TWI418359B - 動脈硬化預防劑，血管內膜增厚抑制劑，血管內皮功能改善劑及功能性食品 - Google Patents

動脈硬化預防劑，血管內膜增厚抑制劑，血管內皮功能改善劑及功能性食品 Download PDF

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Description

動脈硬化預防劑，血管內膜增厚抑制劑，血管內皮功能改善劑及功能性食品
本發明係關於顯示血管內膜增厚抑制作用或血管內皮功能改善作用，可期待抗動脈硬化作用之動脈硬化預防劑、血管內膜增厚抑制劑、血管內皮功能改善劑及顯示如此作用之功能性食品。
心肌梗塞或腦梗塞等之動脈硬化性疾病係顯示與癌症並列之日本國內死因中之最大比率。作為動脈硬化之危險因子，可舉例如高脂血症、高血壓、糖尿病、抽煙、肥胖、高尿酸血症、年紀增長、壓力等，此等互相影響，引起血管障礙。因此，即使各個危險因子的程度為輕度，仍因此等之重複而危險度相加、相乘地增加。
傳統上，發現許多發酵乳、乳酸菌或乳的酵素分解物中之生理功能。例如特開2003－306436號公報及特開2002－65203號公報中記載具有降低膽固醇作用，特開2005－52090號公報及American Journal of Clinical Nutrition 64(1996)p767－771中記載具有降低血壓作用，特開平10－45610號公報中記載具有抗壓力作用，進一步，於WO2005－102542號手冊中記載將獸乳酪蛋白水解成平均鏈長為胺基酸殘基數為2.1以下，得到含有游離胺基酸及胜肽之酪蛋白水解物係具有高血壓蛋白寧(angiotensin)I轉換酵素抑制活性或降低血壓作用。亦即，於此等文獻中，記載減輕對動脈硬化之各個危險因子之發現。
另一方面，認為僅使上述之一種危險因子作用降低，不至於預防動脈硬化發病。例如於食之科學(257(1999)p20－25)或Atherosclerosis(151(2000)p501－508)中，血中膽固醇濃度與動脈硬化發病並無相關，於Circulation 104((2001)p2391－2394)中，即使抑制高血壓狀態，仍未發現動脈硬化程度的變化，另外，於International Journal of Cardiology 81((2001)p107－115)中記載，即使投予高血壓蛋白寧I轉換酵素抑制劑(Enalapril)，仍未發現動脈硬化抑制作用。
因此，於上述WO2005－102542號手冊中所記載之特定酪蛋白水解物中，即使得到減輕對於動脈硬化之各個危險因子之發現，仍不能斷言因此該特定水解物具有抗動脈硬化作用。
然而，動脈主要係由具有外膜與進行血管舒張、收縮之平滑肌層之中膜，以及與血液直接接觸且對於上述中膜之平滑肌層發出指令之內皮細胞層之內膜所構成。近年來逐漸明瞭該內膜中之內皮細胞係掌管關於血液之線溶．凝固、血管之舒張．收縮、炎症之抑制．進展、血管之增殖．衰退等之血管功能之各種指令，認為該內皮功能係與以動脈硬化為首之各種疾病有關者。因此，改善血管內皮功能，可期待預防動脈硬化等。
另外，動脈硬化係動脈壁增厚而變得無彈性之病態，其中粥狀動脈硬化係於動脈之內膜下顯示斑點狀增厚(粥狀)為特徵之減少或阻止血流之症狀之動脈硬化。近年，作為如此症狀之要因，可舉例血管內皮細胞之損傷或功能降低。
因此，可期待抑制血管內膜增厚，緩和、預防粥狀動脈發病之作用。
作為以對人體非破壞條件測定上述血管內皮功能之診斷測定方法，已知例如The American Journal of Cardiology 87((2001)p121－125)所示之體積描記法(Plethysmography)。該體積描記法係暫時地停止動脈血流時，增大內皮細胞產生．釋出血管擴張物質的量，利用暫時地增加血流量，由血管舒張性測定內皮細胞功能之方法，基於內皮細胞功能若受傷害，因為血管舒張物質之釋出量降低，所以血流量亦降低之方法。
 發明之揭示
本發明之課題係提供可改善血管內皮相關機能、可期待預防血管內皮功能相關之各種疾病，例如動脈硬化等之作用，以及顯示緩和、預防血管內膜增厚之作用，可期待預防粥狀動脈硬化等之作用之安全性優異之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用的用劑及動脈硬化預防劑。
本發明之其他課題係提供日常上可連續使用，安全性優異之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用的功能性食品。
依據本發明，提供含有含Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑。
另外，依據本發明，提供含有Xaa Pro Pro作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑。
