JP6159140B2 - アンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、天然由来成分を含むアンジオテンシン変換酵素阻害剤、及び血圧降下剤に関する。

高血圧症は代表的な生活習慣病であり、その患者数は年々増加している。高血圧症は脳出血、クモ膜下出血、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症、腎硬化症等の様々な合併症を引き起こすことが知られている。

ここで、血圧調節においては、昇圧に関与するレニン・アンジオテンシン系と降圧に関与するカリクレイン・キニン系が重要な役割を果たしている。昇圧に関するレニン・アンジオテンシン系では、肝臓から分泌されるアンジオテンシノーゲンが腎臓で生成されるレニンによって、アンギオテンシンＩになり、さらにアンジオテンシンＩ変換酵素（一般に、「アンジオテンシン変換酵素」と称されており、本明細書では、以下、「ＡＣＥ」と略称することがある）により、アンジオテンシＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは、血管平滑筋を収縮させ、血圧を上昇させる。一方、降圧に関するカリクレイン・キニン系では、カリクレインがキニノーゲンに作用して生成されるブラジキニンが、血管を拡張させて、血圧を降下させる。ＡＣＥは、このブラジキニンを分解する活性も有する。このようにＡＣＥは昇圧ペプチドであるアンジオテンシンＩＩの産生と降圧ペプチドであるブラジキニンの不活性化という二つの作用によって血圧を上昇させることが知られている。
従って、このＡＣＥの酵素活性を抑性ないしは阻害することによって、血圧上昇を抑制し、さらに血圧を降下させることが可能となる。ＡＣＥの阻害活性を有する物質の探索が行われており、例えば、プロリン誘導体であるカプトプリルやエナラプリル等は高血圧症の治療に広く用いられている。しかし、近年の消費者嗜好の変化から、天然由来の有効成分を含む医薬や機能性食品が求められるようになっている。

天然由来のＡＣＥ阻害物質については、食品由来タンパク質にプロテアーゼを添加し、分解物中から該酵素の阻害活性の強いペプチドを分離、精製できることが知られている。
例えば、イワシ筋肉のペプシン分解物（特開平３−１１０９７号）、鰹節のサーモライシン分解物（特開平４−１４４６９６号）、ゴマ、米、又はオート麦のサーモライシン分解物（特許第４３６９９８６号）、ローヤルゼリーのトリプシン分解物（特開２００５−２５５６７０号）等が報告されている。
しかし、プロテアーゼを使用する従来の製法では、食用タンパク質の抽出にアルカリを用い、また、中和のために塩酸を用いることが多く、作業が煩雑であり、また、アルカリ、及び酸を使用するため作業に注意が必要である。また、タンパク質を分解させるために高価な酵素を使用するため、大量製造や商品化の上で障害となることも多い。

ここで、霊芝（マンネンタケ）は、マンネンタケ科（Ganodermataceae）、マンネンタケ属（Ganoderma）に属するキノコであり、赤霊芝、黒霊芝、鹿角霊芝などが知られている。
赤霊芝と黒霊芝とは、形状が類似するが、黒霊芝は赤霊芝に特有の苦味トリテルペン成分（ガノデリン酸類）を含まないため、両者の味は全く異なることが報告されている（特開２００３−１０４９０４号）。また、外観色も全く違うため、両者は全くの別種と考えられている。実際、黒霊芝の学名はGanoderma atrum、Ganoderma japonicum、Ganoderma sinenseと記載されている（特開２０１０−２０８９６５号）。
鹿角霊芝は霊芝の一種であり、子実体の形状が笠をもたず、鹿の角のように枝分かれしたものをいい、マクロファージ貧食能向上作用、ガン細胞増殖抑制作用などの免疫賦活活性を有することが知られている（特開２００７−９９６６６）。

霊芝に血圧降下作用があることは種々報告されている。
例えば、特許文献１は、霊芝の熱水抽出物をアセトンで抽出したエキスに高血圧抑制作用があることを教えている。
また、非特許文献１は、霊芝熱水抽出物を高血圧自然発症ラットに投与することにより血圧が降下したことを教えている。
また、非特許文献２は、霊芝粉砕物を、高血圧自然発症ラットに投与することにより血圧が降下したことを教えている。
また、非特許文献３は、霊芝中のガノデリン酸類（トリテルペン類）にＡＣＥ阻害活性があることを教えている。
また、特許文献２は、黒霊芝抽出物と赤霊芝抽出物とを重量比１：１で混合した物は、ＡＣＥ阻害活性、及びin vivoで高血圧抑性作用を有することを教えている。
また、特許文献３は、霊芝を栄養を添加したおがくずで培養した物の抽出物に血圧降下作用があること、及び活性本体は霊芝中の酵素により自己消化してできた物質であることを教えている。

