WO2021193069A1

WO2021193069A1 - 新規複素環式化合物及びその塩、並びに発光基質組成物

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Publication number: WO2021193069A1
Application number: PCT/JP2021/009598
Authority: WO
Inventors: 昌次郎牧; 昇雄北田; 亮平森屋
Original assignee: 黒金化成株式会社; 国立大学法人電気通信大学
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2021-09-30
Also published as: JPWO2021193069A1

Abstract

本発明の課題は、従来よりも更に長波長の光を発することが可能で、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することであり、その解決手段は、下記一般式（１）：［式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＣＨ又はＮであり、Ｚは、ＣＲ^３又はＮであり、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立して、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であるか、Ｒ^１及びＲ^２は、互いに結合して特定構造の２価の基を形成し、Ｒ^４は、水素又は炭素数１～４のアルキル基であり、ｎは、３又は４である］で表されることを特徴とする、複素環式化合物又はその塩である。

Description

新規複素環式化合物及びその塩、並びに発光基質組成物

　本発明は、新規複素環式化合物及びその塩、並びに発光基質組成物に関するものである。

　生物発光系の中でも、ホタルの発光系は、発光効率に優れた系として知られている。該ホタルの発光系においては、発光基質であるホタルルシフェリンが、発光酵素のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）の存在下、励起状態のオキシルシフェリンに変換され、該オキシルシフェリンが基底状態へと失活する際に波長が約５６０ｎｍの黄緑色の光が発せられる。

　また、昨今、かかるホタルの発光系の発光基質の類似体として、多彩な発光波長を実現する化合物が合成されている。例えば、下記特許文献１及び２には、ホタルルシフェリンと類似の分子構造を有するルシフェリンの発光基質が開示されている。

　これらのホタルルシフェリン類似体の中でも、長波長の光を発する発光基質は、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有望であり、例えば、下記特許文献１には、下記構造式（ａ）で表される化合物が、極大波長６８０ｎｍの発光スペクトルを示すことが開示されており、また、下記特許文献２には、下記構造式（ｂ）で表される化合物が、極大波長６７０ｎｍの発光スペクトルを示すことが開示されている。

特開２００９－１８４９３２号公報特開２０１５－１９３５８４号公報

　生体イメージングに最適な波長は、所謂「生体の窓」と呼ばれる、ヘモグロビン、酸化ヘモグロビン、水の散乱、吸収の影響を受けにくい、６５０～９００ｎｍとされている。上記構造式（ａ）又は（ｂ）で表される化合物は、極大波長が「生体の窓」の範囲内にあるものの、より高感度の生体イメージングを実現するためには、更に長波長の光を発する発光基質を開発することが求められる。

　そこで、本発明は、従来よりも更に長波長の光を発することが可能で、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規化合物を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定構造の化合物又はその塩が、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、従来よりも更に長波長の光を発することを見出し、本発明を完成させるに至った。

　即ち、本発明によれば、下記一般式（１）：

［式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＣＨ又はＮであり、
　Ｚは、ＣＲ^３又はＮであり、
　Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であるか、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成し、
　Ｒ^３は、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であり、
　Ｒ^４は、水素又は炭素数１～４のアルキル基であり、
　ｎは、３又は４である］で表されることを特徴とする、複素環式化合物又はその塩が提供される。
　かかる本発明の複素環式化合物及びその塩は、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、従来よりも更に長波長の光を発することができる。

　本発明の複素環式化合物又はその塩の中でも、下記構造式（１－１）：

で表される化合物又はその塩が好ましい。
　構造式（１－１）で表される複素環式化合物及びその塩は、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、より一層長波長の光を発することが可能である。

　また、本発明によれば、上記の複素環式化合物又はその塩を含むことを特徴とする、発光基質組成物が提供される。
　かかる本発明の発光基質組成物は、発光酵素と共にホタル生物発光系を構成でき、また、従来よりも更に長波長の光を発することができる。

　本発明によれば、従来よりも更に長波長の光を発することが可能で、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な新規複素環式化合物及びその塩を提供することができる。

発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した発光系において、発光強度の最大値が１となるように正規化した発光スペクトルである。発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した発光系において、発光強度の最大値が１となるように正規化した発光スペクトルである。発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した発光系の、各波長における発光強度を示す発光スペクトルである。発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した発光系の、各波長における発光強度を示す発光スペクトルである。

　以下に、本発明の複素環式化合物及びその塩、並びに発光基質組成物を、その実施形態に基づき、詳細に例示説明する。

＜複素環式化合物及びその塩＞
　本発明の複素環式化合物は、下記一般式（１）：

で表されることを特徴とする。
　本発明の複素環式化合物は、ジヒドロチアゾール環に加えて、ベンゼン環又は芳香族複素環を有し、分子構造がホタルルシフェリンと類似しているため、ホタル生物発光系における発光基質として機能する。また、本発明の複素環式化合物は、ジヒドロチアゾール環と、ベンゼン環又は芳香族複素環との間に位置するビニレン単位（－ＣＨ＝ＣＨ－）が３又は４つ連なっているため、従来よりも更に長波長の光を発することができる。
　上記一般式（１）で表される複素環式化合物は、塩とすることもでき、該塩も、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、従来よりも更に長波長の光を発することができる。