進一步，依據本發明，含有由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物作為有效成份，具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑。
進一步，依據本發明，提供含有上述任一種用劑作為有效成份之動脈硬化預防劑。
另外，依據本發明，提供含有含Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之功能性食品。
進一步，依據本發明，提供含有Xaa Pro Pro作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之功能性食品。
進一步，依據本發明，提供含有由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物作為有效成份，具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之功能性食品。
另外，依據本發明，提供用以製造具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑或功能性食品之含有含Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物、Xaa Pro Pro、或由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物之使用。
進一步，依據本發明，提供用以製造動脈硬化預防劑之含有含Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物、Xaa Pro Pro、或由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物。
本發明之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑或功能性食品，因為含有特定的酪蛋白之水解物或其濃縮物、Xaa Pro Pro、或含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之特定的發酵物或Xaa Pro Pro作為有效成份，所以安全性優異，尤其功能食品時係可日常中連續使用。因此，有關血管內皮功能之改善慢性高血壓症、或抑制動脈硬化症、血管內膜增厚，尤其抑制因年齡增長、生活習慣等而血管內皮細胞功能降低或損傷而形成粥狀，可期待緩和、預防粥狀動脈硬化發病。
本發明之動脈硬化預防劑，因為含有本發明之上述用劑作為有效成份，所以可期待預防動脈硬化之作用。
用以實施發明之最佳型態
以下係更詳細地說明本發明。
本發明之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用之用劑及功能性食品係含有(a)含Xaa Pro Pro(以下稱為(a)成份)、或(b)含Xaa Pro Pro之獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物(以下稱為(b)成份)、(c)由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物(以下稱為(c)成份)作為有效成份。亦即，(b)及(c)成份係包含(a)成份，以(a)成份，尤其以Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro作為有效成份係有效的，可由後述實施例等而理解。
作為(a)或(b)成份之Xaa Pro Pro係以含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro為宜。(b)成份係以更含有Xaa Pro尤佳。
(b)成份中所含Xaa Pro Pro之含有比率係相對於(b)成份中之胜肽及游離胺基酸之合計量，通常為1重量%以上，以1至5重量%為宜。藉由使該含有比率為1重量%以上，可期待更高的作用。另外，(b)成份中所含之Ile Pro Pro或Val Pro Pro之含有比率係相對於成份中之胜肽及游離胺基酸之合計量，各單獨為0.3重量%以上，或Ile Pro Pro及Val Pro Pro之合計量為0.3重量%以上，可期待高的效果。進一步，分別含有0.3重量%以上之Ile Pro Pro及Val Pro Pro時，可期待更高的效果。
(b)成份中所含之Xaa Pro之含有比率係相對於(b)成份中之胜肽及游離胺基酸之合計量，通常為5重量%以上，以5至25重量%為宜。藉由使該含有比率為5重量%以上，可期待更高的作用。
(c)成份中所含之Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之含有比率係於100g之發酵物之冷凍乾燥物中，換算為10mg以上，以15mg以上為宜時，可期待所需之效果。
