더욱 바람직하게는 3mg∼1g 정도이며, 1일에 여러 회로 나누어서 섭취해도 된다.
동맥경화 예방제의 투여기간은 섭취하는 인간 또는 동물의 연령이나 그 인간이나 동물의 동맥경화 위험인자에 대한 환경 등을 고려하여 여러 가지로 조정할 수 있으며, 통상 1일 이상, 바람직하게는 7일∼365일 사이에서, 상용적인 섭취가 바람직하다.
본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 제제, 및 동맥경화 예방제의 투여 방법은 경구 투여가 통상이다.
본 발명의 제제의 형태는 경구 투여용의 제제의 형태로 할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 경캡슐제, 연캡슐제, 마이크로캡슐, 산제, 과립제, 액제 등을 들 수 있다.
제제화는, 예를 들면 적당하게 필요에 따라, 약제로서 허용되는 담체, 아쥬번트, 부형제, 보형제, 방부제, 안정화제, 결합제, pH 조절제, 완충제, 증점제, 겔화제, 보존제, 항산화제 등을 사용하여, 일반적으로 확인된 제제 실시에 요구되는 단위용량 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은, 본 발명의 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 제의 유효성분으로서의 상기 (b) 또는 (c) 성분을 포함하고, 혈관 내피 기능 개선 및/또는 혈관 내막의 비후 억제 작용을 갖는 특정 보건용 식품 등의 건강식품으로 할 수 있다.
이러한 효능을 얻기 위한 섭취량은, 기능성 식품이 연용 가능하며, 연속적 또는 단속적으로 장기간 섭취하는 것을 감안하면, 인간의 경우, 1일당, 상기 (b) 성분 중의 Xaa Pro Pro 혹은, Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro의 합계량으로서, 또 상기 (c) 성분 중의 Val Pro Pro 및/또는 Ile Pro Pro량으로서, 통상 10μg∼10g, 바람직하게는 1mg∼5g, 더욱 바람직하게는 3mg∼1g 정도이며, 1일당의 섭취 회수에 따라, 기능성 식품에 있어서의 1회당의 섭취량을 상기 양보다 더욱 낮게 하는 것도 가능하다.
본 발명의 기능성 식품의 섭취 기간은 특별히 한정되지 않고, 장기간 섭취하는 것이 바람직하지만, 상기 효능을 얻기 위하여, 통상 1일간 이상, 특히 7일∼365 일 정도로, 상용적인 섭취가 바람직하다.
본 발명의 기능성 식품은, 상기 유효성분인 (b) 또는 (c) 성분 이외에, 필요에 따라, 락토바실루스·헬베티쿠스 이외의 유산균의 발효물이나, 음식품에 사용하는 다른 성분, 예를 들면 당류, 단백질, 지방질, 비타민, 미네랄, 플레이버, 또는 이것들의 혼합물 등의 첨가물을 첨가할 수도 있다.
본 발명의 기능성 음식품의 형태는, 상기 (b) 또는 (c) 성분을, 그대로, 혹은 분말이나 과립으로 하고, 각종 음식품에 첨가함으로써 고형물, 겔 형상물, 액상물의 어느 형태로 할 수 있으며, 예를 들면 유산균 음료 등의 발효유 제품, 각종 가공음식품, 건조분말, 정제, 캡슐제, 과립제 등을 들 수 있고, 게다가 또 각종 음료, 요구르트, 유동식, 젤리, 캔디, 레토르트 식품, 정과(tablet candy), 쿠키, 카스텔라, 빵, 비스킷, 초콜렛 등으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 분석예 및 비교예에 의해 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명의 범위는 이것들에 한정되지 않는다.
제조예 1
우유 유래 카세인(일본 NZMP사제) 1g을 약 80℃로 조정한 증류수 99g에 가하고 충분히 교반한 후, 1N 수산화나트륨(와코쥰야쿠사제) 용액을 첨가하여 pH7.0으로 하고, 또 온도를 20℃로 조정하여 기질 용액을 조제했다.