　上記一般式（１）中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＣＨ又はＮである。ここで、合成の容易性の観点からは、Ｘ及びＹは、ＣＨであることが好ましく、一方、複素環式化合物の水やｐＨが中性付近（好ましくはｐＨが４～１０、より好ましくはｐＨが６～８）の緩衝液への溶解性の観点からは、Ｘ及びＹの一方又は両方は、Ｎであることが好ましい。

　上記一般式（１）中、Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であるか、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成する。
　ここで、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基としては、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３、－ＯＣＦ_３が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基としては、－ＳＨ、－ＳＣＨ_３が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基は、該一価の基中に不飽和結合を有しても、有しなくてもよい。環に直接結合する原子が窒素原子で且つ不飽和結合を有しない一価の基としては、－ＮＨ_２、－ＮＨＣＨ_３、－Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＣＨ_３ＮＨ_２が好ましい。一方、環に直接結合する原子が窒素原子で且つ不飽和結合を有する一価の基としては、－ＮＯ_２、－ＮＯ、－Ｎ＝ＮＨ、－Ｎ＝ＣＨ_２が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基は、該一価の基中に不飽和結合を有しても、有しなくてもよい。環に直接結合する原子が炭素原子で且つ不飽和結合を有しない一価の基としては、－ＣＨ_３、－Ｐｈ（フェニル基）、－Ｃ_６Ｈ_１１（シクロヘキシル基）、－Ｃ_５Ｈ_９（シクロペンチル基）、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＨ_２Ｃｌ、－ＣＨ_２Ｂｒが好ましい。一方、環に直接結合する原子が炭素原子で且つ不飽和結合を有する一価の基としては、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、－ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＣＮ等が挙げられ、－ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＣＮが好ましい。
　また、ハロゲン元素としては、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ及び－Ｉが好ましい。

　天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素との相互作用の観点から、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも一方は、活性水素を含むことが好ましく、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも一方が、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＣＨ_３、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＣＨ_３ＮＨ_２、－Ｎ＝ＮＨ、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、又は－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２であるか、Ｒ^１及びＲ^２が、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成することが更に好ましい。Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも一方が活性水素を含む場合、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩と、発光酵素とが、十分に相互作用し、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩が脱プロトン化（アニオン化）してアニオンになることで、蛍光性が向上することが天然発光基質と同様に考えられ、さらにアニオン化することで、長波長の光を高い効率で発することが可能となる。
　なお、本明細書において、「活性水素」とは、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等のヘテロ原子に結合している水素を指し、活性水素の中でも、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子に結合している水素が好ましく、酸素原子に結合している水素が特に好ましい。

　また、天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素との相互作用の観点から、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも一方は、酸素原子を含むことも好ましく、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも一方が、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３、－ＯＣＦ_３、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＯ_２、－ＮＯ、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、又は－ＣＯＣＨ_３であるか、Ｒ^１及びＲ^２が、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成することが更に好ましい。この場合も、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩と、発光酵素とが、十分に相互作用し、長波長の光を高い効率で発することが可能となる。

　上記一般式（１）中、Ｚは、ＣＲ^３又はＮであり、ここで、Ｒ^３は、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素である。
　環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基としては、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３、－ＯＣＦ_３が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基としては、－ＳＨ、－ＳＣＨ_３が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基は、該一価の基中に不飽和結合を有しても、有しなくてもよい。環に直接結合する原子が窒素原子で且つ不飽和結合を有しない一価の基としては、－ＮＨ_２、－ＮＨＣＨ_３、－Ｎ（ＣＨ_３）_２、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＣＨ_３ＮＨ_２が好ましい。一方、環に直接結合する原子が窒素原子で且つ不飽和結合を有する一価の基としては、－ＮＯ_２、－ＮＯ、－Ｎ＝ＮＨ、－Ｎ＝ＣＨ_２が好ましい。
　また、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基は、該一価の基中に不飽和結合を有しても、有しなくてもよい。環に直接結合する原子が炭素原子で且つ不飽和結合を有しない一価の基としては、－ＣＨ_３、－Ｐｈ（フェニル基）、－Ｃ_６Ｈ_１１（シクロヘキシル基）、－Ｃ_５Ｈ_９（シクロペンチル基）、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＨ_２Ｃｌ、－ＣＨ_２Ｂｒが好ましい。一方、環に直接結合する原子が炭素原子で且つ不飽和結合を有する一価の基としては、－ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、－ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＣＮ等が挙げられ、－ＣＨ_２Ｃ≡ＣＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、－ＣＮが好ましい。
　また、ハロゲン元素としては、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ及び－Ｉが好ましい。