(b)成份中之Xaa Pro Pro及Xaa Pro之Xaa可為任意的胺基酸即可。例如作為Xaa Pro Pro，可舉例如Ser Pro Pro、Leu Pro Pro、Ile Pro Pro、Val Pro Pro，作為Xaa Pro，可舉例如Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Pro。作為(b)成份，可舉例如含有上述舉例之Xaa Pro Pro中之至少1種或2種以上為宜，進一步，含有1種或2種以上之上述舉例之Xaa Pro之酪蛋白水解物為宜。
(b)成份或(c)成份係除了胜肽以外，亦可含有游離胺基酸，進一步，除了上述胜肽及游離胺基酸以外，亦可含有例如市售之獸乳酪蛋白、乳蛋白質中通常所含之脂質、灰分、碳水化合物、食物纖維、水分等，另外，因應需要，可除去部份或全部此等中之適當成份。
製造(b)成份時，例如使用可得到上述Xaa Pro Pro，進而Xaa Pro之酵素群，水解獸乳酪蛋白之方法，由麴菌使獸乳酪蛋白發酵之方法而可得之。
獸乳酪蛋白係含有許多Pro之食品等所使用之經確認安全性之蛋白質，可舉例如牛奶、馬奶、山羊奶、羊奶等之酪蛋白，尤其可適合使用牛奶酪蛋白。
使獸乳酪蛋白水解或發酵時之酪蛋白濃度雖無特別的限制，但為有效率地產生(b)分解物，以3至19重量%為宜。
作為上述酵素群，可舉例如以含有可切斷Xaa Pro Xaa或Xaa Pro Pro Xaa之羧基末端之Xaa Pro序列之胜肽分解酵素之酵素群(X)為宜。
酵素群(X)係以含有具有絲胺酸作為活性中心之絲胺酸型蛋白質分解酵素、或具有金屬作為活性中心之金屬蛋白質分解酵素為宜。作為金屬蛋白質分解酵素，可舉例如中性蛋白質分解酵素(protease)I、中性蛋白質分解酵素Ⅱ及白胺酸胺基肽酶(leucine aminopeptidase)等，更含有此等中之至少1種時，可將所需之水解物，效率佳且短時間，進而以1階段反應而可得之觀點上係適宜的。另外，作為上述可切斷Pro Xaa序列之胜肽分解酵素係以顯示等電點為酸性範圍之酵素為宜。
作為上述酵素群或酵素群(X)，可舉例如來自米麴菌(Aspergillus oryzae)等之麴菌之酵素群。如此之酵素群係可舉例如以適當的培養基培養菌體，水抽出所產生之酵素群等，可舉例如來自米麴菌之酵素群中之顯示等電點為酸性範圍之酵素群尤佳。
作為來自米麴菌之酵素群，可使用市售品，可舉例如Smizyme FP、LP或MP(以上之註冊商標，新日本化學(股)製)、Umamizyme(註冊商標，天野酵素素(股)製)、Sternzyme B11024、PROHIDROXY AMPL(以上為商品名，樋口商會股份有限公司製)、orientaseONS(註冊商標，阪急bioindustry(股)製)、Denatyme AP(註冊商標，Nagase生化學社製)，以使用Smizyme FP(註冊商標，新日本化學(股)製)為宜。
使用此等市售之酵素群時，通常設定最適合之條件，但可因應使用的酵素群，可將如上述可得到酪蛋白水解物之條件，例如使用酵素量或反應時間等以進行適當改變。
水解上述獸乳酪蛋白時酵素群之添加量係於溶解獸乳酪蛋白之水溶液中，酵素群/獸乳酪蛋白之重量比成為1/1000以上，以1/1000至1/10為宜，以1/100至1/10尤佳，以1/40至1/10更好之比率的量。
反應條件係因應酵素群，適當地選擇以可得到目的的酪蛋白水解物，溫度通常為25至60℃，以45至55℃為宜，pH為3至10，以5至9為宜，以5至8尤佳。另外，酵素反應時間通常為2至48小時，以7至15小時為宜。
結束酵素反應係可藉由使酵素失活而進行，通常以60至110℃使酵素失活，可使反應停止。
酵素反應停止後，因應需要，將沈澱物藉由離心分離除去或各種過濾器除去為宜。
另外，因應需要，亦可自所得之水解物除去具有苦味或臭味之胜肽。除去如此之苦味成份或臭味成份係可使用活性碳或疏水性樹脂等而進行。例如於所得之水解物中，對於使用之酪蛋白量，添加1至20重量%，使反應1至10小時而可實施。除去所之使用活性碳係可由離心分離或膜處理操作等之已知方法而進行。
含所得(b)成份之反應液係可直接添加於飲料等之液體製品，利用於功能性食品。另外，為提高(b)成份中之酪蛋白水解物之泛用性，以濃縮上述反應液後，製成乾燥之粉末形態為宜。製成粉末時，可賦予血管內膜增厚抑制作用、血管內皮功能改善作用、預防動脈硬化作用中至少一種作用於各種食品等，可形成功能性賦予劑。
對於如此之粉末，為改善營養均衡或風味等，亦可使含有各種補助添加劑。可舉例如各種碳水化合物、脂質、維生素類、礦物質類、甘味料、香料、色素、質地改善劑等。
本發明之具有改善血管內皮功能及/或抑制血管內膜增厚作用之用劑中，以(b)成份作為有效成份時之投予量係對人時，作為(b)成份中之Xaa Pro Pro、或Xaa Pro Pro及Xaa Pro之合計量，通常每天為10 μ g至10g，以1mg至5g為宜，以3mg至1g程度尤佳，亦可1天分成數次攝取。
投予期間係可依該疾病之症狀等調整，通常為1天以上，以7天至365天為宜，以經常性攝取為宜。