この他にも、霊芝の多様な生理活性が報告されている。例えば、腎障害改善作用（特許第３２７８２０９号）、創傷治癒作用（特開平５−２７９６２５号）、抗菌作用（特開平１１−０６０４０４２３号）、プロテアーゼ阻害作用（特開２００３−３３５６４８号）、5α-リダクターゼ阻害作用（特許第３５３０８８０号）、Ｔ細胞賦活化作用（特開２００７−２６１９６８号）、アディポネクチンの発現上昇作用（Shimojo Y. Kosaka K, Shirasawa T, Effect of Ganoderma lucidum extract on adipocyte differentiation and adiponectin gene expression in the murine pre-adipocyte cell line 3T3-L1, Phytother.Res. 2011 25(2),202-207）などが報告されている。

特開昭６１−２６７５２７号 特許第４９４９５７９号 特許第４７８３５７６号

基礎と臨床 Vol.13 No.12,175−180(1979) J.Nutr.Sci.Vitaminol., 34,433−438,1988 Chem.Pharm.Bull .34(7).3025−3028,(1986)

本発明は、天然物由来の成分を有効成分とする、新たなＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 赤霊芝の１種であるガノデルマ リンジー（Ganoderma lingzhi）のＢＭＣ−９０４９株の子実体、及びその抽出物は、特に優れたＡＣＥ阻害活性、及び血圧降下作用を有する。
(ii) ガノデルマ リンジーの子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水で抽出した抽出物は、特に優れたＡＣＥ阻害活性、及び血圧降下作用を有する。

本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤を提供する。
項１． ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物を有効成分として含むＡＣＥ阻害剤。
項２． 有効成分がガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体の抽出物であり、この抽出物が、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水による抽出物である項１に記載のＡＣＥ阻害剤。
項３． ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物を有効成分として含む血圧降下剤。
項４． 有効成分がガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体の抽出物であり、この抽出物が、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水による抽出物である項３に記載の血圧降下剤。
項５． ガノデルマ リンジーの子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水で抽出した抽出物を有効成分として含むＡＣＥ阻害剤。
項６． ガノデルマ リンジーが、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株である項５に記載のＡＣＥ阻害剤。
項７． ガノデルマ リンジーの子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水で抽出した抽出物を有効成分として含む血圧降下剤。
項８． ガノデルマ リンジーが、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株である項７に記載の血圧降下剤。
項９． ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物のＡＣＥ阻害剤の製造のための使用。
項１０． ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物の血圧降下剤の製造のための使用。
項１１． ガノデルマ リンジーの子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水で抽出した抽出物のＡＣＥ阻害剤の製造のための使用。
項１２． ガノデルマ リンジーの子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水で抽出した抽出物の血圧降下剤の製造のための使用。

本発明の剤は、優れたＡＣＥ阻害活性を有し、血圧降下剤として実用できる。また、安全性が確立された霊芝に由来する成分を有効成分とするため安全なものである。さらに、本発明の剤は、極めて簡単に製造できる。従って、非常に有用なものである。

ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の抽出物を高血圧ラットに投与した後の収縮期血圧の推移を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
（１）第１のＡＣＥ阻害剤・血圧降下剤の有効成分
本発明の第１のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物を有効成分として含む。
また、本発明は、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物をＡＣＥ阻害剤、又は血圧降下剤の製造のために使用することを包含する。

ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株
現在も、霊芝の分類、及び同定は進みつつあり、２０１２年、Cao et al. (Cao Y, Wu, S-H. and Dai, Y-C, Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom ‘’Lingzhi’’ , Fungal diversity 56,49-62,2012)によって、従来、東アジアに分布しているGanoderma lucidum(Lingzhi)がユーラシア大陸（ヨーロッパなど）に分布しているGanoderma lucidumとは形態および分子系統学的に異なる種として、分類学的に新種Ganoderma lingzhi として報告された。
ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株は、ＩＴＳ−５．８Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析、及び国際塩基配列データベース(GeneBank/DDBJ/EMBL)に対する相同性検索の結果と、子実体の形態観察の結果からガノデルマ リンジー（Ganoderma lingzhi）と同定された。
ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株は、種々の用途に広く使用されており、例えば、有限会社微創研から購入できる。