　天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素との相互作用の観点から、Ｒ^３は、活性水素を含むことが好ましく、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－ＮＨＣＨ_３、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＨ－ＮＨ_２、－ＮＣＨ_３ＮＨ_２、－Ｎ＝ＮＨ、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、又は－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２であることが更に好ましい。特には、Ｒ^１及びＲ^２のいずれも、活性水素を含まない場合は、Ｒ^３が、活性水素を含むことが好ましい。Ｒ^３が活性水素を含む場合も、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩と、発光酵素とが、十分に相互作用し、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩が脱プロトン化（アニオン化）してアニオンになることで、蛍光性が向上することが天然発光基質と同様に考えられ、さらにアニオン化することで、長波長の光を高い効率で発することが可能となる。

　また、天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素との相互作用の観点から、Ｒ^３は、酸素原子を含むことも好ましく、即ち、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３、－ＯＣＦ_３、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＮＯ_２、－ＮＯ、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯ_２ＣＨ_３、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＮＨＮＨ_２、又は－ＣＯＣＨ_３であることが更に好ましい。特には、Ｒ^１及びＲ^２のいずれも、酸素原子を含まない場合は、Ｒ^３が、酸素原子を含むことが好ましい。

　上述のように、天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素との相互作用の観点から、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つは、活性水素を含む、及び／又は、酸素原子を含むことが好ましく、活性水素を含み、且つ、酸素原子を含むことが更に好ましく、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが、－ＯＨ、－ＮＨＯＨ、－ＮＣＨ_３ＯＨ、－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＯ_２Ｈ、－ＣＯＮＨ_２、又は－ＣＯＮＨＮＨ_２であるか、Ｒ^１及びＲ^２が、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成することが特に好ましい。特には、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが－ＯＨである場合、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩と、発光酵素とが、十分に相互作用し、一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩が脱プロトン化（アニオン化）してフェノレートアニオンになることで、蛍光性が向上することが天然発光基質と同様に考えられ、さらにアニオン化することで、長波長の光をより一層高い効率で発することが可能となる。

　Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯ_２Ｈである場合、これらの基中の、交換可能な活性水素は、保護基で置換されていてもよい。
　有機合成において、ある官能基のみを選択的に反応させたい場合、一時的に他の反応性の高い官能基を不活性な官能基に変換し保護する必要があり、この際、反応性の高い官能基を不活性な官能基に変換し保護するために使用する基が、「保護基」である。反応性の高い官能基が不活性な官能基に変換された化合物（反応性の高い官能基が保護基で保護された化合物）であっても、生体に投与すると一定の条件下で生体内物質（酵素、タンパク質等）との相互作用により脱保護反応が進行し、その結果生じた化合物が機能を発揮する。
　Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが、－ＯＨ、－ＳＨである場合の保護基としては、－ＭＯＭ（メトキシメチル基）、－ＴＨＰ（２－テトラヒドロピラニル基）、－ＥＥ（エトキシエチル基）、－Ａｃ（アセチル基）、－Ｂｚ（ベンゾイル基）、－Ｐｉｖ（ピバロイル基）、－ＴＭＳ（トリメチルシリル基）、－Ｔｒ（トリチル基）、－Ｂｎ（ベンジル基）、－Ａｌｌｙｌ（アリル基）、－Ｍｓ（メシル基）、－Ｔｓ（トシル基）、－Ｔｆ（トリフラート基）が好ましい。
　また、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが、－ＮＨ_２である場合の保護基としては、－ＢＯＣ（ｔ－ブトキシカルボニル基）、－Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基）、－Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル基）、－Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル基）、－ＮＨＣＨＯ（ホルムアミド基）、－ＮＨＣＯＣＨ_３（アセトアミド基）が好ましい。
　また、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３の少なくとも一つが、－ＣＯ_２Ｈである場合の保護基としては、炭素数１～４のアルキル基が好ましい。なお、－ＣＯ_２Ｈの「Ｈ」が炭素数１～４のアルキル基で保護（置換）された一価の基は、炭素数１～４のアルキル鎖を有するエステル基となる。

　上記一般式（１）中、Ｒ^４は、水素又は炭素数１～４のアルキル基である。ここで、炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。発光効率の観点から、Ｒ^４としては、水素が好ましい。

　上記一般式（１）中、ｎは、ビニレン単位（－ＣＨ＝ＣＨ－）の繰り返し数を示し、３又は４である。生体の窓（６５０～９００ｎｍ）の中央付近の発光波長が得られる点、並びに、合成の容易性の観点から、ｎは、３であることが好ましい。なお、各ビニレン単位は、トランス型の結合で連なっていてもよいし、シス型の結合で連なっていてもよいし、トランス型の結合とシス型の結合が混在していてもよい。発光効率の観点からは、各ビニレン単位は、トランス型の結合で連なっていることが好ましい。

　上記一般式（１）で表される複素環式化合物は、（ｉ）一般式（１）中のＲ^２が－Ｎ（ＣＨ_３）_２であり、ｎが３である化合物、（ｉｉ）一般式（１）中のＸがＮであり、Ｒ^２が－ＯＨ、－ＮＨ_２又は－Ｎ（ＣＨ_３）_２であり、ｎが３である化合物、（ｉｉｉ）一般式（１）中のＺがＮであり、Ｒ^２が－ＯＨ、－ＮＨ_２又は－Ｎ（ＣＨ_３）_２であり、ｎが３である化合物以外であることが好ましい。