얻어진 기질 용액에 아스페르길루스·오리재 유래이며, 적어도 금속 프로테아제, 세린 프로테아제, 중성 프로테아제 I, 중성 프로테아제 Il 및 류신 아미노펩 티다제를 포함하는 시판의 효소(등록상표 「수미자임 FP」, 신니혼카가쿠고교사제)을, 효소/카세인의 중량비가 1/25이 되도록 첨가하고, 50℃에서 14시간 반응시켰다. 계속해서, 110℃에서 10분간의 오토클레이브를 행하고, 효소를 실활시켜, 카세인 효소 분해물 용액을 얻었다. 다음에 얻어진 효소 분해물 용액을 스프레이 드라이어에 의해 건조하고, 분말을 조제했다.
얻어진 분말 중의 함유성분의 분석을 행했다. 단백질은 켈달법으로 측정하고, 아미노산은 아미노산 분석 장치로 측정했다. 또, 이 단백질량에서 아미노산을 뺀 양을 펩티드량으로 했다. 또한, 지질은 산분해법으로, 회분은 직접 회화법으로, 수분은 상압 가열건조법으로 각각 측정했다. 또한, 100%에서 각 성분을 뺀 나머지를 탄수화물량으로 했다. 그 결과, 아미노산은 35.8중량%, 펩티드는 45.7중량%, 수분은 6.6중량%, 지질은 0.2중량%, 회분은 4.1중량% 및 탄수화물은 7.6중량%이었다.
<펩티드 구성 아미노산의 측정>
상기에서 조제한 분말을 적당량의 증류수에 용해하고, 자동 펩티드 분석기(상품명 PPSQ-10 (주)시마즈 세사쿠쇼제)를 사용하여 해석하고, 분말 중에서 N말단측에서 차례로 어떠한 아미노산이 위치할지를 조사했다. 또한, 자동 펩티드 분석기는 유리 아미노산을 검출하지 않는다.
또, 5잔기째의 아미노산의 합계는 120pmol, 6잔기째의 아미노산의 합계는 100pmol이었다. 이들 결과로부터, 상기 분말 중에 포함되는 펩티드의 대부분이 디펩티드 및 트리펩티드인 것을 알았다. 또, 2잔기째의 아미노산이 Pro인 펩티드의 비율이 49.5%로 현저하게 상승했다. 또한 3잔기째의 아미노산이 Pro인 펩티드의 비율도 29.8%로 많았다.
따라서, 상기 분말에는, Xaa Pro 또는 Xaa Pro Pro가 많이 포함되고, 이들 펩티드는 생체 내 프로테아제에 의한 효소분해 작용에 대한 저항성이 높은 펩티드인 것으로 추정할 수 있다.
<효소 분해물 중에 포함되는 펩티드의 측정>
상기 효소 분해물의 분말에 대하여, 각종 화학 합성 표준 펩티드를 사용하고, 상법에 따라, 이 분말에 포함되는 표 1에 나타내는 디펩티드 및 트리펩티드량을 구했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112008064376200-PCT00001
또, 상기 분말을 증류수로 희석 용해한 용액 중의 펩티드 및 유리 아미노산량이 8.15mg/ml이고, 펩티드량이 4.57mg/ml이고, 이 펩티드 중의 Xaa Pro량이 514.5μg이었으므로, 분말 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대한 Xaa Pro의 비율은 6.3중량%이며, 또한, 이 펩티드 중의 Xaa Pro Pro량이 116.5μg이었으므로, 분말 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대한 Xaa Pro Pro의 비율은 1.4중량%인 것을 확인했다.