子実体・抽出物
子実体の形態は特に限定されず、生の子実体、その乾燥物、又はこれらを粉砕した物等を使用できる。また、これらの形態の子実体を水、又はアセトン、エタノールなどの医薬や食品の製造に許容される有機溶媒（以上を総称して「抽出溶媒」ということもある）で抽出した物も、有効成分として使用できる。抽出溶媒は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。さらに、抽出物の乾燥物も、有効成分として、使用できる。
子実体の抽出物は温水抽出物であることが好ましい。温水の温度は、例えば、約１０〜５９℃とすることができ、約２０〜５９℃が好ましく、約２５〜５０℃がより好ましく、約３０〜４０℃がさらにより好ましい。また、抽出時間は、４時間以上が好ましく、１６時間以上がより好ましい。抽出時間は、約２４時間程度までとすればよい。
また、抽出溶媒が水を含む場合の抽出溶媒のｐＨは、約２．５〜６とすることができ、約３〜６が好ましく、約３〜５がより好ましく、約３〜４．５がさらにより好ましい。
ｐＨの調整は、乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムのような有機酸；リン酸、塩酸、硫酸のような無機酸；トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンのような有機塩基；水酸化カリウム、水酸化ナトリウムのような無機塩基などのｐＨ調整剤を用いて行えばよい。ｐＨ調整剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、抽出溶媒には、本発明の効果を損なわない範囲で、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤のような緩衝剤などの抽出助剤の１種、又は２種以上を添加できる。
抽出物は、そのまま使用してもよく、乾燥して得られる乾固物を使用してもよい。乾燥は、自然乾燥、凍結乾燥、約２０〜７０℃での乾燥等が挙げられる。

（２）第２のＡＣＥ阻害剤・血圧降下剤の有効成分
本発明の第２のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は、ガノデルマ リンジーの子実体を、温度が約２０〜５９℃、ｐＨが約３〜６の温水で抽出した抽出物を有効成分として含む。
また、本発明は、ガノデルマ リンジーの子実体を、温度が約２０〜５９℃、ｐＨが約３〜６の温水で抽出した抽出物を、ＡＣＥ阻害剤、又は血圧降下剤の製造のために使用することを包含する。
ｐＨの調整は、乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムのような有機酸；リン酸、塩酸、硫酸のような無機酸；トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンのような有機塩基；水酸化カリウム、水酸化ナトリウムのような無機塩基などのｐＨ調整剤を用いて行えばよい。ｐＨ調整剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、抽出溶媒である上記温度の温水には、本発明の効果を損なわない範囲で、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などの緩衝剤、アセトン、エタノールなどの医薬や食品の製造に許容される有機溶媒などの抽出助剤が含まれていてもよい。
抽出温度は、約２５〜５０℃が好ましく、約３０〜４０℃がより好ましい。また、温水のｐＨは、約３〜５が好ましく、約３〜４．５がより好ましい。抽出時間は、４時間以上が好ましく、１６時間以上がより好ましい。抽出時間は、約２４時間程度までとすればよい。
抽出物は、そのまま使用してもよく、乾燥して得られる乾固物を使用してもよい。乾燥は、自然乾燥、凍結乾燥、約２０〜７０℃での減圧乾燥等が挙げられる。

（３）医薬
本発明の第１及び第２のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は、医薬製剤とすることができる。中でも、経口投与用製剤が好ましい。経口投与用製剤は、有効成分であるガノデルマ リンジーの子実体、又はその抽出物のみからなるものであってもよいが、有効成分を担体や添加剤とともに製剤化してもよい。
経口投与用の固形製剤としては、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。これらは、第１６改正日本薬局方に記載の方法により製造できる。
固形製剤は、有効成分に、薬学的に許容される添加剤（賦形剤のような担体を含む）の１種又は２種以上を配合して調製できる。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などを配合できる。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。
また、液体製剤は、有効成分を、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製できる。
医薬製剤に添加されるその他の添加剤としては、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤などが挙げられる。

医薬固形製剤中の有効成分の含有量は、有効成分が子実体である場合、乾燥重量に換算して、製剤の全量に対して、約０．１〜９５重量％が好ましく、約０．２〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましい。
また、有効成分が子実体の抽出物である場合、乾燥重量に換算して、製剤の全量に対して、約０．０１〜６０重量％が好ましく、約０．１〜２０重量％がより好ましく、約０．５〜１０重量％がさらにより好ましい。