　上記一般式（１）で表される複素環式化合物としては、下記構造式（１－１）から（１－１１）：

で表わされる化合物が好ましく、上記構造式（１－１）で表される化合物が特に好ましい。構造式（１－１）で表される複素環式化合物及びその塩は、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、より一層長波長の光を発することが可能であり、生体内深部の可視化に特に有用である。
　また、合成の容易性の観点からは、構造式（１－１）、（１－２）、（１－４）、（１－５）で表される化合物が好ましい。

　上記一般式（１）で表される複素環式化合物は、特に限定されるものではないが、以下のようにして合成することができる。
　例えば、出発物質として、（Ｅ）－４－メトキシシンナムアルデヒド等のアルコキシ基を有する芳香族アルデヒドを使用し、アルコキシ基をピリジン塩酸塩によりヒドロキシ基に置換し、該ヒドロキシ基を、水素化ナトリウム（ＮａＨ）とクロロメチルメチルエーテル（ＭＯＭＣｌ）でＭＯＭ保護する。次に、ＭＯＭ保護した芳香族アルデヒドに対して、４－ホスホノクロトン酸トリエチル等を反応させてオレフィン数を増やしつつ、エステル体を得る。次に、該エステル体を加水分解してカルボキシル体を得、該カルボキシル体を、Ｓ－トリチル－Ｄ－システインメチルエステル（Ｄ－ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｏｍｅ）と、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）によりアミド化させて、アミド体を得る。次に、該アミド体を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（Ｔｆ_２Ｏ）により、チアゾリン環化させてチアゾリンメチルエステル体を得る。次いで、所望により、チアゾリンメチルエステル体のメチルエステル部分を加水分解して、チアゾリン環を有するカルボキシル体を得る。また、出発物質を適宜変更したり、種々の置換基を導入したりする等して、或いは、他の合成経路を利用して、所望の複素環式化合物を得ることができる。

　上記一般式（１）で表される複素環式化合物は、塩とすることもでき、即ち、本発明の複素環式化合物の塩は、上記一般式（１）で表される複素環式化合物の塩である。かかる本発明の複素環式化合物の塩も、ホタル生物発光系における発光基質として機能する上、従来よりも更に長波長の光を発することができる。
　ここで、本発明の複素環式化合物の塩は、酸との付加塩でも、塩基との付加塩でもよい。例えば、本発明の複素環式化合物と酸との付加塩における酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸、亜リン酸、亜硝酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、パモ酸、ステアリン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、また、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、マンデル酸塩、ケイ皮酸塩、パモ酸塩、ステアリン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられる。一方、本発明の複素環式化合物と塩基との付加塩における塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等が挙げられ、また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。

　上記一般式（１）で表される複素環式化合物の塩は、水やｐＨが中性付近の緩衝液への溶解性に優れる。そのため、上記一般式（１）で表される複素環式化合物の塩は、水やｐＨが中性付近の緩衝液に高濃度で溶解させることができ、発光輝度を向上させることができる。

＜発光基質組成物＞
　本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩を含み、上述した一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩のみからなってもよい。本発明の発光基質組成物は、天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）やその変異酵素等の発光酵素と共にホタル生物発光系を構成でき、また、従来よりも更に長波長の光を発することができる。

　上述した本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光甲虫ルシフェラーゼ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びマグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）の存在する系に添加することによって、発光甲虫ルシフェラーゼにより酸化して発光する。なお、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ＡＴＰ及びＭｇ²⁺と共に発光検出キット（発光基質組成物）として提供することもでき、また、該発光検出キットには、他の発光基質や適切なｐＨに調整した溶液を含めてもよい。

　本発明の複素環式化合物及びその塩を発光系に応用する場合、好適な発光強度を得るためには、本発明の複素環式化合物及びその塩を１μＭ以上の濃度で使用することが好ましく、５μＭ以上の濃度で使用することが更に好ましい。即ち、本発明の発光基質組成物は、上述した一般式（１）で表される複素環式化合物又はその塩を１μＭ以上の濃度で含むことが好ましく、５μＭ以上の濃度で含むことが更に好ましい。また、本発明の発光基質組成物のｐＨ、並びに、発光系のｐＨは、好ましくは４～１０、より好ましくは６～８であり、必要に応じて、ｐＨを安定化するために、リン酸カリウム、トリス塩酸、グリシン、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を含んでもよい。また、発光基質組成物（発光検出キット）が、ＡＴＰを含む場合、該ＡＴＰの濃度は、４０μＭ以上が好ましく、２００μＭ以上が更に好ましい。

　また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、ホタル発光甲虫ルシフェラーゼ発光系において、種々の発光酵素（酸化酵素）によって発光させることができる。ルシフェラーゼは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）、鉄道虫（Railroad worm）等から単離されており、いずれも使用できる。また、使用可能な発光酵素としては、ヒカリコメツキムシルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ等も挙げられる。また、天然のホタルルシフェラーゼの変異酵素を、発光酵素として使用することもできる。