(실시예 1-1)
혈관 내피 기능 개선 효과를 검토하기 위하여, 40세 이상 65세 이하의 성인 남성 중, 수축기 혈압 140∼159mmHg 또는 확장기 혈압 90∼99mmHg을 나타내는 24인씩의 2군을 대상으로 하여, 제조예 1에서 조제한 카세인 가수분해물의 분말 1.25g을 캡슐에 충전한 피험식 또는, 카세인 나트륨 분말 1.25g을 캡슐에 충전한 플라시보를, 조식 시 또는 조식 후 30분 이내에, 1일 1회 7일간 섭취하게 하고, 2군 사이의 이중맹검 크로스오버 시험을 실시했다.
시험은 혈량측정법(Plethysmograph EC6, Primetech Co.제)을 사용하여, 피험식 및 플라시보를 섭취하기 전, 및 7일간 섭취 후에 있어서의, 안정 시와 구혈 해방 후의 전완동맥 혈류량을 측정함으로 행했다. 결과를 각 군의 평균으로서 표 2에 나타낸다.
Figure 112008064376200-PCT00002
표 2 중의 검사값은 각 24인의 평균값±표준편차에서의 표시이며, FBF는 전완 혈류량(Forearm Blood Flow)을 나타낸다.
피험식군의 최대 혈류량 및 (B)/(A)×100은 플라시보군과의 비교에서 p<0.001에서 유의하였다. 피험식군의 최대 혈류량 및 (B)/(A)×100은 섭취 전과의 비교에서 p<0.001에서 유의하였다.
표 2로부터, 안정시의 전완동맥 혈류량은, 섭취 전후에 피험식군과 플라시보군의 비교에서 유의한 차이가 확인되지 않았다.
한편, 구혈 해방 후의 최대 유입양은 섭취 전은 양쪽 군 사이에서 유의한 차이는 확인되지 않았지만, 섭취 후는 섭취 전과 비교해도, 플라시보군과 비교해도 피험식군에서 유의한 높은 값을 보였다(모두 t 검정에서 p<0.001).
또, 반응성 충혈 후의 최대 혈류량의 안정시 비에 대하여, 섭취 전은 양쪽 군 사이에서 유의한 차이는 확인되지 않았지만, 섭취 후는 섭취 전과 비교해도, 플라시보군과 비교해도 피험식군에서 유의한 높은 값을 나타냈다(모두 t 검정에서 p<0.001). 또, 시험기간에 있어서의 혈압의 유의한 개선은 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, 제조예 1에서 제조한 카세인 분해물은 섭취함으로써, 혈량측정법을 사용한 생리적인 혈관 내피 기능평가에 있어서, 현저한 개선 작용을 보이는 것이 밝혀졌고, 혈관 내피 기능 개선제로서 유효한 것이 확인되었다. 또, 이 개선 작용은 혈압강하 작용에 부수된 것이 아닌 것도 확인할 수 있었다.
상기 각 군의 피험자에 대하여, 구강 내에 니트로글리세린 0.3mg을 분무 투여하고, 그 후 10분간, 혈관 내피 비의존성의 외인성 NO에 대한 혈관 확장 반응을 관찰하고, 그동안의 최대 혈류량을 측정값으로 했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112008064376200-PCT00003
표 3중의 검사값은 각 24인의 평균값±표준편차에서의 표시이며, FBF는 전완 혈류량(Forearm Blood Flow)을 나타낸다.
표 3으로부터, 양쪽 군 모두, 섭취 전후의 비교, 및 양쪽 군 사이에서의 비교에서 유의한 차이는 발견되지 않았다. 또, 안정시 비에 대해서도 동일한 결과이었다.
이상의 결과로부터, 제조예 1에서 제조한 카세인 가수분해물에 의한 반응성 혈류량의 개선 효과는, NO에 응답하는 혈관 중막의 기능 개선에 관련된 것은 아니며, 혈관 내피 기능의 개선을 직접 반영한 것이 확인되었다.
(합성예)
IPP 및 VPP를 이하에 나타내는 유기화학 합성법에 의해 합성했다. 합성은 시마즈 세사쿠쇼제의 펩티드 자동 합성장치(PSSM-8형)를 사용한 고상법에 의해 행했다.