医薬液体製剤中の有効成分の含有量は、有効成分が子実体である場合、乾燥重量に換算して、製剤の全量に対して、約０．１〜９５重量％が好ましく、約０．２〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましい。
また、有効成分が子実体の抽出物である場合、乾燥重量に換算して、製剤の全量に対して、約０．０１〜６０重量％が好ましく、約０．１〜２０重量％がより好ましく、約０．５〜１０重量％がさらにより好ましい。
上記範囲であれば、無理のない摂取量で、十分なＡＣＥ阻害活性、及び血圧降下作用が得られる。

（４）食品
本発明の第１及び第２のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は、食品組成物とすることができる。
この食品組成物は、健康食品、又は栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）として好適に用いることができる。また、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、又は栄養機能食品を含む）に好適である。

この食品組成物は、生理学的に許容される添加剤（賦形剤のような担体を含む）を配合して、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤、乳剤、液剤、シロップ剤などの製剤にすることができる。これらの製剤は、第１６改正日本薬局方に記載の方法により製造できる。
生理学的に許容される添加剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような賦形剤ないしは結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。
食品組成物に添加されるその他の添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。

また、この食品組成物は、飲料（スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲料、茶飲料等）、菓子類（クッキー等の焼き菓子、ゼリー、ガム、グミ、飴等）等の一般食品であって上記有効成分を含むものであってもよい。

固形食品組成物中の有効成分の含有量は、有効成分が子実体である場合、乾燥重量に換算して、組成物の全量に対して、約０．１〜９５重量％が好ましく、約０．２〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましい。
また、有効成分が子実体の抽出物である場合、乾燥重量に換算して、組成物の全量に対して、約０．００１〜７０重量％が好ましく、約０．０１〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましく、１〜１０重量％がさらにより好ましい。

液体食品組成物中の有効成分の含有量は、有効成分が子実体である場合、乾燥重量に換算して、組成物の全量に対して、約０．１〜９５重量％が好ましく、約０．２〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましい。
また、有効成分が子実体の抽出物である場合、乾燥重量に換算して、組成物の全量に対して、約０．００１〜７０重量％が好ましく、約０．０１〜５０重量％がより好ましく、約０．１〜２０重量％がさらにより好ましく、１〜１０重量％がさらにより好ましい。
上記範囲であれば、無理のない摂取量で、十分なＡＣＥ阻害活性、及び血圧降下作用が得られる。

（５）使用方法
本発明の第１及び第２のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤の使用対象としては、高血圧患者が好適である。高血圧患者は、本態性高血圧、及び二次性高血圧の何れの患者も対象となる。二次性高血圧の原因疾患である糖尿病性腎炎などの腎臓疾患；原発性アドレナリン症、褐色細胞腫、クッシング症候群などの内分泌疾患；大動脈狭窄症、大動脈炎症症候群などの心血管疾患；脳腫瘍；脳血管障害の急性期；ストレスなどの神経疾患を有する患者も、高血圧の予防のために好適な対象となる。また、本発明の剤の有効成分は天然由来の安全なものであるため、高血圧の予防のために、健常人も好適な対象となる。即ち、本発明の第１及び第２の血圧降下剤は、高血圧の治療、改善、又は予防剤として使用できる。

本発明の第１及び第２のＡＣＥ阻害剤、及び血圧降下剤は、対象者の健康状態などによって異なるが、有効成分が子実体である場合、有効成分の乾燥重量が、１日あたり、約０．０５〜９０ｇ、好ましくは約０．５〜５０ｇになるように摂取ないしは投与することができる。また、有効成分が子実体の抽出物である場合、有効成分の乾燥重量が、１日あたり、約０．０５〜５０ｇ、好ましくは約０．１〜５ｇになるように摂取ないしは投与することができる。
摂取ないしは投与期間は、例えば、約１〜３０００日間とすることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）株間の比較
（１−１）きのこ温水抽出物の調製
霊芝、又は椎茸の子実体70gに、pH5.5の水を1000mL加えてpH4.5とし、37℃で24時間抽出した後、121℃で15分間オートクレーブ処理した。その後、固液分離を行い、得られたろ液を濃縮し、凍結乾燥して、固体を得た。
用いた霊芝は、赤霊芝（ガノデルマ リンジー）ＢＭＣ−９０４９株（有限会社微創研から購入）、赤霊芝（直井ＧＹ株）（パワフル健康食品（株））、鹿角霊芝（（株）坂本バイオ）、黒霊芝（チハヤ（株））である。また、椎茸（大分産市販品）も用いた。