　本発明の複素環式化合物及びその塩を発光基質とする生物発光は、発光系にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ピロリン酸又はマグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）が存在すると、その発光が増強される。これらの化合物の発光増強効果は、発光系におけるＣｏＡ、ピロリン酸又はＭｇ²⁺の濃度がそれぞれ５μＭ以上において顕著であり、濃度の増加に従って発光が増強される。

　ホタル生物発光系を測定／検出に使用するためには、酵素の失活を防止してプラトーな発光挙動を示すように、発光を安定化させることが好ましく、例えば、発光系にマグネシウムイオンを存在させることが好ましく、マグネシウムイオンとピロリン酸を共存させることが更に好ましい。なお、マグネシウムイオン単独の場合、発光安定化の観点から、発光系のマグネシウムイオン濃度は、０．５ｍＭ以上が好ましく、濃度の増加に従って発光の安定性が向上する。また、ピロリン酸マグネシウムを使用する場合、発光安定化の観点から、発光系のピロリン酸マグネシウム濃度は、１０μＭ以上が好ましく、１００μＭ以上が更に好ましい。なお、ピロリン酸とマグネシウムイオンとの割合は、当量比でなくてもよい。また、好適なマグネシウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸塩、酢酸マグネシウム等の有機酸塩が挙げられる。また、好適なピロリン酸塩として、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属のピロリン酸塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のピロリン酸塩、鉄のピロリン酸塩が挙げられる。

　本発明の複素環式化合物及びその塩は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明の複素環式化合物又はその塩をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を結合させることができる。

　また、本発明の複素環式化合物及びその塩は、発光基質の発光によって発光甲虫ルシフェラーゼ活性を検出することを利用した測定／検出に利用することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞又は動物に対して本発明の複素環式化合物又はその塩を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現などを測定／検出することができる。なお、波長の長い光は、光透過性が高く、組織透過性も高い。従って、長波長の発光を有する本発明の複素環式化合物及びその塩は、生体内深部を可視化するための標識材料として有用である。

　以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

＜発光基質の合成＞
（１）機器分析、測定装置
・¹H核磁気共鳴スペクトル（¹H NMR）
　日本電子社製ECA 500（500 MHz）を用いて測定し、測定結果を「¹H NMR（測定周波数、測定溶媒）　ケミカルシフト値（水素の数、多重度、スピン結合定数）」と記載した。ケミカルシフト値（δ）は、テトラメチルシラン（δ = 0）を内部基準とし、ppmで表記した。多重度は、s（単一線）、d（二重線）、t（三重線）、q（四重線）、m（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルについてはbrと付記した。スピン結合定数（J）は、Hzで記載した。

・¹³C核磁気共鳴スペクトル（¹³C NMR）
　日本電子社製ECA 500（126 MHz）を用いて測定し、測定結果を「¹³C NMR（測定周波数、測定溶媒）　ケミカルシフト値」と記載した。ケミカルシフト値（δ）は、テトラメチルシラン（δ= 0）を内部基準とし、ppmで表記した。

・質量スペクトル（MS）：エレクトロンスプレーイオン法（ESI）
　日本電子社製JMS-T100LCAccuTOF質量分析計を用い、高分解能エレクトロスプレーイオン化法（ESI）により測定した。サンプル送液は、インフュージョン法で行った。測定結果は、「ESI-MS : m/z [M + 付加イオン] 質量数」と記載した。

（２）クロマトグラフィー
・分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）
　和光社製のTLCプレート、Wako Silica gel 70 F254 TLCプレートを用いた。TLC上の化合物の検出は、UV照射（254 nmあるいは365 nm）および発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。

・分取用薄層クロマトグラフィー（PTLC）
　ANALTECH社製のUNIPLATETE、厚さ0.5 mmもしくは厚さ2.0 mmを用い、「使用したガラスプレートの縦の長さ×横の長さ×厚さ×枚数；展開溶媒」と記載した。

・シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　E. Merck社製のシリカゲル60F254（Art. 7734）を用いて行い、展開溶媒を記載した。

（３）基本操作
　反応後の抽出溶液の乾燥は、無水硫酸ナトリウムを加えることで行った。
　溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下（20～30 mmHg）、ロータリーエバポレーターを用いて行った。痕跡量の溶媒の除去は、冷却装置「UNI TRAP UT-1000（EYELA 社製）」で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ（約 1 mmHg）を用いて行った。
　溶媒の混合比は、すべて体積比で表した。

（４）溶媒
・蒸留水
　アドバンテック東洋株式会社製GS-200型蒸留水製造装置を用いて蒸留、及びイオン交換処理したものを使用した。

・トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリル
　関東化学株式会社製の有機合成用脱水溶媒、あるいは特級溶媒を、モレキュラーシーブス（4A）を用いて乾燥させて使用した。

・NMR測定用溶媒
　以下に示すものをそのまま用いた。
　CDCl₃: ISOTEC Inc.製99.7 ATOM%D、0.03% TMS
　CD₃OD : ISOTEC Inc.製99.8 ATOM%D（～0.7 ATOM%13C）、0.05% TMS