고상 담체로서 2-클로로트리틸(2-Ch1orotrityl)타입의 폴리스티렌 수지이며,아미노기를 플루오레닐메틸옥시카르보닐기(이하 Fmoc로 약기함)로 보호된 프롤린이 결합한 수지 50mg을 사용했다(시마즈 세사쿠쇼사제 등록상표 SynProPep Resin). 상기 아미노산 배열에 따라, 아미노기가 Fmoc기로 보호된 Fmoc-Ile, Fmoc-Pro 및 Fmoc-Val을 100μmol씩, 상법에 따라, 펩티드 배열대로 차례로 반응시켜 펩티드 결합 수지를 얻었다.
다음에 이 펩티드 결합 수지를 1ml의 반응액 A(10용량% 아세트산, 10용량% 트리플루오로에탄올, 80용량% 디클로로메탄)에 현탁하고, 실온에서 30∼60분간 반응시켜서 펩티드를 수지로부터 잘라낸 후, 반응액 A를 유리 필터로 여과했다. 여과액의 용매를 감압제거 후, 즉시 1ml의 반응액 B(82.5%용량 트리플루오로아세트산, 3%용량 에틸메틸술피드, 5%용량 순수, 5%용량 티오아니솔, 2.5%용량 에탄디티올, 2%용량 티오페놀)를 가하고, 실온에서 6시간 반응시켜 측쇄 보호기를 떼어냈다. 이것에 무수 에테르 10ml를 가하여 펩티드를 침전시키고, 3000 회전, 5분간 원심회전하여 분리했다. 그 침전을 무수 에테르로 수차례 세정한 후, 질소 가스를 불어 건조했다. 이렇게 하여 얻어진 미정제의 합성 펩티드 전량을 0.1N 염산 수용액 2ml에 용해한 후에, C18의 역층 컬럼을 사용한 HPLC로, 이하의 조건에 따라 정제했다.
펌프: 형식 L6200 인텔리전트 펌프(히타치 세사쿠쇼), 검출기: 형식 L4000UV 검출기(히타치 세사쿠쇼)로 215ml의 자외부 흡수를 검출 컬럼: 마이크로 본다스피어 5μ C18(워터즈사제), 용출액: A액; 0.1중량% TFA 수용액, B액; 0.1중량% TFA 함유 아세토니트릴(B/A+B)×100(%): 0→40%(60분), 유속: 1ml/분. 최대 흡수를 나타낸 용출 획분을 분취하고, 이것을 동결건조함으로써 목적으로 하는 합성 펩티드 IPP 및 VPP를 각각 5.7mg, 6.5mg 얻었다. 정제 펩티드를 전자동 단백질 1차구조 분석장치(형식 PPSQ-10, 시마즈 세사쿠쇼제)에 의해, 펩티드의 N말단으로부터 분석하고, 또한 아미노산 분석장치(형식 800시리즈, 니혼분꼬사제)로 분석한 결과, 설계대로인 것을 확인할 수 있었다.
(실시예 1-2)
시험동물로서 Wistar계 래트(7주령, 수컷)를 사용하여, 1주간 순화 사육했다. 이어서, 일산화질소 합성 저해제인 NG-니트로-L-아르기닌메틸에스테르 염산염(L-NAME, Sigma사제)을 1g/L, 또 L-NAME 1g/L과 합성한 Val Pro Pro 0.3g/L 또는, L-NAME 1g/L과 합성예에서 합성한 Ile Pro Pro 0.3g/L의 농도가 되도록, 각각 음용수 중에 용해시켜 1주일, 자유섭취시켰다. 대조로서 L-NAME을 용해하지 않은 물만을 섭취시킨 것을 무처치로 했다.