製造(c)成份所使用之瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，雖可單獨瑞士乳桿菌，但發酵時，於不損害本發明所需效果之範圍，亦可含有其他的乳酸菌等。
作為屬於瑞士乳桿菌種之菌株，作為可生產高量之具有改善血管內皮功能作用及/或抑制血管內膜增厚作用之Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之產生菌，以使用適合之菌體外蛋白質分解酵素活性高者為宜。例如依據以Twining等之方法(Twining,S.Anal.Biochem.143 3410(1984))為基礎之Yamamoto等之方法(Yamamoto,N.等,J.Biochem.(1993)114,740)所測定U/OD590之值，表示400以上之菌株為宜。
作為適合之瑞士乳桿菌，可舉例如瑞士乳桿菌CM4株(獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心日本國茨城縣筑波市東1－1－1中央第6寄存號碼：FERM BP－6060，寄存日1997.8.15)(以下稱為CM4株)。此CM4株係以上述寄存號碼登記於專利手續上之微生物寄存國際上承認相關之布達佩斯條約，該株已經專利認可。
(c)成份係添加含屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株之發酵乳菌酛於含乳蛋白質之原料，適當地選擇發酵溫度等之發酵條件，藉由使其發酵而可得之。
有效成份之(c)成份係包含將所得之(c)成份之濃縮物等，由冷凍乾燥、噴霧乾燥等而成粉末者。
屬於瑞士乳桿菌種之菌株係以使用作為預先前培養之活性非常高之菌酛為宜。開始菌數係以105 至109 個/ml程度為宜。
(c)成份係例如使用於特定保健用食品等之功能性飲食品時，為使風味良好，使嗜好性良好，亦可併用酵母於上述屬於瑞士乳桿菌種之菌株而使發酵。酵母的菌種雖無特別的限制，但可舉例如適合之釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等之酵母菌(Saccharomyces)屬酵母等。酵母之含有比率係因應該目的而可適當選擇。
作為含乳蛋白質之原料，可舉例如牛奶、馬奶、羊奶、山羊奶等之動物奶、及豆漿等之植物奶，此等加工乳之脫脂奶、還原奶、奶粉、煉乳，以牛奶、豆漿、此等之加工乳為宜，以牛奶或其加工乳尤佳。
乳之固形物濃度並無特別的限制，例如使用脫脂奶時之無脂乳固形物濃度，通常為3至15重量%程度，生產性上以6至15重量%為宜。
上述發酵通常係藉由靜置或攪拌發酵，例如發酵溫度為25至45℃，以30至45℃為宜，發酵時間為3至72小時，以12至36小時為宜，乳酸酸度成為1.5%以上時使發酵停止之方法而進行。
本發明之具有改善血管內皮功能作用及/或抑制血管內膜增厚作用之用劑中，以(c)成份作為有效成份時之投予量係對人時，作為(c)成份之乾燥量，通常每天為1至100g，以2至50g之程度為宜，亦可1天分成數次攝取。另外，作為(c)成份中之Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro的量，通常為10 μ g至10g，以1mg至5g為宜，以3mg至1g程度尤佳，亦可1天分成數次攝取。
投予期間係可依該疾病之症狀等調整，通常為1天以上，以7天至365天為宜，以經常性攝取為宜。
本發明之動脈硬化預防劑係包含上述具有改善血管內皮功能作用及/或抑制血管內膜增厚作用之用劑。尤其具有抑制血管內膜增厚作用時，可有效地作為粥狀動脈硬化預防劑。
本發明之動脈硬化劑之投予量係對人時，上述(a)至(c)成份中之Xaa Pro Pro、或Xaa Pro Pro及Xaa Pro之合計量，或Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro的量，通常每天為10 μ g至10g，以1mg至5g為宜，以3mg至1g程度尤佳，亦可1天分成數次攝取。
動脈硬化預防劑之投予期間係可考量攝取人或動物之年齡或該人或動物對動脈硬化危險因子之環境等，而進行各種調整，通常為1天以上，以7天至365天為宜，以經常性攝取為宜。
本發明之具有改善血管內皮功能作用及/或抑制血管內膜增厚作用之用劑，以及動脈硬化預防劑之投予方法，通常為經口投予。
本發明用劑之形態係可為經口投予用之製劑形態。可舉例如錠劑、丸劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微膠囊、散劑、顆粒劑、液劑等。
製劑化係例如因應適當的需要，使用作為藥劑所容許之載體、助劑、賦形劑、補形劑、防腐劑、安定化劑、結合劑、pH調節劑、緩衝劑、增黏劑、凝膠化劑、保存劑、抗氧化劑等，可以一般所認可之製劑實施上所要求之單位用量形態製造。