（発光基質Ａの合成）
　発光基質Ａの合成経路は、以下の通りである。

　トランス-4-クマル酸（１）（0.80 ｇ, 4.88 mmol）のジクロロメタン溶液（55 ml）にN,N-ジメチルアミノピリジン（2.08 g、17.06 mmol）と無水酢酸（3.22 ml, 34.16mmol）を加えて、室温で4時間攪拌したのち、1 M塩酸（5 ml）でクエンチした。酢酸エチル（200 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝ 8：1）で精製し、カルボキシル体（２）（0.87 g, 4.22 mmol, 86%）を黄色固体として得た。

　カルボキシル体（２）（0.87 g, 4.22 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド溶液（35 ml）にN,N-ジメチルアミノピリジン（1.29 g, 12.20 mmol）と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボイミド塩酸塩（2.02 g, 12.20 mmol）とS-トリチル-D-システインメチルエステル（1.99 g, 5.48 mmol）を加えて、室温で4時間攪拌したのち、蒸留水（40 ml）でクエンチした。酢酸エチル（200 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、アミド体（３）（0.52 g, 0.92 mmol, 93%）を白色固体として得た。

　アミド体（３）（320 mg, 0.57 mmol）をアルゴン雰囲気下にし、脱水ジクロロメタン（3 ml）を加えた。脱水ジクロロメタン（3 ml）をアルゴン雰囲気下にし、0℃にてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（1.4 ml, 0.85 mmol）と前述のアミド体溶液を加え、室温に戻し30分攪拌したのち、NaHCO₃水溶液でクエンチした。クロロホルム（40 ml×3）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、チアゾリンメチルエステル体（４）（870 mg, 0.28 mmol, 50%）を白黄色固体として得た。

　チアゾリンメチルエステル体（４）（120 mg, 0.39 mmol）のテトラヒドロフラン（2 ml）溶液に、6 M塩酸水溶液（2 ml）を加え、室温で72時間攪拌したのち、炭酸水素ナトリウムでクエンチし、減圧濃縮した。残滓を自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（smart flash EPCLC Al-580S ULTRAPACK COLUMNS C₁₈ H₂O/メタノール＝95/5）で精製し、発光基質Ａ（50 mg, 0.17 mmol, 44%）を黄色固体として得た。生成物（発光基質Ａ）の同定結果は、以下の通りである。

　¹H NMR(500 MHz, MeOD): δ = 7.40 (d, J = 9.2 Hz 2H), 7.07 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.79 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.97 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 9.2, 10.3 Hz, 1H), 3.49 (t, J = 10.3 Hz, 1H)
　ESI-MS [M-H]^- ; m/z 248.08

（発光基質Ｂの合成）
　発光基質Ｂの合成経路は、以下の通りである。

　市販されている4-ヒドロキシベンズアルデヒド（５）（50 mg, 0.41 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（5 ml）に水素化ナトリウム（24 mg, 6.15 mmol）とクロロメチルメチルエーテル（0.04 ml, 0.53 mmol）を0℃で加えて、室温に戻し1.5時間攪拌したのち、蒸留水（5 ml）でクエンチした。酢酸エチル（20 ml×3回）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：1）で精製し、ホルミル体（６）（37 mg, 0.22 mmol, 54%）を黄色油状で得た。

　ホルミル体（６）（100 mg, 0.61 mmol）を、水素化ナトリウム（90 mg, 2.41 mmol）と4-ホスホノクロトン酸トリエチル（0.26 ml, 1.21 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（10 ml）に0℃で加え、室温で30分攪拌したのち、エタノールでクエンチした。クロロホルム（30 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：1）で精製し、エステル体（７）（187 mg, 0.71 mmol, 117%）を薄黄色油状で得た。

　エステル体（７）（161 mg, 0.61 mmol）のイソプロピルアルコール溶液（10 ml）に、1 M水酸化ナトリウム水溶液（10 ml）を加え、110℃で溶液を2時間加熱還流した。溶液を酢酸エチル（30 ml）で抽出し、水層を1M塩酸水溶液（5 ml）で中和、酢酸エチル（30 ml）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮し、カルボキシル体（８）（114 mg, 0.49 mmol, 79%）を白色固体として得た。

　カルボキシル体（８）（114 mg、0.49 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド溶液（30 ml）にN,N-ジメチルアミノピリジン（120 mg、0.97 mmol）と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボイミド塩酸塩（280 mg、1.46 mmol）とS-トリチル-D-システインメチルエステル（260 mg、0.73 mmol）を加えて、室温で2.5時間攪拌したのち、蒸留水（10 ml）でクエンチした。酢酸エチル（50 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、アミド体（９）（140 mg、0.24 mmol, 48%）を薄黄色固体として得た。