그 후, 래트를 디에틸에테르 마취하에서 방혈 치사시키고, 흉부 대동맥 혈관을 적출하여 2mm폭으로 절단하고, 대동맥 링을 제작했다. 이 링을 5ml의 tyrode액(조성: NaCl 158.3mM, KCl 4.0mM, CaCl2 2.0mM, MaCl2 1.05mM, NaH2PO4 0.42mM, NaHCO3 10.0mM, 글루코오스 5.6mM(pH7.4, 37±0.5℃))로 채운 마그누스 장치(라보서포트사제, 제품명 마이크로티슈 오간 배스 MTOB-1Z)에 부착하고, 2.0g의 정지장력을 걸어 평형화시켰다. 계속해서, 1μM 페닐에프린(Phenylephrine)으로 대동맥 링을 수축시키고, 안정한 수축이 얻어진 표본을 10μM 아세틸콜린으로, 혈관 내피 의존성의 확장 반응을 관찰했다. 혈관 확장 반응에 의한 확장도를 1μM 페닐에프린에 의한 수축에 대한 비율로서 구했다. 결과를 표 4에 나타낸다. 또한, 각 값 모두 1군 8마리의 평균값이다.
비교예 1
Val Pro Pro 또는 Ile Pro Pro 대신, 안지오텐신 I(ACE) 저해약인 에날라프릴을 Val Pro Pro 또는 Ile Pro Pro와 동일한 정도의 저해 활성을 나타내는 0.5mg/L의 농도로서 섭취시킨 이외는, 실시예 1-2와 마찬가지로 혈관확장 반응에 의한 확장도를 측정했다. 결과를 표 4에 나타낸다. 또한, 값은 1군 9마리의 평균값이다.
Figure 112008064376200-PCT00004
표 4의 결과로부터, L-NAME 단독 섭취의 군보다도 Val Pro Pro 또는 Ile Pro Pro를 동시에 섭취한 군이 혈관확장의 비율이 유의하게 증가하고, Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro에 혈관 내피 기능 개선 작용이 있는 것을 알았다. 한편, ACE 저해 활성을 갖는 에날라프릴을 사용한 비교예 1에서는, L-NAME 단독섭취의 군과 비교하여 혈관확장의 유의한 차는 확인되지 않았다. 따라서, ACE 저해 활성을 갖는 물질이면 혈관 내피 기능 개선 작용을 갖는다고는 할 수 없는 것을 알았다.
(실시예 2-1)
(CM4 발효유 사료의 조제)
시판의 탈지분유를 고형율 9%(w/w)가 되도록 증류수로 용해하고, 오토클레이브에서 105℃, 10분간, 고온 가열 살균한 후, 실온까지 냉각하고, CM4주 스타터 발효액(균수 5×108개/mL)을 3%(v/w) 접종하고, 37℃에서 24시간, 정치 상태에서 발효시켜 CM4 발효유를 얻었다.
얻어진 CM4 발효유를 80℃에서 저온살균 후, 동결건조에 의해 분말을 얻었다. 얻어진 동결건조 분말과 시판의 분말사료(상품명 「CE-2」, 닛폰 클레아 가부시키가이샤제)를, 질량비 10:90으로 혼합하여, 고형 사료를 작성하고, CM4 발효유 사료로 했다. 이 사료에는, CM4 발효유 유래의 Val Pro Pro가 34.1mg/kg 및 Ile Pro Pro가 17.1mg/kg 포함되어 있었다.
(혈중 지방질의 개선에 의존하지 않는 혈관 내막의 비후 억제 효과의 확인시험)
아포E 결손 마우스(5주령, 수컷)를 1주간 예비 사육하고, 상기에서 조제한 CM4 발효유 사료 또는, CM4 발효유의 동결건조 분말을 배합하지 않은 시판의 분말사료(상품명 「CE-2」, 닛폰 클레아 가부시키가이샤제)로부터 고형 사료를 조제한 대조 사료를 31주간 자유섭취시켰다(각 군 5마리).
상기 섭취 후의 마우스의 혈액을 심장으로부터 채취하고, 혈액 생화학 검사에 의해, 총 콜레스테롤량, LDL 콜레스테롤량, HDL 콜레스테롤량 및 중성 지방량을 측정했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
또, 마우스의 흉부 대동맥을 채취하고, 헤마톡실린·에오신 염색을 행하고, 혈관의 내막/중막의 면적비를 산출했다. 그 값을 그래프화한 결과를 도 1에 나타낸다.