（１−２）ＡＣＥ阻害活性測定法
J.Hokkaido For.Prod.Res.Inst.Vol22 ,No.2,2008を参考に一部改変した方法にて測定した。
具体的には、まず、0.5M NaClを含有した125mMホウ酸緩衝液(pH8.3)でACE（Sigma社製、ウサギ肺由来）0.1μ/mLとなるように調製したACE液を50μL、氷冷下、2mLエッペンチューブに入れた。次いで、0.5M NaClを含有した125mMホウ酸緩衝液(pH8.3)で、被験物質である（１−１）で得たきのこ抽出物の乾燥物の溶液を調製し、ACE液に50μL添加した。対照は緩衝液のみ50μL添加した。次いで、0.5M NaClを含有した125mMホウ酸緩衝液(pH8.3)で調製した合成基質Hippuryl-L-histidyl-L-leucine（BACHEM社製）の6.5mMを、300μL加え、37℃で1時間加温した。きのこ抽出物は、反応溶液中の最終濃度が250μg/mLになるよう調製した。
加温後、1N HCl 200μLを加え、反応を止めた。さらに酢酸エチル800μLを加え、遊離した馬尿酸を抽出した。抽出液を300μL取り出し、窒素乾固後、乾固物に0.5M NaCl 300μL加え、HPLCにて合成基質にACEが作用することにより遊離した馬尿酸の面積を測定した。

（HPLC測定条件）
溶出液：2%酢酸溶液（90%）とアセトニトリル（10%）との混液
流速：1mL/min
カラム：μBondasphere 5μm C18 100Å（Waters社製）
カラム温度：40℃
検出：UV 240nm

ACE阻害率は、下記式により求めた。

ACE阻害率（％）
＝〔1−（被験物質添加時の馬尿酸の面積／緩衝液のみ添加時の馬尿酸面積）〕×100

（１−３）結果
結果を以下の表１に示す。
霊芝の中でも、赤霊芝ＢＭＣ−９０４９株の抽出物が、格段にＡＣＥ阻害活性が高いことが分かる。

（２）抽出温度の検討
（２−１）赤霊芝の温水又は熱水抽出物の調製
赤霊芝 BMC-9049株の1.4gに水（pH5.5）20mLを加えてpH4.5とし、4℃、25℃、40℃、50℃、又は60℃で24時間抽出後、90〜95℃ 10分加熱処理した。その後、固液分離を行い、得られたろ液を濃縮し、凍結乾燥して固体を得た。
また、赤霊芝 BMC-9049株の1.4gに水（pH5.5）20mLを加えてpH4.5とし、90〜95℃で3時間加熱処理し、抽出後、固液分離を行い、得られたろ液を濃縮し、凍結乾燥して固体を得た。

（２−２）ＡＣＥ阻害活性測定法
（１−２）に記載の方法において、被験物質の最終濃度を、250μg/mLに代えて、500μg/mLとなるようにした他は、（１−２）と同じ方法で、ACE阻害活性を測定した。

（２−３）結果
結果を以下の表２に示す。
抽出温度が４℃を超え、６０℃未満の場合に、格段にＡＣＥ阻害活性が高いことが分かる。

（３）抽出ｐＨの検討
（３−１）赤霊芝の温水又は熱水抽出物の調製
赤霊芝BMC-9049株の1.4gに水20mLを加え、pH3、4.5、5、7、又は8に調製し、37℃で24時間抽出後、90〜95℃で10分加熱処理した。その後、固液分離を行い、得られたろ液を被験物質とした。pHの調製には0.1Mクエン酸溶液、または1M NaOH溶液を用いた。

（３−２）ＡＣＥ阻害活性測定法
（１−２）に記載の方法において、0.5M NaClを含有した125mMホウ酸緩衝液(pH8.3)できのこ抽出物の乾燥物の溶液を調製し、この溶液をACE液に50μL添加したのに代えて、（３−１）で得た被験物質2容量に、0.5M NaClを含有した125mMホウ酸緩衝液(pH8.3)1容量を加えた溶液をACE液に50μL添加した他は、（１−２）と同じ方法で、ACE阻害活性を測定した。