　アミド体（９）（57 mg, 0.096 mmol）をアルゴン雰囲気下にし、脱水ジクロロメタン（1.5 ml）を加えた。脱水ジクロロメタン（1.5 ml）をアルゴン雰囲気下にし、0℃にてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（0.047 ml, 0.288 mmol）と前述のアミド体溶液を加え、室温に戻し30分攪拌したのち、NaHCO₃水溶液でクエンチした。クロロホルム（20 ml×3）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、チアゾリンメチルエステル体（１０）（4.8 mg, 0.016 mmol, 17%）を黄色固体として得た。

　チアゾリンメチルエステル体（１０）（105 mg, 0.36 mmol）のテトラヒドロフラン（2 ml）溶液に、4 M塩酸水溶液（4 ml）を加え、室温で48時間攪拌したのち、炭酸水素ナトリウムでクエンチし、減圧濃縮した。残滓を自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（smart flash EPCLC Al-580S ULTRAPACK COLUMNS C₁₈ H₂O/メタノール＝95/5）で精製し、発光基質Ｂ（40.7 mg, 0.15 mmol, 41%）を黄色固体として得た。生成物（発光基質Ｂ）の同定結果は、以下の通りである。

　¹H NMR(500 MHz, MeOD): δ = 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.92 (dd, J = 10.3, 15.2 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 14.9 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 10.3, 15.5 Hz, 1H), 6.57 (dt, J = 1.7, 8.6 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 4.92 (t, J = 9.1, 1H), 4.05 (dd, J = 9.2, 10.9 Hz, 1H), 3.44 (dd, J = 9.8, 10.8 Hz, 1H)
　ESI-MS [M-H]^- 269.27 ; m/z 616.12

（発光基質Ｃの合成）
　発光基質Ｃの合成経路は、以下の通りである。

　市販されている(E)-4-メトキシシンナムアルデヒド（１１）（1.00 g, 6.17 mmol）とピリジン塩酸塩（29.00 g, 0.25mol）とデカリン（7 ml）を200℃で2時間加熱還流した。溶液を冷まし、蒸留水でクエンチし、酢酸エチル（500 ml×3）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝2：1）で精製し、ホルミル体（１２）（0.50 mg, 3.41 mmol, 55%）を褐色固体として得られた。

　ホルミル体（１２）（89 mg, 0.61 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（5 ml）に水素化ナトリウム（40 mg, 1.202 mmol）とクロロメチルメチルエーテル（0.06 ml, 0.91 mmol）を0℃で加えて、室温に戻し18時間攪拌したのち、蒸留水（5 ml）でクエンチした。酢酸エチル（20 ml×3回）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、ホルミル体（１３）（85 mg, 0.52 mmol, 87%）を褐色油状で得た。

　ホルミル体（１３）（85 mg, 0.44 mmol）を、水素化ナトリウム（70 mg, 1.77 mmol）と4-ホスホノクロトン酸トリエチル（0.19 ml, 0.88 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（5 ml）に0℃で加え、30分攪拌したのち、エタノールでクエンチした。クロロホルム（30 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝3：1）で精製し、エステル体（１４）（17 mg, 0.06 mmol, 13%）を黄色固体として得た。

　エステル体（１４）（55 mg, 0.19 mmol）のイソプロピルアルコール溶液（5 ml）に１ M水酸化ナトリウム水溶液（5 ml）を加え、110℃で溶液を2時間加熱還流した。溶液を酢酸エチル（30 ml）で抽出し、水層を1M塩酸水溶液（5 ml）で中和、酢酸エチル（30 ml）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮し、カルボキシル体（１５）（47 mg, 0.18 mmol, 95%）を黄色固体として得た。

　カルボキシル体（１５）（260 mg、0.99 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド溶液（15 ml）にN,N-ジメチルアミノピリジン（300 mg、2.50 mmol）と1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボイミド塩酸塩（470 mg、2.50 mmol）とS-トリチル-D-システインメチルエステル（430 mg、1.20 mmol）を加えて、室温で2時間攪拌したのち、蒸留水（20 ml）でクエンチした。酢酸エチル（50 ml×3）で抽出したのち、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、アミド体（１６）（499 mg、0.81 mmol, 81%）を黄色固体として得た。

　アミド体（１６）（380 mg, 0.61 mmol）をアルゴン雰囲気下にし、脱水ジクロロメタン（4 ml）を加えた。脱水ジクロロメタン（4 ml）をアルゴン雰囲気下にし、0℃にてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（0.15 ml, 0.92 mmol）と前述のアミド体溶液を加え、室温に戻し30分攪拌したのち、NaHCO₃水溶液でクエンチした。クロロホルム（50 ml×3）で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮した。残滓をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝1：1）で精製し、チアゾリンメチルエステル体（１７）（78 mg, 0.25 mmol, 40%）を褐色固体として得た。

　チアゾリンメチルエステル体（１７）（78 mg, 0.25 mmol）のテトラヒドロフラン（1 ml）溶液に、4 M塩酸水溶液（2 ml）を加え、室温で48時間攪拌したのち、炭酸水素ナトリウムでクエンチし、減圧濃縮した。残滓を自動分取中圧カラムクロマトグラフィー（smart flash EPCLC Al-580S ULTRAPACK COLUMNS C₁₈ H₂O/メタノール＝95/5）で精製し、発光基質Ｃ（40.5 mg, 0.15 mmol, 60%）を褐色固体として得た。生成物（発光基質Ｃ）の同定結果は、以下の通りである。