(비교예 2)
시판의 탈지분유를 고형율 9%(w/w)가 되도록 증류수로 용해하고, 오토클레이브에서 105℃, 10분간, 고온 가열 살균한 후, 실온까지 냉각했다. 실시예 2-1에서 조제한 CM4 발효유와 동등한 산도(2.3%)가 되도록 락트산을 첨가하고, 미발효유를 얻었다.
얻어진 미발효유를 80℃에서 저온살균 후,동결건조에 의해 분말을 얻었다. 얻어진 동결건조 분말과 시판의 분말사료(상품명 「CE-2」, 닛폰 클레아 가부시키가이샤제)를, 질량비 10:90로 혼합하여, 고형 사료를 작성하고, 미발효유 사료로 했다. 이 미발효유 사료에는, Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro는 포함되어 있지 않았다.
얻어진 미발효유 사료를 사용하여, 실시예 2-1과 마찬가지로 마우스에 섭취시킨 후, 실시예 2-1과 동일한 혈액 생화학 검사 및 혈관의 내막/중막의 면적비의 산출을 행했다. 결과를 각각 표 5 및 도 1에 나타낸다.
Figure 112008064376200-PCT00005
표 5의 결과로부터, Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro를 포함하는 CM4 발효유는 대조 사료 및 미발효유 사료에 대하여 고지혈증 개선 작용이 없는 것을 알았다. 한편, 도 1의 결과로부터, Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro를 포함하는 CM4 발효유는 대조 사료 및 미발효유 사료의 어느 것에 대해서도 혈관 내막의 비후를 유의하게 억제하고 있는 것을 알았다. 미발효유에도 CM4 발효유와 동등 이상의 젖 성분이 포함되므로, 본 발명의 효과는 단지 젖 성분만에 의한 효과는 아닌 것을 알았다.
따라서, CM4 발효유의 혈관 내막의 비후 억제 효과는, 고지혈증 개선과는 다른 메커니즘에 의한 것이며, 인간을 포함하는 동물의 고지혈증 이외에 의한 아테로마성 동맥경화에 대해서도 유효한 것을 알았다.
(실시예 2-2)
합성예에 의해 합성한 Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro, 및 실시예 2-1에서 조제한 CM4 발효유, 및 제조예 1에서 조제한 카세인 가수분해물의 분말(제조예 1의 분말이라고 함)을, 각각 시판의 분말사료(상품명 「CE-2」, 닛폰 클레아 가부시키가이샤제)에, 표 6에 나타내는 비율로 혼합하여, 고형 사료를 제작했다. 또, 대조로서 시판의 분말 사료도 준비했다.
(혈관 내막의 비후 억제 효과의 확인 시험)
아포E 결손 마우스(6주령, 수컷, 1군 8마리)에 표 6에 나타내는 사료 1∼7을 각각 31주간 자유섭취시켰다. 이어서, 마우스의 흉부 대동맥을 적출하고 10% 중성 완충 포르말린으로 고정 후, 엘라스티카·반기슨 염색을 실시했다. 조직 표본에 대하여 현미경하에서 촬영한 화상을 컴퓨터로 받아들이고, 화상처리 소프트웨어(Image J)에 의해 혈관의 내막 비후도(내막/중막의 면적비(%))를 산출했다. 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 내막 비후도의 값은 각 군에서의 평균값이다.
Figure 112008064376200-PCT00006
표 6의 결과로부터, Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro는 농도 의존적으로 혈관 내막의 비후를 억제하는 것을 알았다. 또 Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro를 포함하는 CM4 발효유나, Xaa Pro Pro 및 Xaa Pro를 포함하는 제조예 1로 제조한 짐승젖 카세인 가수분해물인 분말도 혈관 내막의 비후를 억제하는 것을 알았다. 따라서, Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro의 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 제제 또는 식품은 혈관 내막의 비후를 억제하여, 아테로마성 동맥 경화증의 예방에 유효한 것을 알았다.