（３−３）結果
結果を以下の表３に示す。
抽出液のｐＨが３〜６、特に３〜５の場合に、格段にＡＣＥ阻害活性が高いことが分かる。

（４）in vivo血圧降下活性の評価
（４−１）霊芝抽出物の調製
温水抽出
赤霊芝BMC-9049株の840gに水を12 L加え、37〜40℃で24時間抽出した後、121℃15分間オートクレーブ処理した。抽出液が40℃付近になるまで、放置した後、固液分離を行い、ろ液を約9L得た。得られたろ液を濃縮し、凍結乾燥して、霊芝温水抽出物の粉末を58.9g得た。

熱水抽出
赤霊芝BMC-9049株の280gを水4L加え、90〜95℃で3時間加熱した。加熱終了後、抽出液が40℃付近になるまで、放置した後、固液分離し、得られたろ液を濃縮し、凍結乾燥を行い、霊芝熱水抽出物 15.3gを得た。

（４−２）血圧降下実験
12週齢の高血圧自然発症ラット(SHR/Izm系)を日本エスエルシー株式会社から購入し、約1週間の予備飼育を行って、一般状態に異常のないことを確認した後、試験に使用した。試験動物はポリカーボネート製ゲージに各3匹収容し、室温23℃±2℃、照明時間12時間/日に設定した飼育室において飼育した。飼料（マウス、ラット用固型飼料；ラボMRストック、日本農産工合株式会社）及び飲料水（水道水）は自由に摂取させた。
一般状態に異常が認められない動物に対し，投与開始前の体重及び収縮期及び拡張期血圧をもとに層別無作為割付を行った。体重を測定した後、収縮期及び拡張期血圧を測定し、群分けを行った。
各検体に注射用水を加え溶解させ、25及び75mg/mLの試験液を調製した。赤霊芝抽出物を注射用水に溶解させて、各群（1群6匹）に、赤霊芝抽出物の投与量が500mg/kg、又は1500mg/kgになるように、20mL/kgの容量で強制単回投与した。また、コントロール群（6匹）には、注射用水を20mL/kgの容量で強制単回投与した。
投与後4、8、及び24時間に非観血式自動血圧測定装置BP-98A[Softron]を用いて、tail-cuff法により収縮期及び拡張期血圧を測定した。測定は1匹につき3回ずつ行い、その平均値を収縮期および拡張期血圧とした。
統計処理は各試験群の試験動物の投与前体重について一元配置分散分析を行った。投与後4、8及び24時間の収縮期血圧変化について、Tukey-kramer法により各試験群について多重比較を行った。有意水準は5及び1%とした。
（４−３）結果
結果を図1に示す。赤霊芝BMC-9049株の抽出物は、温水抽出物及び熱水抽出物の何れもコントロールに比べて、明らかに、高血圧ラットの収縮期血圧を低下させた。また、温水出物の方が熱水抽出物より血圧降下作用が強かった。

本発明の剤は、血圧降下のための医薬や機能性食品として有用なものである。

Claims (9)

1. ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物を有効成分として含むＡＣＥ阻害剤。
2. ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体の抽出物を有効成分として含むＡＣＥ阻害剤を製造する方法であって、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水により抽出する、方法。
3. ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体、又はその抽出物を有効成分として含む血圧降下剤。
4. ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体の抽出物を有効成分として含む血圧降下剤を製造する方法であって、ガノデルマ リンジーＢＭＣ−９０４９株の子実体を、温度２０〜５９℃、ｐＨ３〜６の温水により抽出する、方法。
5. ガノデルマ リンジーの子実体の抽出物を有効成分として含むＡＣＥ阻害剤の製造方法であって、ガノデルマ リンジーの子実体を、温度３０〜５０℃、ｐＨ３〜５の温水で抽出する、方法。
6. ガノデルマ リンジーの子実体の抽出物を有効成分として含む血圧降下剤の製造方法であって、ガノデルマ リンジーの子実体を、温度３０〜５０℃、ｐＨ３〜５の温水で抽出する、方法。
7. 温度３０〜５０℃で抽出する、請求項２又は４に記載の方法。
8. 請求項１記載のＡＣＥ阻害剤を含む、ＡＣＥ阻害用の食品組成物。
9. 請求項３記載の血圧降下剤を含む、血圧降下用の食品組成物。