　¹H NMR(500 MHz, MeOD): δ = 7.30 (d, J = 8.6 Hz 2H), 6.88 (dd, J = 10.8, 15.4 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 10.9, 15.5 Hz, 1H), 6.73 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 6.66 (dd, J = 10.5, 15.4 Hz 1H), 6.50 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.43 (dd, J = 10.9, 14.4 Hz, 1H), 4.95 (t, J = 9.7 Hz, 1H), 3.57 (dd, J = 10.3, 10.3 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 9.7, 10.9 Hz, 1H)
　¹³C NMR (126 MHz, MeOD) δ = 176.88(1C), 169.38(1C), 159.25(1C), 142.21(1C), 139.90(1C), 136.33(1C), 129.06(1C), 128.20(2C), 124.85(1C), 123.63(1C), 115.77(2C), 80.79(1C), 48.18(1C), 35.44(1C)
　HR-ESI-MS: m/z: [M + Na]+ C₁₆H₁₅N₁Na₁O₃S₁の計算値 324.06703 ; 実測値 324.06496

＜発光スペクトル測定＞
　上記のようにして得た発光基質Ａ、Ｂ又はＣを用いて、発光スペクトルの測定を行った。
　具体的には、５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ８．０）５μＬと、２５０μＭの各発光基質の溶液５μＬと、１ｍｇ/ｍＬの天然のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）又はホタルルシフェラーゼの変異酵素（Ａｋａｌｕｃ、天然酵素Ｆｌｕｃのアミノ酸残基２８個を変異させた酵素、理化学研究所より提供、Iwano, S.; Sugiyama, M.; Hama, H.; Watakabe, A.; Hasegawa, N.; Kuchimaru, T.; Tanaka, K. Z.; Takahashi, M.; Ishida, Y.; Hata, J.; et al. Single-Cell Bioluminescence Imaging of Deep Tissue in Freely Moving Animals. Science. 2018, 359 (6378), 935-939.）の溶液５μＬと、１０ｍＭのＡＴＰマグネシウム塩の溶液１０μＬと、を混合し、発光測定装置（ＡＴＴＯ株式会社製、ＡＢ－１８５０）を用いて、１８０秒間発光スペクトルの測定を行った。結果を図１、図２、図３及び図４に示す。
　図１は、発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した場合において、発光強度の最大値が１となるように正規化した発光スペクトルであり、図２は、発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した場合において、発光強度の最大値が１となるように正規化した発光スペクトルである。
　また、図３は、発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した場合の、各波長における発光強度を示す発光スペクトルであり、図４は、発光基質Ａ、Ｂ又はＣと、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した場合の、各波長における発光強度を示す発光スペクトルである。

　図１から分かるように、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した場合、発光基質Ａの発光スペクトルにおける極大波長は５３５ｎｍであり、発光基質Ｂの発光スペクトルにおける極大波長は６５０ｎｍであり、発光基質Ｃの発光スペクトルにおける極大波長は７６５ｎｍであった。
　また、図２から分かるように、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した場合、発光基質Ａの発光スペクトルにおける極大波長は５３０ｎｍであり、発光基質Ｂの発光スペクトルにおける極大波長は６５５ｎｍであり、発光基質Ｃの発光スペクトルにおける極大波長は７６０ｎｍであった。
　図１及び図２から、天然酵素（Ｆｌｕｃ）及び変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）のいずれを用いても、発光スペクトルにおける極大波長は、ほぼ同等であり、また、本発明に従う発光基質Ｃを使用した場合、発光スペクトルにおける極大波長が７５０ｎｍを超えること分かる。

　また、図３及び図４から分かるように、天然酵素（Ｆｌｕｃ）を使用した場合は、発光基質Ａの輝度が最も高いものの、変異酵素（Ａｋａｌｕｃ）を使用した場合は、発光基質Ｃの輝度が最も高く、酵素側を変えることで、本発明に従う発光基質Ｃの輝度を大幅に向上させられることが分かる。

　本発明の複素環式化合物及びその塩は、ホタル生物発光系における発光基質として利用できる。

Claims

　下記一般式（１）：

［式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＣＨ又はＮであり、
　Ｚは、ＣＲ^３又はＮであり、
　Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ独立して、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であるか、互いに結合して下記式：

で表される２価の基を形成し、
　Ｒ^３は、水素、環に直接結合する原子が酸素原子である一価の基、環に直接結合する原子が硫黄原子である一価の基、環に直接結合する原子が窒素原子である一価の基、環に直接結合する原子が炭素原子である一価の基、又はハロゲン元素であり、
　Ｒ^４は、水素又は炭素数１～４のアルキル基であり、
　ｎは、３又は４である］で表されることを特徴とする、複素環式化合物又はその塩。
　下記構造式（１－１）：

で表される、請求項１に記載の複素環式化合物又はその塩。
　請求項１又は２に記載の複素環式化合物又はその塩を含むことを特徴とする、発光基質組成物。