(실시예 3-1∼3-2, 비교예 3 및 4)
CM4주(실시예 3-1), 락토바실루스·헬베티쿠스 JCM 1004(L. helveticus JCM 1004)(실시예3-2), 락토바실루스·가세리 JCM 1131(L. gasseri JCM 1131)(비교예 3) 또는 시판의 동결건조 스타터 CH-1(크리스티안 한센사제, Streptococcus themophilus, Lactobacillus delbruckii sp. bulgaricus를 포함함)을, 표 7에 나타내는 스타터액 첨가율 및 발효시간의 조건을 채용하고, 실시예 2-1에 준하여 발효유를 조제하고, 그 동결건조물을 각각 얻었다.
얻어진 동결건조물을, 시판의 분말사료(상품명 「CE-2」, 닛폰 클레아 가부시키가이샤제)와 각각 중량비로 10:90이 되도록 혼합하여, 고형 사료를 제조했다. 이 사료 중의 Val Pro Pro 및 Ile Pro Pro량을 표 7에 나타낸다.
다음에, 제조한 각 고형 사료를 사용하여, 실시예 2-2와 동일하게 혈관 내막의 비후 억제 효과의 확인시험을 행하고, 내막 비후도(내막/중막의 면적비(%))를 산출했다. 결과를 표 7에 나타낸다. 또한, 내막 비후도의 값은 각 군에서의 평균값이다.
Figure 112008064376200-PCT00007
표 7의 결과로부터, 락토바실루스·헬베티쿠스 발효물은 다른 균종에 의해 조제한 발효물에는 없는, 혈관 내막의 비후 억제 효과를 갖는 것이 밝혀졌다.

Claims (15)

  1. Xaa Pro Pro를 포함하는, 짐승젖 카세인의 가수분해물 또는 그 농축물을 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
  2. 제 1 항에 있어서, Xaa Pro Pro의 함유 비율이 짐승젖 카세인의 가수분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여 1중량% 이상인 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제 1 항에 있어서, Xaa Pro Pro가 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제 3 항에 있어서, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro의 함유 비율이 짐승젖 카세인의 가수분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여 0.3중량% 이상인 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 짐승젖 카세인의 가수분해물이 Xaa Pro를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제 5 항에 있어서, Xaa Pro가 Ile Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gln Pro, Met Pro, Tyr Pro 및 이것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, Xaa Pro의 함유 비율이 짐승젖 카세인의 가수분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대하여 5중량% 이상인 것을 특징으로 하는 제제.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 짐승젖 카세인의 가수분해물이 짐승젖 카세인을 누룩곰팡이에 의해 발효하여 얻은 발효물인 것을 특징으로 하는 제제.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 짐승젖 카세인의 가수분해물이 짐승젖 카세인을 누룩곰팡이 유래의 효소에 의해 효소 분해하여 얻은 분해물인 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제 9 항에 있어서, 누룩곰팡이 유래의 균체외 효소가 아스페르길루스·오리재 유래의 효소인 것을 특징으로 하는 제제.
  11. Xaa Pro Pro를 유효성분으로서 함유하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막 의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
  12. 제 11 항에 있어서, Xaa Pro Pro가 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  13. 락토바실루스·헬베티쿠스종에 속하는 균주에 의해 유단백질을 포함하는 원료를 발효시켜서 얻어진, Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro를 포함하는 발효물을 유효성분으로 포함하고, 혈관 내피 기능 개선 및 혈관 내막의 비후 억제 중 적어도 하나의 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제 13 항에 있어서, 락토바실루스·헬베티쿠스가 락토바실루스·헬베티쿠스 CM4주(독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물 기탁센터 기탁번호: FERM BP-6060)인 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 제제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동맥경화 예방제.
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