本發明之功能性食品係含有作為本發明之具有改善血管內皮功能作用及/或抑制血管內膜增厚作用之用劑之有效成份之上述(b)或(c)成份，可製成具有改善血管內皮功能及/或抑制血管內膜增厚作用之特定保健用食品等之健康食品。
為得到如此效能之攝取量係可連續使用功能性食品，若有鑑於連續地或間斷地長期間攝取時，對人時，作為上述(b)成份中之Xaa Pro Pro、或Xaa Pro Pro及Xaa Pro之合計量，以及作為上述(c)成份中之Val Pro Pro及/或Ile Pro Pro的量，通常每天為10 μ g至10g，以1mg至5g為宜，以3mg至1g程度尤佳，亦可因應每天之攝取次數，使功能性食品中每次的攝取量比上述量更低。
本發明之功能性食品之攝取期間並無特別的限制，雖以長期間攝取為宜，但為得到上述效能，通常1天以上，尤其以7天至365天程度，常用之攝取為宜。
本發明之功能性食品係除了上述有效成份之(b)或(c)成份之外，因應需要，亦可添加瑞士乳桿菌以外之乳酸菌之發酵物、或飲食品使用之其他成份，例如糖類、蛋白質、脂質、維生素、礦物質、香料、或此等之混合物等之添加物。
本發明之功能性飲食品之形態係將上述(b)或(c)成份，以直接、或成粉末或顆粒，添加於各種飲食品，可製成固形物、凝膠狀物、液狀物之任一種形態，可舉例如乳酸菌飲料等之發酵乳製品、各種加工飲食品、乾燥粉末、錠劑、膠囊劑、顆粒劑等，進一步可製成各種飲料、優酪乳、流動食品、果凍、糖果、殺菌軟袋食品、錠果、軟式餅乾(cookie)、長崎蛋糕、麵包、甜餅乾(biscuit)、巧克力等。
 實施例
以下係由實施例、分析例及比較例更詳細地說明本發明，但本發明並不侷限於此等範圍。
製造例1
加入1g之來自牛奶之酪蛋白(日本ZNMP社製)於99g之調整成約80℃之蒸餾水，充分攪拌後，添加1N之氫氧化鈉(和光純藥社製)溶液成pH7.0，並且將溫度調整成20℃，調製基質溶液。
於所得之基質溶液中，添加來自米麴菌之至少含有金屬蛋白質分解酵素、絲胺酸蛋白質分解酵素、中性蛋白質分解酵素I、中性蛋白質分解酵素Ⅱ及白胺酸胺基肽酶之市售酵素(註冊商標「Smizyme FP」，新日本化學工業社製)，使酵素/酪蛋白之重量比成為1/25，以50℃反應14小時。接著，以110℃，10分鐘進行高壓釜殺菌，使酵素失活，得到酪蛋白酵素分解物溶液。接著，將所得之酪蛋白酵素分解物溶液，以噴霧乾燥器乾燥，調製粉末。
對所得之粉末中之含有成份進行分析。以基耶達測氮法測定蛋白質，胺基酸係以胺基酸分析裝置測定。另外，自該蛋白質量減去胺基酸的量作為胜肽量。進而，脂質係以酸分解法，灰分係以直接灰化法，水分係以常壓加熱軟燥法，分別測定。另外，自100%減去各成份之殘餘量作為碳水化合物量。該結果係胺基酸為35.8重量%、胜肽為45.7重量%、水分為6.6重量%、脂質為0.2重量%、灰分為4.1重量%及碳水化合物為7.6重量%。
<測定構成胜肽之胺基酸>溶解上述調製的粉末於適量的蒸餾水，使用自動胜肽分析機(商品名PPSQ－10(股)島津製作所製)分析，調查粉末中由N端依序排列何種胺基酸。另外，自動胜肽分析機未檢測出游離胺基酸。
另外，第5殘基胺基酸之合計為120pmol，第6殘基胺基酸之合計為100pmol。由此等結果，判定上述粉末中所含之胜肽幾乎完全為二胜肽及三胜肽。另外，第2殘基胺基酸為Pro之胜肽之比率為49.5%，明顯上昇。進一步，第3殘基胺基酸為Pro之胜肽之比率亦為29.8%之多。
因此，上述粉末中，含有許多Xaa Pro或Xaa Pro Pro，推測此等胜肽係對於生體內蛋白質分解酵素之酵素分解作用之抵抗性高之胜肽。
<測定酵素分解物中所含胜肽>對於上述酵素分解物的粉末，使用各種化學合成標準胜肽，依據常法，求出該粉末所含之如表1所示之二胜肽及三胜肽的量。結果如表1所示。
另外，以蒸餾水稀釋溶解上述粉末之溶液中之胜肽及游離胺基酸量為8.15mg/ml，胜肽量為4.57mg/ml，該胜肽中之Xaa Pro量為514.5 μ g，所以確認Xaa Pro Pro對粉末中之胜肽及游離胺基酸之合計量之比率為6.3重量%，進一步，因為該胜肽中之Xaa Pro Pro為116.5 μ g，所以確認Xaa Pro Pro對粉末中之胜肽及游離胺基酸之合計量之比率為1.4重量%。
實施例1－1
為檢討血管內皮功能改善效果，以40歲以上65歲以下之成人男性中，顯示收縮壓為140至159mmHg或舒張壓為90至99mmHg之各24人之2組為對象，將充填1.25g之製造例1調製之酪蛋白水解物粉末於膠囊之試驗食或充填1.25g之酪蛋白鈉粉末於膠囊之安慰劑(placebo)，於早餐時或早餐後30分鐘以內，1天1次，攝取7天，實施兩組間之雙重盲檢(Double Blind Test)交叉(交叉式)試驗。
試驗係使用體積描記法(Plethysmograph EC6,Primetech Co.製)，於攝取試驗食及安慰劑之前，以及攝取7天後，測定安靜時及止血解放後之前腕動脈血流量而進行。結果係各組平均，如表2所示。
表2中之檢查值係以各24人之平均值±標準偏差表示，FBF係表示前腕血流量(Forearm Blood Flow)。
試驗食組之最大血流量及(B)/(A)×100與安慰劑組之比較，p<0.001之有意義。試驗食組之最大血流量及(B)/(A)×100與攝取前之比較，p<0.001之有意義。
由表2中，安靜時之前腕動脈血流量係於攝取前後，比較試驗食組及安慰劑組，認為無有意差。
另一方面，止血解放後之最大流入量，攝取前於兩組間，雖認為無有意差，但攝取後與攝取前比較，與安慰劑組比較，認為試驗食組皆顯示有意義的高值(任一種之t檢定，p<0.001)。
另外，對於反應性充血後之最大血流量之安靜時比，雖認為攝取前兩組間無有意差，但攝取後與攝取前比較，與安慰劑組比較，試驗食組皆顯示有意義的高值(任一種之t檢定，p<0.001)。另外，認為試驗期間之血壓無有意義的改善。
由上述結果，製造例1製造之酪蛋白分解物係藉由攝取，於使用體積描記法之生理上血管內皮功能評估中，顯示明顯的改善作用，確認有效地作為血管內皮功能改善劑。另外，亦可確認此改善作用並不附於血壓降低作用。
對於上述各組試驗者，噴霧投予0.3mg之硝酸甘油於口腔內，後續10分鐘，觀察對血管內皮非依賴性之外因性NO之血管舒張反應，其中最大血流量作為測定值。結果如表3所示。
表3中之檢查值係以各24人之平均值±標準偏差表示，FBF係表示前腕血流量(Forearm Blood Flow)。
由表3認為兩組均於攝取前後之比較，及兩組間之比較無有意義。並且，對於安靜時比較亦為相同的結果。
由上述結果，確認由製造例1製造之酪蛋白分解物之反應性血流量之改善效果係與於回應NO之血管中膜之功能改善並無關聯，直接反映改善血管內皮功能者。
合成例
由如下所示之有機化學合成法合成IPP及VPP。合成係由使用島津製作所製之胜肽自動合成裝置(PSSM－8型)之固相法而進行。
作為固相載體係2－氯三苯基(2－Chlorotrityl)型之聚苯乙烯樹脂，使用50mg之鍵結胺基為芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl，以下簡稱為Fmoc)保護之脯胺酸之樹脂(島津製作所社製，註冊商標SynProPep Resin)。依據上述胺基酸序列，各100 μ g之胺基為Fmoc保護之Fmoc－Ile、Fmoc－Pro、Fmoc－Val，依據常法，使如胜肽序列依序反應而得胜肽鍵結樹脂。
接著，將此胜肽鍵結樹脂懸浮於1ml之反應液A(10容量%之醋酸、10容量%之三氟乙醇、80容量%之二氯甲烷)，於室溫下使進行反應30至60分鐘，自樹脂切離胜肽後，以玻璃過濾器過濾反應液A。減壓除去濾液的溶劑，立即加入1ml之反應液B(82.5%容量之三氟乙酸、3%容量之乙基甲基硫、5%容量之純水、5%容量之茴香硫醚、2.5%容量之乙二硫醇、2%容量之苯硫酚)，於室溫下使進行反應6小時，脫去支鏈保護基。加入10ml之無水醚於其中，使胜肽沈澱，以3000回轉，雛心5分鐘而分離。以無水醚數次洗淨該沈澱後，吹入氮氣乾燥。溶解如此所得之未精製之合成胜肽總量於2ml之0.1N鹽酸水溶液後，以使用C18之逆相管柱之HPLC，依據下述條件精製。
唧筒：L6200型Intelligent Pump(日立製作所)、偵測器：L4000型UV偵測器(日立製作所)，檢測於215nm之紫外線吸收、管柱：Bondasphere5 μ C18(Waters社製)、沖提液：A液；0.1重量%TFA(三氟醋酸)水溶液、B液；加入0.1重量%TFA之乙腈(B/A＋B)×100(%)：0→40%(60分鐘)、流速：1ml/分。分取顯示最大吸收之溶出部份，將其冷凍乾燥而得到分別為5.7mg、6.5mg之合成胜肽IPP及VPP。由全自動蛋白質一次構造分析裝置(形式PPSQ－10，島津製作所製)，自胜肽之N端分析精製胜肽，進一步以胺基酸分析裝置(800型系列，日本分光社製)分析的結果，可確認如設計所示。
實施例1－2
作為試驗動物係使用Wistar系(7週齡，公)，馴化飼育一週。接著，分別溶解於飲水中，使濃度成為1g/L之一氧化氮合成抑制劑之NG－硝基－左旋精胺酸甲酯鹽酸鹽(L－NAME，Sigma社製)、及1g/L之L－NAME與0.3g/L之合成Val Pro Pro、或1g/L之L－NAME與0.3g/L之合成例合成之Ile Pro Pro，使自由攝取一週。對照組係使僅攝取未溶解L－NAME的水者，作為無處置。
之後，使大鼠於乙醚麻醉下放血致死，摘出胸部大動脈血管，切成2mm寬，製作大動脈環。將該環安裝於充滿5ml之tyroid液(組成：158.3mM之NaCl、4.0mM之KCl、2.0mM之CaCl2 、1.05mM之MgCl2 、0.42mM之NaH2 PO4 、10.0mM之NaHCO3 、5.6mM之葡萄糖(pH7.4，37±0.5℃))之Magnus(結索)裝置(Labosupport社製，製品名Micro tissue organ bath MTOB－1Z)，施以2.0g之靜止張力而使平衡化。接著，以1 μM之去氧腎上腺素(Phenylephrine)，使大動脈環收縮，將得到安定收縮之標本，以10 μM之乙醯膽鹼，觀察血管內皮依賴性舒張反應。由血管舒張反應之舒張度，求出相對於1 μM之去氧腎上腺素所引起收縮之比率。結果如表4所示。另外，各值均為1組8隻之平均值。
比較例1
取代Val Pro Pro、或Ile Pro Pro，使血管收縮素轉換酵素(ACE)抑制劑之Enalapril之濃度成為與Val Pro Pro或Ile Pro Pro顯示相同程度之抑制活性之0.5mg/L，使其攝取以外，與實施例1－2同樣地由血管舒張反應測定舒張度。結果如表4所示。另外，各值均為1組9隻之平均值。
由表4之結果可知，同時攝取Val Pro Pro或Ile Pro Pro組比單獨攝取L－NAME組之血管舒張比率為有意義增加，Val Pro Pro及Ile Pro Pro具有血管內皮功能改善作用。另一方面，使用具有ACE抑制活性之Enalapril之比較例1中，與單獨攝取L－NAME組相比較，認為無血管舒張的有意差。因此，可知具有ACE抑制活性之物質，稱不上具有血管內皮功能改善作用。
實施例2－1
(調製CM4發酵乳飼料)以蒸餾水溶解市售之脫脂奶粉，使固形率成為9%(w/w)，以高壓釜105℃，10分鐘高溫加熱殺菌後，冷卻至室溫，接種3%(v/w)之CM4株菌酛發酵液(菌數為5×108 個/ml)，於37℃，24小時靜置狀態發酵，而得CM4發酵乳。
將所得之CM4發酵乳，以80℃殺菌後，由冷凍乾燥而得粉末。將所得之冷凍乾燥粉末與市售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本Clea股份有限公司製)，以質量比10：90混合，作成固型飼料，作為CM4發酵乳飼料。於此飼料中，含有來自CM4發酵乳之34.1mg/kg之Val Pro Pro及17.1mg/kg之Ile Pro Pro。
(不依賴改善血中脂質之血管內膜增厚抑制效果之確認試驗)預備飼育1週之載體蛋白E(Apolipoprotein E,簡稱Apo E)欠缺之小鼠，上述調製之CM4發酵乳飼料、或自未配合CM4發酵乳之冷凍乾燥粉末之市售粉末飼料(商品名「CE－2」，日本Clea股份有限公司製)調製固型飼料之對照飼料，自由攝取31週(各組5隻)。
由上述攝取後小鼠之心臟採取血液，由血液生化學檢查，測定總膽固醇量、LDL膽固醇量、HDL膽固醇量及中性脂肪量。結果如表5所示。
另外，採取小鼠胸部大動脈，進行蘇木紫－伊紅染色(Hematoxylin－Eosin stain)，算出血管內膜/外膜之面積比。將該值圖形狀之結果如圖1所示。
比較例2
以蒸餾水溶解市售之脫脂奶粉，使固形率成為9%(w/w)，以高壓釜105℃，10分鐘高溫加熱殺菌後，冷卻至室溫，添加乳酸以使與實施例2－1調製之CM4發酵乳相同酸度(2.3%)，而得未發酵乳。
將所得之未發酵乳，以80℃殺菌後，由冷凍乾燥而得粉末。將所得之冷凍乾燥粉末與市售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本Clea股份有限公司)，以質量比10：90混合，作成固型飼料，作為未發酵乳飼料。於此未發酵乳飼料中，未含有Xaa Pro Pro及Xaa Pro。
使用所得之未發酵乳飼料，與實施例2－1同樣地使小鼠攝取後，與實施例2－1同樣地進行血液生化學檢查及算出血管內膜/外膜之面積比。結果分別如表5及圖1所示。
由表5的結果可知含Val Pro Pro及Ile Pro Pro之CM4發酵乳相對於對照飼料及未發酵乳飼料，不具高脂血症改善作用。另一方面，由圖1的結果可知含Val Pro Pro及Ile Pro Pro之CM4發酵乳相對於對照飼料及未發酵乳飼料中任一種，有意義地抑制血管內膜增厚。由未發酵乳飼料亦含有與CM4發酵乳相同以上之乳成份，可知本發明之功效係不僅來自乳成份之功效。
因此，可知CM4發酵乳之血管內膜增厚抑制效果係依據與改善高脂血症不同的機制，對於包含人類之動物之因高脂血症以外所引起之粥狀動脈硬化亦有效。
實施例2－2
將由合成例所合成之Val Pro Pro及Ile Pro Pro，以及實施例2－1所調製之CM4發酵乳、及製造例1調製之酪蛋白水解物之粉末，分別於市售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本Clea股份有限公司製)，如表6所示之比率混合，製作固型飼料。另外，亦準備市售之粉末飼料作為對照。
(血管內膜增厚抑制作用之確認試驗)分別使載體蛋白E欠缺之小鼠(6週齡，公，1組8隻)自由攝取31週之如表6所示之飼料1至7。接著，摘出小鼠之胸部大動脈，以10%之中性緩衝甲醛固定後，實施Elastica van Gieson stain染色。讀取顯微鏡下拍攝組織標本之影像於電腦，由影像處理軟體(Image J)算出血管內膜增厚度(內膜/中膜之面積比(%))。結果如表6所示。另外，內膜增厚度的值係各組之平均值。
由表6之結果可知Val Pro Pro及Ile Pro Pro係依濃度而抑制血管內膜增厚。另外，可知含Val Pro Pro及Ile Pro Pro之CM4發酵乳、或含Xaa Pro Pro及Xaa Pro之製造例1製造之獸乳酪蛋白水解物之粉末亦抑制血管內膜之增厚。因此，含至少1種Val Pro Pro及Ile Pro Pro之胜肽之用劑或食品係抑制血管內膜增厚，有效地預防粥狀動脈硬化症。
實施例3－1至3－2、比較例3及4
將CM4株(實施例3－1)、瑞士乳桿菌JCM1004(L.helveticus JCM1004)(實施例3－2)、加氏乳酸桿菌JCM1131(L.gasseri JCM1131)(比較例3)或市售之冷凍乾燥菌酛CH－1(Chr－Hansen社製，含嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii sp.bulgaricus))，採用表7示之菌酛液添加率及發酵時間之條件，依據實施例2－1，調製發酵乳，分別得到該冷凍乾燥物。
將所得之冷凍乾燥粉末與市售之粉末飼料(商品名「CE－2」，日本Clea股份有限公司)，分別以質量比10：90混合，製造固型飼料。此飼料中之Val Pro Pro及Ile Pro Pro量如表7所示。
接著，使用製造各固型飼料，與實施例2－2同樣地進行血管內膜增厚抑制效果之確認試驗，算出內膜增厚度(內膜/中膜之面積比(%))。結果如表7所示。另外，內膜增厚度的值係各組之平均值。
由表7之結果顯示瑞士乳桿菌發酵物係具有由其他菌種調製之發酵物所沒有的血管內膜增厚抑制效果。
圖1係表示實施例2－1及比較例2所進行之血管內膜增厚抑制效果之確認試驗之結果圖。

Claims (13)

  1. 一種用劑，其特徵為，必須含有作為Xaa Pro Pro之Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro，且含有作為有效成份的獸乳酪蛋白之水解物或其濃縮物，具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用。
  2. 如申請專利範圍第1項之用劑，其中Xaa Pro Pro之含有比率係相對於獸乳酪蛋白之水解物中之胜肽及游離胺基酸之合計量為1重量%以上。
  3. 如申請專利範圍第2項之用劑，其中Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之含有比率係相對於獸乳酪蛋白之水解物中之胜肽及游離胺基酸之合計量為0.3重量%以上。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之用劑，其中獸乳酪蛋白之水解物係必須含有作為Xaa Pro之選自Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro、Tyr Pro及此等之混合物所成群的至少一種。
  5. 如申請專利範圍第4項之用劑，其中Xaa Pro之含有比率係相對於獸乳酪蛋白之水解物中之胜肽及游離胺基酸之合計量為5重量%以上。
  6. 如申請專利範圍第1項之用劑，其中獸乳酪蛋白之水解物係將獸乳酪蛋白以米麴菌發酵而得之發酵物。
  7. 如申請專利範圍第1項之用劑，其中獸乳酪蛋白之水解物係將獸乳酪蛋白以來自米麴菌之酵素進行酵素分 解而得之分解物。
  8. 一種用劑，其特徵為，含有以Xaa Pro Pro及/或Val Pro Pro作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用。
  9. 一種用劑，其特徵為，含有由屬於瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)種之菌株，使含乳蛋白質之原料發酵所得之含Ile Pro Pro及/或Val Pro Pro之發酵物作為有效成份，具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用。
  10. 如申請專利範圍第9項之用劑，其中瑞士乳桿菌係瑞士乳桿菌CM4株(寄存號碼：CCRC 910111)。
  11. 一種動脈硬化預防劑，其特徵為，含有如申請專利範圍第1項、第8項及第9項中任一項之用劑作為有效成份。
  12. 一種功能性食品，其特徵為，含有如申請專利範圍第1項、第8項及第9項中任一項之用劑作為有效成份之具有改善血管內皮功能及抑制血管內膜增厚中至少一種作用。
  13. 一種功能性食品，其特徵為，含有如申請專利範圍第11項之用劑作為有效成份，具有動脈硬化預防作用。
TW096105562A 2006-02-14 2007-02-14 動脈硬化預防劑，血管內膜增厚抑制劑，血管內皮功能改善劑及功能性食品 TWI418359B (zh)

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